JP5674789B2 - gntRを破壊することによって生産性が向上したイソプロピルアルコール生産細菌 - Google Patents
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Description
植物由来原料から製造されたイソプロピルアルコールは、脱水工程を経てプロピレンに変換できることから、カーボンニュートラルなプロピレンの原料として有望である。またアセトンも溶剤、プラスチックの原料として幅広く使われている。京都議定書によって2008年から2012年の間に先進国全体で二酸化炭素排出量を1990年比で5%削減することが義務付けられている現在、カーボンニュートラルなプロピレンはその汎用性から地球環境上極めて重要である。
上記のような再使用においては、アセトンから高選択的にプロピレンを製造する方法を工業上、実用的に確立することが必要とされている。また、Cu(25%)−酸化亜鉛(35%)−酸化アルミニウム(40%)触媒の存在下、400℃でアセトンの水素化反応を行い、プロピレンを得る方法も知られている(例えば、東ドイツ特許 DD84378号公報参照)。しかし、この方法では、反応温度が400℃と高温であるにも関わらず、アセトン転化率が89%と低い。また該方法ではプロピレンが水添されることによりプロパンが生成する副反応のため、プロピレン選択性も89%と不充分である。
本発明は、イソプロピルアルコールの生産性を大幅に向上させた大腸菌、該大腸菌を用いたイソプロピルアルコール生産方法及びアセトン生産方法、更には該大腸菌を用いて得られたアセトンを含有するイソプロピルアルコールから、プロピレンを生産する方法を提供することを目的とする。
〔1〕イソプロピルアルコール生産系を備え、転写抑制因子GntRの活性が不活化されており、該不活化に伴うイソプロピルアルコール生産能を維持又は強化する酵素活性パターンとして下記(1)〜(3)のいずれかを備えた、イソプロピルアルコール生産大腸菌。
(1)グルコース−6−リン酸イソメラーゼ(Pgi)活性、グルコース−6−リン酸−1−デヒドロゲナーゼ(Zwf)活性、及びホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(Gnd)活性の野生型の維持。
(2)グルコース−6−リン酸イソメラーゼ(Pgi)活性の不活化と、グルコース−6−リン酸−1−デヒドロゲナーゼ(Zwf)活性の強化。
(3)グルコース−6−リン酸イソメラーゼ(Pgi)活性の不活化と、グルコース−6−リン酸−1−デヒドロゲナーゼ(Zwf)活性の強化と、ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(Gnd)活性の不活化。
〔2〕 前記グルコース−6−リン酸−1−デヒドロゲナーゼ(Zwf)活性が、エシェリヒア属細菌由来のグルコース−6−リン酸−1−デヒドロゲナーゼ(Zwf)をコードする遺伝子に由来するものである[1]に記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
〔3〕 前記イソプロピルアルコール生産系が、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ、CoAトランスフェラーゼ及びチオラーゼの各酵素遺伝子により構築されたものである[1]又は[2]に記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
〔4〕 前記イソプロピルアルコール生産系が、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ、CoAトランスフェラーゼ及びチオラーゼの各酵素遺伝子により構築されたものであり、かつ各酵素遺伝子が、それぞれ独立に、クロストリジウム属細菌、バチルス属細菌及びエシェリヒア属細菌からなる群より選択された少なくとも1種の原核生物に由来するものである[1]〜[3]のいずれかに記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
〔5〕 前記アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性が、クロストリジウム・アセトブチリカム由来の酵素をコードする遺伝子に由来するものであり、前記イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性がクロストリジウム・ベイジェリンキ由来の酵素をコードする遺伝子に由来するものであり、前記CoAトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性がエシェリヒア・コリ由来の各酵素をコードする遺伝子に由来するものである[3]又は[4]記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
〔6〕 前記イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ及び前記アセト酢酸デカルボキシラーゼの少なくとも1つの活性が、遺伝子改変体として導入された遺伝子に由来する[3]〜[5]のいずれかに記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
