JP5679966B2

JP5679966B2 - 皮膚機能改善組成物

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Publication number: JP5679966B2
Application number: JP2011514361A
Authority: JP
Inventors: 英嗣後藤; 啓子明石; 敏宏辻; 光記橋本; 正樹山根; 英雅元島
Original assignee: YOTSUBA MILK PRODUCTS CO Ltd
Current assignee: YOTSUBA MILK PRODUCTS CO Ltd
Priority date: 2009-05-20
Filing date: 2010-03-26
Publication date: 2015-03-04
Anticipated expiration: 2030-03-26
Also published as: US20120100222A1; WO2010134384A1; JPWO2010134384A1

Description

本発明は、皮膚機能改善組成物に関するものであり、詳しくは、乳から分離した乳脂肪球膜（ＭＦＧＭ）を有効成分として含有する、安全性の高い経口摂取用の皮膚機能改善組成物、特に皮膚の乾燥状態を改善する作用を有する皮膚機能改善組成物、に関する。

皮膚は外界と接し、様々な環境下から体内の生命活動を保護する人体で最大の臓器である。人体の約70％が水分によって占められていることから、皮膚の役割の一つとして、体内から水分を必要以上に逃がさないことが挙げられる。
外的環境の水分が少ない場合、皮膚から多くの水分が蒸散してしまい、いわゆる乾燥肌と呼ばれる状態を呈する。さらに、近年、過度な清潔性を求めるため、洗顔料やせっけんの使いすぎによる皮脂成分の漏出とそれに伴う乾燥肌に悩むケースが増加している。
乾燥肌によってかゆみやひび割れを呈するだけでなく、皮膚の主要な機能である体内の水分保持能力が失われた状態であるため、皮膚の経皮水分蒸散量（Trans Epidermal Water Loss:ＴＥＷＬ）が増加することが知られている。ＴＥＷＬが増大した皮膚は外的環境からの保護機能が低下しているため、例えば細菌感染等の疾病の一因ともなりうる。ＴＥＷＬを低下させると、すなわち、皮膚からの過剰な水分蒸散を抑制し、皮膚の水分保持能力を向上させると、皮膚を健康な状態に保つことが出来る。
また、皮膚が肥厚化することも正常な水分保持能力を乱すことになり、ＴＥＷＬの増加に至ってしまう。つまり、この肥厚化を抑制することで、皮膚の水分保持能力を正常化させて健全な肌を保持することができる。

また、皮膚組織で外界と接している層は角質層と呼ばれ、表皮角化細胞が脱核して形成された扁平な角質細胞と、細胞間脂質から構成される。角質細胞の細胞膜は、周辺帯（cornified cell envelope）により裏打ちされて疎水的で強固な角質層を形成し、角質層バリアー機能の基礎を形成している。
皮膚異常が認められたマウスの皮膚においては、周辺帯の構成成分であるSmall proline-rich proteinをコードする遺伝子群（Sprr遺伝子群）の発現が極端に変動することが明らかとなっている（非特許文献１）。
角質層が複合的に形成されていることを考えれば、特定遺伝子の発現変動が正常な角質層の発達に対して阻害的な効果をもたらすことが類推できる。つまり、皮膚異常時における異常な遺伝子発現変動を、正常な発現量へ回復させることができれば、角質層が正常に形成されて皮膚異常が改善されることが期待される。

従来、特許文献１に示すように経皮水分蒸散量を抑制する目的で、皮膚に塗布する外用剤等の開発が行われているが、皮膚内部への薬効成分の吸収が不十分であったり、乾燥肌で傷ついた皮膚が薬効成分以外の化学物質に対して炎症反応を示すことがあった。また、外用剤のべとつきといった官能面の忌避や皮膚における持続性が劣るため、使用感に問題が多いことが問題であった。
これらの問題を回避するために、特許文献２〜４に示すように、近年、経皮水分蒸散量を低下させる食品が多数開発されている。しかし、作用機序が不明であったり、食品としての風味に問題があったり、なによりも、食品としては価格が極めて高価であり、決して満足できるものではない。

一方で、乳に含まれる脂肪は、乳脂肪球膜で被膜され、脂肪球として乳汁中に分散している。乳脂肪球膜は特徴的な膜タンパク質成分と脂質成分から構成されており、乳汁中での脂肪の安定化に寄与している。
なお、乳脂肪球膜（Milk Fat Globule Membrane）は、通常ＭＦＧＭと略称されることが多いが、最近では同じものを乳脂質球膜（Milk Lipid Globule Membrane）とも呼び、ＭＬＧＭと略称されることもある。ここでは、乳脂肪球膜という名称を用い、ＭＦＧＭと略記する。
乳脂肪球膜の工業的な濃縮方法としては、特許文献５で示される方法がある。乳脂肪球膜は乳化性が高いことが菅野によって報告されている（非特許文献２）ものの、乳化性以外での用途について、開発が求められていた。

特開２００８−５６５７０号公報特開２００７−３０６８８２号公報特開２００４−３１５５１２号公報特開２００４−２３８２８５号公報特開平９−１７２９６２号公報

Songmei Geng, J. Cell. Sci. 119(23), 4901-4912, (2006) Kanno, C. J. Food. Sci. 54(６), 1534-1539, (1989)

本発明は、‘安価で安全性が高く経口摂取が可能であり’、且つ、‘皮膚の乾燥状態の改善作用を有する（特に、肌の潤いを保つための、経皮水分蒸散量の低減作用、皮膚肥厚化の抑制作用を有する）’皮膚機能改善組成物を提供することを課題とする。

本発明者は、上記従来の課題を解決するべく鋭意研究を重ねた結果、乳（特に、バターミルクやこの加工品）から精密ろ過で乳脂肪球膜（ＭＦＧＭ）を分離し、得られた乳脂肪球膜を経口摂取することで、皮膚の経皮水分蒸散量や皮膚肥厚化が低減し、皮膚の乾燥状態が改善されることを見出した。
さらに本発明者は、驚くべきことに乳脂肪球膜が、皮膚組織の最も外側に位置し、経皮水分蒸散量のコントロールに最も重要な角質層の周辺帯の構成成分であるSmall proline-rich proteinをコードする遺伝子群（Sprr遺伝子群）とインボルクリンをコードする遺伝子（Ivl遺伝子）の発現量を、正常に保つ働きがあることを見出した。これまで乳の特定成分がSmall proline-rich proteinやインボルクリンに対して影響を与える知見は全く知られていない。
本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものである。

