JP5689601B2 - 組成物 - Google Patents

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Description

本発明は、組成物及びかかる組成物の使用に関する。
プロバイオティクスは、宿主の腸管内の微生物バランスを改善することによって宿主に潜在的に利益を与える生きた微生物、特に細菌を含む栄養補助食品である。異なるいくつかの微生物が使用されており、最も一般的なものは乳酸菌である。典型的には、このような微生物を含む食品組成物は、ヨーグルトなどの発酵乳製品に組み込まれる。
プロバイオティクス及びプレバイオティクスの理論的根拠は、体が、腸管内菌叢と総称される微生物の生態環境を含むことである。いくつかの状況（抗生物質若しくは他の薬物の使用、過剰のアルコール、ストレス、疾患、又は毒性物質への曝露）は、微生物のバランスを変更する可能性がある。このような状況では、体で良好に働く微生物は数が減少することがあり、有害な競合相手の繁殖が可能になる恐れがあり、体の健康を害する。
プロバイオティクスは、体の自然発生の腸内フローラを支援するよう意図されている。例えば、プロバイオティクスは、体の自然のフローラの再建を支援するために、医師によって、より頻繁には栄養士によって抗生物質の過程の後に推奨されることもある。
プレバイオティクスは、１９９５年に初めて「結腸において限定された数の細菌の増殖及び／又は活性を選択的に刺激することによって宿主に有益な作用をもたらす非消化性食品材料」と定義された（Gibson, G.R., Roberfroid, M.B. J. Nutr. 125 (1995) 1401-1412）。これらの物質は、上消化管では消化も吸収もされないが、結腸において選択的に発酵される。プレバイオティクスは、結腸における有用な微生物、主に乳酸桿菌（lactobacilli）及びビフィドバクテリウム（bifidobacteria）のための標的エネルギー源として働き、非常に競合的な結腸環境で栄養上の利点をそれらにもたらす（Tuohy, K.M., et al. Curr. Pharmaceut. Design 11 (2005) 75-90）。
機能性食品は、プレバイオティクス、プロバイオティクス、又はこれらの成分の組合せを含有することができる。プロバイオティクス細菌、主にビフィドバクテリウム及び乳酸桿菌によるプレバイオティクスの発酵は、宿主の健康に有益であると考えられる。プレバイオティクスは、腸の機能、病原の定着に対する抵抗性、免疫学、大腸癌、並びに脂質及び鉱質代謝に影響を及ぼすことによって良好な健康を促進すると考えられる（Gibson, G.R., Roberfroid, M.B. J. Nutr. 125 (1995) 1401-1412）。
米国特許第６，５４４，５６８号明細書には、プレバイオティクス非消化性繊維を含むベーキング部分、及び凍結乾燥した生菌プロバイオティクス乳酸菌を含む非ベーキング部分を含む機能性食品が開示されている。
Crittenden, R.G., et al. Journal of Applied Microbiology 90 (2001) 268-278には、シンバイオティクスヨーグルト中でのビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）Lafti（商標）B94及び難消化性デンプンの使用が開示されている。難消化性デンプンに加えて、この細菌は、いくつかの他のプレバイオティクス物質を利用することもできる。
米国特許第６，５４４，５６８号明細書
Gibson, G.R., Roberfroid, M.B. J. Nutr. 125 (1995) 1401-1412 Tuohy, K.M., et al. Curr. Pharmaceut. Design 11 (2005) 75-90 Crittenden, R.G., et al. Journal of Applied Microbiology 90 (2001) 268-278
これらの開示にもかかわらず、プロバイオティクスとプレバイオティクスのより選択的で且つ効率的な組合せが引き続き求められている。
本発明は、従来技術の問題を軽減する。
一態様において、本発明は、組成物であって、
（ａ）１又は複数の生菌ビフィドバクテリウム・ラクティス株と、
（ｂ）糖成分と
を含み、
糖成分が、重合度２〜１００のキシロオリゴ糖を含む組成物を提供する。
別の態様において、本発明は、本発明の組成物を含む経口摂取用の製品であって、ドライ経口サプリメント、液体経口サプリメント、牛乳、ヨーグルト、チーズ、アイスクリーム、発酵穀類で製造された製品、乳児用調製粉乳、粉末飲料、菓子、栄養バー、及び粉乳から選択される製品を提供する。
別の態様において、本発明は、対象の腸でのビフィドバクテリウム・ラクティスの定着及び／又は活性を選択的に増強させる医薬品の製造における本発明に従う組成物の使用を提供する。
別の態様において、本発明は、プロバイオティクス含有食品の発酵中にビフィドバクテリウム・ラクティスのレベルを選択的に上昇させる手段を提供する。
キシロオリゴ糖
