JP5675597B2 - ***の使用の検出 - Google Patents
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Description
前記軽鎖の領域が、配列番号1のアミノ酸24-35、51-57、および90-98のアミノ酸配列を有し、前記重鎖の領域が、配列番号2のアミノ酸27-36、51-66、および99-107のアミノ酸配列を有する。好ましくは、テストキットは、非競合的均一アッセイを実施するための試薬、たとえばTR-FRETテストに必要な試薬を含む。キットは、反応溶液、緩衝液、洗浄溶液および検出手段、たとえば標識および任意にフルオロメーターを更に含んでいてもよい。
抗-THC Fabの開発
マウスは、フロイントアジュバントにおいて、THC結合BSA(Fitzgerald)で免疫処置し、2回目のブースター後に血清サンプルをテストし、直接ELISAにおいて抗原に対してベストな応答を示すマウスを、抗体ファージディスプレイライブラリーの供給源となるように選択した。WO 2004/046733に記載されるとおり、抗体フラグメントファージディスプレイライブラリーを構築し、THC-特異的ファージを濃縮し(enrich)、個々のクローンのFab遺伝子フラグメントを単離し、発現させて特徴付けをした。抗-THC T3 Fabを、更なるアッセイのために選択した。
抗-THC FabとTHCの免疫複合体に対する抗-免疫複合体抗体の開発
ナイーブなヒトscFvファージディスプレイライブラリーからの免疫複合体特異的抗体の選択
T3 FabフラグメントをImmunoPure Sulfo-NHS-LC-Biotin Kit (Pierce) を用いてビオチン化した。ビオチン化抗体を精製し、緩衝液をEcono-Pac 10DG Columns (Bio-Rad, CA, USA) を用いてPBSに変更した。BSA/PBS中の200μlのナイーブなヒトscFvファージディスプレイライブラリー (カッパまたはラムダ軽鎖) を、10μlのストレプトアビジンコート磁気ビーズ (Dynal, M-280) および0.5μgのビオチン化T3 Fabと、+4℃で一晩かけてプレインキュベートした。ナイーブなヒトscFvファージディスプレイライブラリーは、50人の健康な個体のプールリンパ球から構築した。ライブラリーのサイズは、1x108 クローンであると推定された。ナイーブなヒトscFvファージディスプレイライブラリーは、カッパまたはラムダ特異的VL-遺伝子の何れかと結合したIgM特異的VH-遺伝子を含有する。未結合のファージは、ビーズから分離し、それらの100μlを、100 ngのTHC、500 ngのビオチン化T3 Fab、および5μlのストレプトアビジンコート磁気ビーズと、シェーカーでRTで1時間インキュベートした。選択手順のためのバックグラウンドは、結合反応からTHCを除去したことを除いて同様の方法で実施した。磁気ビーズは、0.5 mlのPBSで5回洗浄し、結合したファージを100μlのHCl (pH 2.2) で30分間溶出した。溶出されたファージを1M Trisで中和し、E. coli XL1-Blue細胞を感染させた。細胞を増殖させ、ファージを、WO 2004/046733に記載されるとおり精製した。溶出したファージを、バックグラウンドコントロールウェルから溶出したファージの量と比較した場合、3回のパンニングラウンドの後、濃縮(enrichment)が観察された。また、T3 FabとTHCにより形成された免疫複合体に特異的なバインダーの濃縮(enrichment)は、選択ラウンドから溶出したファージプールをテストした場合、および個々のscFvファージクローンを分析することにより、ファージELISAで明らかに観察された。
T3+THC複合体に特異的に結合する個々のscFvファージクローンを採取し、配列決定し、発現させてテストした。クローン104は、更なる調査のために選択した。scFvは、発現と精製の間に凝集する傾向があるため、免疫複合体特定的なクローン104は、ヒトのラムダ軽鎖の遺伝子領域およびIgG1 CH1定常領域をそれぞれVLおよびVH遺伝子にクローニングすることにより、Fabフラグメントに変換した。6つのヒスチジン残基を含有するC-末端タグを、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)精製のために、CH1のC-末端に挿入した。104 Fabフラグメントを、発現ベクターpKKtacにクローニングし、配列を確認した。抗-T3+THC免疫複合体Fab 104軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号3として記載され、Fab VH-CH1-6His-タグ領域のアミノ酸配列は、配列番号4として記載される。配列番号3のアミノ酸no 1-111は、軽鎖の可変領域を表し、配列番号4のアミノ酸no 1-120は、重鎖の可変領域を表す。配列番号3のアミノ酸no 112-216は、ヒトのラムダ軽鎖の定常領域を表し、配列番号4のアミノ酸no 121-223は、ヒトの重鎖CH1領域の定常領域を表す。重鎖の定常領域のC-末端にある6つのヒスチジン残基は、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)によるFabフラグメントの精製を促進する。
