JP5688747B2 - スクリーニング法 - Google Patents
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Description
Leeら、2001 Williamsonら、2002 Shiraziら、1993 Scalesら、2002 Singhら、1995 a, b Ghoshalら、1999 Goedertら、(1989) EMBO J. 1989 Feb; 8(2): 393-9. Cloning and sequencing of the cDNA encoding an isoform of microtubule-associated protein tau containing four tandem repeats: differential expression of tau protein mRNAs in human brain. Goedert M, Spillantini MG, Potier MC, Ulrich J, Crowther RA Goedert M, Jakes R. (1990) Expression of separate isoforms of human tau protein: correlation with the tau pattern in brain and effects on tubulin polymerization. EMBO J., 9, 4225-30 J Biol Chem. 1993 Mar 25; 268 (9): 6394-401. Molecular cloning, expression, and characterization of a 49-kilodalton casein kinase I isoform from rat testis. Graves PR, Haas DW, Hagedorn CH, DePaoli-Roach AA, Roach PJ. Altschulら、(1990) J. Mol. Diol. 215: 403〜10 Ausubel, Short Protocols in Molecular Biology, 1992 Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 Sambrookら、1989 Armitageら、1992, Nature 357: 80-82
(a)少なくとも1種の候補物質、本明細書に記載のタウタンパク質、およびタウタンパク質をリン酸化し得るキナーゼを、キナーゼが候補物質の不在下でタウタンパク質の部位をリン酸化し得る条件下で接触させるステップと、
(b)候補物質が、タウタンパク質の1個または複数の部位でタウタンパク質のリン酸化を阻害するか否か、場合によってはどの程度阻害するかを決定するステップと、
(c)1個または複数の前記部位でタウタンパク質のリン酸化を阻害する候補物質を選択するステップと
を含む方法を提供する。
(a)少なくとも1種の候補物質、本明細書に定義のタウタンパク質、およびタウタンパク質を脱リン酸化し得るホスファターゼを、ホスファターゼが候補物質の不在下でタウタンパク質の部位を脱リン酸化し得る条件下で接触させるステップと、
(b)候補物質が、タウタンパク質の1個または複数の部位でタウタンパク質の脱リン酸化を促進するか否か、場合によってはどの程度促進するかを決定するステップと、
(c)1個または複数の前記部位でタウタンパク質の脱リン酸化を促進する候補物質を選択するステップと
を含む方法を提供する。
(a)少なくとも1種の候補物質、本明細書に定義したタウタンパク質、およびカゼインキナーゼ1を、カゼインキナーゼ1が候補物質の不在下でタウタンパク質の部位をリン酸化し得る条件下で接触させるステップと、
(b)候補物質が、カゼインキナーゼ1によるタウタンパク質の1個または複数の部位でタウタンパク質のリン酸化を阻害するか否か、場合によってはどの程度阻害するかを決定するステップと、
(c)1個つまたは複数の前記部位でタウタンパク質のリン酸化を阻害する候補物質を選択するステップと
を含む方法を提供する。
(a)少なくとも1種の候補物質、本明細書に定義したタウタンパク質、カゼインキナーゼ1(CK1)、プロテインキナーゼA(PKA)およびグリコーゲン合成酵素キナーゼ3β(GSK-3β)を、キナーゼが候補物質の不在下でタウタンパク質の部位をリン酸化し得る条件下で接触させるステップと、
(b)候補物質が、キナーゼによるタウタンパク質の1個または複数の部位でのタウタンパク質のリン酸化を阻害するか否か、場合によってはどの程度阻害するかを決定するステップと、
(c)1個または複数の前記部位でタウタンパク質のリン酸化を阻害する候補物質を選択するステップと
を含む方法を提供する。
表1には、本発明に至る研究で発見された新規部位と、それらの部位で作用し得るキナーゼをまとめている。表2および表3は、このデータをより詳細に示したものである。
