JP5680989B2 - 非ヒト動物を検出するためのプライマー・プローブセット - Google Patents
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Description
(I)
下記(1)及び(2)から選択されるプライマーペアと、下記(3)〜(6)から選択されるペプチド核酸(PNA)プローブとを含む、非ヒト動物に由来する28SリボソームRNAをコードするゲノムDNAの標的領域に相当するDNA断片を増幅するためのプライマー・プローブセット:
プライマーペア:
(1) 5’-gtttccctcaggatagctgg-3’ (配列番号1) に示す塩基配列を3’末端側に含む、全体が20〜30塩基の鎖長を有するオリゴヌクレオチドと、5’-cctctaatcattcgctttaccgg-3’ (配列番号2) に示す塩基配列を3’末端側に含む、全体が23〜33塩基の鎖長を有するオリゴヌクレオチドとからなるプライマーペア
(2) 配列番号1に示す塩基配列に対し相補的な塩基配列からなるDNA断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドと、配列番号2に示す塩基配列に対し相補的な塩基配列からなるDNA断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドとからなり、前記(1)のプライマーペアと同一の領域を増幅することができるプライマーペア
PNAプローブ:
(3) N-agacccgacgcacccccgc-C (配列番号3) に示す塩基配列 (NはPNAオリゴマー鎖のN末端側を、CはPNAオリゴマー鎖のC末端側を指す)を含む、全体が19〜29塩基の鎖長を有するPNAオリゴマーからなるプローブ
(4) 配列番号3に示す塩基配列に対し相補的な塩基配列からなるDNA断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるPNAオリゴマーからなり、前記(1)または(2)のプライマーペアを用いた核酸増幅反応において、ヒトの28SリボソームRNAをコードするDNAが存在する場合に、該DNAとハイブリダイズして該DNAの増幅を阻止することができるプローブ
(5) 前記(3)のプローブを構成するPNAオリゴマーに対して相補的な塩基配列からなるPNAオリゴマーからなるプローブ
(6) 前記(4)のプローブを構成するPNAオリゴマーに対して相補的な塩基配列からなるPNAオリゴマーからなるプローブ。
(II)
検査対象から調製されたDNA試料を鋳型とし、(I)に記載のプライマー・プローブセットを用いてDNA断片の増幅を行う増幅工程と、増幅工程により標的増幅産物が得られているか否かを確認する確認工程とを含む、非ヒト動物DNAの検出方法。
(III)
確認工程において標的増幅産物が得られていることが確認された場合に、前記DNA試料が核酸増幅反応の試料として適した品質を有していると結論付ける工程を更に含む、(II)に記載の方法。
(IV)
増幅工程において、ヒトに由来する28SリボソームRNAをコードするゲノムDNAの増幅が阻止される、(II)又は(III)に記載の方法。
(V)
(I)に記載のプライマー・プローブセットを含む、非ヒト動物DNA検出用キット。
(VI)
検査対象から調製されたDNA試料を鋳型とし、前記(I)記載の(1)及び(2)から選択されるプライマーペアと、前記(I)記載の(3)〜(6)から選択されるペプチド核酸(PNA)プローブとを含むプライマー・プローブセットを用いてDNA断片の増幅を行う増幅工程と、増幅工程により得られた標的増幅産物の塩基配列に基づいて該標的増幅産物の起源生物種を推定する推定工程とを含む、検査対象に含まれるDNAの起源生物種を推定する方法。
本発明で用いられるプライマーペアは、好ましくは、(1) 配列番号1に示す塩基配列を3’末端側に含む、全体が20〜30塩基の鎖長を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号2に示す塩基配列を3’末端側に含む、全体が23〜33塩基の鎖長を有するオリゴヌクレオチドとからなるプライマーペアである。
本発明のプライマー・プローブセットを用いた核酸増幅反応は、食品、食品原料等の検査対象から抽出したDNA試料を鋳型とすることができる。本発明に係る、非ヒト動物DNAの増幅を確認する方法は、特に、核酸増幅反応によってアレルギーの原因となる特定の食品原料を検出する検査を行う際の、前検査あるいは同時検査のために使用することができる。すなわち、核酸増幅反応を用いた小麦、そば、落花生、エビ、カニ等の検出法(非特許文献1)や、牛、豚、鶏等の検出法(非特許文献2)を使用する際に、前検査あるいは同時検査として、検査対象となるDNA試料液に対して、本発明のプライマー・プローブセットを用いた核酸増幅を行うことが好ましい。