104 Fabフラグメントの発現ベクターを、E.coli生産株RV308に形質転換した。細胞を、100μg/mlアンピシリンおよび2%グルコースを含む25 mlのTB培地(酵母抽出物12 g/l、大豆ペプトン24 g/l、KH2PO4 2.31 g/l、K2HPO4 12.54 g/l、グリセロール 5 g/l、pH 7.1)に接種し、シェーカーで+37℃で一晩インキュベートした。一晩の培養の後、6 mlの接種物を、100μg/mlのアンピシリンを含む300 mlのTBを含有する2つのエルレンマイヤーボトルに添加した。細胞は、OD600が4になるまでシェーカーで+37℃でインキュベートし、その後、0.3 mlの1M IPTGおよび100μg/mlのアンピシリンを培養物に添加し、インキュベーションをシェーカーで+30℃で一晩継続した。培地の上清を、104 Fabフラグメントの精製のために使用した。細胞を4°で20分間4000 gで遠心分離し、上清をきれいなフラスコに注いだ。上清を、残りの染色体DNAを除去するために2 mg/mlのDNaseIで+37℃で1時間処理した。発現したFab 104は、そのC-末端に6xHis-タグを有しているため、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)により精製することができた。Fab 104は、Ni2+ Chelating Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech) により精製した。Fab 104の純度は、SDS-PAGEで確認した。
THCのための均一(homogenous)時間分解蛍光共鳴エネルギー移動 (TR-FRET) イムノアッセイ
抗-THC FabフラグメントT3は、LANCE Eu-W1024 ITC chelate Kit (Wallac) によりユーロピウムで標識した。標識T3の緩衝液は、50 mM Tris、pH 7.8、0.9% NaClに変更した。抗-T3 + THC 免疫複合体Fabフラグメント104は、Alexa Fluor Protein Labeling kit (Molecular Probes, Inc.) によりAlexa Fluor 647で標識した。
Claims (15)
- テトラヒドロカンナビノール(THC)と配列番号1および配列番号2のアミノ酸配列を有する抗-THC抗体フラグメントとの免疫複合体を特異的に認識し、かつ、抗体の軽鎖および重鎖の相補性決定領域(CDRs)を含む抗体フラグメントであって、前記軽鎖の領域が、配列番号3のアミノ酸23-35、51-57、および93-100のアミノ酸配列を有し、前記重鎖の領域が、配列番号4のアミノ酸29-35、50-60、および99-109のアミノ酸配列を有する抗体フラグメント。
- 請求項1に記載の抗体フラグメントであって、配列番号3のアミノ酸1-111および配列番号4のアミノ酸1-120を含む抗体フラグメント。
- 請求項2に記載の抗体フラグメントであって、配列番号3および配列番号4のアミノ酸配列を含む抗体フラグメント。
- 請求項1〜3の何れか1項に記載の抗体フラグメントおよび別の抗体フラグメントを含む、THCを検出するためのテストキットであって、別の抗体フラグメントが配列番号1および配列番号2のアミノ酸配列を含むテストキット。
- 請求項4に記載のテストキットであって、非競合的均一イムノアッセイのための試薬を含むテストキット。
- 請求項5に記載のテストキットであって、時間分解蛍光共鳴エネルギー移動(TR-FRET)のための試薬を含むテストキット。
- 請求項4〜6の何れか1項に記載のテストキットであって、複数の乱用薬物をアッセイするための試薬を含むテストキット。
- ***を使用したことについてテストされるヒトから採取した身体サンプルにおいてテトラヒドロカンナビノール(THC)を検出するための、請求項1〜3の何れか1項に記載の抗体フラグメントと抗-THC抗体フラグメントとの使用であって、前記抗-THC抗体フラグメントが配列番号1および配列番号2のアミノ酸配列を含む使用。
- 身体から採取したサンプルにおいて分析物を検出するためのイムノアッセイ方法であって、分析物に特異的に結合する第一の抗体フラグメントおよび分析物と第一の抗体フラグメントの複合体に特異的に結合する第二の抗体フラグメントを含む試薬ペアと、サンプルを反応させ、前記複合体への第二の抗体フラグメントの結合を決定し、このことが、サンプル中の分析物の存在を示し、
前記分析物がテトラヒドロカンナビノール(THC)であること、前記第一の抗体フラグメントが、配列番号1および配列番号2のアミノ酸配列を含み、ならびに前記第二の抗体フラグメントが、抗体の軽鎖および重鎖の相補性決定領域(CDRs)を含み、ここで前記軽鎖の領域が、配列番号3のアミノ酸23-35、51-57、および93-100のアミノ酸配列を有し、前記重鎖の領域が、配列番号4のアミノ酸29-35、50-60、および99-109のアミノ酸配列を有することを特徴とする、イムノアッセイ方法。 - 非競合的均一イムノアッセイ方法である、請求項9に記載のイムノアッセイ方法。
- TR-FRETである、請求項10に記載のイムノアッセイ方法。
- 請求項9〜11の何れか1項に記載のイムノアッセイ方法であって、分析されるサンプルが、血液、尿、および口腔流体からなる群より選択されるイムノアッセイ方法。
- THCが唾液から決定される、請求項9に記載のイムノアッセイ方法。
- 請求項1〜3の何れか1項に記載の抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項1〜3の何れか1項に記載の抗体フラグメントを発現することができる宿主細胞。
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