〔7〕 前記イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼの遺伝子改変体が配列番号40で表される塩基配列であり、前記アセト酢酸デカルボキシラーゼの遺伝子改変体が配列番号43で表される塩基配列である[6]に記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
〔8〕 さらに、スクロース非PTS遺伝子群のうちスクロース加水分解酵素遺伝子を少なくとも有する[1]〜[7]のいずれかに記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
〔9〕 [1]〜[8]のいずれかに記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いて植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産することを含むイソプロピルアルコール生産方法。
〔10〕 [1]〜[8]のいずれかに記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いて植物由来原料からイソプロピルアルコールを得ること、及び
得られたイソプロピルアルコールに、触媒として、酸化亜鉛と、第4族の元素を含む少なくとも1種の酸化物とを含有し且つ共沈法で調製された複合酸化物を接触させることを含む、アセトン生産方法。
〔11〕 [1]〜[8]のいずれかに記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いて植物由来原料から得られ且つアセトンを含有するイソプロピルアルコールに、反応温度50〜300℃の範囲で、触媒として固体酸物質およびCuを含む水添触媒を接触させることを含む、プロピレンの製造方法。
〔12〕 前記Cuを含む水添触媒が、さらに第6族、第12族、および第13族のうち少なくとも一つの元素を含む触媒である[11]に記載のプロピレンの製造方法。
〔13〕 前記固体酸物質がゼオライトである[11]又は[12]に記載のプロピレンの製造方法。
本発明のイソプロピルアルコール生産大腸菌では、GntR活性が不活化されていると共に、上記所定の酵素活性パターンの補助酵素群を備えているため、イソプロピルアルコールを高生産することができる。
また、この際、GntRの活性の不活化により向上したイソプロピルアルコール生産能に影響する酵素が存在することが見出された。これらの酵素の活性のパターンによって、GntRの活性の不活化により向上したイソプロピルアルコール生産能が維持又は強化される。
例えば、所定のイソプロピルアルコール生産能を発揮するイソプロピルアルコール生産系を備え、且つ遺伝子組み換え技術によりGntRを不活化した以外は、何ら人為的に変更していないイソプロピルアルコール生産大腸菌、及び、イソプロピルアルコールの生産能を高めるための改変が付与されたイソプロピルアルコール生産系を備え、且つ、遺伝子組み換え技術によりGntRを不活化した以外は、何ら人為的に変更していないイソプロピルアルコール生産大腸菌は、前記イソプロピルアルコール生産大腸菌に包含される。
(1)グルコース−6−リン酸イソメラーゼ(Pgi)活性、グルコース−6−リン酸−1−デヒドロゲナーゼ(Zwf)活性及びホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(Gnd)活性の野生型の維持、
(2)グルコース−6−リン酸イソメラーゼ(Pgi)活性の不活化と、グルコース−6−リン酸−1−デヒドロゲナーゼ(Zwf)活性の強化、
(3)グルコース−6−リン酸イソメラーゼ(Pgi)活性の不活化と、グルコース−6−リン酸−1−デヒドロゲナーゼ(Zwf)活性の強化と、ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(Gnd)活性の不活化。
なかでも、上記(3)の補助酵素群の酵素活性パターンがイソプロピルアルコール生産能の観点からより好ましい。
本発明における「遺伝子組換え技術により」との文言は、生来の遺伝子の塩基配列に対する別のDNAの挿入、あるいは遺伝子のある部分の置換、欠失又はこれらの組み合わせによって塩基配列上の変更が生じているものであれば全て包含し、例えば、突然変異が生じた結果得られたものであってもよい。
強化の方法としては、イソプロピルアルコール生産大腸菌が有している各種酵素の活性が高まれば、特に制限はなく、菌体外から導入された酵素遺伝子による強化、菌体内の酵素遺伝子の発現増強による強化、及びこれらの組み合わせを挙げることができる。
本発明において「宿主」とは、ひとつ以上の遺伝子を菌体外から導入された結果、本発明のイソプロピルアルコール生産大腸菌となる当該大腸菌を意味する。
以下に、本発明について説明する。
本発明におけるグルコース−6−リン酸イソメラーゼ(Pgi)とは、国際生化学連合(I.U.B.)酵素委員会報告に準拠した酵素番号5.3.1.9に分類され、D−グルコース−6−リン酸からD−フルクトース−6−リン酸を生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