本明細書に記載したアッセイおよびアッセイ方法は、野生型タウタンパク質もしくは完全長タウタンパク質、キナーゼもしくはホスファターゼ、またはそれらの断片、活性部分もしくは誘導体を用いることができる。タウタンパク質の場合、本アッセイで用いられる材料は、上述のように非リン酸化され得るか、あるいは部分的にリン酸化され得る。
新しい薬剤の同定に至る薬剤探索は、主要化合物が発見された前後に、非常に多くの候補物質をスクリーニングすることを含み得ることはよく知られている。これは、薬学研究に非常に経費がかかり、かつ時間を要する要因の1つである。スクリーニング工程を補助する手段は、注目に値する商業上の重要性と有用性を有しているはずである。
AD脳から単離したタウタンパク質内の新規リン酸化部位を見出すために、LC/MS/MS系の方法を用いた。最初に、ヒトのAD脳材料の熱安定性調製物からいわゆるPHF-タウを抽出し、次いでさらに、イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。SDS-PAGEを用いて単離し、次いで、ホスホペプチドマッピングを試みた。クーマシー染色バンドを切り出し、還元し、アルキル化し、トリプシン、キモトリプシンおよびエンドプロテアーゼAsp-Nなどの一連のプロテアーゼを用いて酵素的に消化した。次いで、得られたペプチド混合物は、200nl/分の流速でアセトニトリル勾配を用いて溶出されるペプチドを入れた75ミクロンID PepMap逆相カラムを用いて得られるペプチド分離物を用いてQ-TOFミクロ装置を使用してLC/MS/MSにより分析される。
薬剤開発では、化合物が提示した標的に対して効果を有するか否かを示すための簡単な読み取りを備えた迅速なハイスループットアッセイを開発することが望まれている。キナーゼなどの酵素機能を阻害する化合物の場合、改変のレベルを容易に検出し得る方法で、酵素により改変される標的酵素に対する人工的基質を開発することは可能である。阻害化合物の存在において、その基質は改変されず、かつそれは容易に検出することができる。
他の候補阻害剤化合物は、ポリペプチドまたはペプチド断片の三次元構造のモデル化に基づき、かつ合理的な薬剤設計を用いて、特定の分子形状、大きさおよび電荷特性を有する有望な阻害剤化合物を得ることができる。
タウタンパク質のリン酸化または脱リン酸化を調節または作用する物質の同定後、さらにその物質について研究することができる。さらに、その物質を製造し、かつ/または調製(すなわち、薬品、医薬組成物または薬剤などの組成物の製造または製剤化)に用いることができる。これらは個体に投与することができる。
質量分析
データ収集
SDS-PAGEの後、PHF-タウに関係のあるゲルバンドを切り出し、還元し、アルキル化し、トリプシンで消化した。ペプチドは、一連のアセトニトリルおよび水溶液洗浄によりゲル断片から抽出した。抽出物を最初の上清とともにプールし、凍結乾燥した。次いで、各試料を50mMの重炭酸アンモニウム6ml中に再懸濁し、LC/MS/MSにより分析した。クロマトグラフィーによる分離は、Ultimate LC系(Dionex, UK)を用いて実施した。ペプチドは、75mm径C18 PepMapカラムの逆相クロマトグラフィーにより分離した。0.05%ギ酸に溶解したアセトニトリルの勾配を送達して、200nl/分の流速でペプチドを溶出した。ペプチドは、Q-Tofmicro (Micromass,UK)に適したZスプレー源を用いて、エレクトロスプレーイオン化によりイオン化した。この装置は、衝突誘起断片形成によるシークエンシングにおいて、自動切替型でそれらの輝度に基づいた前駆イオンを選択して運転するように設定した。
質量スペクトルデータはピークリストに加工され、Mascotソフトウエア(Matrix Science, UK)を用いて、タウ-6の完全長配列(アミノ酸441個;分子量45847)に対して探索した。リン酸化ペプチドは、探索するパラメーター内の可変的な改変としてリン酸塩を選択することにより同定した。セリン、スレオニンおよびチロシンのリン酸化をすべて検討した。各ペプチド内の改変の正確な位置は、産生された断片イオンのパターンによって決定した(さらなる説明については下記を参照されたい)。
決定的な証拠を取得し、リン酸化の正確な部位を決定すること目的として、逆相クロマトグラフィーによりペプチドを単離し、タンデム型MS/MSによりシークエンスした。これらの実験では、各ホスホペプチドに関係のある前駆イオンを個別に選択し、それを衡突解離(CID)に供した。そのようにして得られた断片イオンはホスホペプチドの配列を示し、改変の部位はその関連断片イオンの分子量によって決定される。反対に、特定のホスホペプチド内のリン酸化の他の可能性のある部位は、MS/MSスペクトル内の他の断片イオンの存在により除外することもできる。
