JP5684963B2 - 筋肉由来前駆細胞、その組成物、および治療法を使用した軟部組織および骨の増大および肥厚 - Google Patents
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Description
本発明は、筋肉由来前駆細胞(または幹細胞)(MDCまたはMDSC)およびMDC組成物ならびに体組織(特に、軟部組織および骨)の増大におけるその使用に関する。特に、本発明は、軟部組織および骨への導入後に長期生存を示す筋肉由来前駆細胞、MDCを単離する方法、ならびにヒトまたは動物の軟部組織および骨(上皮組織、脂肪組織、神経組織、器官組織、筋組織、靭帯組織、および軟骨組織を含む)を増大するためにMDC含有組成物を使用する方法に関する。本発明はまた、美容状態および機能性状態(例えば、皮膚の状態、胃食道逆流、膀胱尿管逆流、尿失禁、大便失禁、骨格筋脱力、心不全、および心筋梗塞に関連する傷害または脱力)を治療するための筋肉由来前駆細胞の新たな使用に関する。
シリコーンまたはポリテトラフルオロエチレン(PTFE)などの合成材料を用いた軟部組織の増大は当技術分野において周知である。アルネット(Arnett)に付与された米国特許第5,876,447号は、顔面形成手術のためのシリコーンインプラントの使用を開示している。しかしながら、このような合成材料は宿主組織にとって異物であり、インプラントの封入および周囲組織の瘢痕化をもたらす免疫応答を引き起こす。従って、このようなインプラントは、さらなる機能的または審美的な問題を生む可能性がある。
本発明の目的は、移植後に長期生存を示す新規の筋肉由来前駆細胞(幹細胞)(MDCまたはMDSC)およびMDC組成物を提供することである。本発明のMDCおよびMDC含有組成物は、デスミン、M-カドヘリン、MyoD、ミオゲニン、CD34、およびBcl-2などの前駆細胞マーカーを発現する初期前駆筋肉細胞(すなわち、筋肉由来幹細胞)を含む。さらに、これらの初期前駆筋肉細胞はFlk-1、Sca-1、MNF、およびc-met細胞マーカーを発現するが、CD45細胞マーカーもc-Kit細胞マーカーも発現しない。
筋肉由来細胞および組成物
本発明は、体組織(好ましくは軟部組織)への移植後に長期生存率を示す初期前駆細胞(本明細書では筋肉由来前駆細胞または筋肉由来幹細胞(MDSC)とも呼ばれる)からなるMDCを提供する。本発明のMDCを得るには、筋肉外植片(好ましくは骨格筋)を、動物ドナー(好ましくは、ヒトを含む哺乳動物)から得る。この外植片は、「休止状態」の筋肉前駆細胞を含む構造的および機能的な合胞体として働く(T.A.パートリッジ(Partridge)ら、1978、Nature 73:306-8;B.H.リプトン(Lipton)ら、1979、Science 205:1292-4)。本発明による移植片に、または細胞療法として使用されるMDCは、ヒトの成人、胎児、胚、または胎盤ドナー細胞を含む、自己ドナーまたは非自己(すなわち、同種異系)ドナーから得ることができる。
本発明の1つの態様において、MDCは骨格筋供給源から単離され、目的の筋肉性軟部組織部位もしくは非筋肉性軟部組織部位または骨構造に導入または移植される。有利なことに、本発明のMDCは、移植後に長期生存を示す多数の前駆細胞を含むように単離および濃縮される。さらに、本発明の筋肉由来前駆細胞は、デスミン、CD34、およびBcl-2などの多数の特徴的な細胞マーカーを発現する。さらに、本発明の筋肉由来前駆細胞はSca-1およびFlk-1細胞マーカーを発現するが、CD45もc-Kit細胞マーカーも発現しない(実施例1を参照のこと)。
本発明によるMDCおよびその組成物は、美容的処置(例えば、形成外科または老化防止処置)において軟部組織を増大するための材料としてかなり有用である。特に、このようなMDCおよびMDC含有組成物は、ヒトまたは動物被検体における様々な皮膚の状態(創傷、ひだ、しわ、非外傷起源の皮膚のくぼみ、皮膚萎縮線条、陥没した瘢痕、尋常性座瘡の傷跡、および唇の形成不全が挙げられるが、これに限定されない)を治療するために使用することができる。より詳細には、本発明のMDCおよび組成物は、顔(特に、眼の周囲の領域)のひだ、しわ、または皮膚のくぼみを治療するために使用することができる。皮膚の状態を治療するために、MDCは本明細書に開示されるように調製され、次いで、欠陥を充填、肥厚、または修復するために、例えば、注射によって皮膚に皮下投与または皮内投与される。必要に応じて、深い皮膚のくぼみまたは欠陥ならびに表面のくぼみまたは欠陥を修復するように、導入されるMDCの数が調節される。例えば、約5mmの皮膚領域を増大するために、約1〜1.5×106MDCが用いられる(実施例3を参照のこと)。
別の態様において、本発明によるMDCおよびその組成物は、動物またはヒトを含む哺乳動物被検体における管腔の状態の治療剤としてさらに有用である。特に、筋肉由来前駆細胞は、体内の様々な生物学的管腔または空隙を完全にまたは部分的にブロック、強化、拡大、密閉、修復、肥厚、または充填するために用いられる。管腔として血管、腸、胃、食道、尿道、膣、ファローピウス管、精管、および気管が挙げられるが、これに限定されない。空隙として、様々な組織創傷(すなわち、外傷による筋肉および軟部組織容積の喪失;発射物の貫通による軟部組織の破壊(例えば、刺創または射創);疾患による軟部組織の喪失または組織の外科的除去による組織死(乳癌の***切除術後の***組織の喪失もしくは肉腫などを治療するための外科手術後の筋組織の喪失を含む)、動物またはヒトを含む哺乳動物の体内に存在し得る障害、亀裂、憩室、嚢胞、フィステル、動脈瘤、および他の望ましくないまたは好ましくないくぼみまたは開口部が挙げられ得るが、これに限定されない。管腔の状態を治療するために、MDCは本明細書に開示されるように調製され、次いで、空隙を充填または修復するために、例えば、注射または静脈内送達によって管腔組織に投与される。必要に応じて、軟部組織環境における大きな空隙または小さな空隙を修復するように、導入されるMDCの数が調節される。