検査対象からのDNAの調製は、核酸抽出法として当業者に公知の任意の方法を用いて行うことができる。たとえば、フェノール/クロロホルム法、界面活性剤による細胞溶解やプロテアーゼ酵素による細胞溶解、ガラスビーズによる物理的破壊方法、凍結溶融を繰り返す処理方法などにより行うことができる。抽出のための試薬としては、市販されている各種DNA抽出キットを用いてもよい。必要に応じて、メンブランフィルターによる濾過やホモジナイズを行い検査対象からDNAを抽出することができる。
核酸増幅反応としてはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)や、LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification)等を適用することができる。好ましくは核酸増幅反応としてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いる。
核酸増幅反応により標的増幅産物が得られたかどうかは、アガロースゲル電気泳動、DNAハイブリダイゼーションやリアルタイム PCR等の方法を用いて確認することができる。標的増幅産物の断片長は、増幅しようとする28S rRNA遺伝子領域の塩基配列において両プライマーに挟まれる領域の塩基数となる。本発明のプライマーペアを用いた場合は、標的増幅産物の断片長は約60-83bpである。このような標的増幅産物の長さであることは、DNAの断片化による影響が、非特許文献1で用いられるアレルギー検査法と極端に異ならない点で有効である。
本発明では、得られた標的増幅産物の起源生物種、特に動物種を、標的増幅産物の塩基配列を指標として確認する工程を行うこともできる。具体的には、標的増幅産物をアガロース電気泳動等により精製し、バンドを切り出してDNAを抽出し、得られたDNA断片をダイレクトシーケンス法に供して塩基配列を決定するか、または、適当なベクターに挿入後、大腸菌等にクローニングして培養した後に、得られたDNA断片の塩基配列を確認する。配列の確認はサンガー法やマキサム−ギルバート法等の一般的な方法によって行えばよい。確認された塩基配列のうち、プライマー配列を除いた塩基配列を公共あるいは個人が持つデータベースと照合することで、当該異物の生物種を推定することが可能である。本願発明によって得られる増幅領域は、GenBank等において比較的広範囲なデータが開示されているため、生物種の推定に有効である。
(1) 試料の調製
DNAの取得
サバフグ、マカレイ、ブリ、アジ、サバ、カツオ、マグロ、シマホッケ、サンマ、ボラ、マダラ、アンコウ、アオメエソ(メヒカリ)、サケ、カラフトシシャモ、ドジョウ、マイワシ、ウナギ、エイ、マボヤ、マダコ、コウイカ、ヤリイカ、スルメイカ、アワビ、サザエ、ツブガイ、ホンミル、マテガイ、シジミ、トリガイ、アサリ、ハマグリ、ホッキガイ、バカガイ(アオヤギ)、ホタテ、マガキ、ムラサキイガイ(ムール貝)、アカガイ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ニワトリ、ウシエビ(ブラックタイガー)、アキアミ、ホッコクアカエビ(アマエビ)、イセエビ、タラバガニ、ズワイガニ、ナンキョクオキアミ、イサザアミ、シャコ、マナマコ、エゾバフンウニ、クラゲ、コメ、とうもろこし、小麦、大豆、落花生、そば、ばれいしょ、トマト、人参、玉ねぎ、白菜、ホウレンソウ、きゅうり、アロエベラ、パイナップル、パパイヤ、オレンジ、メロン、柿、いちじく、マンゴー、バナナ、アボカド、ブルーベリー、ブドウ、キウイ、リンゴは市場から購入した。
上記のようにして調製した各DNA試料液を用いてPCRを行った。PCRは、下記表1に示す反応液組成と、表2に示す温度条件で、フォワードプライマーに配列番号1に示す塩基配列からなるフォワードプライマー、リバースプライマーに配列番号2に示す塩基配列からなるリバースプライマー、PNAプローブに配列番号3に示す塩基配列からなるPNAプローブを用い、0.2 mlチューブより、PCR装置にABI PRISM 9700(アプライドバイオシステムズ社製)を使用して行った。
PCR後の反応液7.5 μLをそれぞれエチジウムブロマイド含有の3.5%アガロースゲル電気泳動に供した。同時に分子量マーカーとして20 bp DNA Ladder(タカラバイオ株式会社)を0.5 μL供し、UV照射で視覚化することで、PCR増幅産物の有無および断片長の確認を行った。
実施例1に示したPCRで得られたウシDNA由来の標的増幅産物の塩基配列を、ダイレクトシーケンス法により確認した。
(1) 試料の調製、PCRと標的増幅産物の確認
ヒトDNAは、試薬メーカー3社(Novagen、Biochain、GenScript)からそれぞれ1種類ずつ精製済みのDNA溶液を購入した。これらのDNA溶液を用い、それぞれ滅菌水を用いて20 ng/μLから10倍ずつ20 pg/μL(103倍)まで段階希釈したDNA試料液を作製した。