キシロオリゴ糖は、１，４−β−結合によって連結された五炭糖であるキシロース分子を含むが、他の結合も可能である。キシロオリゴ糖の重合度は、キシロース単位数を指す。したがって、キシロビオースは、１，４−β−結合によって連結されたキシロース分子２個からなり、重合度２である。同様に、キシロトリオースは、重合度３である。重合度又はｄｐは、重合反応の時間ｔにおける平均ポリマー鎖中の繰返し単位数である。
別の態様において、好ましくは、糖成分（ｂ）は、その主成分として重合度２のキシロオリゴ糖を含む。即ち、このような糖成分において、キシロオリゴ糖の最大単一基の重合度は２である。したがって、例えば、このようなキシロオリゴ糖は、重合度２のキシロオリゴ糖を重合度３のキシロオリゴ糖より高い割合で含有する。しかし、このようなキシロオリゴ糖中の重合度２のキシロオリゴ糖の割合は、必ずしもキシロオリゴ糖の大部分を構成しているわけではなく、５０％未満でもよい。
好ましくは、糖成分（ｂ）における重合度２のキシロオリゴ糖の割合は、少なくとも４０％、好ましくは少なくとも４５％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５５％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％である。これらの百分率は、乾燥重量ベースの百分率である。
好ましくは、キシロオリゴ糖の重合度は２である。
別の態様において、好ましくは、糖成分（ｂ）は、その主成分として重合度３のキシロオリゴ糖を含む。
好ましくは、糖成分（ｂ）における重合度３のキシロオリゴ糖の割合は、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも１２％、好ましくは少なくとも１４％、好ましくは少なくとも１５％、好ましくは少なくとも１６％、好ましくは少なくとも１７％、好ましくは少なくとも１８％である。
好ましくは、糖成分（ｂ）における重合度が少なくとも４であるキシロオリゴ糖の割合は、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３５％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも４５％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５５％、好ましくは少なくとも６０％である。
好ましくは、糖成分（ｂ）における重合度が少なくとも５であるキシロオリゴ糖の割合は、９０％未満、好ましくは８５％未満、好ましくは８０％未満、好ましくは７５％未満、好ましくは７０％未満、好ましくは６５％未満、好ましくは６０％未満である。
好ましくは、糖成分（ｂ）における重合度２〜１０のキシロオリゴ糖の割合は、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％である。
好ましくは、糖成分（ｂ）における重合度１のキシロオリゴ糖の割合は、８０％未満、好ましくは７０％未満、好ましくは６０％未満、好ましくは５０％未満、好ましくは４０％未満、好ましくは３５％未満、好ましくは３０％未満、好ましくは２５％未満、好ましくは２０％未満である。
好ましくは、糖成分（ｂ）における重合度１〜２のキシロオリゴ糖の割合は、８０％未満、好ましくは７０％未満、好ましくは６０％未満、好ましくは５０％未満、好ましくは４０％未満、好ましくは３５％未満、好ましくは３０％未満、好ましくは２５％未満、好ましくは２０％未満である。
好ましくは、キシロオリゴ糖の重合度は２〜１０である。
別の態様において、好ましくは、糖成分（ｂ）における重合度が少なくとも５であるキシロオリゴ糖の割合は、４５％超、好ましくは５０％超、好ましくは５５％超、好ましくは６０％超、好ましくは６５％超、好ましくは７０％超、好ましくは７５％超、好ましくは８０％超、好ましくは８５％超、好ましくは９０％超である。
一態様において、好ましくはキシロオリゴ糖はキシランである。
好ましくは、キシランの重合度は少なくとも３０である。好ましくは、キシランは、重合度３５〜４０のキシラン、重合度４１〜５０のキシラン、重合度５１〜６０のキシラン、重合度６１〜７０のキシラン、及び重合度７１〜８０のキシランから選択される。
キシロオリゴ糖としては、トウモロコシ、サトウキビ、竹、綿実、及び木材から得ることができるキシランが挙げられる。好ましくは、キシロオリゴ糖は木材から得られる。キシランより低い重合度のキシロオリゴ糖は、キシランの酵素加水分解により調製してもよい。キシランの酵素加水分解は、キシラナーゼＥＣ ３．２．１．８を使用して実施してもよい。或いは、キシランの化学分解は、蒸気、鉱酸（例えば、リン酸）希釈溶液又はアルカリ性溶液を使用して予備生成してもよい。このような化学及び酵素工程は、連続して使用してもよい。キシロオリゴ糖の分離及び精製は、種々のプロセスによって実施してもよい。これらのプロセスとしては、酢酸などの揮発性不純物を除去する真空蒸着、及び有機溶媒を用いた溶媒抽出が挙げられる。所与のｄｐ範囲のキシロオリゴ糖の分離は、膜、さらには異なる濃度のエタノール性溶液を用いて実施した。吸着、イオン交換、及びクロマトグラフ分離技法を使用して、キシロオリゴ糖を精製してもよい。種々のキシロオリゴ糖が市販されている。
米国特許第６，９４２，７５４号明細書には、酵素を用いたリグノセルロースパルプからキシロオリゴ糖を調製する方法が開示されている。
ビフィドバクテリウム・ラクティス
いずれのビフィドバクテリウム・ラクティス株を使用してもよい。