本発明によるMDCおよびその組成物はまた、動物またはヒトを含む哺乳動物において括約筋の傷害、脱力、疾患、または機能不全を治療するために使用することができる。特に、MDCは、食道括約筋、肛門括約筋、噴門括約筋、幽門括約筋、および尿道括約筋の組織を増大するために使用される。さらに詳畑には、本発明は、胃食道逆流の症状、尿失禁、および大便失禁に対する軟部組織増大治療を提供する。括約筋欠陥を治療するために、MDCは本明細書に開示されるように調製され、次いで、さらなる容積、充填、または支持体を提供するために、例えば、注射によって括約筋組織に投与される。必要に応じて、様々な量の肥厚材料を生じるように、導入されるMDCの数が調節される。例えば、約5mmの胃食道接合部領域または約5〜10mmの肛門括約筋領域を増大するために、約1〜1.5×106MDCが用いられる(実施例4を参照のこと)。
本発明のさらに別の態様において、ヒトまたは動物被検体における筋肉の状態を治療するためにMDCおよびその組成物が用いられる。特に、MDCは、傷害、疾患、不活動性、または酸素欠乏もしくは外科手術による外傷により引き起こされる脱力または機能不全を治療するために骨格筋または平滑筋を増大するために使用することができる。さらに詳細には、本発明は、スポーツ関連傷害などの骨格筋の脱力または機能不全に対する治療を提供する。本発明はまた、心不全または心筋梗塞関連傷害などの平滑筋の疾患または機能不全に対する治療を提供する。
本発明の別の局面において、本発明のMDCは、1種類またはそれ以上の種類の活性生体分子をコードする核酸配列を含むように、およびこれらの生体分子(タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ホルモン、代謝産物、薬物、酵素などを含む)を発現するように遺伝子操作することができる。このようなMDCは、ヒトを含むレシピエントに対して組織適合性(自己)でもよく、非組織適合性(同種異系)でもよい。これらの細胞は、様々な治療のための(例えば、癌、移植拒絶、筋肉および神経組織の再生、糖尿病、肝不全、腎不全、神経の欠陥および疾患(例えば、パーキンソン病)などの疾患および病理の治療のための)、ならびに遺伝子産物(例えば、本明細書に記載の治療剤)を組織増大部位または空隙充填部位に送達するための長期局所送達系として働くことができる。
本発明の別の局面において、記載のような後期プレプレート(例えば、PP5-6)のMDSCを非自己(同種異系)宿主に注射することによって、細胞が効率的に移植される。例えば、注射の30日後に宿主筋肉において、多数の細胞を含む同種異系移植片が観察された(例えば、3×105個の非宿主起源の筋肉由来幹細胞を注射した後に、2000個を超えるジストロフィン+筋原線維が宿主筋肉で見出された)(実施例10)。この結果から、注射されたMDSCは、注射後の一般的に不十分な拡散および悪い生存率を回避しただけでなく、(例えば、異なるマウス系統のように、宿主と起源が異なる様々な移植ドナーMDSC間での細胞移植でよく観察される)宿主筋肉における免疫拒絶を回避したことも分かる。この結果から、非自己筋肉由来幹細胞は宿主の患部筋肉における細胞療法の効率を著しく改善したことが証明された。さらに、MDSCは、免疫寛容(immunoprivileged)となっていると考えられる。後期プレプレーティング(例えば、PP5または6)の同種異系MDSC細胞は、異なる系統の宿主動物に注射または移植された場合、初期プレプレート(例えば、PP1-2またはPP1-4)の非幹細胞より10倍以上長く生き残る。
本明細書に示す以下の実施例は、本発明を実施する様々な局面を例示および例証することが意図され、どのようにも、本発明を限定することが意図されない。
MDCの濃縮および単離
MDCは、チャンスロールらの特許出願の米国特許出願第09/302,896号に記載のように調製した。筋肉外植片は、多数の供給源(すなわち、3週齢のmdx(ジストロフィー)マウス(C57BL/10ScSn mdx/mdx、ジャクソン研究所(Jackson Laboratories))、4〜6週齢の正常雌SD(スプラーグ・ドーリー)ラット、またはSCID(重症複合免疫不全症)マウス)の後足から得た。各動物供給源からの筋組織を解剖して、骨を取り出し、切り刻んでスラリーにした。次いで、スラリーを、0.2%XI型コラゲナーゼ、ジスパーゼ(グレードII、240単位)、および0.1%トリプシンとの37℃で1時間の連続インキュベーションによって消化した。結果として生じた細胞懸濁液を18、20、および22ゲージ針に通し、3000rpmで5分間遠心分離した。その後、細胞を増殖培地(10%ウシ胎仔血清、10%ウマ血清、0.5%ニワトリ胚抽出物、および2%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したDMEM)に懸濁した。次いで、細胞を、コラーゲンコーティングフラスコにプレプレーテイングした(チャンスロールらの特許出願の米国特許出願第09/302,896号)。約1時間後、上清をフラスコから取り出し、新鮮なコラーゲンコーティングフラスコに再プレーテイングした。この1時間インキュベーションで速やかに付着した細胞は大部分が線維芽細胞であった(Z.クー(Qu)ら、前記;チャンスロールらの米国特許出願第09/302,896号)。細胞の30〜40%が各フラスコに付着した後に、上清を取り出し、再プレーテイングした。約5〜6回の連続プレーティングの後、培養物にはPP6細胞と呼ばれる小さな丸い細胞が豊富にあった。PP6細胞を出発細胞集団から単離し、さらなる研究に使用した。初期プレーティングにおいて単離された付着細胞を一緒にプールし、PP1-4細胞と名付けた。
mdxPP1-4、mdxPP6、正常PP6、および線維芽細胞をプレプレーティング法によって分け、免疫組織化学分析によって調べた。「-」は細胞の2%未満が発現を示したことを示し;「(-)」;「-/+」は細胞の5〜50%が発現を示したことを示し;「+/-」は細胞の約40〜80%が発現を示したことを示し;「+」は細胞の>95%が発現を示したことを示し;「nor」は正常細胞を示し;「na」は免疫組織化学データが入手できないことを示す。