そのようなものとしては、例えば、Deinococcus radiophilus等のDeinococcus属菌、Aspergillus niger、Aspergillus aculeatus等のAspergillus属菌 、Acetobacter hansenii等のAcetobacter属菌、Thermotoga maritima等のThermotoga属菌、Cryptococcus neoformans等のCryptococcus属菌、Dictyostelium discoideum等のDictyostelium属菌、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas aeruginosa等のPseudomonas属、Saccharomyces cerevisiae等のSaccharomyces属、Bacillus megaterium等のBacillus属菌、Escherichia coli等のEscherichia属菌由来のものが挙げられる。
好ましくは、イソプロピルアルコールの生産に関与する酵素活性の強化を挙げることができる。本発明におけるイソプロピルアルコール生産大腸菌は、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、CoAトランスフェラーゼ活性及び前述したチオラーゼ活性の4種類の酵素活性が、菌体外から付与され若しくは菌体内において発現増強され、又はこれら双方がなされていることが更に好ましい。
そのようなものとしては、例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)、クロストリジウム・ベイジェリンキ(Clostridium beijerinckii)等のクロストリジウム属細菌、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)等のエシェリヒア属細菌、ハロバクテリウム種(Halobacterium sp.)細菌、ズーグロア・ラミゲラ(Zoogloea ramigera)等のズーグロア属細菌、リゾビウム種(Rhizobium sp.)細菌、ブラディリゾビウム・ジャポニカム(Bradyrhizobium japonicum)等のブラディリゾビウム属細菌、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)等のカンジダ属細菌、カウロバクター・クレセンタス(Caulobacter crescentus)等のカウロバクター属細菌、ストレプトマイセス・コリナス(Streptomyces collinus)等のストレプトマイセス属細菌、エンテロコッカス・ファカリス(Enterococcus faecalis)等のエンテロコッカス属細菌由来のものが挙げられる。
そのようなものとしては、例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)、クロストリジウム・ベイジェリンキ(Clostridium beijerinckii)等のクロストリジウム属細菌、バチルス・ポリミクサ(Bacillus polymyxa)等のバチルス属細菌由来のものが挙げられる。
そのようなものとしては、例えば、クロストリジウム・ベイジェリンキ(Clostridium beijerinckii)等のクロストリジウム属細菌由来のものが挙げられる。
そのようなものとしては、例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)、クロストリジウム・ベイジェリンキ(Clostridium beijerinckii)等のクロストリジウム属細菌、ローセブリア・インテスチナリス(Roseburia intestinalis)等のローセブリア属細菌、ファカリバクテリウム・プラウセンツ(Faecalibacterium prausnitzii)等ファカリバクテリウム属細菌、コプロコッカス(Coprococcus)属細菌、トリパノソーマ・ブルセイ(Trypanosoma brucei)等のトリパノソーマ、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli:大腸菌)等エシェリヒア属細菌由来のものが挙げられる。
酵素活性の導入は、例えば酵素をコードする遺伝子を遺伝子組換え技術を用いて宿主細菌の菌体外から菌体内に導入することにより行うことができる。このとき、導入される酵素遺伝子は、宿主細胞に対して同種又は異種のいずれであってもよい。菌体外から菌体内へ遺伝子を導入する際に必要なゲノムDNAの調製、DNAの切断及び連結、形質転換、PCR(Polymerase Chain Reaction)、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設計、合成等の方法は、当業者によく知られている通常の方法で行うことができる。これらの方法は、Sambrook, J., et al., ”Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press,(1989)などに記載されている。