DNA溶液の代わりに滅菌超純水を添加した、PNAプローブを含むPCR反応液を、蓋を開けたまま1時間分析環境に放置後、PCRを行う実験を20反応液×3回行ったが、計60反応液のいずれからも何の増幅産物も得られなかった(データ省略)。
試薬メーカー3社から購入した3種類のヒトDNAをそれぞれ鋳型として、PNAプローブを含むPCRを行った結果、Novagen、GenScriptから購入したヒトDNAで50 ngからの増幅を完全に阻害した(図3)。Biochainから購入したヒトDNAで5 ng、50 ngからそれぞれごく薄い標的増幅産物が得られたものの、この増幅産物はGenBankデータベース中のラット配列(Accession No. AY739179)と一致したことから、原因はラット由来DNAの微量の混入だと推測した。
(1) 試料の調製、PCRと標的増幅産物の確認
ランチョンミート、ウインナーソーセージ、牛肉味付、やきとり(たれ味)、白湯スープの素、アンチョビーソース、いか味付、いわし油漬、さんま塩焼、スパゲッティ用調味料、とりささみ水煮、貝柱水煮、乾燥スープ(コンソメ)、中華だし、風味調味料(かつお)、風味かまぼこ(タラ100%と表示)、コンビーフ(牛肉)、まぐろ水煮、ずわいがにほぐしみ、あさり水煮、オイスターソース、ナンプラーは市場から購入した。DNA試料液は、Genomic-tip 20/Gを用い、非特許文献1に記載された方法、または、Genomic-tip 100/Gを用い、Genomic DNA Handbook (QIAGEN) のTissueに記載された方法に従って抽出し取得した。
配列番号1の5’末端側の6塩基上流に設計した配列番号4に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号2に示す塩基配列からなるリバースプライマーと、配列番号3に示す塩基配列からなるプローブとのセットを用いて、実施例3と同様にヒトDNAを鋳型としてPCRを行った結果、ヒトDNAからの増幅産物が得られた。したがって、本研究の目的とする動物共通PCRプライマー・PNAプローブセットとして配列番号4、2、3のセットは不適当と考えた。
配列番号4: 5’-ccatctagtagctggttccct-3’
配列番号3に示す塩基配列のN末端側の4塩基を欠いた配列番号5に示す塩基配列からなるプローブと、配列番号1に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号2に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマー・プローブセットを用いて、実施例3と同様にヒトDNAを鋳型としてPCRを行った結果、ヒトDNAからの増幅産物が得られた。したがって、本研究の目的とする動物共通PCRプライマー・PNAプローブセットとして配列番号1、2、5のセットは不適当と考えた。
配列番号5: H2N-ccgacgcacccccgc-CONH2
配列番号2:プライマー
配列番号3:人工的に合成されたペプチド核酸(PNA)プローブ
配列番号4:プライマー
配列番号5:人工的に合成されたペプチド核酸(PNA)プローブ
Claims (6)
- 下記(1)及び(2)から選択されるプライマーペアと、下記(3)〜(6)から選択されるペプチド核酸(PNA)プローブとを含む、非ヒト動物に由来する28SリボソームRNAをコードするゲノムDNAの標的領域に相当するDNA断片を増幅するためのプライマー・プローブセット:
プライマーペア:
(1) 5’-gtttccctcaggatagctgg-3’ (配列番号1) に示す塩基配列を3’末端側に含む、全体が20〜25塩基の鎖長を有するオリゴヌクレオチドと、5’-cctctaatcattcgctttaccgg-3’ (配列番号2) に示す塩基配列を3’末端側に含む、全体が23〜28塩基の鎖長を有するオリゴヌクレオチドとからなるプライマーペア
(2) 配列番号1に示す塩基配列に対し相補的な塩基配列からなるDNA断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる、配列番号1に示す塩基配列と95%以上の相同性を有する塩基配列からなり、少なくとも3’末端の1塩基が、配列番号1に示す塩基配列の3’末端の1塩基と同一であるオリゴヌクレオチドと、配列番号2に示す塩基配列に対し相補的な塩基配列からなるDNA断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる、配列番号2に示す塩基配列と95%以上の相同性を有する塩基配列からなり、少なくとも3’末端の1塩基が、配列番号2に示す塩基配列の3’末端の1塩基と同一であるオリゴヌクレオチドとからなり、前記(1)のプライマーペアと同一の領域を増幅することができるプライマーペア