好ましくは、１又は複数の生菌ビフィドバクテリウム・ラクティス株は、Ｂ．ラクティス（Ｂ．ｌａｃｔｉｓ）Ｂｌ−０４、Ｂ．ラクティスＢｉ−０７、Ｂ．ラクティス４２０、Ｂ．ラクティスＤＮ １７３ ０１０、Ｂ．ラクティスＨＮ０１９、Ｂ．ラクティスＢｂ−１２、Ｂ．ラクティスＤＲ１０、Ｂ．ラクティスＤＳＭ１０１４０、Ｂ．ラクティスＬＫＭ５１２、Ｂ．ラクティスＤＳＭ ２０４５１、及びそれらの混合物から選択されるが、これらに限定されない。
好ましくは、１又は複数の生菌ビフィドバクテリウム・ラクティス株は、Ｂ．ラクティスＢＩ−０４、Ｂ．ラクティスＢｉ−０７、Ｂ．ラクティス４２０、Ｂ．ラクティスＢｂ−１２、Ｂ．ラクティスＤＮ １７３ ０１０、Ｂ．ラクティスＨＮ０１９、及びそれらの混合物から選択される。
好ましくは、組成物が食品組成物であるとき、食品組成物は、１食(serving)当たり１×１０６〜１×１０１２コロニー形成単位（ＣＦＵ）のビフィドバクテリウム・ラクティス株を含む。好ましくは、食品組成物は、１食当たり１０７−１０１０ＣＦＵのビフィドバクテリウム・ラクティス株を含む。
経口摂取用の製品
別の態様において、本発明は、本明細書に記載されたように、組成物を含む経口摂取用の製品に関する。このような経口摂取用の製品としては、食糧、又は経口サプリメントを挙げることができる。本明細書に記載する組成物は、このような経口摂取用の製品の成分である。
好ましくは、経口摂取用の製品は、ドライ経口サプリメント、液体経口サプリメント、牛乳、ヨーグルト、チーズ、アイスクリーム、穀類で製造された製品、乳児用調製粉乳、粉末飲料、菓子、栄養バー、及び粉乳から選択される。好ましくは、ドライ経口サプリメントは錠剤又は丸剤である。好ましくは、穀類はミューズリである。
好ましくは、経口摂取用の製品は、１食又は１用量当たり２〜１０ｇのキシロオリゴ糖、好ましくは１食又は１用量当たり３〜９ｇのキシロオリゴ糖、好ましくは１食又は１用量当たり４〜８ｇのキシロオリゴ糖、好ましくは１食又は１用量当たり５〜７ｇのキシロオリゴ糖を含む。好ましくは、キシロオリゴ糖の上記用量は１日用量である。
好ましくは、経口摂取用の製品は、１食又は１用量当たり５ｇのキシロオリゴ糖を含む。
好ましくは、経口摂取用の製品は、１食又は１用量当たり１×１０６〜１×１０１２コロニー形成単位（ＣＦＵ）のビフィドバクテリウム・ラクティス株を含む。この範囲を下回る場合、その量のビフィドバクテリウム・ラクティスは、効率的ではなく、この範囲を上回る量のビフィドバクテリウム・ラクティスを使用することは、ヒトにとって大量すぎる経口摂取用の製品が必要になると考えられる。好ましくは、経口摂取用の製品は、１食又は１用量当たり１０７〜１０１０ＣＦＵのビフィドバクテリウム・ラクティス株を含む。好ましくは、上記用量は１日用量である。
好ましくは、経口摂取用の製品はヨーグルトである。好ましくは、ヨーグルトは、１食当たり１０６〜１０８ＣＦＵ／ｍｌのビフィドバクテリウム・ラクティス株を含む。
経口摂取用の製品は、さらに保存剤、安定剤、染料、酸化防止剤、懸濁剤、及び矯味剤から選択される成分を含んでもよい。保存剤としては、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが挙げられる。
薬学的組成物
一態様において、本明細書に記載する組成物は薬学的組成物であり、これは、さらに薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤を（それらの組合せを含めて）含む。
薬学的組成物は、ヒト及び動物の医薬としてヒト又は動物に使用してもよく、典型的には薬学的に許容される希釈剤、担体、又は賦形剤のいずれか１又は複数を含む。治療上使用するのに許容される担体又は希釈剤は、薬学技術分野で周知であり、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.（A. R. Gennaro edit. 1985）に記載されている。医薬用の担体、賦形剤、又は希釈剤の選択は、所期の投与経路及び標準薬学慣例に関連して選択することができる。薬学的組成物は、担体、賦形剤、若しくは希釈剤として、又はそれらに加えて、任意の適当な結合剤、滑沢剤、懸濁剤、コーティング剤、可溶化剤を含んでもよい。
キット
別の態様において、本発明は、キットであって、１又は複数の生菌ビフィドバクテリウム・ラクティス株を含む第１の容器と、糖成分を含む第２の容器とを備え、糖成分は重合度２〜１００のキシロオリゴ糖を含むキットを提供する。
したがって、本明細書に記載する組成物の成分は、キットの形で用いられてもよい。成分は、同時、連続、又は分離投与で用いられてもよい。キットの第１の容器は、組成物に関して本明細書に記載するビフィドバクテリウム・ラクティス株に関するさらなる特徴のいずれかをさらに含む１又は複数のビフィドバクテリウム・ラクティス株を含んでもよい。同様に、キットの第２の容器は、組成物に関して本明細書に記載する糖成分及びキシロオリゴ糖に関するさらなる特徴のいずれかをさらに含む糖成分を含んでもよい。
好ましくは、キットは、丸剤又はヨーグルト（これらに限定されない）に組み込まれたビフィドバクテリウム・ラクティス株を含む。
好ましくは、キットは、果汁、及び穀類で製造された製品（これらに限定されない）から選択される食糧に組み込まれたキシロオリゴ糖を含む。好ましくは、穀類はミューズリである。