即ち、請求項１に係る本発明は、乳脂肪球膜（ＭＦＧＭ）を有効成分として含有する経口摂取用の皮膚機能改善組成物を提供するものである。
請求項２に係る本発明は、乳脂肪球膜（ＭＦＧＭ）が精密ろ過によって調製されたものである、請求項１に記載の皮膚機能改善組成物を提供するものである。
請求項３に係る本発明は、乳脂肪球膜（ＭＦＧＭ）が精密ろ過の保持液を遠心分離することによって調製されたものである、請求項１又は２に記載の皮膚機能改善組成物を提供するものである。
請求項４に係る本発明は、乳脂肪球膜（ＭＦＧＭ）が脱脂処理されたものである、請求項１〜３のいずれかに記載の皮膚機能改善組成物を提供するものである。
請求項５に係る本発明は、乳脂肪球膜（ＭＦＧＭ）がタンパク質加水分解酵素で処理されたものである、請求項１〜４のいずれかに記載の皮膚機能改善組成物を提供するものである。
請求項６に係る本発明は、乳脂肪球膜（ＭＦＧＭ）が、乳、クリーム、バターミルク、ホエイ、およびこれら加工品のうちの１以上のものから得られたものである、請求項１〜５のいずれかに記載の皮膚機能改善組成物を提供するものである。
請求項７に係る本発明は、乳脂肪球膜（ＭＦＧＭ）を、0.004質量％以上含有する、請求項１〜６のいずれかに記載の皮膚機能改善組成物を提供するものである。
請求項８に係る本発明は、皮膚の乾燥状態の改善作用を有する請求項１〜７のいずれかに記載の皮膚機能改善組成物を提供するものである。
請求項９に係る本発明は、経皮水分蒸散量を低減する作用を有する請求項１〜８のいずれかに記載の皮膚機能改善組成物を提供するものである。
請求項１０に係る本発明は、表皮肥厚を抑制する作用を有する請求項１〜９のいずれかに記載の皮膚機能改善組成物を提供するものである。
請求項１１に係る本発明は、角質層の周辺帯の構成成分であるSmall proline-rich proteinをコードする遺伝子群（Sprr遺伝子群）とインボルクリンをコードする遺伝子（Ivl遺伝子）の発現量を正常化させる作用を有する、請求項１〜１０のいずれかに記載の皮膚機能改善組成物を提供するものである。
請求項１２に係る本発明は、請求項１〜１１のいずれかに記載の組成物からなる皮膚機能改善作用を有する飲食品を提供するものである。
請求項１３に係る本発明は、請求項１〜１１のいずれかに記載の組成物からなる経口摂取用の皮膚機能改善剤を提供するものである。
請求項１４に係る本発明は、乳脂肪球膜（ＭＦＧＭ）を有効成分として含有してなる経口摂取用の皮膚機能改善剤を提供するものである。

本発明により、‘安価で安全性が高く経口摂取が可能であり’且つ‘皮膚の乾燥状態の改善作用を有する’皮膚機能改善組成物を提供することが可能となる。
詳しくは、本発明により、皮膚の経皮水分蒸散量を低下させ、あるいは皮膚肥厚化を抑制し、皮膚の乾燥状態を改善することが可能となる。特に、経皮水分蒸散量の上昇あるいは皮膚が肥厚しているような荒れ肌において、角質層の周辺帯の構成成分であるSmall proline-rich proteinをコードする遺伝子群（Sprr遺伝子群）とインボルクリンをコードする遺伝子（Ivl遺伝子）の発現量が異常に増加して角質層の成熟が阻害された場合、ＭＦＧＭの経口摂取により該当遺伝子の発現量を正常化させ、角質層の構造を安定化することによって、荒れ肌の改善や皮膚のバリア機能を向上させることが可能となる。
これにより、本発明は、前記皮膚機能改善作用を有する飲食物および経口摂取用の皮膚機能改善剤、を提供することが可能となる。

実施例３における、ＭＦＧＭの摂取によるSprr遺伝子群とIvl遺伝子の発現量の変化を示す図である。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、有効成分として乳脂肪球膜（以下、単にＭＦＧＭと略称する場合がある。）を含有する経口摂取用の皮膚機能改善組成物である。
なお、乳脂肪球膜（Milk Fat Globule Membrane）は、通常、ＭＦＧＭと略称されることが多いが、最近では同じものを乳脂質球膜（Milk Lipid Globule Membrane）とも呼び、ＭＬＧＭと略称されることもある。

本発明に用いることができるＭＦＧＭとしては、牛から搾乳されたものに限らず、ヒト、ヤギ、馬、ラクダ、羊などから搾乳された乳から分離されたＭＦＧＭを用いることが可能である。特には、牛から搾乳された乳からものが好ましい。

本発明に用いることができるＭＦＧＭは、乳、クリーム、バターミルク、ホエイ、およびこれらの加工品のうちの１以上のものから得ることができる。
ＭＦＧＭは、乳、バターミルク、クリーム、ホエイ、およびこれらの加工品である、粉乳、濃縮バターミルク、バターミルクパウダー、ホエイパウダー、濃縮ホエイなどに少量存在する。
特に、バターミルクあるいは加工品である濃縮バターミルク、バターミルクパウダーから分離されたＭＦＧＭであることが好ましい。

従って、‘乳’を原料として用いる場合、クリーム分離機によって‘クリーム’を調製し、チャーニングを行いバター画分とバターミルク画分に分離した後に、‘バターミルク’を用いてＭＦＧＭを調製することが好ましい。
また、本発明に好適なバターミルクとしては、バター製造時に発生したバターミルク、バターミルクパウダーや濃縮バターミルクを水で還元した還元バターミルクを挙げることができる。

