JP5686284B2 - 中枢神経髄鞘形成不全の治療用組成物及び治療剤 - Google Patents

Description

本発明は、ＰＬＰ１タンパク質の機能亢進によって生じる中枢神経髄鞘形成不全の治療用組成物及び治療剤に関する。

先天性大脳白質形成不全症は、大脳をはじめとする中枢神経系の白質の髄鞘形成が遺伝的要因により先天的に不完全（低形成）な疾患群である。先天性大脳白質形成不全症は、髄鞘の構成成分や髄鞘化に必要な因子等の遺伝的な異常が原因でおこり、中枢神経系の髄鞘化の広範かつ著明な低下あるいは停止を特徴とする。

先天性大脳白質形成不全症の一つであるPelizaeus-Merzbacher（ペリツェウス・メルツバッハ）病（以下、ＰＭＤとする。）は、1855年のPelizaius及び1910年のMerzbacherにより報告された疾患である（非特許文献１）。

ＰＭＤは、髄鞘形成不全疾患であり、大脳白質の広範な髄鞘形成不全を特徴とする。この髄鞘形成不全の原因の一つとしてＸ染色体上に存在するProteolipidprotein１（ＰＬＰ１）遺伝子が知られる。ＰＬＰ１遺伝子の重複、変異、欠失等の異常、及び、その他原因不明の異常によって、中枢神経に特異的なグリア細胞であるオリゴデンドロサイトによる髄鞘形成不全が引き起こされ、ＰＭＤを発症する（例えば、非特許文献１、２参照）。

ＰＭＤ患者は精神、言語、運動に強い精神障害を発症し、具体的病症として、頭部振戦、眼振、歩行時のふらつき、言語障害、視神経萎縮、進行性運動障害、精神運動発達退行等がみられる。とくに幼児期で発症すると重症化し、精神、言語、運動に強い障害がみられる。

ＰＭＤの発症頻度は、医学書においては、例えばＡＬＤ（副腎白質ジストロフィー）はもちろん、ＭＬＤ（ロイコジストロフィー）より更に少ないとされているものの、実際に患者同士で連絡を取り始めるとかなりの数が存在しており、少なくとも国内ではＡＬＤとほぼ同等の潜在的な患者数が存在すると考えられる。

Duncan ID, Journal ofthe Neurological Science, 228: 204-205（2005） Inoue K, Neurogenetics,6 (1): 1-16（2005）

しかし、現在までのところ、ＰＭＤの有効な治療薬及び治療方法はなく、対症療法による治療がなされているのみである。

本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、ＰＬＰ１タンパク質の機能亢進によって生じる中枢神経髄鞘形成不全に対する有効な治療用組成物及び治療剤を提供することを目的とする。

本発明の第１の観点に係る治療用組成物は、ＰＬＰ１タンパク質の機能亢進によって生じる中枢神経髄鞘形成不全の治療用組成物であって、活性型Ｃｄｋ５を含有することを特徴とする。

また、本発明の第２の観点に係る治療用組成物は、ＰＬＰ１タンパク質の機能亢進によって生じる中枢神経髄鞘形成不全の治療用組成物であって、Ｃｄｋ５活性化タンパク質を含有することを特徴とする。

前記Ｃｄｋ５活性化タンパク質は、ｐ３５であることが好ましい。

また、本発明の第３の観点に係る治療用組成物は、ＰＬＰ１タンパク質の機能亢進によって生じる中枢神経髄鞘形成不全の治療用組成物であって、パキシリンを含有することを特徴とする。