レトロウイルスおよびアデノウイルスベクター
MDC実験のために、MFG-NB(N.フェリー(Ferry)ら、1991、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8377-81)レトロウイルスベクターを使用した。このベクターは、長末端反復配列(LTR)から転写されるシミアンウイルス(SV40)ラージT抗原からクローニングされた核局在配列を含む改変LacZ遺伝子(NLS-LacZ)を含んでいる。以前に述べられたように(J.C.ファンデュテコム(van Deutekom)ら、1998、Neuromuscul.Disord.8:135-48)、このレトロウイルスストックを増殖および調製した。レトロウイルスの力価を1×107〜1×109cfu/mlにした。
ウイルス形質導入のために、MDCをT75フラスコに1〜1.5×106の密度でプレーテイングした。PP6 MDCをHBSS(ハンクス液)で洗浄し、8μg/mlポリブレン(Polybrene)(商標)(アボット ラボラトリーズ(Abbott Laboratories)、Chicago、IL)を含むDMEM 5mlに溶解したレトロウイルス(1×107〜1×109cfu/ml)またはアデノウイルス(1×109cfu/ml)懸濁液と37℃で24時間インキュベートした。ウイルス形質導入されたMDCを、増殖培地10ml中で37℃で2時間増殖させた。次いで、MDCをHBSSで洗浄し、0.25%トリプシンで1分間、酵素消化した。処理されたウイルス形質導入されたMDCを3,500rpmで5分間遠心分離し、ペレットをHBSS 20μlに再懸濁した。
MDC注射およびコラーゲン注射
SDラットに標準的な方法を用いてハロタンで麻酔をかけ、手術部位をべタジン(Betadine)(登録商標)液で洗浄することによって外科手術の準備をした。ハミルトン微量注射器を用いて、下腹部の皮膚に、HBSSで溶解したMDC懸濁液10マイクロリットル(μl)(約1〜1.5×106細胞)、市販ウシコラーゲン(コンティゲン(Contigen)(商標);C.R.Bard、Covington、GA)10μl、または滅菌食塩水10μlを注射した。注射の5日後、2週間後、および4週間後に、各注射部位の周囲の領域を切除し、組織化学分析用に調製し、顕微鏡で調べ、写真を撮った。組織化学分析は、ヘマトキシリン染色、エオシン染色、またはトリクローム染色を含んだ。
前記のように、SDラットに外科手術の準備をした。胃食道接合部および肛門括約筋を曝露するために腹部正中切開を行った。ハミルトン微量注射器を用いて、軟部組織に、HBSSに溶解した筋肉由来前駆細胞懸濁液10μl(1〜1.5×106細胞)を注射した。注射の3日後、各注射部位の周囲の領域を切除し、組織化学分析用に調整し、LacZマーカーを有する細胞の位置および生存を確かめるためにβ-ガラクトシダーゼ染色し、顕微鏡で調べ、写真を撮った。これらの実験の結果は、MDC組成物が、胃食道逆流または大便失禁の症状または状態を治療するための食道括約筋および肛門括約筋肥厚材料として使用できることを証明している(図2Aおよび2B)。
前言己のように、SDラットに外科手術の準備をした。膀胱尿管接合部を曝露するために腹部正中切開を行った。ハミルトン微量注射器を用いて、組織に、HBSSに溶解したMDC懸濁液10μl(1〜1.5×106細胞)を注射した。注射の3日後、各注射部位の周囲の領域を切除し、組織化学分析用に調整し、LacZマーカーを有する細胞の位置および生存を確かめるためにβ-ガラクトシダーゼ染色し、顕微鏡で調べ、写真を撮った。これらの実験の結果は、MDCに基づく組成物が、膀胱尿管逆流の症状または状態を治療するための尿管膀胱増大材料として使用できることを証明している(図3Aおよび3B)。
凍結傷害およびMDC移植
前記のように、SDラットに外科手術の準備をした。膀胱および尿道を曝露するために下部正中切開を行った。次いで、膀胱を食塩水1mlで満たした。ドライアイスで冷却した8mm直径アルミニウム棒を用いて凍結損傷を行った。冷却した消息子を膀胱壁の一面に15秒間または30秒間当てた(それぞれ、「穏やかな」損傷または「厳しい」損傷と呼ぶ)。凍結傷害直後、厳しい損傷群に本発明の筋肉由来細胞(HBSS 15μlに溶解した1〜1.5×106の細胞)を注射したのに対して、対照の厳しい損傷群にHBSS(15μl)を注射した(n=3/群)。凍結傷害の1週間後、他の穏やかな損傷群および厳しい損傷群に、HBSS 50μlに溶解したMDC懸濁液(2〜3×106細胞)を注射したのに対して、対照の穏やかな損傷群および厳しい損傷群にHBSS 50μlを注射した(n=4/群)。各群について、30ゲージ針およびハミルトン微量注射器を用いて、傷害を受けた領域の中心に注射を行った。
免疫組織化学分析用の試料を開製するために、組織または細胞試料を冷アセトンで-20℃で2分間固定し、5%HSで1時間ブロッキングした。試料を、加湿チャンバー内で室温で一晩、マウスモノクローナル抗平滑筋アクチン一次抗体(カタログ番号F-3777;シグマケミカルカンパニー(Sigma Chemical Co.)、St.Louis、MO)(PBS(pH7.4)で1:400に希釈)とインキュベートした。次いで、試料をPBSで3回洗浄し、Cy3蛍光色素結合抗マウスIgG二次抗体(シグマケミカルカンパニー)(PBS(pH7.4)で1:200に希釈)とインキュベートした。
組織または細胞試料を冷アセトンで-20℃で2分間固定し、5%HSで1時間ブロッキングした。次いで、試料を、加湿チャンバー内で室温で一晩、マウスモノクローナル抗骨格ミオシン(ファスト)一次抗体(カタログ番号M-4276;シグマケミカルカンパニー)(PBS(pH7.4)で1:400に希釈)とインキュベートした。次いで、試料をPBSで3回洗浄し、Cy3結合抗マウスIgG二次抗体(シグマケミカルカンパニー)(PBS(pH7.4)で1:200に希釈)とインキュベートした。
