JP5688718B2 - ヘモキニン−1受容体及びヘモキニン−1由来ペプチド - Google Patents
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Description
Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2(配列番号1)
[式中、C末端のメチオニンのカルボキシル基はアミド化されている。以下同様に表記する]
である。
Arg-Ser-Arg-Thr-Arg-Gln-Phe-Tyr-Gly-Leu-Met-NH2(配列番号2)
である。
Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-NH2(配列番号3)
とC末端フラグメント(SP(7-11))
Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2(配列番号4)
と2領域に分割され、かつこれらのフラグメントは異なる機能を有していることが報告されている(非特許文献1)。具体的には、SPをラットやマウスに投与すると疼痛関連行動(例えば、ひっかき行動)を誘発するが、SPのN末端フラグメントを投与することにより疼痛関連行動を抑制することができる。一方、SPのC末端フラグメントを投与すると疼痛関連行動が誘発される。
Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-NH2(配列番号3)
及びSPのN末端フラグメント(SP(1-8))
Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-NH2(配列番号5)
がSPに起因する疼痛関連行動を抑制することが報告されている(非特許文献2及び3)。
SP(1-5):Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-NH2(配列番号6)
HK-1(1-5):Arg-Ser-Arg-Thr-Arg-NH2(配列番号7)
がそれぞれ、SPに起因する疼痛関連行動(ひっかき行動)や、ホルマリン投与により誘発される炎症性疼痛を抑制することを見出した。また、SPのN末端フラグメント(SP(1-5))及びHK-1のN末端フラグメント(HK-1(1-5))におけるL型アミノ酸の一部をD型アミノ酸に置換することによって、前記抑制効果が長時間持続することを見出した。
HK-1受容体機能のアンタゴニストであることが推測される化合物とGPR83とを接触させるステップ;
前記化合物の、GPR83への結合及び/又はアンタゴニスト活性を検出するステップ;及び
疼痛、炎症、又は掻痒の治療に有用な化合物をスクリーニングするステップ;
を含む、上記方法。
HK-1受容体機能のアンタゴニストであることが推測される化合物と前記細胞膜とを接触させるステップ;及び
前記化合物が、GPR83に結合して、アンタゴニスト活性を発揮するかどうかを測定するステップ;
を含む、(2)に記載の方法。
(i) 配列番号17〜20のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(ii) 配列番号17〜20のいずれかで表されるアミノ酸配列の部分配列を含み、且つHK-1受容体活性を有するポリペプチド;
(iii) 配列番号17〜20のいずれかで表されるアミノ酸配列を含み、且つHK-1受容体活性を有するポリペプチド;
(iv) (i)〜(iii)のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つHK-1受容体活性を有するポリペプチド;又は
(v) (i)〜(iii)のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つHK-1受容体活性を有するポリペプチド;
である、(1)に記載の使用、又は(2)若しくは(3)に記載の方法。
(a) Arg-Ser-Arg-Thr-Arg-NH2(配列番号7)
[C末端のArg-NH2は、カルボキシル基がアミド化されたArgを示す]
で表されるアミノ酸配列からなるペプチド;
(b) Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-NH2(配列番号6)
[C末端のGln-NH2は、カルボキシル基がアミド化されたGlnを示す]
で表されるアミノ酸配列からなるペプチド;
(c) 上記(a)又は(b)のペプチドのアミノ酸配列において、Arg及びLys以外の位置で1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つサブスタンスPに対するアンタゴニスト活性、疼痛抑制活性、炎症抑制活性、及び掻痒抑制活性からなる群から選択される少なくとも1つの活性を有するペプチド