また、本発明の第４の観点に係る中枢神経髄鞘形成不全の治療剤は、請求項１乃至４の何れか１項に記載の治療用組成物を含有することを特徴とする。

前記中枢神経髄鞘形成不全は、ペリツェウス・メルツバッハ病（ＰＭＤ）であることが好ましい。

本発明によれば、ＰＬＰ１タンパク質の機能亢進によって生じる中枢神経髄鞘形成不全に対する薬物標的分子が初めて明らかになり、その中枢神経髄鞘形成不全に対する有効な治療用組成物及び治療剤が得られる。そのため、難病である中枢神経髄鞘形成不全に罹患した患者が、子どもから大人へと成長する過程において、高いクオリティ・オブ・ライフを維持できるようになる。長期化した闘病生活及び入院又は通院に費やす時間を大幅に短縮させて、肉体的・精神的・経済的な負担が軽減できる。人的及び物的医療資源の軽減による社会的利益も大きい。本発明による利点は計り知れない。

ＰＬＰ１遺伝子導入による髄鞘分化阻害がＣｄｋ５によってリバースされることを示す蛍光写真図である。 ＰＬＰ１遺伝子導入による髄鞘分化阻害がＣｄｋ５によってリバースされることを示す統計データである。 ＰＬＰ１遺伝子導入による髄鞘分化阻害がＣｄｋ５によってリバースされるウエスタンブロットを示す図である。 ＰＬＰ１遺伝子導入による髄鞘分化阻害がＣｄｋ５活性化分子ｐ３５によってリバースされることを示す統計データである。 ＰＬＰ１遺伝子導入による髄鞘分化阻害がＣｄｋ５下流因子であるPaxillinによってリバースされることを示す統計データである。

以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。

本実施形態に係る、ＰＬＰ１タンパク質の機能亢進によって生じる中枢神経髄鞘形成不全の治療用組成物は、活性型Ｃｄｋ５（Cyclin-dependent kinase5，サイクリン依存性キナーゼ５）を含有する。活性型Ｃｄｋ５は、具体的にはＭｙｒ−Ｃｄｋ５である。

Ｃｄｋ５は哺乳動物の脳で機能するプロテインキナーゼであり、細胞増殖を制御する典型的なＣｄｋ（cyclin-dependent kinase，サイクリン依存性キナーゼ）とは異なり、おもに、細胞***をしなくなった神経細胞で活性がみられる。

また、本実施形態に係る、ＰＬＰ１タンパク質の機能亢進によって生じる中枢神経髄鞘形成不全の治療用組成物は、Ｃｄｋ５活性化タンパク質を含有する。Ｃｄｋ５活性化タンパク質は、例えばｐ３５、ｐ３９等である。

Ｃｄｋ５は、サイクリンとは異なるｐ３５又はｐ３９という脳に特異的に発現する活性化サブユニットによって活性化されて、脳の形成から死に至るまで、哺乳動物において一生にわたって機能して、種々の神経活動を調節する。Ｃｄｋ５をノックアウトすると、脳の層構造が逆転したり記憶の消去ができなくなる。

また、本実施形態に係る、ＰＬＰ１タンパク質の機能亢進によって生じる中枢神経髄鞘形成不全の治療用組成物は、パキシリン（paxillin）を含有する。Ｃｄｋ５の下流因子であるパキシリンを共発現させても、ＰＬＰ１によって誘導された髄鞘不全が回復する。

本実施形態に係る中枢神経髄鞘形成不全の治療剤は、上述の治療用組成物を含有する。上述の中枢神経髄鞘形成不全の治療用組成物のいずれか、若しくはそれらのうち２つ以上の組み合わせは、当業者に周知の薬学的に許容される担体、希釈剤、腑形剤等の製剤用添加物を用いて剤形化することができる。その形態は治療に適切な剤形であれば特に特定されず、例えば、経口剤として、錠剤、カプセル、顆粒、散剤、シロップ、腸溶剤、徐放性カプセル、カシュー、咀嚼錠、ドロップ、丸剤、内用液剤、菓子錠剤、徐放錠、徐放性顆粒等に剤形化してもよい。また、注射剤に剤形化してもよく、例えば、溶液性注射剤、乳濁性注射剤、又は固形注射剤等が挙げられる。本実施形態に係る治療剤には、上記製剤用添加物の他、異なる医薬組成物を配合することもできる。