実施例1に記載のように調製した筋肉由来前駆細胞を、35mmコラーゲンコーティングディッシュ内の増殖培地にプレーテイングした。24時間後、増殖培地を融合培地と交換した。細胞を融合培地中で維持し、MDCが筋管に分化するまで培地を毎日交換した。
MDC注射の2週間後、動物を安楽死させ、膀胱細片を調製するために使用した。2本の細片を各膀胱から調製し、膀胱の円周に沿うように両細片を切断した。膀胱細片を組織浴に取り付け、神経収縮(20Hz、10回および80回のショック)にかけ、以下に記載のように記録および分析した。
SDラットを安楽死させ、注射部位周囲組織の試料を取り出した。液体窒素で予め冷却した2-メチルブタンを用いて、試料を瞬間凍結した。試料の組織化学分析はヘマトキシリン染色およびエオシン染色を含んだ。試料を染色し、顕微鏡で調べ、写真を撮った。それぞれのクライオスタット切片の厚さは10μmであった。
動物を安楽死させ、素早く膀胱を取り出した。各膀胱から膀胱壁の円周をカバーする2本の細片を得た。95%O2および5%CO2を通気したクレブス液(113mmol/lNaCl、4.7mmol/l KCl、1.25mmol/l CaCl2、1.2mmol/l MgSO4、25mmol/l NaHCO3、1.2mmol KH2PO4、および11.5mmol/lグルコース)を含む5ml器官浴に、細片を取り付けた。初張力を10mNに設定し、等尺性収縮を、TBM4ひずみゲージ増幅器と連結したひずみゲージ変換器(ワールドプレシジョンインスツルメンツ(World Precision Instruments))で測定した。データ収集プログラム(Windaq、 DATAQインスツルメンツインク(DATAQ Instruments,Inc.)、Akron、OH)を用いて収縮測定値を集約した。チャンネル当たりのサンプリングレートを100Hzに設定した。計算プログラム(WindaqEx、 DATAQインスツルメンツインク)を用いて、収縮の振幅をコンピュータで計算した。20分の平衡期間後、器官浴の上部および下部にある4cm離れた2本の白金ワイヤ電極によって、電場刺激を加えた。実験の間、温度を37℃に維持した。
膀胱細片を、継続時間0.25msecと最大電圧(100V)の四角波パルスで刺激し、1Hz、2Hz、5Hz、10Hz、20Hz、または40Hzで10回または80回のショックを用いて周波数応答曲線を作成した。電気刺激後、収縮を誘導するために5μM、10μM、または20μMカルバコールを膀胱細片に添加した。平行実験において、1μMアトロピンを添加し、電気刺激を前記のように加え、収縮を誘導するために50μMメチレンATPを添加した。
平滑筋におけるMDCの再神経支配を評価するためにアセチルコリン(Ach)染色を使用した。Achは、神経終末の存在を示す神経筋接合部の染色である。MDC注射の3日後、15日後、30日後、または6ヵ月後に組織を切除し、Ach染色し、顕微鏡で観察し、写真を撮った。
値は平均±標準偏差として報告する。0.05未満の「P」値が統計的に有意であるとみなされた。スチューデント試験を使用した。
実施例1に記載のように調製した筋肉由来前駆細胞を細胞分化について評価した。α-SMアクチンは、知られているうちで最古の平滑筋細胞表現型マーカーであり(K.M.マクフュー(McHugh)、1995、Dev.Dyn.204:278-90)、主要な筋線維芽細胞表現型マーカーである(I.ダービー(Darby)ら、1990、Lab.Invest.63:21-9)。筋肉細胞分化の間、α-SMアクチン発現は減少するのに対して、ファストMyHC発現は増加する。α-SMアクチンおよびファストMyHCマーカーを用いた、MDCで治療された膀胱組織の組織化学分析によって、凍結傷害部位への注射後にMDCが分化することが証明された。凍結損傷を受けた膀胱組織への注射の5日後に、いくつかのMDC(少なくとも20%)がα-SMアクチン染色を示す(図5B)。このことは、細胞がまだ分化していないことを示している。しかしながら、注射の6ヵ月後、α-SMアクチン染色の減少(図5F)および付随するファストMyHC染色の増加(図5l)によって示されるように、実質的に全てのMDCが筋管または筋原線維に分化していた。
アセチルコリン(Ach)は神経筋接合部に存在するので、筋肉神経支配の指標として役立つ。Achマーカーを用いた、MDCで治療された膀胱組織の組織化学分析によって、凍結損傷部位への注射後のMDCの再神経支配が証明された。凍結損傷を受けた膀胱組織への注射の3日後、比較的低レベルのAch染色により示されるように(図6A)、注射されたMDCはわずかな神経支配しか示さない。注射の15日後に、増大したレベルのAch染色により示されるように(図6B)、増大したレベルの神経支配が観察された。注射の30日後に、神経支配がさらに増加したことを示す、さらに多くのAch染色が観察された(図6C)。注射の6ヵ月後に、低倍率で見られるMDC注射領域全体にわたるかなりのAch染色により示されるように(図6D)、広範囲の神経支配が観察された。これらの結果から、骨盤神経が膀胱のMDC注射領域内に成長していることが分かり、MDCは注射組織の収縮性および機能を改善できることが示唆される。
注射されたMDCが治療された膀胱組織の機能を改善したかどうかを確かめるために、いくつかの収縮性研究をやり遂げた(前記を参照のこと)。表3は、凍結傷害後にMDCを注射した、またはMDCを注射しなかった膀胱筋肉の収縮パラメータを示すデータを示す。
値は平均±標準偏差である。統計解析のために、対照群およびMDC注射群に対してスチューデント試験を行った。群番号1:凍結傷害直後にMDCを注射した厳しい損傷群。群番号2:凍結損傷の1週間後にMDCを注射した穏やかな損傷群。群番号3:凍結損傷の1週間後にMDCを注射した厳しい損傷群。群番号4:正常な膀胱組織。
前記のように、SDラットに外科手術の準備をした。心臓を曝露するために胸部切開を行った。ハミルトン微量注射器を用いて、心室壁に、HBSSで溶解したMDC懸濁液10μl(1〜1.5×106細胞)を注射した。3日目に、各注射部位周囲の領域を切除し、組織化学分析用に調製し、LacZマーカーを有する細胞の位置および生存を確かめるためにβ-ガラクトシダーゼ染色し、顕微鏡で調べ、写真を撮った。これらの実験の結果は、MDC組成物が、心不全または心筋梗塞に派生した傷害または脱力を治療するための心筋軟部組織増大材料として使用できることを証明している(図7Aおよび7B)。