PNAプローブ:
(3) N-agacccgacgcacccccgc-C (配列番号3) に示す塩基配列 (NはPNAオリゴマー鎖のN末端側を、CはPNAオリゴマー鎖のC末端側を指す)を含む、全体が19〜24塩基の鎖長を有するPNAオリゴマーからなるプローブ
(4) 配列番号3に示す塩基配列に対し相補的な塩基配列からなるDNA断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる、配列番号3に示す塩基配列と95%以上の相同性を有する塩基配列からなるPNAオリゴマーからなり、前記(1)または(2)のプライマーペアを用いた核酸増幅反応において、ヒトの28SリボソームRNAをコードするDNAが存在する場合に、該DNAとハイブリダイズして該DNAの増幅を阻止することができるプローブ
(5) 前記(3)のプローブを構成するPNAオリゴマーに対して相補的な塩基配列からなるPNAオリゴマーからなるプローブ
(6) 前記(4)のプローブを構成するPNAオリゴマーに対して相補的な塩基配列からなるPNAオリゴマーからなるプローブ。 - 検査対象から調製されたDNA試料を鋳型とし、請求項1に記載のプライマー・プローブセットを用いてDNA断片の増幅を行う増幅工程と、増幅工程により標的増幅産物が得られているか否かを確認する確認工程とを含む、非ヒト動物DNAの検出方法。
- 確認工程において標的増幅産物が得られていることが確認された場合に、前記DNA試料が核酸増幅反応の試料として適した品質を有していると結論付ける工程を更に含む、請求項2に記載の方法。
- 増幅工程において、ヒトに由来する28SリボソームRNAをコードするゲノムDNAの増幅が阻止される、請求項2又は3に記載の方法。
- 請求項1に記載のプライマー・プローブセットを含む、非ヒト動物DNA検出用キット。
- 検査対象から調製されたDNA試料を鋳型とし、下記(1)及び(2)から選択されるプライマーペアと、下記(3)〜(6)から選択されるペプチド核酸(PNA)プローブとを含むプライマー・プローブセットを用いてDNA断片の増幅を行う増幅工程と、増幅工程により得られた標的増幅産物の塩基配列に基づいて該標的増幅産物の起源生物種を推定する推定工程とを含む、検査対象に含まれるDNAの起源生物種を推定する方法:
プライマーペア:
(1) 5’-gtttccctcaggatagctgg-3’ (配列番号1) に示す塩基配列を3’末端側に含む、全体が20〜25塩基の鎖長を有するオリゴヌクレオチドと、5’-cctctaatcattcgctttaccgg-3’ (配列番号2) に示す塩基配列を3’末端側に含む、全体が23〜28塩基の鎖長を有するオリゴヌクレオチドとからなるプライマーペア
(2) 配列番号1に示す塩基配列に対し相補的な塩基配列からなるDNA断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる、配列番号1に示す塩基配列と95%以上の相同性を有する塩基配列からなり、少なくとも3’末端の1塩基が、配列番号1に示す塩基配列の3’末端の1塩基と同一であるオリゴヌクレオチドと、配列番号2に示す塩基配列に対し相補的な塩基配列からなるDNA断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる、配列番号2に示す塩基配列と95%以上の相同性を有する塩基配列からなり、少なくとも3’末端の1塩基が、配列番号2に示す塩基配列の3’末端の1塩基と同一であるオリゴヌクレオチドとからなり、前記(1)のプライマーペアと同一の領域を増幅することができるプライマーペア
PNAプローブ:
(3) N-agacccgacgcacccccgc-C (配列番号3) に示す塩基配列 (NはPNAオリゴマー鎖のN末端側を、CはPNAオリゴマー鎖のC末端側を指す)を含む、全体が19〜24塩基の鎖長を有するPNAオリゴマーからなるプローブ
(4) 配列番号3に示す塩基配列に対し相補的な塩基配列からなるDNA断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる、配列番号3に示す塩基配列と95%以上の相同性を有する塩基配列からなるPNAオリゴマーからなり、前記(1)または(2)のプライマーペアを用いた核酸増幅反応において、ヒトの28SリボソームRNAをコードするDNAが存在する場合に、該DNAとハイブリダイズして該DNAの増幅を阻止することができるプローブ
(5) 前記(3)のプローブを構成するPNAオリゴマーに対して相補的な塩基配列からなるPNAオリゴマーからなるプローブ
(6) 前記(4)のプローブを構成するPNAオリゴマーに対して相補的な塩基配列からなるPNAオリゴマーからなるプローブ。
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