(但し、
Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-NH2(配列番号3)
[C末端のPhe-NH2は、カルボキシル基がアミド化されたPheを示す]
で表されるアミノ酸配列からなるペプチド;及び
Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-NH2(配列番号5)
[C末端のPhe-NH2は、カルボキシル基がアミド化されたPheを示す]
で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを除く)。
(d) Arg-DTrp-Arg-Thr-Arg-NH2(配列番号9)
[DTrpはD型のトリプトファンを示し、C末端のArg-NH2は、カルボキシル基がアミド化されたArgを示す]
で表されるアミノ酸配列からなるペプチド;
(e) Arg-DTrp-Lys-Pro-Gln-NH2(配列番号8)
[DTrpはD型のトリプトファンを示し、C末端のGln-NH2は、カルボキシル基がアミド化されたGlnを示す]
で表されるアミノ酸配列からなるペプチド;
(f) 上記(d)又は(e)のペプチドのアミノ酸配列において、DTrp、Arg及びLys以外の位置で1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つサブスタンスPに対するアンタゴニスト活性、疼痛抑制活性、炎症抑制活性、及び掻痒抑制活性からなる群から選択される少なくとも1つの活性を有するペプチド。
本発明に係るペプチドは、
Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-NH2(配列番号6)又は
Arg-Ser-Arg-Thr-Arg-NH2(配列番号7)
[C末端のGln-NH2及びArg-NH2はそれぞれカルボキシル基がアミド化されたGln及びArgを示す]
で表されるアミノ酸配列からなる。
Arg-DTrp-Lys-Pro-Gln-NH2(配列番号8)又は
Arg-DTrp-Arg-Thr-Arg-NH2(配列番号9)
[DTrpはD型のトリプトファンを示し、C末端のGln-NH2及びArg-NH2はそれぞれカルボキシル基がアミド化されたGln及びArgを示す]
で表されるアミノ酸配列からなるペプチドも包含する。
HK-1は、疼痛、炎症、及び掻痒に関与する物質である。従って、HK-1に特異的に結合する受容体を利用し、そのアンタゴニストを探索することにより、疼痛、炎症、又は掻痒の治療に有用な候補物質を見出すことが可能となる。
(i) 配列番号17〜20のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(ii) 配列番号17〜20のいずれかで表されるアミノ酸配列の部分配列を含み(好ましくは、配列番号17〜20のいずれかで表されるアミノ酸配列の部分配列からなり)、且つHK-1受容体活性を有するポリペプチド;
(iii) 配列番号17〜20のいずれかで表されるアミノ酸配列を含み、且つHK-1受容体活性を有するポリペプチド;
(iv) (i)〜(iii)のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列において、1〜10個、好ましくは1〜7個、より好ましくは1〜4個のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つHK-1受容体活性を有するポリペプチド;又は
(v) (i)〜(iii)のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み(好ましくは、(i)〜(iii)のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり)、且つHK-1受容体活性を有するポリペプチド。
前記化合物の、GPR83への結合及び/又はアンタゴニスト活性を検出するステップ;及び
疼痛、炎症、又は掻痒の治療に有用な化合物をスクリーニングするステップ。
GPR83を含有する細胞膜を調製するステップ;
HK-1受容体機能のアンタゴニストであることが推測される化合物と前記細胞膜とを接触させるステップ;及び
前記化合物が、GPR83に結合して、アンタゴニスト活性を発揮するかどうかを測定するステップ。
HK-1及びSPのN末端領域からなるペプチドの薬理学的評価1
1.実験目的