好ましくは、キットは指示書も含む。これらの指示書は、キット成分の推奨投与方法又は順序に関する可能性がある。
使用
別の態様において、本発明は、本明細書に記載されたように、対象の腸でのビフィドバクテリウム・ラクティスの定着及び／又は活性を選択的に増大させる医薬品の製造における組成物又はキットの使用を提供する。
組成物又はキットは、本明細書に記載されたように、発酵食品中のビフィドバクテリウム・ラクティスのレベルを上昇させるのに使用してもよい。
組成物又はキットは、本明細書に記載されたように、対象の腸でのクロストリジウム・パーフィンジェンス（Clostridium perfingens）の定着を低減又は抑制する医薬品の製造において使用してもよい。
組成物又はキットは、本明細書に記載されたように、対象の腸でのサルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）の定着を低減又は抑制する医薬品の製造において使用してもよい。
組成物又はキットは、本明細書に記載されたように、対象の腸での腸管病原性大腸菌（enteropathogenic Escherichia coli）の定着を低減又は抑制する医薬品の製造において使用してもよい。
組成物は、本明細書に記載されたように、ドライ経口サプリメント、液体経口サプリメント、牛乳、ヨーグルト、チーズ、アイスクリーム、発酵穀類で製造された製品、調製粉乳、粉末飲料、菓子、栄養バー、及び粉乳から選択される経口摂取用の製品でも使用してよい。
組成物又はキットは、本明細書に記載されたように、アトピー性湿疹を軽減する医薬品の製造において使用してもよい。
組成物又はキットは、本明細書に記載されたように、下痢の治療用の医薬品の製造において使用してもよい。
組成物又はキットは、本明細書に記載されたように、免疫機能を向上させる医薬品の製造において使用してもよい。
組成物又はキットは、本明細書に記載されたように、腸機能を改善する医薬品の製造において使用してもよい。
方法
本明細書に記載されたように、組成物又はキットを対象に経口投与することによって、対象の腸でのビフィドバクテリウム・ラクティスの定着を選択的に増大させる方法。
本明細書に記載されたように、有効量の組成物又はキットを対象に経口投与することによって、対象の腸でのクロストリジウム・パーフィンジェンスの定着を低減又は抑制する方法。
本明細書に記載されたように、有効量の組成物又はキットを対象に経口投与することによって、対象の腸でのサルモネラ・ティフィムリウムの定着を低減又は抑制する方法。
本明細書に記載されたように、有効量の組成物又はキットを対象に経口投与することによって、対象の腸での大腸菌（Escherichia coli）の定着を低減又は抑制する方法。
本明細書に記載されたように、有効量の組成物又はキットを対象に経口投与することによって、対象におけるアトピー性湿疹を低減する方法。
本明細書に記載されたように、有効量の組成物又はキットを対象に経口投与することによって、対象における下痢を治療する方法。
本明細書に記載されたように、有効量の組成物又はキットを対象に経口投与することによって、対象における免疫機能を向上させる方法。
本明細書に記載されたように、有効量の組成物又はキットを対象に経口投与することによって、対象における腸機能を改善する方法。
好ましくは、対象は動物又はヒトである。
好ましくは、対象は哺乳類、魚、又は家禽である。
好ましくは、対象は哺乳類、好ましくはヒトである。
糖成分（ｂ）
糖成分（ｂ）は、６．５重量％未満の単糖、好ましくは６．０重量％未満の単糖、好ましくは５．５％未満の単糖、好ましくは５．０％未満の単糖、好ましくは４．５％未満の単糖、好ましくは４．０％未満の単糖、好ましくは３．５％未満の単糖、好ましくは３．０％未満の単糖、好ましくは２．５％未満の単糖、好ましくは２．０％未満の単糖、好ましくは１．５％未満の単糖、好ましくは１．０％未満の単糖、好ましくは０．５％未満の単糖を含有してもよい。
別の態様において、糖成分（ｂ）は、０重量％〜６．９重量％の単糖を含有する。糖成分（ｂ）は、好ましくは０〜５．０重量％の単糖、好ましくは０〜４．０重量％の単糖、好ましくは０〜３．０重量％の単糖、好ましくは０〜２．０重量％の単糖、好ましくは０〜１．０重量％の単糖を含有する。
別の態様において、糖成分（ｂ）は、単糖を実質的に含有しない。
次に、添付図を参照してほんの一例として、本発明を、さらに詳細に説明する。
一連のプレバイオティクス上でのビフィドバクテリウム・ラクティスＢｌ−０４の増殖曲線を示す図である。 一連のプレバイオティクス上でのビフィドバクテリウム・ラクティスＢｌ−０４の別の増殖曲線を示す図である。 増殖曲線下面積の計算方法を示す図である。 一連のプレバイオティクス上でのラクトバチルス・アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）の増殖曲線を示す図である。 一連のプレバイオティクス上でのラクトバチルス・アシドフィラスの別の増殖曲線を示す図である。 一連の単一糖類上でのビフィドバクテリウムの様々な株の細菌増殖速度を示す棒グラフである。 一連の単一糖類上でのビフィドバクテリウムの様々な株の細菌増殖速度を示す棒グラフである。 一連の単一糖類上での細菌の様々な株の細菌増殖速度を示す棒グラフである。 一連の単一糖類上での細菌の様々な株の細菌増殖速度を示す棒グラフである。 