中枢神経髄鞘形成不全治療剤を投与する対象の疾患は、ヒト又はヒト以外の脊椎動物において、ＰＬＰ１タンパク質の機能亢進によって中枢神経において髄鞘が形成不全になる疾患であれば限定されないが、例えばＰＭＤである。ここで、ＰＬＰ１タンパク質の機能亢進は、ＰＬＰ１タンパク質の過剰発現によるものでもよく、タンパク質自体の活性亢進によるものでもよい。

ＰＭＤは、症状的には同じロイコジストロフィーである、ＭＬＤ、Krabbe病等と共通する部分があり、髄鞘形成不全の程度により６つの病型（Ｉ型古典型、ＩＩ型先天型、ＩＩＩ型、ＩとＩＩの中間型、ＩＶ型成人、Ｖ型）に分類され、頻度的にも多いのはＩ型及びＩＩ型である。

Ｉ型古典型は、生後数ヶ月以内に発症して、病理学的に虎斑状髄島を残す白質の広範な髄鞘形成不全をもって特徴づけられる。生後数ヶ月に方向不定のゆっくりとした特徴的な眼振が現れ、その後に運動発達遅延、企図振顫、失調、舞踏病様あるいはアセトーゼ様の不随運動が出現する。下肢の痙性麻痺を伴うことが多く、視神経萎縮、構音障害、痙攣も認められることがある。知能障害に比べて、運動機能障害の程度が強い。

ＩＩ型先天型は、生後早期に発症して、古典型より重篤な臨床経過を示す。病理学的には脳全体の白質の髄鞘は、殆ど完全に欠損しており、加齢によってもほぼ変化する事がなく、死に至るまで髄鞘が形成されないままに経過する。わずかに脳神経根と脊髄神経のみに髄消化がみられる。

本実施形態に係る治療剤は、上述の何れの病型にも有効である。なお、中枢神経髄鞘形成不全治療剤の患者への投与方法及び投与量は、投与目的、剤形、患者の状態等に応じ、当業者が適宜選択可能である。

また、本実施形態に係る治療剤は、ＰＬＰ１遺伝子の重複、変異、及び欠失の何れの遺伝子異常に起因する中枢神経髄鞘形成不全であっても有効である。

本実施例では、まず、ＰＬＰ１タンパク質の機能亢進によって中枢神経において髄鞘が形成不全になる疾患のモデルとして、ＰＬＰ１を過剰発現させることで、髄鞘形成不全を起こすオリゴデンドロサイトを作製した。オリゴデンドロサイトは、ニューロンの周囲にミエリン鞘を形成することで神経軸索を保護し、かつ、神経電気信号の伝導効率を上げる役割を果たしている。

マウス脳髄鞘形成細胞であるオリゴデンドロサイト前駆細胞の株化細胞であるFBD-102bを用いた。FBD-102bを無血清条件にして、分化（オリゴデンドロサイト前駆細胞から髄鞘突起をもつ成熟オリゴデンドロサイトへの分化）を誘導した（J. Cell Sci. 2007, Vol.120, pp4355-4366）。FBD-102b細胞は分化すると、細胞体の数倍もの長さをもつ髄鞘膜由来の突起を形成し（形態的変化）、髄鞘特異的蛋白質の発現を伴った（生化学的変化）オリゴデンドロサイトに分化した。