先行研究にて、SPのN末端領域とC末端領域では異なる機能を有すると報告されている(非特許文献1)。そこで、我々の実験系でも同様の効果を有するか否かについて検討した。なお、N末端領域のnHK-1(HK-1(1-5))及びnSP(SP(1-5))、C末端領域のcHK-1(HK-1(6-11))及びcSP(SP(6-11))は以下に示すアミノ酸配列である:
nHK-1:Arg-Ser-Arg-Thr-Arg-NH2(配列番号7)
nSP:Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-NH2(配列番号6)
cHK-1:Gln-Phe-Tyr-Gly-Leu-Met-NH2(配列番号10)
cSP:Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2(配列番号11)。
髄腔内にカテーテルを留置したラットにカテーテルを通じて10-3M (10 nmol/10μl)のHK-1及びSP、N末端領域のnHK-1及びnSP、C末端領域のcHK-1及びcSPを投与し、投与直後からの行動学的変化を、ペプチド投与5分間のひっかき行動回数を指標として評価した。ここで、「10-3M (10 nmol/10μl)の・・・を投与」とは、ペプチド(例えば、nHK-1)を10 nmol含有する10μlの溶液(すなわち10-3M溶液)を、10μl全量投与することを意味する。以下、同様に表記する。結果を図1に示す。なお、これらのグラフは10-3M (10 nmol/10μl)のSP及びHK-1の単独投与により誘発されるひっかき回数をControlとし、このひっかき回数を100%として示している。
HK-1及びSPのN末端領域からなるペプチドの薬理学的評価2
1.実験目的
先行研究にて、SPのN末端領域はSPに対してアンタゴニスト効果を有するペプチドであると報告されている(非特許文献2及び3)。そこで、我々の実験系でも同様の効果を有するか否かについて検討した。なお、N末端領域のSPは非特許文献2及び3で用いたペプチド(SP(1-7)及びSP(1-8))よりアミノ酸配列の短いペプチドSP(1-5)を用いて評価した。さらに、HK-1も同様にN末端領域のペプチドとしてHK-1(1-5)を用いて評価した。今回使用したペプチド(nSP及びnHK-1)がこれまでに報告されたSPフラグメントペプチド(SP(1-7)及びSP(1-8))よりアミノ酸配列が短くなっているのは、より短いアミノ酸配列の方が製剤化の観点から有益であると推測されたからである。
(i)投与間隔
図2は、髄腔内にカテーテルを留置したラットにカテーテルを通じて10-3M (10 nmol/10μl)のN末端領域のnSP、nHK-1を投与後、10-3M (10 nmol/10μl)のSP投与により誘発されるひっかき回数の変化についてnSP及びnHK-1とSPとの投与間隔を変化させた結果を示したものである。なお、生理食塩水投与後5分後のSP投与により誘発されるひっかき回数をControlとし、そのひっかき回数を100%として示した。
図3は、髄腔内にカテーテルを留置したラットにカテーテルを通じて10-5M (100 pmol/10μl)、10-4M (1 nmol/10μl)、10-3M (10 nmol/10μl)のN末端領域のnSP、nHK-1を投与後、10-3M (10 nmol/10μl)のSP投与により誘発されるひっかき回数の変化についてnSP及びnHK-1の投与濃度を変化させた結果を示したものである。なお、生理食塩水投与後5分後のSP投与により誘発されるひっかき回数をControlとし、そのひっかき回数を100%として示した。
HK-1及びSPのN末端領域からなるペプチドのSPに対する抑制効果に関与するアミノ酸の同定
1.実験目的
図2及び図3よりnSP及びnHK-1はSP誘発ひっかき行動に対して抑制効果を有するペプチドであることが示唆された。そこで、これらのペプチドの薬理学的効果に関与するアミノ酸を特定することを目的としてnSP及びnHK-1のアミノ酸のうちArgとLysをLeuに置換したペプチドを合成し、これらのペプチドの前投与によるSP誘発ひっかき行動の変化の違いを指標に、それぞれの合成ペプチドの薬理学的効果について評価した。
髄腔内にカテーテルを留置したラットにカテーテルを通じて10-3M (10 nmol/10μl)のN末端領域のnSP、nHK-1及び置換ペプチド:
Leu1-nSP:Leu-Pro-Lys-Pro-Gln-NH2(配列番号12)
Leu3-nSP:Arg-Pro-Leu-Pro-Gln-NH2(配列番号13)
Leu1-nHK-1:Leu-Ser-Arg-Thr-Arg-NH2(配列番号14)
Leu3-nHK-1:Arg-Ser-Leu-Thr-Arg-NH2(配列番号15)
Leu5-nHK-1:Arg-Ser-Arg-Thr-Leu-NH2(配列番号16)