一連の単一糖類上での様々な病原体の増殖速度を示す棒グラフである。 一連の単一糖類上での様々な病原体の増殖速度を示す棒グラフである。 一連の単一糖類を用いたビフィドバクテリウムの結腸シミュレーションを示す棒グラフである。 一連の単一糖類を用いたビフィドバクテリウム・ラクティスの結腸シミュレーションを示す棒グラフである。 一連の単一糖類を用いたビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）の結腸シミュレーションを示す棒グラフである。 一連の単一糖類を用いたクロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）の結腸シミュレーションを示す棒グラフである。 一連の単一糖類を用いた全短鎖脂肪酸の結腸シミュレーションを示す棒グラフである。
次に、下記の実施例で、本発明をさらに詳細に説明する。
［実施例］
Longlive 041021, 95Pは、Shandong Longlive、Chinaから入手可能である。
RaftiloseP95は、Orafti、Belgiumから入手可能である。
α-D-グルコースは、Serva、Germanyから入手可能である。
de Man Rogosa Sharpe培地（ＭＲＳ）は、（LabM）から入手可能である。
MRS 2は、グルコースを含まないMRS培地である。
トリプシンダイズブロス培地（ＴＳＢ）は、Becton Dickinson、Franceから入手可能である。
ビフィドメディウム（Bifidomedium）（Bif58）の処方は、DSM、Deutsche Sammlung von Mikroorganismenから入手可能である。
ビフィドバクテリウム・ラクティスBl-07は、Danisco A/Sから入手可能である。
ビフィドバクテリウム・ラクティスBl-04は、Danisco A/Sから入手可能である。
ビフィドバクテリウム・ラクティスHN019（Howaru）は、Danisco A/Sから入手可能である。
ビフィドバクテリウム・ラクティスDN 173 010は、Groupe Danoneから入手可能である。
ビフィドバクテリウム・ラクティスBb-12は、Christian Hansen A/Sから入手可能である。
ビフィドバクテリウム・ラクティス420は、Danisco A/Sから入手可能である。
ビフィドバクテリウム・ブレーベBb-03は、Danisco A/Sから入手可能である。
ビフィドバクテリウム・ロンガムKC-1は、Danisco A/Sから入手可能である。
ビフィドバクテリウム・ロンガム913（Wisby）は、Danisco A/Sから入手可能である。
ラクトバチルス・アシドフィラスNCFMは、Danisco A/Sから入手可能である。
ラクトバチルス・ブルガリカス（Lactobacillus bulgaricus）1260は、Danisco A/Sから入手可能である。
ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）Lpc-37は、Danisco A/Sから入手可能である。
ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）HN001（Howaru）は、Danisco A/Sから入手可能である。
ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）715は、Danisco A/Sから入手可能である。
実験で使用した他の微生物は、菌株保存機関から入手可能である。
ＡＴＣＣ＝American Type Culture Collection
ＤＳＭ＝Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
ＣＣＵＧ＝Culture Collection、University of Goteborg、Sweden
ＥＥＬＡ＝Finnish Food Safety Authority
プレバイオティクス候補及びそれらの組成物を表１に示す。
Ａｂｂｒ．＝略語、Ｓｔｅｒ．＝滅菌手順、Ｆ＝濾過、ＵＶ＝紫外線。
Figure 0005689601
プレバイオティクスを１０％濃縮保存溶液に溶解し、糖鎖長に応じて濾過（０．２μｍ Minisart NML、Sartorius AG、Germany）又は紫外線（３０秒、１２０ｍＪ／ｃｍ２）（XL-1500 UV Crosslinker、Spectronics Corporation、ＵＳ）によって無菌化し、＋４℃、好気状態で貯蔵した。培養で使用した被検菌株及びそれらの増殖培地（括弧内の培地は、第１の前培養で使用した培地である）を表２に示す。ビフィドバクテリウム、乳酸桿菌、及びストレプトコッカス・サーモフィルス（Strep. thermophilus）はＭＲＳ培地中で増殖させ、他の細菌類はＴＳＢ中で増殖させた。
すべての培養物を、ビーズバイアル（Technical Service Consultants社製、ＵＫ）中−７０℃で貯蔵した。継代培養では、細菌を２つのビーズからそれらの適切な増殖培地５ｍｌ（表２）に接種した。前培養物は、凍結保存物から、適切な媒体中、３７℃、嫌気的条件下で混濁するまで２４〜４８時間増殖させた。次いで、細菌をさらにＭＲＳ又はＴＳＢ（表２）に接種し、さらに３７℃で２４時間インキュベートした。これらの懸濁液を増殖密度測定に使用した。