本発明におけるプロモーターとはシグマ因子を有するRNAポリメラーゼが結合し、転写を開始する部位を意味する。例えばエシェリヒア・コリ由来のGAPDHプロモーターはGenBank accession number X02662の塩基配列情報において、塩基番号397−440に記されている。
このことから、CoAトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性が宿主大腸菌のゲノム遺伝子より得られたものである場合、充分なイソプロピルアルコール生産能力を獲得する観点から、両酵素遺伝子の発現を担うプロモーターを他のプロモーターと置換する等によって両酵素遺伝子の発現を増強することが好ましい。CoAトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性の発現を増強するために用いられるプロモーターとしては、前述のエシェリヒア・コリ由来GAPDHプロモーター等を挙げることができる。
更に好ましい態様としては、上記pIPA/B株、pIaaa/B株又はpIa/B::atoDAB株のGntR活性とグルコース−6−リン酸イソメラーゼ(Pgi)活性を不活化し、グルコース−6−リン酸−1−デヒドロゲナーゼ(Zwf)活性を強化した株である。
スクロース資化酵素をコードする遺伝子としては、微生物のスクロース資化経路のうち、PTS系と非PTS系に関与する酵素群をコードする遺伝子が含まれる。
具体的にスクロースPTSに関与する酵素群をコードする遺伝子としては、ScrA(スクロースの取り込みを行う)、ScrY(スクロースのリン酸化を行う)、ScrB(微生物内部でスクロースの分解を行う)、ScrR(ScrA,Y,Bをコードする遺伝子の発現を制御する)、ScrK(フルクトースのリン酸化を行う)をコードする遺伝子が挙げられる。
本発明において「遺伝子改変体」とは、当該酵素遺伝子の塩基配列に、欠失、置換、付加等の改変を加えたものすべてが含まれる。具体的には、当該酵素遺伝子の塩基配列のうち、コドンのみに変更を加え、当該コドンのみに変更を加えた塩基配列を基に合成されるアミノ酸配列には変更がないものや、当該酵素遺伝子のプロモーター領域のみに変更を加え、当該プロモーター領域のみに変更を加えた塩基配列を基に合成されるアミノ酸配列には変更がないものなどが挙げられる。
改変される酵素遺伝子は、宿主本来の遺伝子であってもよく、他種の微生物由来の酵素遺伝子であってもよい。
またイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼをコードする酵素遺伝子のみ又はアセト酢酸デヒドロゲナーゼ酵素遺伝子のみが、遺伝子改変されていてもよく、これらが同時に遺伝子改変されていてもよい。
好ましくは、遺伝子改変体は、大腸菌のコドン使用頻度に基づいて使用コドンを改変した改変体遺伝子である。このような遺伝子改変体とすることにより、イソプロピルアルコールの生産性を上げることができる。
より好ましくは、イソプロピルアルコール生産能が予め付与された大腸菌であることができ、これにより、より効率よくイソプロピルアルコールを生産させることができる。
なお、本方法における混合物とは、大腸菌の培養に一般的に用いられる基本培地を主体とすればよい。培養条件については、前述した事項がそのまま適用される。
回収されたイソプロピルアルコールが水溶液の状態である場合には、本イソプロピルアルコールの生産方法は、回収工程に加えて、脱水工程を更に含んでいてもよい。イソプロピルアルコールの脱水は、常法により行なうことができる。
この生産装置では、イソプロピルアルコール生産細菌と植物由来原料とを含む培地が収容された培養槽に、装置外部から気体を注入するための注入管が連結され、培地に対してエアレーションが可能となっている。
また、培養槽には、連結管を介して、捕捉液としてのトラップ液が収容されたトラップ槽が連結されている。このとき、トラップ槽へ移動した気体又は液体がトラップ液と接触してバブリングが生じる。
これにより、培養槽で通気培養により生成したイソプロピルアルコールは、エアレーションによって蒸散して培地から容易に分離される共に、トラップ槽においてトラップ液に補足される。この結果、イソプロピルアルコールを、より精製された形態で連続的に且つ簡便に生産することができる。
前記イソプロピルアルコール生産大腸菌を用いて得られたイソプロピルアルコールに、共沈法で調製された前記複合酸化物を接触させることにより、脱水素反応が生じて、イソプロピルアルコールからアセトンが生産できる。これにより、前記イソプロピルアルコール生産大腸菌を用いて生産されたイソプロピルアルコールを効果的に利用して、効率よく物質生産を行うことができる。
第4族の元素とは、周期律表の第4族の元素を意味し、チタン、ジルコニウム及びハフハニウム等を挙げることができる。アセトンを高選択的に生産するとの点で、ジルコニウムであることが好ましい。
酸化亜鉛と、第4族元素を含む少なくとも1種の酸化物との比率については、特に制限はないが、50:50〜99:1とすることが、触媒活性及びアセトン選択性の点で好ましく、65:35〜95:5とすることがより好ましい。酸化亜鉛の比率が50以上であればより高い触媒活性を示すことができ、99以下であればより高いアセトン選択性を示すことができるため好ましい。