前記のように、SDラットに外科手術の準備をした。肝臓および脾臓を曝露するために腹部正中切開を行った。ハミルトン微量注射器を用いて、両部位に、HBSSに溶解したMDC懸濁液10μl(1〜1.5×106細胞)を注射した。同時に、脊髄を曝露するために背部正中切開および部分的な椎弓切除を行った。次いで、肝臓および脾臓組織に行ったように、レベルT10の脊髄組織に、HBSSに溶解したMDC懸濁液を注射した。4日目に、各注射部位の周囲の領域を切除し、組織化学分析用に調製し、LacZマーカーを有する細胞の位置および生存を確かめるためにβ-ガラクトシダーゼ染色し、顕微鏡で調べ、写真を撮った。これらの実験は、MDC組成物が、様々な肝臓、脾臓、および脊髄の傷害、疾患、または機能不全を治療するための肝臓、脾臓、および脊髄の軟部組織増大材料として使用できることを示している(図8A-8B、9A-9B、および10A-10B)。
筋肉由来細胞の単離
MDCは、実施例1に記載のようにmdxマウスから得た。
PP6細胞集団からクローンを単離するために、PP6細胞を、LacZ、ミニジストロフィン、およびネオマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドでトランスフェクトした。簡単に述べると、pPGK-NEOからのネオマイシン耐性遺伝子を含むSmaI/SalI 断片を、LacZ遺伝子を含むpIEPlacZプラスミドのSmaI/SalI部位に挿入して、pNEOlacZプラスミドを作成した。ジストロフィン遺伝子の短縮型を含むDysM3からのXhoI/SalI断片(K.ユアサ(Yuasa)ら、1998、FEBS Lett.425:329-336;タケダ(Takeda)博士、Japanから寄贈)をpNEOlacZのSalI部位に挿入して、ミニジストロフィン、LacZ、およびネオマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドを作成した。トランスフェクション前に、このプラスミドをSalI消化で線状化した。
PP6、mc13、およびマウス線維芽細胞を6ウェル培養皿にプレーテイングし、冷メタノールで1分間固定した。次いで、細胞をリン酸緩衝食塩水(PBS)で洗浄し、5%ウマ血清で室温で1時間ブロックした。一次抗体を以下のようにPBSで希釈した:抗デスミン(1:100、シグマ)、ビオチン化抗マウスCD34(1:200、ファーミンゲン(Pharmingen))、ウサギ抗マウスBcl-2(1:500、ファーミンゲン)、ウサギ抗マウスM-カドヘリン(1:50、A.ウェリング(Wernig)博士から寄贈)、マウス抗マウスMyoD(1:100、ファーミンゲン)、マウス抗ラットミオゲニン(1:100、ファーミンゲン)、ウサギ抗マウスFlk-1(1:50、リサーチ ダイアグノスティクス(Research Diagnostics))、およびビオチン化Sca-1(1:100、ファーミンゲン)。細胞を一次抗体と室温で一晩インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、適切なビオチン化二次抗体と室温で1時間インキュベートした。その後、細胞をPBSでリンスし、次いで、Cy3蛍光色素結合ストレプトアビジン(1/300)と室温で1時間インキュベートした。次いで、細胞を蛍光顕微鏡で分析した。各マーカーについて、染色された細胞の割合を10個の無作為に選ばれた細胞視野に対して計算した。
細胞を、12ウェルコラーゲンコーティングフラスコに、ウェル1個につき1〜2×104細胞の密度でトリプリケートでプレーテイングした。200ng/ml組換えヒトBMP-2(rhBMP-2)を増殖培地に添加することで、細胞を刺激した。増殖培地は、最初のプレーティングの1日後、3日後、および5日後に交換した。同時に、対照細胞群をrhBMP-2添加なしで増殖した。rhBMP-2で刺激して、またはrhBMP-2で刺激せずに6日後、細胞を、マイクロサイトメーターを用いて計数し、オステオカルシン発現およびアルカリホスファターゼ発現について分析した。オステオカルシン染色のために、細胞をヤギ抗マウスオステオカルシン抗体(PBSで1:100に希釈、ケミコン)とインキュベートした後、Cy3蛍光色素結合抗ヤギ抗体とインキュベートした。アルカリホスファターゼ活性を測定するために、細胞溶解産物を調製し、p-ニトロフェニルホスフェート(シグマ)からの無機リン酸の加水分解による試薬中での色変化を利用する市販のキットを用いて分析した。結果として生じる色変化を分光光度計で測定し、データを、106細胞に標準化された1リットル当たりのALP活性国際単位として表した。スチューデントt検定を用いて統計学的有意性を解析した(p<0.05)。
筋形成
mc13細胞(5×105細胞)をmdxマウスの後足筋肉に筋肉内注射した。注射の15日後に動物を屠殺し、注射された筋組織を凍結し、クライオスタットで切片にし、ジストロフィン(前記を参照のこと)およびLacZ発現についてアッセイした。LacZ発現を試験するために、筋肉切片を1%グルタルアルデヒドで固定し、次いで、X-gal基質(リン酸緩衝食塩水に溶解した0.4mg/ml 5-ブロモクロロ-3インドリル-β-D-ガラクトシド(ベーリンガーマンハイム(Boehringer-Mannheim))、1mM MgCl2、5mM K4Fe(CN)6、および5mM K3Fe(CN)6)と1〜3時間インキュベートした。分析前に、切片をエオシンで対比染色した。平行実験において、mc13細胞(5×105細胞)をmdxマウスの尾静脈に静脈内注射した。注射の7日後に動物を屠殺し、後足を切り離し、記載のようにジストロフィンおよびβ-ガラクトシダーゼの存在についてアッセイした。