乳由来のＭＦＧＭは、上記した原料から様々な方法によって調製する事ができることが知られているが、具体的には、精密ろ過を行うことで調製することができる。
調製方法の例を挙げると、上記原料を温水で全固形分1〜15％（例えば約6％）になるように調整し、20〜65℃（例えば約50℃）に保持し、ＭＦＧＭを均一に溶解させる。バターミルクを原料とした場合、固形分の調製は必要がない。
その後、0.5〜6.0μｍ（特には0.8μｍ）の精密ろ過膜を有する精密ろ過機（MFS-1：日本テトラパック社製）で精密ろ過を行うことで、ＭＦＧＭを高含有する、ろ過保持液を得ることができる。
そして、得られたろ過保持液を乾燥（具体的には凍結乾燥）することで、‘ＭＦＧＭ粉末’を得ることができる。特に、上記括弧内の数値付近の条件で行うことで、高純度のＭＦＧＭ粉末を調製することができる。
なお、得られたろ過保持液について、必要であれば、15,000×g、15分以上で遠心分離を行い、得られた沈殿物を乾燥（具体的には凍結乾燥）もしくは適当な濃度に再溶解させて乾燥（具体的には凍結乾燥や噴霧乾燥）することで、より高純度のＭＦＧＭ粉末を得ることができる。

なお、上記得られたＭＦＧＭは、脱脂処理を行うことで、脂質由来の不純物の含量を低下させて、純度を向上させることができる。当該脱脂処理には、例えば、クロロホルム、ヘキサン、エタノール、アセトンなどの有機溶媒を用いることができる。これら有機溶媒との混合後、転倒混和、遠心分離等の操作を行い、当該溶媒を除去して水層を得ることによって行うことができる。
また、上記得られたＭＦＧＭは、難水溶性である。そこで、タンパク質加水分解酵素での処理を行うことによってタンパク質をペプチドに分解し、水に対する溶解度を向上させることが、飲食品や薬剤への加工等の点で好適である。当該タンパク質加水分解酵素処理は、平均分子量を約5000以下、好ましくは約1000以下に分解できるように行えばよい。タンパク質加水分解酵素としては、当該範囲に分解できる活性を有するものであれば如何なるものを用いてもよいが、例えば、スミチームFP（新日本化学工業社製）、スミチームLP-50D（新日本化学工業社製）、スミチームFLAVOR（新日本化学工業社製）、スミチームTP（新日本化学工業社製）、ウマミザイムG（天野エンザイム社製）、Protamex（novozymes社製）を単独、もしくは組み合わせて用いることができる。

上記のようにして得られたＭＧＦＭは、経口摂取した場合に‘皮膚機能改善作用’を有するものである。
本発明における皮膚機能改善作用は、具体的には‘皮膚の乾燥状態の改善作用’を有するものであり、さらに具体的には‘皮膚の経皮水分蒸散量の低下作用’、‘皮膚肥厚化の抑制作用’を有するものである。そして、それにより荒れ肌の改善や皮膚のバリア機能を向上させる効果が奏されるものである。
なお、上記皮膚の経皮水分蒸散量の低下作用は、経皮水分蒸散量が上昇しているような荒れ肌において角質層の周辺帯の構成成分であるSmall proline-rich proteinをコードする遺伝子群（Sprr遺伝子群）とインボルクリンをコードする遺伝子（Ivl遺伝子）の発現量が異常に増加して角質層の成熟が阻害された場合、ＭＦＧＭの経口摂取により該当遺伝子の発現量を正常化させ、角質層の構造を安定化することによるものと認められる。

本発明のＭＦＧＭを有効成分とする皮膚機能改善組成物の有効量としては、後述するヌードマウスを用いた動物試験により、マウス体重１ｋｇあたり、ＭＦＧＭを8.3ｍｇ以上、好ましくは25ｍｇ以上経口摂取させることにより、皮膚の経皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）が低下することが分かった。
したがって、通常、体重60ｋｇの成人一人一日あたり、ＭＦＧＭを0.5ｇ以上、好ましくは1.5ｇ以上摂取させることにより皮膚の乾燥状態を改善して、荒れ肌の改善や皮膚のバリア機能を向上させることが期待できるので、この必要量を確保できるようにすればよい。

皮膚機機能改善組成物に含有されるＭＦＧＭの量としては、上記摂取量を担保できる量を含有するものであればよいが、具体的には、0.004質量％以上、好ましくは0.01質量％以上、さらに好ましくは0.5質量％以上、特に好ましくは1.5質量％以上となるように含有させることができる。
また、含有量の上限値としては特に制限はないが、実施の形態に合わせて、他の原料成分との割合上許される限りの量を含有させることが可能である。例えば、70質量％、具体的には32質量％、を含有させることもできる。

本発明のＭＦＧＭを有効成分とする皮膚機能改善組成物は、食品、医薬品、化粧品、工業用原料等の形態にすることができる。
すなわち、如上のようにして得られるＭＦＧＭを各種原料に混合して、食品、医薬品、化粧品、工業用原料等を製造することができる。

本発明において、食品、医薬品、化粧品、工業用原料等の形状としては特に限定されるものはない。
例えば、食品としては、ヨーグルト、乳飲料、アイスクリーム等の乳製品のほかに、乳製品を原料として使用している他の食品、例えば、クッキー、スプレッド、パン等、またＭＦＧＭを直接摂取する方法としてサプリメントの形態にすることができる。
さらには、他の原料として、糖類、脂質、タンパク質、ビタミン類、ミネラル類、フレーバー等、他の飲食品に通常使用する原材料等を混合して栄養食品とすることも可能である。
また、医薬品である剤の形態としては、粉末状、砕粒状、顆粒状などとすることができ、カプセルに充填する形態の他、水に分散した溶液の形態、賦型剤等と混和して得られる錠剤の形態などとして用いることができる。