共沈共沈法とは、多成分系の複合酸化物を製造する方法として一般的に用いられる調製法であり、2種類以上の金属塩の混合水溶液にアルカリ水溶液のような沈殿剤を加えることで、固体として均一に沈殿させることができる。
脱水素反応を行う際の反応温度は通常100℃〜500℃、好ましくは150℃〜450℃、さらに好ましくは200℃〜400℃とすることができる。アセトンとイソプロピルアルコール、水素には平衡関係があり、反応温度が高いほうがアセトンの平衡組成が高くなる。このため、反応温度が100℃以上であればイソプロピルアルコールが大量に残存することなく、好ましい。また500℃以下であれば、望ましくない副反応の増大を招くことがなく好ましい。反応圧力には特に限定はなく、反応温度にも依存するが、好ましくは0.1MPa〜1.0MPaとすることができる。
反応生成物の回収後には、必要に応じて、適宜、精製等を追加的に行ってもよい。アセトンの精製方法等については、当業界で周知又は公知の精製方法を適用することができる。
前記プロピレン生産方法では、前記イソプロピルアルコール生産大腸菌により得られたイソプロピルアルコールが、前記固体酸物質により、イソプロピルアルコールが脱水されてプロピレンおよび水が生成する。
前記触媒反応工程では、イソプロピルアルコール生産工程で得られたアセトンを含むイソプロピルアルコールを原料として、Cuを含む水添触媒および固体酸物質を用いて所定の条件下で、アセトンと水素を反応させる。
反応器へ水素ガスを供給する場合には、通常は連続的に供給するが、この方法に特に限定されるものではない。水素の供給の形態としては、反応開始時に水素ガスを供給した後、反応中供給を停止し、ある一定時間経過後に再度供給する間欠的な供給でもよいし、液相反応の場合には溶媒に水素ガスを溶解させて供給してもかまわない。
前記触媒反応工程に適用される反応温度は、50℃〜300℃である。50℃未満では、充分なアセトン、又はイソプロピルアルコールの転化率が得られず、また300℃を超えると予想外の副反応やプロピレンの重合等が生じて充分なプロピレンの選択率が維持できない。経済性の点で、反応温度は、好ましくは150℃〜250℃、より好ましくは150〜200℃の範囲である。
特にゼオライトとしては、イソプロピルアルコールやプロピレンの分子径に近いことから、酸素10〜12員環の細孔を有するゼオライトが好ましい。酸素10〜12員環を有するゼオライトとしては、フェリエライト、ヒューランダイト、ZSM−5、ZSM−11、ZSM−12、NU−87、シーター1、ウェイネベアイト、X型ゼオライト、Y型ゼオライト、USY型ゼオライト、モルデナイト、脱アルミニウムモルデナイト、β−ゼオライト、MCM−22、MCM−56などが挙げられる。これらの中でもβ−ゼオライトが好ましい。
また、前記Cuを含む水添触媒には、PbSO4、FeCl2、SnCl2などの金属塩;K、Naなどのアルカリ金属やアルカリ金属塩;BaSO4;などを添加してもよく、これにより、前記Cuを含む水添触媒の活性やプロピレンの選択率が向上する場合がある。前記金属塩、アルカリ金属又はアルカリ金属塩の前記水添触媒への添加量としては、特に制限はないが、主に選択性の点で、0.01質量%〜10.00質量%であることが好ましい。
市場で入手できるCuを含む水添触媒としては、例えば、CuO−ZnO−Al2O3、CuO−Cr2O3−BaOなどが挙げられる。
固体酸物質と水添触媒との量比は特に限定されないが、固体酸物質:水添触媒(質量比)が、通常は1:0.01〜1:100、好ましくは1:0.05〜1:50であることが好ましい。固体酸物質:水添触媒の量比が1:0.01以上であれば、十分なアセトンの転化率となる傾向があり、また固体酸物質:水添触媒の量比が1:100以内であれば、脱水反応が十分に行われてプロピレンの収率が十分となる傾向がある。
本発明においては、触媒として固体酸物質と、水添触媒との2成分を用いればよい。また、その触媒の使用方法としては、特に限定はなく、例えば、酸触媒成分である、固体酸物質と、水添触媒とをセンチメートルサイズの触媒粒子レベルで物理混合したものを用いてもよいし、両者を微細化し混合した後に、改めてセンチメートルサイズの触媒粒子へ成形してもよいし、固体酸物質を担体として、その上に水添触媒を担持してもよいし、水添触媒を担体として、その上に固体酸物質を担持してよい。また、水添触媒と、固体酸物質とを混合等することなく、各々を用いてもよい。
本発明において、反応器に水添触媒および固体酸物質を充填する方法は特に限定されない。反応器として固定床反応器を用いる場合、水添触媒および固体酸物質の充填方法は反応成績に大きな影響を与えることがある。前述のように、本発明では水素化と脱水反応とが段階的に起こっていると考えられる。従って、反応の各段階に応じた適当な触媒種を順番に反応器に充填することは、触媒を効率よく使用するという意味で、また目的としない副反応を抑制するという意味で好ましい充填方法である。
(イソプロピルアルコール生産株の作製)
本実施例で使用した大腸菌株とプラスミドの一覧表を表1及び表2に示した。
<B::atoDAB株の作製>
エシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAの全塩基配列は公知であり(GenBank accession number U00096)、エシェリヒア・コリMG1655株のCoAトランスフェラーゼ αサブユニットをコードする遺伝子(以下、atoDと略することがある)の塩基配列も報告されている。すなわちatoDはGenBank accession number U00096に記載のエシェリヒア・コリMG1655株ゲノム配列の2321469〜2322131に記載されている。
なおエシェリヒア・コリMG1655株はアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。
なお、エシェリシア・コリB株(ATCC11303)は細胞・微生物・遺伝子バンクであるアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。
<プラスミドpIazの作製>
クロストリジウム属細菌のアセト酢酸デカルボキシラーゼはGenBank accession number M55392に、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼはGenBank accession number AF157307に記載されている。
上記の遺伝子群を発現させるために必要なプロモーターの塩基配列として、GenBank accession number X02662の塩基配列情報において、397−440に記されているエシェリヒア・コリ由来のグリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(以下GAPDHと呼ぶことがある)のプロモーター配列を使用することができる。
<エシェリヒア・コリB株Δpgi株の作製>
エシェリヒア・コリMG1655のゲノムDNAの全塩基配列は公知であり(GenBank accession number U00096)、エシェリヒア・コリのホスホグルコースイソメラーゼ(以下pgiと呼ぶことがある)をコードする遺伝子の塩基配列も報告されている(GenBank accession number X15196)。pgiをコードする遺伝子(1,650bp)の塩基配列近傍領域をクローニングするため、caggaattcgctatatctggctctgcacg(配列番号14)、cagtctagagcaatactcttctgattttgag(配列番号15)、cagtctagatcatcgtcgatatgtaggcc(配列番号16)及びgacctgcagatcatccgtcagctgtacgc(配列番号17)に示すオリゴヌクレオチドプライマーを4種合成した。配列番号14のプライマーは5’末端側にEcoRI認識部位を、配列番号15および16のプライマーは5’末端側にXbaI認識部位を、配列番号17のプライマーは5’末端側にPstI認識部位をそれぞれ有している。
<pIaaa/BΔpgi株の作製>
エシェリヒア・コリのチオラーゼおよびエシェリヒア・コリのCoAトランスフェラーゼのアミノ酸配列と遺伝子の塩基配列は既に報告されている。すなわち、チオラーゼをコードする遺伝子はGenBank accession number U00096に記載のエシェリヒア・コリMG1655株ゲノム配列の2324131〜2325315に記載されている。またCoAトランスフェラーゼをコードする遺伝子は上記エシェリヒア・コリMG1655株ゲノム配列の2321469〜2322781に記載されている。これらと共に、後述するクロストリジウム属細菌由来のアセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を発現させることでイソプロピルアルコールの生産が可能である。
<B::atoDABΔpgi株の作製>
実施例1で作製したB::atoDABに実施例3で作製したpTH18cs1−pgiを形質転換し、クロラムフェニコール10μg/mlとカナマイシン50μg/mlを含むLB寒天プレートに30℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をカナマイシン50μg/mlを含むLB液体培地に接種し、30℃で一晩培養した。次にこの培養液の一部をカナマイシン50μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをカナマイシン50μg/mlを含むLB液体培地で、30℃で24時間培養し、更にカナマイシン50μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布して42℃で生育するコロニーを得た。
<B::atoDAB△gntR株の作製>
エシェリヒア・コリB株のゲノムDNAの全塩基配列は公知であり(GenBank accession No.CP000819)、GntRをコードする塩基配列はGenBank accession No.CP000819に記載のエシェリヒア・コリB株ゲノム配列の3509184〜3510179に記載されている。GntRをコードする塩基配列(gntR)の近傍領域をクローニングするため、ggaattcgggtcaattttcaccctctatc(配列番号30)、gtgggccgtcctgaaggtacaaaagagatagattctc(配列番号31)、ctcttttgtaccttcaggacggcccacaaatttgaag(配列番号32)、ggaattcccagccccgcaaggccgatggc(配列番号33)に示すオリゴヌクレオチドプライマーを4種合成した。配列番号30および33のプライマーは5’末端側にEcoRI認識部位をそれぞれ有している。