を投与した5分後に10-3M (10 nmol/10μl)のSP投与により誘発されるひっかき回数を評価した。なお、生理食塩水投与後5分後に10-3MのSP投与により誘発されるひっかき回数をControlとし、そのひっかき回数を100%として示した。結果を図4に示す。
HK-1及びSPのN末端領域からなるペプチドのSPに対する抑制効果の持続に関与するアミノ酸の同定
1.実験目的
図2及び図3よりnSP及びnHK-1はSP誘発ひっかき行動に対して抑制効果を有するペプチドであることが示唆された。そこでnSP及びnHK-1のペプチドの薬理学的効果をより持続させることを目的としてDTrp2-nSP、及びDTrp2-nHK-1:
DTrp2-nSP:Arg-DTrp-Lys-Pro-Gln-NH2(配列番号8)
DTrp2-nHK-1:Arg-DTrp-Arg-Thr-Arg-NH2(配列番号9)
を合成し、SP投与により誘発されるひっかき行動をこれらの合成ペプチドの前投与によって変化が生じるか否かを指標に、それぞれの合成ペプチドの薬理学的効果について評価した。
髄腔内にカテーテルを留置したラットにカテーテルを通じて10-3M (10 nmol/10μl)のDTrp2-nSP及びDTrp2-nHK-1を投与後に10-3M (10 nmol/10μl)のSP投与により誘発されるひっかき回数を評価した。図5は、DTrp2-nSP及びDTrp2-nHK-1とSPとの投与間隔を変化させた結果を示したものである。なお、生理食塩水投与後5分後のSP投与により誘発されるひっかき回数をControlとし、そのひっかき回数を100%として示した。
HK-1及びSPのN末端領域からなるペプチドの疼痛抑制効果
1.実験目的
本実験では、ホルマリン足底投与に伴う疼痛行動に対するnSP及びnHK-1の髄腔内への前投与による効果を確認した。
髄腔内にカテーテルを留置したラットにカテーテルを通じて10-2M (100 nmol/10μl)のnSP及びnHK-1、または食塩水(10μl)を投与し、5分後に後肢の皮下に2%ホルマリンを50μl投与した。ホルマリンを投与してから60分間の疼痛行動(足を振る(flinching)行動)を計測し、疼痛の程度を評価した。ホルマリン投与後10分間の期間(phase Iと称する)は、2分に1回、各回1分間かけて疼痛行動を計測した。ホルマリン投与後10〜60分間の期間(phase IIと称する)は、疼痛行動を5分に1回、各回1分間かけて計測し、疼痛の程度を評価した。phase Iではホルマリン投与に伴う化学刺激による行動(phasic pain)が見られ、phase IIではそれに続く持続疼痛(tonic pain)が見られる。
HK-1及びSPのN末端領域からなるペプチドの痒み誘発物質投与に伴う痒みの抑制効果
1.実験目的
図5の結果より、SPの髄腔内投与により誘発されるひっかき行動に対して、nSPとnHK-1の抑制効果は投与15分後には消失したが、DTrp2-nSP及びDTrp2-nHK-1は投与20分後でも有意な抑制効果を有する。従って、nSP及びnHK-1のアミノ酸配列にDTrpを組み込むことにより、その効果が長期間維持されることが示唆された。そこで、皮下組織における痒み行動に対するペプチドの髄腔内投与の効果について確認した。髄腔内にカテーテルを留置したラットにカテーテルを通じて10-2M (100 nmol/10μl)のDTrp2-nSP、及びDTrp2-nHK-1:
DTrp2-nSP:Arg-DTrp-Lys-Pro-Gln-NH2(配列番号8)
DTrp2-nHK-1:Arg-DTrp-Arg-Thr-Arg-NH2(配列番号9)
をそれぞれ合成し、頸部の皮下組織に内因性痒み誘発物質として知られているヒスタミンおよびセロトニン(5-HT)をそれぞれ投与した。これらの痒み誘発物質投与に伴う痒み行動に対して、ペプチドの髄腔内への前投与が痒み行動に変化をもたらすか否かを指標に評価した。
髄腔内にカテーテルを留置したラットにカテーテルを通じて10-2 M (100 nmol/10μl)のDTrp2-nSP、DTrp2-nHK-1、又は食塩水(10μl)を投与した直後に、痒み誘発物質である10-3 M ヒスタミン(0.25 mg/50μl)、又は1.13×10-4 M 5-HT(0.25 mg/50μl)をそれぞれ頸部の皮下に投与し、20分間の痒み行動を計測することで、痒みの程度を評価した。
BLAST検索によるHK-1特異的受容体候補物質の探索
1.目的
従来のHK-1に関する知見より、HK-1特異的受容体は、NK1Rとは異なるものの、ある程度の構造類似性があることが示唆される。そこで、GenBankのBLAST検索を実施した。