以下、本発明を実施例等によって詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらにより何ら限定されるものではない。（なお、以下の含有割合で、単に「％」と記載されているところは、「質量％」を表す。）

＜実施例１＞マウスを用いたＭＦＧＭの経皮水分蒸散量低下効果
ＭＦＧＭによる経皮水分蒸散量の低下効果を以下の要領で検証した。
（１）ＭＦＧＭの調製
まず、ＭＦＧＭは以下の方法で調製した。すなわち、‘濃縮バターミルク’（よつ葉乳業社製全固形分30％）を温水で全固形分が6％になるように希釈し、50℃に保持した。その後、0.8μmの精密ろ過膜を有する精密ろ過機（MFS-1：日本テトラパック社製）で精密ろ過を行い、得られた保持液を凍結乾燥して、‘ＭＦＧＭ粉末’を調製した。
この‘ＭＦＧＭ粉末’は、全固形当たりタンパク質を86％、脂質を6％、糖質を1％、灰分を7％含有していた。ＭＦＧＭは水に難溶性であるため、混入している可溶性タンパク質（主としてホエイタンパク質）の量を定量すれば、ＭＦＧＭのタンパク質成分の重量が推定でき、ＭＦＧＭの純度が算出できる。この‘ＭＦＧＭ粉末’に含まれる可溶性タンパク質含量は50％であったため、ＭＦＧＭの純度はおよそ50％であった。
また、対照物として脱脂粉乳（よつ葉乳業社製）から糖質を除去した‘乳タンパク質’を用いた。この乳タンパク質には、全固形当たりタンパク質を86％、脂質を2％、糖質を5％、灰分を7％含有していた。

（２）経皮水分蒸散量の測定
これらの試料を用いて、以下に示す経皮水分蒸散量測定系により、ＭＦＧＭの水分蒸散量低下効果を、乳タンパク質と比較した。
４週齢のHos:HR-1雄性マウス（以下、HR-1と略）を株式会社星野試験動物飼育所より75匹購入した。このマウスは特殊飼料としてHR-AD用精製飼料（日本農産工業社製）を与えると、皮膚の経皮水分蒸散量が上昇し、アトピー様の皮膚炎を発症することが知られている。
予備飼育及び実験期間を通じ、温度22±3℃、湿度50±20％、換気回数13〜17回／時間、照明12時間（8:00〜20:00）の環境下で、ステンレスラックにポリカーボネート製ケージを設置し、個別に収容した。飼料は予備飼育及び実験期間を通じてポリカーボネート製ドーム型給餌器カバーを装着したステンレス製給餌器により自由に与えた。水はポリサルフォン製給水器（先管ステンレス製）により水道水を自由に与えた。動物入荷日の翌日にすべての動物について体重を測定した。検疫・馴化期間においてはすべての動物に普通飼料を与えた。
普通飼料として、ラボＭＲストック粉末（日本農産工業社製）を用い、予備飼育期間中の全ての群および群分け後の無処置群について与えた。また、マウスの経皮水分蒸散量を上昇させるために、特殊飼料としてHR-AD用精製飼料（日本農産工業社製）を群分け後の無処置群を除く全ての動物に、それぞれ被験物質を所定の量で混合して、混餌として与えた。成分表は以下の表１に示す通りである。

検疫・馴化期間終了日に、５週齢のHR-1マウスの体重及び背部皮膚の経皮水分蒸散量（以下、ＴＥＷＬと略称する場合がある。）を測定した。ＴＥＷＬの測定には、Tewameter TM300（Courage+Khazaka社製）を用いた。さらに体重も測定した。
検疫・馴化期間中の体重増加及び一般状態観察により健康とみなされた動物について、測定したＴＥＷＬの値を指標にして層別連続無作為化法により、表１の群構成表に基づき群分けを行った。
群分け翌日より、無処置群を除き、所定の量で投与物質が混合された特殊飼料の摂取を開始し、動物の安楽死及び皮膚摘出日まで自由に摂取させた。無処置群は引き続き普通飼料で飼育した。特殊飼料摂取開始後１回／週の割合で、体重、摂餌量及び背部皮膚のＴＥＷＬを測定した。

得られた数値は、各群で平均値及び標準誤差を算出した。
無処置群及び対照群間の有意差は、Ｆ検定により等分散性の検定を行い、等分散の場合はStudentの、不等分散の場合はAspin-Welchのｔ検定を行った。
対照群〜皮膚機能改善組成物群間の有意差は、Bartlett法により等分散性の検定を行った。等分散の場合には一元配置分散分析を行い、有意な場合はDunnett法により平均値の比較を行った。不等分散の場合はKruskal-WallisのＨ検定を行い、有意な場合はDunnett法により平均順位の比較を行った。Ｆ検定、Bartlett法、一元配置分散分析及びKruskal-WallisのＨ検定については有意水準を危険率5％、ｔ検定及びDunnett法については有意水準を危険率10％、5％及び1％とした。

６週間の飼育において、体重、摂餌量は群間の差異は認められなかった。ＴＥＷＬ量の変化を以下の表２に示す。なお、それぞれの数値は、１２例の平均値±標準誤差を示す。
各ＭＦＧＭ投与群において、「##」はＰ＜0.01、「#」はＰ＜0.05で、対照群（ＨＲ−ＡＤ用精製飼料のみを投与）と比較してDunnettの多重比較検定で有意差があるものを示す。
対照群において、「**」は、Ｐ＜0.01で無処置群（普通飼料のみを投与）と比較してｔ検定で有意差があるものを示す。

その結果、‘対照群’（HR-AD用精製飼料のみを投与）では、２週経過後から６週経過後にかけてＴＥＷＬは顕著な上昇を示し、無処置群と比較して、２週経過後以降の全てのポイントにおいて有意に高い値を示した。このことから、特殊飼料を摂取することによりHR-1マウスの背部皮膚の保湿能低下が誘発されたことが示された。
それに対して、‘1.5％ＭＦＧＭ投与群’は４週経過後、５週経過後及び６週経過後において、‘0.0125％ＭＦＧＭ投与群’は５週経過後及び６週経過後において、‘0.00415％ＭＦＧＭ投与群’は６週経過後において、それぞれ対照群と比較して有意に低い値を示した。
ＭＦＧＭを摂取した群が示した値は、投与量に依存していた。これらのことから、ＭＦＧＭはHR-1マウスの背部皮膚の経皮水分蒸散量の上昇を抑制し、保湿能低下を改善することが示された。