Figure 0005689601
プレバイオティクス上でのプロバイオティクスのインビトロ増殖
単一糖上での細菌増殖速度を決定する一般方法
マルチウェルプレート中の液体試料の吸光度の動的変化を記録する自動オンライン濁度計（Bioscreen C、Labsystems社製、Finland）で、嫌気性増殖を測定した。プレートの各ウェルに、２０μｌの１０ｗ／ｖ％プレバイオティクス溶液を好気的状態で充填し、続いて適切な培地中１ｖ／ｖ％定常期初期試験細菌１８０μｌを嫌気的に添加した。対照ウェルには、２００μｌの１ｖ／ｖ％定常期初期試験細菌又は当該の細菌を培養するのに使用した同じ培地しか含まれなかった。最終プレバイオティクス濃度は１ｗ／ｖ％であった。
すべての株を３７℃で２４時間インキュベートし、吸光度（ＯＤ ６００ｎｍ）を３０分ごとに測定した。各測定の前に、プレートを１０秒間振盪した。各株と糖の組合せについて、異なる２組の実験を５回反復して行った。
単一糖源上の細菌増殖の速度は、ソフトウェア（BioLink、Version 5.07、Labsystems社製、ＵＫ）によって自動的に処理された吸光度の結果から増殖曲線（２４時間）下面積を算出することによって確定した。同様の分析がJaskari et al. Appl. Microbiol Biotechnol 49 (1998) 175-181によって行われた。各ウェルについて、連続した時点で測定された吸光度値から作製された対称的な長方形を用いて、増殖曲線下面積を算出した。これを図１に示す。
この長方形の面積の半分は、連続した時点間の増殖曲線下面積であり、これは次式で書き表すことができる。
Figure 0005689601
 （１）
測定期間（２４時間、３０分ごとに測定）の面積をすべて合計して、各ウェルの増殖曲線について増殖曲線下面積を得た。対照培地（糖類を添加していない基本増殖培地）での増殖を、ベースライン増殖（ａｂｓ０）の結果から差し引いた。平均の標準誤差（ＳＥ）を使用して、各細菌とプレバイオティクスの組合せの並列結果間のバラツキを算出した。１０個の並列ウェルについて増殖曲線下面積の平均を使用して、ＳＥを以下の通り算出した。
Figure 0005689601
 （２）
式中、ｎ＝並列対象の数
Figure 0005689601
式中、ｎ＝並列対象の数
χｉ＝対象ｉの値
Figure 0005689601
ビフィドバクテリウム・ラクティスＢｌ−０４の増殖
一般方法を用いて、一連のプロバイオティクス上でのビフィドバクテリウム・ラクティスＢｌ−０４の増殖を実施した。これらについての結果を表３に示し、このデータから得られた増殖曲線を図１に示す。
Figure 0005689601
Figure 0005689601
一連のプロバイオティクス上でのビフィドバクテリウム・ラクティスＢｌ−０４の増殖について、一般方法を用いてさらに試験を実施した。このさらなる試験の結果を表４に示し、このデータから得られた増殖曲線を図２に示す。
Figure 0005689601
Figure 0005689601
他のＢ．ラクティス株についても同様の増殖曲線が得られた。
ラクトバチルス・アシドフィラスの増殖
一般方法を用いて、一連のプロバイオティクス上でのラクトバチルス・アシドフィラスの増殖が実施されたと確定するために、２つの実験を行った。実験１の結果を図４に示し、実験２の結果を図５に示す。
これらの曲線の比較から、キシロオリゴ糖はＢ．ラクティスの増殖をはるかによく支援することが理解できる。一方、フルクトオリゴ糖は両方の増殖を支援する。したがって、キシロオリゴ糖の方が選択性が高い。
ビフィドバクテリウム及び単一糖類
一連の単一糖類上でのビフィドバクテリウムの様々な株の細菌増殖速度を、一般方法に従って確定した。培地を含まない増殖曲線下平均面積は、表５及び図６に示す通りであった。
Figure 0005689601
一般方法に従って、さらに実験を行って、一連の単一糖類上でのビフィドバクテリウムのより広範囲な株の細菌増殖速度を確定した。培地を含まない増殖曲線下平均面積は、表６及び図７に示す通りであった。
Figure 0005689601
Ｂ．ラクティスはすべて、キシロオリゴ糖Longlive、ｄｐ２、及びｄｐ２〜１０を大いに利用した。大部分の被検ビフィドバクテリウムは、グルコース上と同様のレベル、又ははるかに高いレベルで、ＦＯＳ上で増殖することができ、したがってＸＯＳはＦＯＳより選択性が高い。
乳酸桿菌及びＳ．サーモフィルスと単一糖類
一連の単一糖類を用いた乳酸桿菌の様々な株及びＳ．サーモフィルスの細菌増殖の速度を測定するために２つの実験を行った。一般方法に従って、細菌増殖速度を確定した。第１の実験では、培地を含まない増殖曲線下平均面積は、表７及び図８に示す通りであった。
Figure 0005689601
第２の実験では、培地を含まない増殖曲線下平均面積は、表８及び図９に示す通りであった。
Figure 0005689601
これらの細菌はすべて、グルコースで発酵したが、キシロオリゴ糖では優れた程度には発酵しなかった。ＦＯＳは、ラクトバチルス・アシドフィラスＮＣＦＭ及びパラカゼイＬｐｃ−３７の増殖を大いに向上させた。
病原体及び単一糖類