アデノウイルスBMP-2プラスミド(adBMP-2)を構築するために、rhBMP-2コード配列をBMP-2-125プラスミド(ジェネティクスインスティチュート(Genetics Institute)、Cambridge、MA)から切り出し、HuCMVプロモーターを含む複製欠損(E1およびE3遺伝子欠失)アデノウイルスベクターにサブクローニングした。簡単に述べると、BMP-2-125プラスミドをSalIで消化して、rhBMP-2 cDNAを含む1237塩基対断片を得た。次いで、rhBMP-2 cDNAをpAd.loxプラスミドのSalI部位に挿入し、遺伝子をHuCMVプロモーター制御下に置いた。pAd.loxとpsi-5ウイルスDNAのCRE-8細胞へのコトランスフェクションによって、組換えアデノウイルスを得た。結果として生じたadBMP-2プラスミドを、後に使用するまで-80℃で保存した。
全RNAは、トライゾール(TRIzol)試薬(ライフ テクノロジーズ(Life Technologies))を用いて単離した。逆転写は、第1鎖cDNA合成用スーパースクリプト(SuperScript)(登録商標)プレアンプリフィケーション システム(Preamplification System)(ライフ テクノロジーズ)を用いて製造業者の説明書に従って行った。簡単に述べると、ランダムヘキサマー100ngを全RNA 1μgに70℃で10分間アニーリングさせ、次いで、氷上で冷却した。逆転写は、10×PCR緩衝液2μl、25 mM MgCl2 2μl、10mM dNTPミックス1μl、0.1M DTT 2μl、および200U スーパースクリプト(SuperScript)II逆転写酵素を用いて行った。反応混合物を42℃で50分間インキュベートした。
他のプライマーは、以前の研究(J.ローウェデル(Rohwedel)ら、1995、Exp.CellRes 220:92-100;D.D.コルネリソン(Cornelison)ら、1997、Dev.Biol.191:270-283)に従って設計し、以下の配列を有した:
3匹の6〜8週齢雌SCIDマウス(ジャクソン研究所)を対照群および実験群に使用した。動物にメトキシフルランで麻酔をかけ、手術台の上にうつぶせにした。頭蓋骨を曝露するために10番ブレードを用いて頭皮を解剖し、骨膜を剥がした。歯科用バーを用いて、最小限に硬膜を貫通して、全厚約5mmの円形頭蓋骨欠陥を作成した。adBMP-2を形質導入した、またはadBMP-2を形質導入していない0.5〜1.0×106 MDCをコラーゲンスポンジマトリックス(ヘリスタット(Helistat)(商標)、コーラテックインク(Colla-Tec,Inc.))に播種し、これを頭蓋骨欠陥の中に入れた。4-0ナイロン縫合糸を用いて頭皮を閉じ、動物に餌を与え、活動を許した。14日後、動物を屠殺し、頭蓋骨標本を観察し、次いで、顕微鏡で分析した。フォンコッサ染色のために、頭蓋骨標本を4%ホルムアルデヒドで固定し、次いで、0.1M AgNO3溶液に15分間浸漬した。標本を少なくとも15分間、光に曝露し、PBSで洗浄し、次いで、観察のためにヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
凍結切片を3:1メタノール/氷酢酸(v:v)中で10分間固定し、風乾させた。次いで、切片を、2×SSC(0.3 M NaCl、0.03Mクエン酸Na)pH7.0に溶解した70%ホルムアミド中で70℃で2分間変性した。その後、スライドを、一連のエタノール洗浄液(70%、80%、および95%)で各濃度2分間、脱水した。Y染色体特異的プローブ(Y.ファン(Fan)ら、1996、Muscle Nerve 19:853-860)を、バイオニック(BioNick)キット(ギブコBRL)を用いて製造業者の説明書に従ってビオチン化した。次いで、ビオチン化プローブを、G-50クィックスピンカラム(Quick Spin Column)(ベーリンガー マンハイム)を用いて精製し、精製されたプローブを5ng/ml超音波処理済ニシン***DNAと共に凍結乾燥した。ハイブリダイゼーション前に、50%ホルムアミド、1×SSC、および10%デキストラン硫酸を含む溶液にプローブを再懸濁した。75℃10分間の変性後、プローブを変性切片の上に置き、37℃で一晩ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、切片を2×SSC溶液(pH7.0)で72℃で5分間リンスした。次いで、切片を、BMS溶液(0.1M NaHCO3、0.5M NaCl、0.5%NP-40、pH8.0)でリンスした。ハイブリダイズしたプローブを、フルオレセイン標識アビジン(オンコル インク(ONCOR,Inc))を用いて検出した。核を、ベクタシールド(Vectashield)封入剤(ベクターインク(Vector,Inc))に溶解した10ng/ml臭化エチジウムで対比染色した。
mc13、PP6、および線維芽細胞が発現する生化学マーカーを、RT-PCRおよび免疫組織化学を用いて分析した。表4(以下)は、mc13細胞が、幹細胞様特性を有する造血細胞のマーカーとして最近同定されたヒトKDR遺伝子のマウス相同体であるFlk-1(B.L.ツィーグラーら、前記)を発現したが、CD34もCD45も発現しなかったことを示す。しかしながら、本発明のPP6 MDCから得られた他のクローン分離株はCD34ならびに他のPP6細胞マーカーを発現した。PP6筋肉由来前駆細胞集団をクローニングし、筋肉由来前駆細胞に特徴的な細胞マーカーを発現するクローン分離株を得るために、本明細書に記載の手順を使用できることが当業者に理解されると思われる。このようなクローン分離株は本発明の方法に従って使用することができる。例えば、クローン分離株は、デスミン、CD34、およびBcl-2を含む前駆細胞マーカーを発現する。好ましくは、クローン分離株はまたSca-1およびFlk-1細胞マーカーを発現するが、CD45もc-Kit細胞マーカーも発現しない。
前記のように細胞を単離し、免疫組織化学分析で調べた。「-」は、細胞の0%が発現を示したことを示す。「+」は、細胞の>98%が発現を示したことを示す。
「+/-」は、細胞の40〜80%が発現を示したことを示す。「-/+」は、細胞の5〜30%が発現を示したことを示す。「na」はデータが得られないことを示す。