＜実施例２＞マウスを用いたＭＦＧＭの皮膚肥厚抑制効果
ＭＦＧＭにより経皮水分蒸散量が低下することが、実施例１において明らかとなった。そこで、経過週数６週目に背部皮膚の摘出を行った。得られた背部皮膚の一部は、定法に従って10％中性緩衝ホルマリンで固定した後にHematoxylin eosin染色を行い、病理組織学的検査を行った。病理組織学的検査により得られた病理組織像より、各動物における背部皮膚の表皮厚および真皮厚を測定した。また、皮膚の厚さは表皮厚と真皮厚の和とした。
背部皮膚の皮膚厚、真皮厚および皮膚の厚さを以下の表３に示す。なお、それぞれの数値は、１２例の平均値±標準誤差を示す。
また、各ＭＦＧＭ投与群において、「##」はＰ＜0.01で、対照群（HR-AD用精製飼料のみを投与）と比較してDunnettの多重比較検定で有意差があるものを示す。なお、対照群において、「**」は、Ｐ＜0.01で無処置群（普通飼料のみを投与）と比較してｔ検定で有意差があるものを示す。

その結果、‘対照群’（HR-AD用精製飼料のみを投与）では、表皮厚は56.3±2.8μｍ、真皮厚は379.6±14.8μmで、皮膚の厚さは0.44±0.02mmであり、表皮、真皮および皮膚の厚さのそれぞれについて無処置群と比較して有意に高い値を示したことから、対照群では皮膚肥厚が誘導されていると認められた。
それに対して、‘1.5％ＭＦＧＭ投与群’では、表皮厚は25.0±2.3μm、真皮厚は292.9±12.5μmで、皮膚の厚さは0.32±0.01mmであった。
また、‘0.0125％ＭＦＧＭ投与群’および‘0.00415％ＭＦＧＭ投与群’では、それぞれの表皮厚は41.7±2.1μmおよび46.7±2.2μm、真皮厚は318.3±13.0μmおよび332.1±10.9μmで、皮膚の厚さは0.36±0.01mmおよび0.38±0.01mmであった。
即ち、すべてのＭＦＧＭ投与群は、表皮、真皮および皮膚の厚さのそれぞれについて対照群と比較して有意に低い値を示し、また投与量に依存してより低値を示した。
これらのことから、ＭＦＧＭはHR-1マウスの背部皮膚の肥厚化を抑制し、正常な皮膚へと改善することが示された。

＜実施例３＞ＭＦＧＭにより経皮水分蒸散量の低下および皮膚肥厚が抑制されたマウスの遺伝子解析
ＭＦＧＭにより経皮水分蒸散量の低下および皮膚肥厚の抑制が、実施例１および実施例２において明らかとなった。この際にマウスの皮膚で発現しているIvl遺伝子とSprr遺伝子群の発現量を、リアルタイムＰＣＲによって解析した。
まず、実施例１の試験とほぼ同様の方法により、マウスの投与飼育を行った。但し、１群６匹として３群、すなわち‘無処置群’、‘対照群’および‘1.5％ＭＦＧＭ投与群’を設定した。
そして、経過週数４週を経過した時点で、マウスの背部皮膚から定法に従ってＲＮＡの抽出を行った。経過週数４週時の経皮水分蒸散量の値は表２とほぼ同様の値を示した。得られたＲＮＡを、PrimeScript(R) RT reagent Kit (Perfect Real Time)（タカラバイオ社製）を用いて逆転写反応してｃＤＮＡを得た。角質層の周辺帯の構成成分であるインボルクリンをコードする遺伝子（「Ivl」）と、Small proline-rich proteinをコードする遺伝子群（「Sprr1b」、「Sprr2a」、「Sprr2d」、「Sprr2e」、「Sprr2f」、「Sprr2g」および「Sprr2h」）を標的とし、リアルタイムＰＣＲを行った。
リアルタイムＰＣＲ反応は、SYBR(R) Premix EX TaqTMII (Perfect Real Time)（タカラバイオ社製）を使用し、ＰＣＲ装置と検出器はDNA Engine OpticonTM System <PTC−200 DNA EngineTM Cycler, CFD-3200 OpticonTM Detector>（MJ Research社製）を使用した。
各遺伝子の発現量は、グルクロニダーゼ−β遺伝子（Gusb、内部標準遺伝子）に対する量を求め、無処置群の発現量を１とした相対値で比較した。
発現解析した遺伝子と用いたプライマー配列（下記配列表の配列番号）との関係を表４に示す。
得られた結果に対して各群間の有意差は、Ｆ検定により等分散性の検定を行い、等分散の場合はStudentの、不等分散の場合はWelchのｔ検定を実施した。

得られた発現量を表５および図１に示す。なお、表５および図１における遺伝子発現量の比較において、「**」はＰ＜0.01、「*」はＰ＜0.05で、それぞれ無処置群に対して対照群を比較してｔ検定で有意差があることを示し、「##」はＰ＜0.01、「#」はＰ＜0.05で、それぞれ対照群（HR-AD用精製飼料のみを投与）に対して1.5％ＭＦＧＭ投与群を比較して、ｔ検定で有意差があるものを示す。