一対のらせん状フィラメント(PHF)タウは、Hangerら(1998)に記載されているようにしてアルツハイマー病脳から精製した。簡単に説明すれば、脳組織をホモゲナイズし、不溶性PHF-タウを分画遠心法により回収した。グアニジン中に可溶化した後、再生バッファーに対して透析し、PHF-タウを陰イオン交換および逆相クロマトグラフィーにより精製した。
最大タウアイソフォーム(2N4R)を発現するプラスミドを用いて、以前Mulotら(1994)に記載されているようにして組換え型ヒトタウを調製し精製した。簡単に説明すれば、2N4Rタウを発現する細菌細胞溶解物を加熱し、遠心分離にかけ非耐熱性タンパク質を除去した。硫酸アンモニウムで上清を分画し、沈殿した原料を可溶化し、バッファーに透析した後、陽イオン交換クロマトグラフィーにかけた。NaClでタンパク質を溶出し、タウを含有する画分をプールし、重炭酸アンモニウムに対して透析した後、凍結乾燥した。
30℃で6時間、3mMのATPの存在下で、組換え型ヒトタウ(40μg/ml)を、各所定濃度で、67U/mlカゼインキナーゼ1(CK1)、67U/mlカゼインキナーゼ2(CK2)、167U/mlサイクリックAMP依存性プロテインキナーゼ(PKA)、67U/mlグリコーゲン合成酵素-3β(GSK-3β)、または4種類のキナーゼすべての組合せとインキュベートした。各キナーゼは、New England Biolabsから精製組換え形態で入手した。
PHF-タウまたはインビトロにおけるリン酸化タウタンパク質を10%(wt/vol)ポリアクリルアミドゲル上で単離し、コロイド性クーマシーブルーGで染色した。タウに対応するタンパク質バンドを切り出し、カルバミドメチル化し、タンパク分解酵素(トリプシンまたはAsp-N)で消化した。一連のアセトニトリルおよび水溶液洗浄によりゲル断片からペプチドを抽出し、乾燥させ、50mMの重炭酸アンモニウム中に再懸濁した。
ラットおよびヒトの皮質ニューロンを1〜10分間、Aβペプチド(25〜35)またはリバースAβペプチド(35〜25)で処理した。ホスホチロシンを含有するタンパク質を免疫沈降させ、SDS-PAGEにより単離した。ニューロン培養物および免疫沈降物の熱安定性抽出物のウェスタンブロットをタウに対する抗体で探索した。
PHF-タウで発見した新規部位
今日の文献では、PHF-タウ中に、直接的手段により同定された25個の周知のリン酸化部位(すべてセリンまたはスレオニンである)が報告されている(Hangerら、1998)。さらに、抗体の反応性のみによって同定された2〜3個の部位がある。本発明者らは、PHF-タウにさらに12個のリン酸化部位を見出したが、そのうちの1個はチロシン残基(tyr394)であり、部位の合計は37個になった。新規部位の4個はこれまでに報告されている部位よりもタウ中のアミノ末端にあり、また3個の部位はこれまでに発見されたものよりもカルボキシ末端である。12個の新規部位のうち、4個はタウの選択的スプライス領域中にあり、したがって、特異的タウアイソフォーム中にのみ存在し、これまで同定されたすべてのPHF-タウリン酸化部位は、すべてのタウアイソフォーム中に存在する。PHF-タウ中の12個の新規部位の1個だけ(thr414またはser416のいずれか)が正常な脳由来のタウで検出される(ser416)。
表1も参照されたい。
本発明者らは、Aβペプチドによるニューロンの治療が、タウを含有するニューロンタンパク質のチロシンリン酸化を増加させることを見出した。このAβによって誘導されるホスホチロシンの増加は、タウにおける基本レベルの約4倍であった。
インビトロにおけるPHF-タウリン酸化を再現するために、他の個別のリン酸化部位とプロテインキナーゼの組合せを同定する。タウオパシーに関与したキナーゼとしては、GSK-3α、ERK1およびERK2、cdk5、cdc2キナーゼ、JNK、SAPキナーゼファミリーのいくつかのメンバー(1γ、2a、2b、3、4)、p38MAPキナーゼ、カルモデュリン依存性キナーゼ、PKC、MARK、PKN、PKB、TTK、DYRK、Rhoキナーゼ、およびホスホリラーゼキナーゼが挙げられる。
Claims (16)
- (a)タウタンパク質の1個または複数の部位でのリン酸化においてカゼインキナーゼ1の活性を阻害可能な候補化合物、または(b)カゼインキナーゼ1に結合して、1個または複数の部位でのタウタンパク質との相互作用を阻害可能な候補化合物のスクリーニング方法であって、
カゼインキナーゼ1が候補化合物の不在下でタウタンパク質の前記部位をリン酸化することができる条件下で、少なくとも1種の候補化合物、タウタンパク質またはその断片、およびカゼインキナーゼ1を接触させ、前記候補化合物が、特徴(a)または(b)を有するか否か、場合によってはどの程度有するかを決定するステップを含み、