CD34+細胞およびBcl-2+細胞のインビボでの位置を特定するために、正常マウスの下腿3頭筋からの筋組織切片を、抗CD34抗体および抗Bcl-2抗体を用いて染色した。CD34陽性細胞は小さな筋肉由来細胞集団を構成し(図12A)、これはまたデスミン陽性であった(図12B)。CD34+デスミン+細胞を抗IV型コラーゲン抗体で同時染色すると、細胞は基底膜に局在した(図12Bおよび12D)。図12A-Dの矢じりで示すように、小さな血管もまたCD34陽性およびIV型コラーゲン陽性であったが、核染色と共局在しなかった。血管内皮細胞によるCD34の発現は、以前の研究(L.フィナら、前記)において示されている。Bcl-2+デスミン+細胞が同様に特定され(図12E-12H)、基底膜内に局在した(図12Fおよび12H)。切片はまた、衛星細胞の位置を特定するためにM-カドヘリン染色した(図12l)。衛星細胞は、CD34+デスミン+細胞またはBcl-2+デスミン+細胞とほぼ同じ位置で特定された(矢印、図12l)。しかしながら、CD34またはBcl-2とM-カドヘリンを共局在させる多くの試みが失敗に終わった。これは、M-カドヘリンを発現する細胞がBcl-2もCD34も共に発現しないことを示唆している。これは、本明細書に開示されるように、PP6細胞が高レベルのCD34およびBcl-2を発現するが、極めて少ないレベルのM-カドヘリンしか発現しないことと一致している。
mc13細胞を、rhBMP-2刺激による骨形成分化能について評価した。細胞を6ウェル培養皿にプレーテイングし、200ng/ml rhBMP-2の存在下または非存在下で集密状態になるまで増殖した。3〜4日以内に、rhBMP-2に曝露されたmc13細胞は、rhBMP-2に曝露されていない細胞を比較して劇的な形態学的変化を示した。rhBMP-2の非存在下では、mc13細胞は多核筋管に融合し始めた(図13A)。しかしながら、200ng/ml rhBMP-2に曝露されると、細胞は単核のままであり、融合しなかった(図13B)。細胞密度が>90%集密状態に達すると、未処理培養物は融合して複数の筋管を形成したのに対して(図13C)、処理された細胞は円形になり、肥厚した(図13D)。免疫組織化学を用いて、これらの肥大細胞のオステオカルシン発現を分析した。オステオカルシンは、骨に沈着し、骨芽細胞によって特異的に発現されるマトリックスタンパク質である。未処理群とは対照的に、rhBMP-2で処理された肥大細胞は著しいオステオカルシン発現を示した(図13E)。従って、mc13細胞は、rhBMP-2に曝露すると骨芽細胞に分化できることが示唆される。
mc13細胞がインビボで筋形成系統に分化できるかどうかを確かめるために、細胞をmdxマウスの後足筋組織に注射した。注射の15日後に動物を屠殺し、組織学分析および免疫組織化学分析のために後足を採取した。いくつかの筋原線維が、注射部位周囲の領域においてLacZ染色およびジストロフィン染色を示した(図15Aおよび15B)。このことから、mc13細胞はインビボで筋形成系統に分化し、筋肉再生を促進し、ジストロフィー筋肉におけるジストロフィンを回復できることが分かる。
骨格が十分に発達した(6〜8週齢)雌SCIDマウスにおいて、前記のように歯科用バーを用いて頭蓋骨欠陥(約5mm)を作成した。以前の実験から、5mmの頭蓋骨欠陥は「治癒しない」ことが証明されている(P.H.クレブスバッハ(Krebsbach)ら、1998、Transplantation 66:1272-1278)。adBMP-2を形質導入した、またはadBMP-2を形質導入していないmc13細胞を播種したコラーゲンスポンジマトリックスで、頭蓋骨欠陥を塞いだ。これらのマウスを14日で屠殺し、頭蓋骨欠陥の治癒を分析した。図16Aに示すように、rhBMP-2を形質導入していないmc13細胞で治療された対照群は、欠陥治癒の証拠を示さなかった。対照的に、rhBMP-2を発現するように形質導入されたmc13細胞で治療された実験群は、2週間で、頭蓋骨欠陥のほとんど完全な閉塞を示した(図16B)。鉱化した骨を強調するフォンコッサ染色は、rhBMP-2を発現するように形質導入されたmc13細胞で治療された群において活発な骨形成を示したが(図16D)、対照群では最小限の骨形成しか観察されなかった(図16C)。
方法
本実施例に記載の実験において使用した正常マウス(C57 BL/6J)またはmdxマウス(C57 BL/10 ScSn mdx/mdxマウス)はジャクソン研究所(Bar Harbor、ME)から購入し、それぞれドナーおよび宿主として使用した。
雌ウサギに、ハロタン麻酔をかけて、横向きにして外科手術の準備をした。円板を曝露するために、脊椎周囲切開をT4-L2脊椎レベルの領域において行った。ハミルトン微量注射器を用いて、円板に、HBSSで溶解したLacZマーカーを有する筋肉由来前駆細胞懸濁液10μl(1〜1.5×106細胞)を注射した。注射の10日後に、円板を切除し、組織化学分析用に調製し、LacZマーカーを有する細胞の位置および生存を確かめるためにβ-ガラクトシダーゼ染色し、顕微鏡で調べ、写真を撮った。これらの実験の結果は、MDC組成物が、先天性、変性、または外傷性の円板の症状、傷害、または状態(背中の痛み、ならびに円板および脊柱の欠陥)を治療するための円板増大材料として使用できることを証明している(図20Aおよび20B)。
Claims (18)
- 哺乳動物において食道組織、尿道括約筋、または皮膚組織を増大または肥厚させる際に
使用するための医薬品を製造するための、
(a)単離された骨格筋由来前駆細胞(MDC)であって、
(i)骨格筋組織由来の骨格筋細胞の懸濁液を、該骨格筋細胞の懸濁液中に存在する
速やかに付着する細胞が付着する細胞培養培地を含む第1のコラーゲンコーティング容器
にプレーティングするステップ、
(ii)非付着細胞を含む前記第1の容器中の細胞培養培地の上清を、第2のコラー
ゲンコーティング容器に再プレーティングするステップ、
(iii)ステップ(ii)から得られた細胞培養培地中の非付着細胞を、新鮮なコ
ラーゲンコーティング容器に、5回、連続的に再プレーティングするステップであって、