NK1Rのアミノ酸配列を考慮して、BLAST検索を実施したところ、四つの遺伝子;NK3R、NK2R、GPR83、及びGPR15-likeがHK-1特異的受容体の候補遺伝子と考えられた。これらの遺伝子のNK1Rとの相同性は、それぞれ、60%、50%、35%、29%である。
NK1Rノックダウン効果
1.実験目的
はじめに、NK1R siRNAによるNK1Rノックダウン効果を確認した。
(1)
NK1R siRNA #1
sense 5’-CAACAGGACUUAUGAGAAATT-3’(配列番号21)
antisense 5’-UUUCUCAUAAGUCCUGUUGTT-3’(配列番号22)
NK1R siRNA #2
sense 5’-CAUCAGUGCAGGUGAUUAUTT-3’(配列番号23)
antisense 5’-AUAAUCACCUGCACUGAUGTT-3’(配列番号24)
NK1R siRNA #3
sense 5’-GCAGAGAACUUCACAGGAATT-3’(配列番号25)
antisense 5’-UUCCUGUGAAGUUCUCUGCTT-3’(配列番号26)
MM siRNA #1
sense 5’-AUCCGCGCGAUAGUACGUATT-3’(配列番号27)
antisense 5’-UACGUACUAUCGCGCGGAUTT-3’(配列番号28)
MM siRNA #2
sense 5’-UUACGCGUAGCGUAAUACGTT-3’(配列番号29)
antisense 5’-CGUAUUACGCUACGCGUAATT-3’(配列番号30)
MM siRNA #3
sense 5’-UAUUCGCGCGUAUAGCGGUTT-3’(配列番号31)
antisense 5’-ACCGCUAUACGCGCGAAUATT-3’(配列番号32)
(2)ノックダウン効果の検証
HVJ Envelop Vector Kit(石原産業)を用い、当該キットのプロトコールに従ってsiRNAを調製した。髄腔内にカテーテルを留置したラットにカテーテルを通じて10μlのsiRNA溶液を投与した。HVJ-Eのみの投与と、mismatch siRNAの投与とを対照とし、SP又はHK-1によるひっかき行動の回数の経時的な変化を評価すると、SP及びHK-1誘発ひっかき回数に変化が認められなかった。従って、HVJ-E単独投与、又はMM siRNAを前処理してもSP又はHK-1誘発のひっかき行動には影響がほとんどないと見なされる。
GPR83ノックダウン効果
1.実験目的
GPR83 siRNAによるGPR83ノックダウン効果を確認した。
(1)
GPR83 siRNA #1
sense 5’-GCACAUGGGUGUUUGGGAATT-3’(配列番号33)
antisense 3’-UUCCCAAACACCCAUGUGCTT-3’(配列番号34)
GPR83 siRNA #2
sense 5’-CCACUGUGGCCGUGAGUUATT-3’(配列番号35)
antisense 3’-UAACUCACGGCCACAGUGGTT-3’(配列番号36)
GPR83 siRNA #3
sense 5’-GGGAGGAGCUUCAGCCAUATT-3’(配列番号37)
antisense 3’-UAUGGCUGAAGCUCCUCCCTT-3’(配列番号38)
(2)ノックダウン効果の検証
実施例8と同様にGPR83 siRNAを調製し、ラット髄腔内に投与した。
GPR15-likeノックダウン効果
1.実験目的
GPR15-like siRNAによるGPR15-likeノックダウン効果を確認した。
(1)
GPR15-like siRNA #1
sense 5’-GAUCAAAGCUGCAAUCAUATT-3’(配列番号39)
antisense 5’-UAUGAUUGCAGCUUUGAUCTT-3’(配列番号40)
GPR15-like siRNA #2
sense 5’-CCAAUGAAACCAAGGCUAATT-3’(配列番号41)
antisense 5’-UUAGCCUUGGUUUCAUUGGTT-3’(配列番号42)
GPR15-like siRNA #3
sense 5’-GGACAUUUAUCUUGCUGUATT-3’(配列番号43)
antisense 5’-UACAGCAAGAUAAAUGUCCTT-3’(配列番号44)
(2)ノックダウン効果の検証
実施例8と同様にGPR15-like siRNAを調製し、ラット髄腔内に投与した。
GPR83 siRNA髄腔内投与による脊髄細胞でのGPR83ノックダウンにおける疼痛抑制効果
1.実験目的
本実験では、ホルマリン足底投与に伴う疼痛行動に対する、GPR83 siRNA髄腔内投与によるGPR83ノックダウン条件下における抑制効果を確認した。