一連の単一糖類を用いた結腸由来の様々な病原体及び他の微生物の増殖速度を測定するために、２つの実験を行った。一般方法に従って、増殖速度を確定した。第１の実験では、培地を含まない増殖曲線下平均面積は、表９及び図１０に示す通りであった。
Figure 0005689601
第２の実験では、培地を含まない増殖曲線下平均面積は、表１０及び図１１に示す通りであった。
Figure 0005689601
キシロオリゴ糖はＦＯＳ又はグルコースより、これらの病原体に対して低い増殖速度を発現した。ＦＯＳは、ユウバクテリウム・リモサム（Eubacterium limosum）、バクテロイデス・ブルガータス（Bacteroides vulgatus）、及びバクテロイデス・フラギリス、並びにスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）の増殖を正の対照であるグルコースと同じレベルに向上させた。潜在的に病原性の微生物、大腸菌、クロストリジウム・パーフリンジェンス、サルモネラ・ティフィムリウム、並びにスタフィロコッカス・アウレウス及びスタフィロコッカス・エピデルミスの増殖は、糖を含まないＭＲＳ又はＴＳＢ媒体上での増殖に比べて、抑制さえ認められた。
結腸シミュレーション
４つの並列ユニットＶ１〜Ｖ４からなる半連続４チャネル結腸シミュレーターモデルを使用して、いくつかの結腸シミュレーションを行った。ユニットの状態を、盲腸／上行結腸を表すＶ１から、遠位結腸／直腸を表すＶ４までヒト結腸の異なる区画を表すように調整した。結腸シミュレーションは、Makivuokko, H., et al. Nutr. Cancer, 52, (2005), 94-104;及びMakivuokko, H., et al. Biosci. Biotechnol. Biochem., 70, (2006), 2056-2063に記載されているように行った。
一般方法
第１の容器（Ｖ１）に供給する培地容器から最後の容器（Ｖ４）まで、シミュレーターユニットは、容器に無酸素性Ｎ２を供給することによって嫌気的に維持した。４段階ユニットはそれぞれ、無菌シミュレーター培地中５０ｍｌに溶解した適切な糖１ｇを含み（Macfarlane, G. T., et al. Microb. Ecol., 35, (1998), 180-187を参照のこと）、嫌気性キャビネット内部のガラス血清瓶に封止した。対照シミュレーションユニットでは、５０ｍｌの無菌シミュレーター培地を同様にガラス血清瓶に封止した。シミュレーターユニットのすべての容器に、適切な細菌の試料を嫌気的に接種した。
結腸シミュレーション−ビフィドバクテリウム
一連の単一糖類を用いたビフィドバクテリウムの結腸シミュレーションの平均値結果（平均値のプラス又はマイナス標準誤差、＋／−ＳＥ）を図１２に示す。
結腸シミュレーション−Ｂ．ラクティス
一連の単一糖類を用いたビフィドバクテリウム・ラクティスの結腸シミュレーションの結果を図１３に示す。
結腸シミュレーション−Ｂ．ロングム
一連の単一糖類を用いたビフィドバクテリウム・ロングムの結腸シミュレーションの結果を図１４に示す。
結腸シミュレーション−Ｃ．パーフリンゲンス
一連の単一糖類を用いたクロストリジウム・パーフリンゲンスの結腸シミュレーションの結果を図１５に示す。
結腸シミュレーション−短鎖脂肪酸
一連の単一糖類を用いた全短鎖脂肪酸の結腸シミュレーションの結果を図１６に示す。全短鎖脂肪酸という用語は、Ｃ１−Ｃ５鎖脂肪酸、特に酢酸、プロピオン酸、及び酪酸を指す。
結論
これらの結腸シミュレーションから、キシロオリゴ糖種は、Ｂ．ロングムやＣｌ．パーフリンゲンスなどの他の種よりビフィドバクテリウム・ラクティスに対してはるかに高い選択性を示すことが理解できる。
１０６〜１０８ＣＦＵ／ｍｌのＢ．ラクティスＨＮ００１９及び１食当たり５ｇのキシロオリゴ糖（ｄｐ２〜１０）を含有するヨーグルト。標準発酵過程の後に、キシロオリゴ糖を添加した。
この実施例は、本明細書に記載されたように任意のＢ．ラクティス株又は任意のキシロオリゴ糖試料を使用するように変えてもよい。さらに、キシロオリゴ糖の量は、１食当たり２〜１０ｇを使用するように変えてもよい。
１０７〜１０１０ＣＦＵのＢ．ラクティスＨＮ００１９及び１食当たり５ｇのキシロオリゴ糖（ｄｐ２〜１０）を含有する栄養バー。
この実施例は、本明細書に記載されたように任意のＢ．ラクティス株又は任意のキシロオリゴ糖試料を使用するように変えてもよい。さらに、キシロオリゴ糖の量は、１食当たり２〜１０ｇを使用するように変えてもよい。
１食当たり１０７〜１０１０ＣＦＵのＢ．ラクティスＨＮ００１９株及び１食当たり５ｇのキシロオリゴ糖（ｄｐ２〜１０）を含有する粉末飲料。但し、水分活性は０．５未満に維持する。
この実施例は、本明細書に記載されたように任意のＢ．ラクティス株又は任意のキシロオリゴ糖試料を使用するように変えてもよい。さらに、キシロオリゴ糖の量は、１食当たり２〜１０ｇを使用するように変えてもよい。
１食当たり１０７〜１０１０ＣＦＵのＢ．ラクティスＨＮ００１９株及び１食当たり５ｇのキシロオリゴ糖（ｄｐ２〜１０）を含有する調製粉乳。但し、水分活性は０．５未満に維持する。
この実施例は、本明細書に記載されたように任意のＢ．ラクティス株又は任意のキシロオリゴ糖試料を使用するように変えてもよい。さらに、キシロオリゴ糖の量は、１食当たり２〜１０ｇを使用するように変えてもよい。