細胞の30〜40%がそれぞれの容器に付着した後に、上清を再プレーティングするステ
ップ、および
(iv)6回目の容器(PP6)からMDCを単離するステップ
を含む方法を用いて単離された細胞と、
(b)生理学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤と、
を含む組成物であって、食道組織、尿道括約筋、または皮膚組織を増大または肥厚させる
ために十分な量で存在する組成物の使用。
- 前記食道組織の増大が、胃食道逆流の症状を治療し、尿道括約筋の増大が、尿失禁を治
療する、請求項1記載の使用。
- 前記皮膚組織が、ひだ、非外傷起源の皮膚のくぼみ、しわ、皮膚萎縮線条、陥没した瘢
痕、尋常性座瘡の傷跡、唇の形成不全、および傷害、外傷、外科手術、または疾患に派生
した創傷のうちの1または複数から選択される状態を有する、請求項1記載の使用。
- 組成物が、組織に対して自己または同種異系のMDC細胞を含む、請求項1記載の使用。
- 食道組織、尿道括約筋、または皮膚組織の欠陥または空隙を治療するための医薬品を製
造するための、
(a)単離された骨格筋由来前駆細胞(MDC)であって、
(i)骨格筋組織由来の骨格筋細胞の懸濁液を、該骨格筋細胞の懸濁液中に存在する
速やかに付着する細胞が付着する細胞培養培地を含む第1のコラーゲンコーティング容器
にプレーティングするステップ、
(ii)非付着細胞を含む前記第1の容器中の細胞培養培地の上清を、第2のコラー
ゲンコーティング容器に再プレーティングするステップ、
(iii)ステップ(ii)から得られた細胞培養培地中の非付着細胞を、新鮮なコ
ラーゲンコーティング容器に、5回、連続的に再プレーティングするステップであって、
細胞の30〜40%がそれぞれの容器に付着した後に、上清を再プレーティングするステ
ップ、および
(iv)6回目の容器(PP6)からMDCを単離するステップ
を含む方法を用いて単離された細胞と、
(b)生理学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤と、
を含む組成物であって、食道組織、尿道括約筋、または皮膚組織の欠陥または空隙を治療
するために十分な量で存在する組成物の使用。
- 前記食道組織の欠陥または空隙の治療が、胃食道逆流の症状を治療し、尿道括約筋の欠
陥または空隙の治療が、尿失禁を治療する、請求項5記載の使用。
- 前記皮膚組織が、障害、亀裂、嚢胞、くぼみ、および傷害、外傷、外科手術、または疾
患に派生した創傷からなる群より選択される症状を有する、請求項5記載の使用。
- 前記皮膚が、ひだ、非外傷起源の皮膚のくぼみ、しわ、皮膚萎縮線条、陥没した瘢痕、
尋常性座瘡の傷跡、および唇の形成不全からなる群より選択される症状を有する、請求項
5記載の使用。
- 皮膚のくぼみが顔のくぼみを含む、請求項8記載の使用。
- 顔のくぼみが眼の周囲の領域を含む、請求項9記載の使用。
- 医薬品の製造において組成物用の吸収担体材料または付着担体材料を使用することをさ
らに含む、請求項5記載の使用。
- 組成物が、組織に対して自己または同種異系のMDC細胞を含む、請求項5記載の使用。
- 審美的欠陥または美容的欠陥を治療する際に使用するための医薬品を製造するための、
(a)単離された骨格筋由来前駆細胞(MDC)であって、
(i)骨格筋組織由来の骨格筋細胞の懸濁液を、該骨格筋細胞の懸濁液中に存在する
速やかに付着する細胞が付着する細胞培養培地を含む第1のコラーゲンコーティング容器
にプレーティングするステップ、
(ii)非付着細胞を含む前記第1の容器中の細胞培養培地の上清を、第2のコラー
ゲンコーティング容器に再プレーティングするステップ、
(iii)ステップ(ii)から得られた細胞培養培地中の非付着細胞を、新鮮なコ
ラーゲンコーティング容器に、5回、連続的に再プレーティングするステップであって、
細胞の30〜40%がそれぞれの容器に付着した後に、上清を再プレーティングするステ
ップ、および
(iv)6回目の容器(PP6)からMDCを単離するステップ
を含む方法を用いて単離された細胞と、
(b)生理学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤と、
を含む組成物であって、審美的欠陥または美容的欠陥を治療するために十分な量で医薬品
に存在する組成物の使用。
- 医薬品を組織に注射することができる、請求項13記載の使用。
- 胃腸管平滑筋組織の収縮性を回復または改善する際に使用するための医薬品を製造する
ための、
(a)単離された骨格筋由来前駆細胞(MDC)であって、
(i)骨格筋組織由来の骨格筋細胞の懸濁液を、該骨格筋細胞の懸濁液中に存在する
速やかに付着する細胞が付着する細胞培養培地を含む第1のコラーゲンコーティング容器
にプレーティングするステップ、
(ii)非付着細胞を含む前記第1の容器中の細胞培養培地の上清を、第2のコラー
ゲンコーティング容器に再プレーティングするステップ、
(iii)ステップ(ii)から得られた細胞培養培地中の非付着細胞を、新鮮なコ
ラーゲンコーティング容器に、5回、連続的に再プレーティングするステップであって、
細胞の30〜40%がそれぞれの容器に付着した後に、上清を再プレーティングするステ
ップ、および
(iv)6回目の容器(PP6)からMDCを単離するステップ
を含む方法を用いて単離された細胞と、
(b)生理学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤と、
を含む組成物であって、平滑筋収縮性を回復または改善するために十分な量で医薬品に存
在する組成物の使用。
- 胃腸管平滑筋が、食道平滑筋、胃平滑筋、および腸平滑筋からなる群より選択される、
請求項15記載の使用。
- 胃腸管平滑筋の回復または改善が胃不全麻痺を改善または矯正する、請求項15記載の使用
。
- 同種異系筋肉由来前駆細胞がヒト供給源から得られる、請求項4または12記載の使用。
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