表５および図１が示すように、Ivl遺伝子とSprr遺伝子群の発現量に有意に差異が認められた。
‘対照群’（アトピー様の皮膚炎を発症するHR-AD用精製飼料を摂取し、経皮水分蒸散量が上昇した群）では、すべての遺伝子の発現量が、通常食を摂取した‘無処置群’（通常食を摂取した群）と比較して有意に亢進していた。
一方、‘1.5％ＭＦＧＭ投与群’（HR-AD用精製飼料に1.5％のＭＦＧＭを添加し経皮水分蒸散量が無処置群と同程度であった群）においては、Sprr2fを除く他の全てSprr遺伝子群とIvl遺伝子の発現量が‘対照群’と比較して有意に低下し、‘無処置群’の発現量に近づいていた。また、有意差は無いものの、Sprr2fも他の遺伝子同様の挙動を示した。
このことから、経口的に摂取したＭＦＧＭは、皮膚炎によって肌の恒常性が失われた結果、経皮水分蒸散量が上昇した皮膚において、過剰に発現したIvl遺伝子やSprr遺伝子群の発現量を通常の状態へと戻す作用を有していることが明らかとなった。
この結果は、角質層の成熟が阻害された皮膚において、角質層の構造を通常の状態へ回復させることによって角質層の機能を回復させ、経皮水分蒸散量の上昇を抑制していることを示唆している。
ＭＦＧＭがIvl遺伝子やSprr遺伝子群に対してこのような働きを持つことは従来知られていない。

＜実施例４＞ＭＦＧＭを含有するヨーグルトの調製
ＭＦＧＭを含有するヨーグルトを以下の要領で調製した。
すなわち、ＭＦＧＭを2.5％（w/w）になるように水に懸濁して40℃に加温後、カッターミキサーを使用して10分間10,000rpmで溶解させた。以下に示す‘低脂肪ヨーグルト’（表６）および‘無脂肪ヨーグルト’（表７）の処方に基づいて原料を調合して（ＭＦＧＭの終濃度0.5％）、60℃に加温した。
ホモジナイザーを用いて150kg/cm²で均質化した後、90℃、10分の殺菌工程を経て、４３℃に冷却した。
スターター（Yo-MIX 499）を0.15DCU/kgで植菌し、100g/容器になるよう充填を行い、43℃で培養を行った。ｐＨが4.7以下になった時点で10℃以下にまで冷却を行い、冷蔵した。

その結果、低脂肪や無脂肪タイプにおいても風味が非常に良好な試作物を得ることができた。
このようにして調製されたヨーグルトは、肌の潤いを保つための経皮水分蒸散量を低減させ、皮膚の乾燥状態を改善して、荒れ肌の改善や皮膚のバリア機能を向上させる効果が期待できる。

＜実施例５＞ＭＦＧＭを含有するサプリメントの調製
ＭＦＧＭを含有するサプリメントを以下の要領で調製した。
すなわち、以下に示す配合表（表８）に基づいて原材料を混合し、ロータリー型打錠機で打錠物を調製した。

このようにして調製されたサプリメントは、肌の潤いを保つための経皮水分蒸散量を低減させ、皮膚の乾燥状態を改善して、荒れ肌の改善や皮膚のバリア機能を向上させる効果が期待できる。

＜実施例６＞ＭＦＧＭのヒトの肌に対する改善効果
（１）ＭＦＧＭ含有食品の摂取試験
日常的に肌の乾燥を自覚している、肌の測定、理学的検査、医師診察および血液尿検査等に問題の無い20〜40歳の健康な男女40名を被験者とした。なお、本試験は、治験審査委員会の承認後、被験者の同意取得および試験全般においてヘルシンキ宣言に基づく倫理的原則および試験計画書を遵守して実施した。
試験食品は、実施例５に記載の配合で調製したＭＦＧＭサプリメントを被験食品とし、対照食品として、50％ＭＦＧＭ粉末を脱脂粉乳で置き換えたものを用意した。

試験はダブルブラインド法で試験を行った。まず、40人の被験者を２群に分けた。なお、試験開始初日（０週目）においては、以下に述べるすべての測定項目において群間に有意な差は認められなかった。
試験食品を朝５錠、昼５錠、夜６錠、28日間（2009年2月4日から2009年3月4日もしくは2009年2月5日から2009年3月5日）連日摂取させた上で、摂取初日（0週目）、2週目および4週目に検査測定を行った。検査項目は以下の通りである。

・Ａ）医師診察（スクリーニング時、0、2、4週目）
医師による問診、聴打診を行った。
・Ｂ）理学的検査（スクリーニング時、4週目）
身長（スクリーニング時のみ）、体重、体脂肪率、ＢＭＩ、体温、血圧および脈拍を測定した。
・Ｃ）血液学的検査（スクリーニング時、0、2、4週目）
白血球数、赤血球数、ヘモグロビン、ヘマトクリット、血小板数を測定した。測定には、多項目自動血球分析装置（SE9000）、多項目自動血球分析装置（XE2100：Sysmex社製）を使用した。
・Ｄ）血液生化学的検査（スクリーニング時、0、2、4週目）
総蛋白、Ａ／Ｇ、アルブミン、総ビリルビン、ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＬＤＨ、γ−ＧＴＰ、ＡＬＰ、尿素窒素、尿酸、クレアチニン、Ｎａ、Ｋ、Ｃｌ、空腹時血糖、総コレステロール、ＨＤＬ‐コレステロール、中性脂肪を測定した。
空腹時血糖値のみ自動分析装置JCA-BM9030（日本電子株式会社製）を使用して測定し、その他項目は自動分析装置JCA-BM8060（日本電子株式会社製）を使用した。
・Ｅ）尿検査（スクリーニング時、0、2、4週目）
糖、蛋白、潜血、ウロビリノーゲン、ｐＨ、比重を測定した。測定には、全自動尿分析装置 AUTION MAX AX-4280（アークレイ株式会社製）を使用した。
・Ｆ）顔の経皮水分蒸散変化量の測定（スクリーニング時、0、2、4週目）
経皮水分蒸散量を測定した。測定には、Tewameter TM300（Courage+Khazaka社製）を使用し、24±2℃、55±5％の恒温恒湿度室で20分以上馴化を行い、測定部位は左目の下1cmとした。
そして、試験食品摂取前の経皮水分蒸散量を０として、経時的に変化した量を蒸散量変化量とした。
・Ｇ）アンケート調査（0、1、2、3、4週目）
顔の皮膚に関して、乾燥、肌荒れ、はり、しっとり感、色つや、しわ、透明感、化粧のり（女性のみ）についてのアンケートを行った。
顔の肌の状態を、摂取前を０として、良くなった場合は２、やや良くなった場合は１、変化なしの場合は０、やや悪くなった場合は−１および悪くなった場合は−２として、１週間ごとに体感性を調査した。
・Ｈ）摂取記録
試験食品と健康食品や薬の利用および飲酒量（アルコールの種類や量）に関し、試験期間中毎日記入した。