一方、ヒトＰＬＰ１遺伝子FLJ45458（TOYOBO社）を鋳型に、下記の配列を持つオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ExTaqpolymerase（タカラバイオ社）でPCR増幅した。
プライマーＳ：ccgggatccatgggcttgttagagtgctgtgcaagatgtctg（配列番号１）
プライマーＡＳ：ccgggatcctcagaacttggtgcctcggcccatg（配列番号２）
コントロールベクターとしてRetroX-IRES-ZsGreen１（Takara Bio社、Kyoto、Japan）を用い、増幅したヒトＰＬＰ１遺伝子をpRetroX-IRES-ZsGreen１のIRES下流に挿入した。従ってpRetroX-IRES-PLP1-ZsGreen1は、ＰＬＰ１と蛍光蛋白質ZsGreenを同時に発現する。これを上述のように取得したオリゴデンドロサイトにトランスフェクトし、ＰＬＰ１をFBD-102b細胞に過剰に発現させＰＭＤで最も多い重複型を再現した。図１，図２，図３に示すように、髄鞘形成不全即ち分化不全が観察された。つまり、試験管内でＰＬＰ１に依存した髄鞘膜の形成・分化不全が再現できた。なお、pRetroX-IRES-ZsGreen１には、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の遺伝子が組み込まれており、ＰＬＰ１を発現する細胞は緑色蛍光を発する。

コントロールとして、ＰＬＰ１遺伝子を導入していない非組換えpRetroX-IRES-ZsGreen１を、上述と同様にしてオリゴデンドロサイトにトランスフェクトした。

また、ｍｙｒ−Ｃｄｋ５は、ヒトＣｄｋ５のＮ末端にミリストイル化されるアミノ酸配列が付加された活性型Ｃｄｋ５（Cell 2007,Vol.129, pp1065-1079）であり、Addgene社（Cambridge、MA、USA）からpWZL-Myr-FLAG-Cdk5プラスミドとして購入した。これを上述と同様にしてオリゴデンドロサイトにトランスフェクトした。

更に、pRetroX-IRES-PLP1-ZsGreen1とpWZL-Myr-FLAG-Cdk5とを上述と同様にしてオリゴデンドロサイトにトランスフェクトした。

各オリゴデンドロサイトを４％パラホルムアルデヒドで固定し、髄鞘形成のマーカーであるＭＢＰを認識する抗ＭＢＰ抗体（Millipore社、 カタログ番号AB15542、１００倍希釈）を用いて髄鞘を標識した。なお、二次抗体として、Alexa Fluor594抗マウスＩｇＧ（Molecular Probes 社、カタログ番号A-11005、５００倍希釈）を用いた。結果を図１に示す。

図の横列の導入遺伝子は左から順に、コントロールベクターのみ、pRetroX-IRES-PLP1-ZsGreen1のみ、コントロールベクターとpWZL-Myr-FLAG-Cdk5、pRetroX-IRES-PLP1-ZsGreen1とpWZL-Myr-FLAG-Cdk5である。形態分化（morphologicaldifferentiation）の指標としては、このJCS論文の規則に従い「細胞体から５本以上の髄鞘突起を出し、更にその髄鞘突起からも分岐した突起を有していること」とした。図の縦列が分化誘導マイナス及びプラス、図の横列が導入された遺伝子を示す。細胞への遺伝子導入はLipofectaminePlus試薬（Invitrogen社, Carlsbad,CA, USA）を用いて行われた。緑色蛍光写真に示すように、FBD-102b細胞にＰＬＰ１遺伝子を導入すると分化が阻害され、ＰＬＰ１遺伝子とＣｄｋ５を共導入すると分化能が回復した。即ち、活性型（ｍｙｒ、膜結合型）Ｃｄｋ５キナーゼを共発現させると、ＰＬＰ１によって誘導された髄鞘分化不全が、形態的にも生化学的にも回復することが判明した。

図２は、図１の統計データである。P＜0.01であり、母体数ｎは９０細胞以上である。図２に示されるように、ＰＬＰ１遺伝子導入による髄鞘分化阻害がＣｄｋ５によってリバースされることが理解される。