<pGAP−Ia/B::atoDAB△gntR株の作成>
実施例6で作製したエシェリヒア・コリ、B::atoDAB△gntR株コンピテントセルに実施例2で作製したプラスミドpIaを形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpIa/B::atoDAB△gntR株を得た。
<pIaz/B::atoDAB△gntR株の作成>
実施例6で作製したエシェリヒア・コリ、B::atoDAB△gntR株コンピテントセルに実施例2で作製したプラスミドpIazを形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpIaz/B::atoDAB△gntR株を得た。
<B::atoDAB△pgi△gntR株の作製>
実施例5で作製したエシェリヒア・コリB::atoDAB△pgi株に実施例6で作製したプラスミドpTH18cs1−gntRを形質転換し、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに30℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB液体培地に接種し、30℃で一晩培養した。次にこの培養液の一部をカナマイシンクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをLB液体培地で、30℃で24時間培養し、更にLB寒天プレートに塗布して42℃で生育するコロニーを得た。
<pIa/B::atoDAB△pgi△gntR株の作成>
実施例9で作製したエシェリヒア・コリ、B::atoDAB△pgi△gntR株コンピテントセルに実施例2で作製したプラスミドpIaを形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpIa/B::atoDAB△pgi△gntRを得た。
<pIaz/B::atoDAB△pgi△gntR株の作成>
実施例9で作製したエシェリヒア・コリ、B::atoDAB△pgi△gntR株コンピテントセルに実施例2で作製したプラスミドpIazを形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpIaz/B::atoDAB△pgi△gntR株を得た。
<B::atoDAB△gnd株の作製>
ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(gnd)の塩基配列近傍領域をクローニングするため、cgccatatgaatggcgcggcggggccggtgg(配列番号34)、tggagctctgtttactcctgtcaggggg(配列番号35)、tggagctctctgatttaatcaacaataaaattg(配列番号36)、cgggatccaccaccataaccaaacgacgg(配列番号37)に示すオリゴヌクレオチドプライマーを4種合成した。配列番号34のプライマーは5’末端側にNdeI認識部位を有し、配列番号35および配列番号36のプライマーは5’末端側にSacI認識部位を有している。また、配列番号37のプライマーは5’末端側にBamHI認識部位を有している。
<pIa/B::atoDAB△gnd株の作製>
実施例12で作製したエシェリヒア・コリ、B::atoDABΔgnd株コンピテントセルに実施例2で作製したプラスミドpIaを形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpIa/B::atoDAB△gnd株を得た。
<pIaz/B::atoDAB△gnd株の作製>
実施例12で作製したエシェリヒア・コリ、B::atoDAB△gnd株コンピテントセルに実施例2で作製したプラスミドpIazを形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpIaz/B::atoDAB△gndを得た。
<B::atoDAB△pgi△gnd株の作製>
実施例5で作製したエシェリヒア・コリB株、B::atoDAB△pgi株に実施例12で作製したプラスミドpTH18cs1−gndを形質転換し、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに30℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB液体培地に接種し、30℃で一晩培養した。次にこの培養液の一部をカナマイシンクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをLB液体培地で、30℃で24時間培養し、更にLB寒天プレートに塗布して42℃で生育するコロニーを得た。
<pIa/B::atoDAB△pgi△gnd株の作製>