試験開始後における被験者の除外基準として、試験食品の摂取率が９割を下回る者、禁忌食品・医薬品を摂取した者、測定日前日に明らかに普段の食生活からはずれた暴飲暴食を行った者は除外することとしたところ、対照食品群の男性、女性各1名、被験食品群の女性1名が禁忌医薬品を摂取していたことが判明した。そこで本試験では、3名の全データを除外して解析した。
摂取率は、対照食品群で100％、被験食品群で99.4％（最高100％、最低92.9％）であった。
そして、各項目の検査値については、群ごとに平均値±標準偏差で示した。各項目の試験食品間の比較については、Ｆ検定により等分散性の検定を行い、等分散の場合にはStudentのｔ検定を、不等分散の場合はAspin-Welchのｔ検定を行うことにより評価した。各群の摂取前に対する各摂取週との比較については、Paired ｔ検定で評価した。有意水準はＦ検定では両側５％、ｔ検定では両側５％および１％とした。

（２）結果
試験の結果、経皮水分蒸散量の変化量と肌アンケートの結果において、両群（被験食品群と対照食品群）で有意な差違が認められた。
なお、理学的検査、血液学的検査、血液生化学的検査、尿検査および医師診察所見の結果から、ＭＦＧＭに由来する有害事象に相当するものは認められなかった。

まず、経皮水分蒸散量の変化量の結果を表９に示す。
なお、変化量の値が大きいと皮膚の水分がより逃げやすい皮膚へと変化していることを示し、逆に小さい場合は水分を保持する能力が一定、もしくは改善して肌の潤いを保つことができると考えられる。
摂取前値と比較し、摂取2週後において、両群で蒸散量変化量が有意に上昇した。摂取4週後には対照食品群で蒸散量変化量が有意に上昇した。これは、実施期間が真冬であったことにより経皮水分蒸散量が上昇する季節要因が原因であることが考えられた。しかし、被験食品群では対照食品群と比較し、摂取4週後における蒸散量変化量が有意に低値を示した。つまり、脱脂粉乳を含有する対照食品では季節要因で経皮水分蒸散量が上昇し続けたのに対して、ＭＦＧＭを含有する被験食品では、摂取4週間後の経皮水分蒸散量が減少に転じたことは、ＭＦＧＭはヒトにおいても経皮水分蒸散量を低下させる作用があることを示している。
この結果で、ＭＦＧＭを含有する被験食品を4週間摂取すると、水分蒸散量の上昇を抑制しうることが示され、特に肌が乾燥しやすく、肌荒れが気になる冬季において、肌を正常に保ち得ることが示された。

対照食品=18名，被験食品=19名
*，**：摂取前と比較して有意差あり（それぞれp < 0.05，0.01）（Paired-t）
#：対照食品と比較して有意差あり（p <0.05）（t 検定）

次に、肌アンケート結果を表１０に示す。
「摂取前」と比較し、摂取1週後に対照食品群で顔の乾燥が、被験食品群で顔の透明感以外の全項目が、摂取2週後に対照食品群で顔の乾燥、顔の荒れが、被験食品群で顔の乾燥、顔の荒れおよび化粧のりが、摂取3週後に対照食品群で顔の乾燥が、被験食品群で顔の透明感以外の全項目が、摂取4週後に対照食品群で顔の乾燥が、被験食品群で全項目が、それぞれ有意に上昇した。
また、「対照食品群」と比較し、被験食品群で摂取３週後における顔の荒れ、顔の色つや、および化粧のりが、摂取4週後において全項目がそれぞれ有意な高値を示した。
この結果から、ＭＦＧＭの摂取によって、肌の乾燥に由来する肌質悪化への改善効果が実感できることが示された。

対照食品=18名（女性13名），被験食品=19名（女性12名）
平均値±標準偏差
摂取前を「0」とし，「よくなった：2」，「やや良くなった：1」，「変化なし：0」，「やや悪くなった：-1」，「悪くなった：-2」として計算した
*，**：摂取前と比較して有意差あり（それぞれp < 0.05，0.01）（Paired-t）
#，##：対照食品と比較して有意差あり（それぞれp <0.05， 0.01）（t 検定）

＜実施例７＞ヒトケラチノサイトに対するＭＦＧＭの効果
（１）脱脂酵素分解ＭＦＧＭの調製
実施例１と同様に調製したＭＦＧＭ粉末4.23gを、160mlの水に加え、ポリトロンホモジナイザーで十分に懸濁（19,500rpm、5分）した。そして、400mlのメタノール、200mlのクロロホルムを加えてさらにポリトロンホモジナイザーで懸濁（19,500rpm、10分）した。
次いで、懸濁液を分液ロートに移し、160mlの水と200mlのクロロホルムを加え、十分に倒置混和の後、一昼夜放置した。有機溶媒層を除去した後、水層に対して200mlのクロロホルムを加え、十分に倒置混和して一昼夜放置した。得られた水層を凍結乾燥してＭＦＧＭのタンパク質画分（脱脂ＭＦＧＭ粉末）を得た。
得られた脱脂ＭＦＧＭ粉末は難水溶性であるためにタンパク質加水分解酵素で分解することで、タンパク質をペプチドにして溶解性を向上させなければ、以下の試験に供することが出来ない。そこで、30mlの水に3gの脱脂ＭＦＧＭ粉末を加え、ポリトロンホモジナイザーで十分に懸濁（19,500rpm、5分）した。懸濁液に対して1％（v/v）のスミチームFLAVOR（新日本化学工業社製）、1％（w/w）のスミチームTP（新日本化学工業社製）および1％（w/w）のProtamex（novozymes社製）を加え、55℃で1時間反応させた。反応終了後、沸騰水浴中で5分間保持して酵素を失活させた。なお、コントロールとして、脱脂ＭＦＧＭ粉末を加えずに同様の操作を行ったものも同時に調製した。
なお、当該‘脱脂酵素分解ＭＦＧＭ’を、ペプチドＰＡＧＥに供したところ、含有されるタンパク質の平均分子量は、約1,000であることが明らかになった。