前記1個または複数の部位がタウタンパク質の(S46/T50)、S113、S131、T149、T169、S184、S208、(S210/T212)、S214、S237、S238、S241、S258、S262、T263、S285、S289、S305、S341、S352、S356、T361、T373、T386、(S412/S413/T414)、S433、およびS435からなる群から選択される、方法。 - (a)カゼインキナーゼ1が候補化合物の不在下でタウタンパク質の前記部位をリン酸化することができる条件下で、少なくとも1種の候補化合物、タウタンパク質またはその断片、およびカゼインキナーゼ1を接触させるステップと、
(b)候補化合物が、カゼインキナーゼ1によるタウタンパク質のリン酸化を阻害するか否か、場合によってはどの程度リン酸化を阻害するかを決定するステップと、
(c)1個または複数の部位でタウタンパク質またはその断片のリン酸化を阻害する候補化合物を選択するステップと
を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記カゼインキナーゼ1が、配列番号1に包含されるアミノ酸1からアミノ酸428に記載のアミノ酸配列を有する完全長カゼインキナーゼ1の断片または誘導体である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記カゼインキナーゼ1が、配列番号1に包含されるアミノ酸1からアミノ酸428に記載のアミノ酸配列を有する完全長カゼインキナーゼ1と95%を超える配列同一性を有する、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タウタンパク質が一対のらせん状フィラメントタウである、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タウタンパク質が、配列番号2に包含されるアミノ酸1からアミノ酸441に記載のアミノ酸配列を有する完全長タウタンパク質の断片または誘導体である、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タウタンパク質が、配列番号2に包含されるアミノ酸1からアミノ酸441に記載のアミノ酸配列を有する完全長タウタンパク質と95%を超える配列同一性を有する、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タウタンパク質の前記部位がS262および/またはS356から選択される、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タウタンパク質の1個または複数の部位が、S113、S258、S289、S433、およびS435からなる群から選択される、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記スクリーニングが、カゼインキナーゼ1および他のキナーゼを含むキナーゼの組合せと候補化合物との接触の効果を決定することを含み、カゼインキナーゼ1および他のキナーゼが、同時にまたは連続して使用されるものである、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記キナーゼの組合せが、カゼインキナーゼ2(CK2)、プロテインキナーゼA(PKA)、グリコーゲン合成酵素キナーゼ3α(GSK-3α)またはグリコーゲン合成酵素キナーゼ3β(GSK-3β)の1種または複数と組み合わせたカゼインキナーゼ1(CK1)を含む、請求項10に記載の方法。
- 前記キナーゼの組合せが、PKAおよびGSK-3βと組み合わせたカゼインキナーゼ1(CK1)を含む、請求項10に記載の方法。
- タウタンパク質の1個または複数の部位におけるリン酸化の有無または程度を決定する前記ステップが、リン酸化された部位と非リン酸化部位とを区別可能な質量分光法または部位特異的認識物質を使用する、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記部位特異的認識物質がモノクローナル抗体である、請求項13に記載の方法。
- 前記スクリーニングが、複数の基質が固定されている固相を用いて多重アッセイで実施される、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
- タウタンパク質の少なくとも1個の以下の部位:タウタンパク質の(S46/T50)、S113、S131、T149、T169、S184、S208、(S210/T212)、S214、S237、S238、S241、S258、S262、T263、S285、S289、S305、S341、S352、S356、T361、T373、T386、(S412/S413/T414)、S433、およびS435を含む、基質の1個または複数の部位がタウタンパク質のリン酸化部位に対応する、請求項15に記載の方法。
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