髄腔内にカテーテルを留置したラットにカテーテルを通じて4.5 mM(45 pmol/10μl)のGPR83 siRNA、対象群として4.5 mM(45 pmol/10μl)のNK1R siRNA、4.5 mM(45 pmol/10μl)のmismatch siRNA(MM siRNA:ネガティブコントロール)、及び10μlのHVJ-E(siRNAの導入試薬)を投与した4日後に、後肢の皮下に2%ホルマリンを50μl投与した。そしてホルマリンを投与してから60分間の疼痛行動(足を振る(flinching)行動)を計測し、疼痛の程度を評価した。ホルマリン投与後10分間の期間(phase Iと称する)は、2分に1回、各回1分間かけて疼痛行動を計測した。ホルマリン投与後10〜60分間の期間(phase IIと称する)は、疼痛行動を5分に1回、各回1分間かけて計測し、疼痛の程度を評価した。phase Iではホルマリン投与に伴う化学刺激による行動(phasic pain)が見られ、phase IIではそれに続く持続疼痛(tonic pain)が見られる。
GPR83 siRNA髄腔内投与による脊髄細胞でのGPR83ノックダウンにおける痒み誘発物質投与に伴う痒みの抑制効果
1.実験目的
図11の結果より、GPR83 siRNA髄腔内投与による脊髄細胞のGPR83ノックダウン条件下において、SP髄腔内投与により誘発されるひっかき行動は抑制できなかったが、HK-1誘発ひっかき行動は抑制することができた。
髄腔内にカテーテルを留置したラットにカテーテルを通じて4.5 mM(45 pmol/10μl)のGPR83 siRNA、対象群として4.5 mM(45 pmol/10μl)のNK1R siRNA、及び10μlのHVJ-E(siRNAの導入試薬)を投与した4日後に、痒み誘発物質である10-3 M ヒスタミン(0.25 mg/50μl)、及び1.13×10-4 M 5-HT(0.25 mg/50μl)をそれぞれ頸部の皮下に投与し、20分間の痒み行動を計測することで、痒みの程度を評価した。
これまでの結果をまとめると、3種の遺伝子を標的としたsiRNAを導入したHVJ-Eの投与後における、SP又はHK-1投与によるひっかき行動は、対照的な実験結果をもたらした。実際、SP投与によるひっかき行動はNK1R siRNA前投与で抑制され、HK-1投与によるひっかき行動はGPR83 siRNA前投与によって抑制された。
Claims (6)
- 被験物質を非ヒト動物でのin vivoにおいて評価する方法において、
非ヒト動物のGPR83の機能を阻害するステップ;
被験物質をGPR83の機能が阻害された非ヒト動物に投与するステップ;
他の被験物質をGPR83の機能が阻害された他の非ヒト動物に投与するステップ;
被験物質を投与されたGPR83の機能が阻害された非ヒト動物の痒み行動と、他の被験物質を投与されたGPR83の機能が阻害された他の非ヒト動物の痒み行動とを比較するステップ;及び
被験物質がヘモキニン-1又はセロトニンにより誘発される掻痒の関連物質であるか否かを評価するステップ;
を含む、上記方法。 - 被験物質を投与されたGPR83の機能が阻害された非ヒト動物の痒み行動が抑制された場合に、被験物質がヘモキニン-1又はセロトニンにより誘発される掻痒の関連物質であると評価するステップ;
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 被験物質を非ヒト動物でのin vivoにおいて評価する方法において、
非ヒト動物のGPR83の機能を阻害するステップ;
被験物質をGPR83の機能が阻害された非ヒト動物に投与するステップ;
被験物質をGPR83の機能が阻害されていない非ヒト動物に投与するステップ;
被験物質を投与されたGPR83の機能が阻害された非ヒト動物の痒み行動と、被験物質を投与されたGPR83の機能が阻害されていない非ヒト動物の痒み行動とを比較するステップ;及び
被験物質のHK-1受容体機能のアンタゴニスト活性を評価するステップ;
を含む、上記方法。 - 被験物質を投与されたGPR83の機能が阻害されていない非ヒト動物の痒み行動が抑制された場合に、被験物質のHK-1受容体機能のアンタゴニスト活性がGPR83のHK-1受容体機能のアンタゴニスト活性よりも高いと判断するステップ;
をさらに含む、請求項3に記載の方法。 - GPR83が、配列番号17〜20のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- GPR83の機能阻害がsiRNAによって行われる、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
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