（２）ヒトケラチノサイト（ＨＥＫ）の培養
CELL APLLICATIONS, INC.から48歳・白色人種・女性・顔から採取した同一ロットのヒトケラチノサイト（ＨＥＫ）を購入した。凍結保存されたＨＥＫを、定法に従って取り扱い、0.05mMカルシウムを含有する増殖培地（Ca低含有）を用いて、5,000cells/cm²となるよう35mmディッシュに播種した。なお、増殖培地としては、KERATINOCYTE CALCIUM-FREE MEDIUM（CELL APLLICATIONS, INC.社製）を用い、培地のカルシウム源としては、滅菌済みの塩化カルシウム溶液を用いた。

群分けは、前記増殖培地に、終濃度で100μMになるように上記‘脱脂酵素分解ＭＦＧＭ’を加えて培養した群（ＭＦＧＭ群）と、；ＭＦＧＭを加えない酵素処理液（上記コントロール）を同量加えて培養した群（対照群）、；の２群とした。
両群とも、37℃、5％CO₂、湿潤状態でのインキュベーターで静置して培養し、隔日で培地交換を行った。
60％コンフルエント程度に達したところで、分化誘導培地（カルシウムを2mM含有する上記増殖培地）に交換した。その後、0、6、24時間経過時の細胞を回収し、以下の試験に供した。

（３）リアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現量の確認
分化誘導培地への交換後の各時間経過したＨＥＫから、定法に従ってＲＮＡの抽出を行い、実施例３と同様にして、角質層の周辺帯の構成成分であるインボルクリンをコードする遺伝子（「Ivl」）と、Small proline-rich proteinをコードする遺伝子群（「Sprr1a」、「Sprr1b」、「Sprr2a」、「Sprr2b」、「Sprr2c」、「Sprr2d」、「Sprr2e」、「Sprr2f」、「Sprr2g」、「Sprr3」および「Sprr4」）を標的とし、リアルタイムＰＣＲを行った。
各遺伝子の発現量は、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素遺伝子（Gapdh、内部標準遺伝子）に対する量を求め、対照群の発現量を１とした相対値で比較した。
発現解析した遺伝子と用いたプライマー配列（下記配列表の配列番号）との関係を表１１に示す。
得られた結果に対して各群間の有意差は、Ｆ検定により等分散性の検定を行い、等分散の場合はStudentの、不等分散の場合はWelchのｔ検定を実施した。

得られた発現量を表１２に示す。有意差が認められたのはSprr3とSprr4であったため、この２遺伝子の結果を示した。なお、遺伝子発現量の比較において、「*」はＰ＜0.05で対照群に対してｔ検定で有意差があることを示す。

その結果、分化誘導培地への交換直後（0時間）において、ＭＦＧＭ群では対照群と比較してSprr3とSprr4の両遺伝子の発現量は、有意差は認められなかったものの、約半分の発現量であった。
また、分化誘導培地への交換後、対照群ではSprr3とSprr4の両遺伝子の発現量が上昇し続けるのに対して、ＭＦＧＭ群では6時間で一旦発現量が上昇するものの、24時間経過後では、対照群よりも有意に低くなった。詳しくは、Sprr3の発現量は対照群の約0.37倍に、Sprr4の発現量は約0.48倍になった。
以上の結果から、脱脂したＭＦＧＭに由来するペプチドは、ＨＥＫにおけるSprr遺伝子群の発現量を抑制する作用を有していることが明らかとなった。この様な知見は従来知られていない。

＜実施例８＞高純度ＭＦＧＭの調製
ＭＦＧＭを以下の方法で調製した。すなわち、‘濃縮バターミルク’（よつ葉乳業社製全固形分30％）を温水で全固形分が6％になるように希釈し、50℃に保持した。その後、0.8μmの精密ろ過膜を有する精密ろ過機（MFS-1：日本テトラパック社製）で精密ろ過を行い、得られた保持液をASM100型円筒型連続遠心分離機（巴工業社製）で沈殿物を得た。
得られた沈殿物を2％固形分になるよう再懸濁後、凍結乾燥して、高純度の‘ＭＦＧＭ粉末’を調製した。

本発明は、食経験の豊富な安全な素材であって、より安価な経口摂取用の皮膚機能改善効果を有する組成物を提供する。
従って、本発明に係る皮膚機能改善用組成物は、日常的な食事などとして摂取することによって、皮膚の乾燥状態を改善して荒れ肌の改善や皮膚のバリア機能を向上させる効果が期待される。
また、本発明は、前記効果を奏する皮膚機能改善剤を提供し、医薬分野への応用も期待される。

Claims

バターミルク、濃縮バターミルク、或いはバターミルクパウダーを精密ろ過することによって得られる精密ろ過の保持液を遠心分離することにより調製された沈殿物又はその乾燥物を有効成分として含有してなる、経口摂取用の皮膚機能改善用薬剤。
皮膚の乾燥状態の改善用である、請求項１記載の皮膚機能改善用薬剤。
経皮水分蒸散量低減用である、請求項１記載の皮膚機能改善用薬剤。
表皮肥厚抑制用である、請求項１記載の皮膚機能改善用薬剤。
角質層の周辺帯の構成成分であるSmall proline-rich proteinをコードする遺伝子群（Sprr遺伝子群）とインボルクリンをコードする遺伝子（Ivl遺伝子）の発現量を正常化させて経皮水分蒸散量を低減する、請求項３に記載の皮膚機能改善用薬剤。