次に、髄鞘塩基性蛋白質（ＭＢＰ）の発現をウエスタンブロットで確認することによって、生化学的レベルで髄鞘分化を調べた。図1と同じ遺伝子導入を行い、ＭＢＰ抗体はCovance社（Emeryville,CA, USA）のSMI94を1:100希釈で用いた。ＭＢＰは髄鞘マーカー蛋白質である。またコントロール蛋白質の発現確認としてのZsGreen抗体を用いた。これはTakara Bio社のZ2474Nを1:1000希釈で用いた。図３は、ＰＬＰ１遺伝子導入による髄鞘分化阻害がＣｄｋ５によってリバースされるウエスタンブロットを示す図である。図３に示すように、ＰＬＰ１遺伝子を導入するとFBD-102b細胞のＭＢＰの発現が阻害され、ＰＬＰ１遺伝子とＣｄｋ５を共導入するとＭＢＰの発現が回復した。各実験間での蛍光蛋白質ZsGreenの発現は一定である。

次に、図１のＣｄｋ５遺伝子の代わりにオリゴデンドロサイト前駆細胞でのＣｄｋ５活性化因子であるｐ３５を遺伝子導入した（J. Cell Sci.2007, Vol.120, pp4355-4366）。マウスＣｄｋ５活性化因子ｐ３５は、FBD-102b細胞のtotal RNAからRT-PCR法で増幅し、遺伝子導入に用いた。

図４は、ＰＬＰ１遺伝子導入による髄鞘分化阻害がＣｄｋ５活性化分子ｐ３５によってリバースされることを示す統計データである。ここで、Ｐ＜0.01であり、母体数ｎは９０細胞以上である。図４に示すように、ＰＬＰ１遺伝子を導入するとFBD-102b細胞の分化が阻害され、ＰＬＰ１遺伝子とｐ３５を共導入すると分化が回復した。即ち、Ｃｄｋ５の活性化因子であるｐ３５を共発現させても、ＰＬＰ１によって誘導された髄鞘不全が回復することが判明した。なお、図中の標記は図１と同じ順番である。

次に、図1のＣｄｋ５遺伝子の代わりにオリゴデンドロサイト前駆細胞でのＣｄｋ５下流因子であるPaxillinを遺伝子導入した（J. Cell Sci.2007, Vol.120, pp4355-4366）。マウスPaxillinはN1E-115細胞のtotal RNAからRT-PCR法で単離されpCMV-paxillinプラスミドを作成した（Exp. CellRes. 2006, Vol.312, pp2954-2961）。

図５は、ＰＬＰ１遺伝子導入による髄鞘分化阻害がＣｄｋ５下流因子であるPaxillinによってリバースされることを示す統計データである。ここで、Ｐ＜0.01であり、母体数ｎは９０細胞以上である。図５に示すように、ＰＬＰ１遺伝子を導入するとFBD-102b細胞の分化が阻害され、ＰＬＰ１遺伝子とPaxillinを共導入すると分化が回復した。即ち、Ｃｄｋ５の下流因子であるpaxillinを共発現させても、ＰＬＰ１によって誘導された髄鞘不全が回復することが判明した。なお、図中の標記は図１と同じ順番である。

難病であるＰＭＤについての有効な治療薬が得られるので、多数の小児難病患者を救済できる。

配列番号１〜２：プライマー

Claims (6)

1. ＰＬＰ１タンパク質の機能亢進によって生じる中枢神経髄鞘形成不全の治療用組成物であって、
   活性型Ｃｄｋ５を含有する治療用組成物。
2. ＰＬＰ１タンパク質の機能亢進によって生じる中枢神経髄鞘形成不全の治療用組成物であって、
   Ｃｄｋ５活性化タンパク質を含有する治療用組成物。
3. 前記Ｃｄｋ５活性化タンパク質は、ｐ３５である請求項２に記載の治療用組成物。
4. ＰＬＰ１タンパク質の機能亢進によって生じる中枢神経髄鞘形成不全の治療用組成物であって、
   パキシリンを含有する治療用組成物。
5. 請求項１乃至４の何れか１項に記載の治療用組成物を含有する、中枢神経髄鞘形成不全の治療剤。
6. 前記中枢神経髄鞘形成不全は、ペリツェウス・メルツバッハ病（ＰＭＤ）であることを特徴とする請求項５に記載の中枢神経髄鞘形成不全の治療剤。