１食当たり１０７〜１０１０ＣＦＵのＢ．ラクティスＨＮ００１９株及び１食当たり５ｇのキシロオリゴ糖（ｄｐ２〜１０）を含有する粉乳。キシロオリゴ糖は、スプレー乾燥する前に溶液として添加される。
この実施例は、本明細書に記載されたように任意のＢ．ラクティス株又は任意のキシロオリゴ糖試料を使用するように変えてもよい。さらに、キシロオリゴ糖の量は、１食当たり２〜１０ｇを使用するように変えてもよい。
１食当たり１０７〜１０１０ＣＦＵのＢ．ラクティスＨＮ００１９株及び１食当たり５ｇのキシロオリゴ糖（ｄｐ２〜１０）を含有する粉乳。キシロオリゴ糖は、スプレー乾燥した後に添加される。
この実施例は、本明細書に記載されたように任意のＢ．ラクティス株又は任意のキシロオリゴ糖試料を使用するように変えてもよい。さらに、キシロオリゴ糖の量は、１食当たり２〜１０ｇを使用するように変えてもよい。
上記の明細書に記載された刊行物はすべて、参照により本明細書に組み込まれる。記載された本発明の方法及びシステムの様々な修正及び変形は、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本発明を特定の好ましい実施形態に関連して説明してきたが、特許請求される本発明は、このような特定の実施形態に不当に限定されるべきでないと理解されたい。実際、本発明を実施するための記載されたモードの様々な修正は、化学又は関連分野の技術者に明らかであり、次の特許請求の範囲内に入るよう意図されている。

Claims (18)

  1. （ａ）１又は複数の生菌ビフィドバクテリウム・ラクティス株と、
    （ｂ）糖成分と
    を含み、前記糖成分が、重合度２〜１０のキシロオリゴ糖を含み、
    糖成分（ｂ）における重合度３のキシロオリゴ糖の割合が、少なくとも１０％である組成物であって、１０７〜１０１０ＣＦＵのビフィドバクテリウム・ラクティス当たり２〜１０ｇのキシロオリゴ糖を含む、ビフィドバクテリウム・ラクティス株の選択的増殖促進用組成物。
  2. 糖成分（ｂ）における重合度２のキシロオリゴ糖の割合が、少なくとも５０％である、請求項１に記載の組成物。
  3. 糖成分（ｂ）における重合度２のキシロオリゴ糖の割合が、少なくとも７０％である、請求項１に記載の組成物。
  4. 糖成分（ｂ）における重合度が少なくとも４であるキシロオリゴ糖の割合が、少なくとも３０％である、請求項１に記載の組成物。
  5. 糖成分（ｂ）における重合度が少なくとも５であるキシロオリゴ糖の割合が、５０％超である、請求項１に記載の組成物。
  6. キシロオリゴ糖がキシランである、請求項１に記載の組成物。
  7. １又は複数の生菌ビフィドバクテリウム・ラクティス株が、Ｂ．ラクティスＢｌ−０４、Ｂ．ラクティスＢｉ−０７、Ｂ．ラクティス４２０、Ｂ．ラクティスＤＮ １７３ ０１０、Ｂ．ラクティスＨＮ０１９、Ｂ．ラクティスＢｂ−１２、Ｂ．ラクティスＤＳＭ１０１４０、及びそれらの混合物から選択される、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
  8. 食品組成物である、請求項１〜７のいずれかに記載の組成物。
  9. 食品組成物が、１食当たり１×１０６〜１×１０１２コロニー形成単位のビフィドバクテリウム・ラクティス株を含む、請求項８に記載の組成物。
  10. 請求項１〜９のいずれかに記載の組成物を含む経口摂取用の製品であって、ドライ経口サプリメント、液体経口サプリメント、牛乳、ヨーグルト、チーズ、アイスクリーム、穀類で製造された製品、乳児用調製粉乳、粉末飲料、菓子、栄養バー、及び粉乳から選択される製品。
  11. １又は複数の生菌ビフィドバクテリウム・ラクティス株を含む第１の容器と、
    糖成分を含む第２の容器とを備え、前記糖成分が重合度２〜１０のキシロオリゴ糖を含み、前記糖成分における重合度３のキシロオリゴ糖の割合が、少なくとも１０％であり、１０７〜１０１０ＣＦＵのビフィドバクテリウム・ラクティス当たり２〜１０ｇのキシロオリゴ糖を含むキット。
  12. ビフィドバクテリウム・ラクティス株が、丸剤又はヨーグルトに組み込まれている、請求項１１に記載のキット。
  13. キシロオリゴ糖が、果汁、及び穀類で製造された製品から選択される食糧に組み込まれている、請求項１１又は１２に記載のキット。
  14. 対象の腸でのビフィドバクテリウム・ラクティスの定着及び／又は活性を選択的に増強させる医薬品の製造における、請求項１〜９のいずれかに記載の組成物、又は請求項１１〜１３のいずれかに記載のキットの使用。
  15. 対象の腸でのクロストリジウム・パーフィンジェンスの定着を低減又は抑制する医薬品の製造における、請求項１〜９のいずれかに記載の組成物、又は請求項１１〜１３のいずれかに記載のキットの使用。
  16. 発酵食品中のビフィドバクテリウム・ラクティスのレベルを上昇させる医薬品の製造における、請求項１〜９のいずれかに記載の組成物、又は請求項１１〜１３のいずれかに記載のキットの使用。
  17. 下痢の治療用の医薬品の製造における、請求項１〜９のいずれかに記載の組成物、又は請求項１１〜１３のいずれかに記載のキットの使用。
  18. 腸機能を改善する医薬品の製造における、請求項１〜９のいずれかに記載の組成物、又は請求項１１〜１３のいずれかに記載のキットの使用。
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