実施例15で作製したエシェリヒア・コリ、B::atoDAB△pgi△gnd株コンピテントセルに実施例2で作製したプラスミドpIaを形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpIa/B::atoDAB△pgi△gndを得た。
<pIaz/B::atoDAB△pgi,△gnd株の作製>
実施例15で作製したエシェリヒア・コリ、B::atoDAB△pgi△gnd株コンピテントセルに実施例2で作製したプラスミドpIazを形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpIaz/B::atoDAB△pgi△gnd株を得た。
<B::atoDAB△gnd△gntR株の作製>
実施例12で作製したエシェリヒア・コリ、B::atoDAB△gnd株コンピテントセルに実施例6で作製したプラスミドpTH18cs1−gntRを形質転換し、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに30℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB液体培地に接種し、30℃で一晩培養した。次にこの培養液の一部をカナマイシンクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをLB液体培地で、30℃で24時間培養し、更にLB寒天プレートに塗布して42℃で生育するコロニーを得た。
<pIa/B::atoDAB△gnd△gntR株の作製>
実施例18で作製したエシェリヒア・コリ、B::atoDAB△gnd△gntR株コンピテントセルに実施例2で作製したプラスミドpIaを形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpIa/B::atoDAB△gnd△gntR株を得た。
<pIaz/B::atoDAB△gnd△gntR株の作成>
実施例18で作製したエシェリヒア・コリ、B::atoDAB△gnd△gntR株コンピテントセルに実施例2で作製したプラスミドpIazを形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpIaz/B::atoDAB△gnd△gntR株を得た。
<B::atoDAB△pgi△gnd△gntR株の作製>
実施例15で作製したエシェリヒア・コリ、B::atoDAB△pgi△gnd株コンピテントセルに実施例6で作製したプラスミドpTH18cs1−gntRを形質転換し、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに30℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB液体培地に接種し、30℃で一晩培養した。次にこの培養液の一部をカナマイシンクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをLB液体培地で、30℃で24時間培養し、更にLB寒天プレートに塗布して42℃で生育するコロニーを得た。
<pIa/B::atoDAB△pgi△gnd△gntR株の作製>
実施例21で作製したエシェリヒア・コリ、B::atoDAB△pgi△gnd△gntR株コンピテントセルに実施例2で作製したプラスミドpIaを形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpIa/B::atoDAB△pgi△gnd△gntR株を得た。
<pIaz/B::atoDAB△pgi△gnd△gntR株の作製>
実施例21で作製したエシェリヒア・コリ、B::atoDAB△pgi△gnd△gntR株コンピテントセルに実施例2で作製したプラスミドpIazを形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpIaz/B::atoDAB△pgi△gnd△gntR株を得た。
<pIa/B::atoDAB株の作製>
実施例1で作製したエシェリヒア・コリ、B::atoDAB株コンピテントセルに実施例2で作製したプラスミドpIaを形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpIa/B::atoDAB株を得た。
<pIaz/B::atoDAB△pgi株の作製>
実施例5で作製したエシェリヒア・コリ、B::atoDAB株△pgiコンピテントセルに実施例2で作製したプラスミドpIazを形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpIaz/B::atoDAB△pgi株を得た。
(イソプロピルアルコールの生産)
本実施例では、WO2009/008377号パンフレット図1に示される生産装置を用いてイソプロピルアルコールの生産を行った。培養槽は3リットル容のガラス製のものを使用し、トラップ槽は10L容のポリプロピレン製のものを使用した。トラップ槽には、トラップ液としての水(トラップ水)を1槽あたり9Lの量で注入し、2台連結して使用した。なお、培養槽には廃液管を設置して、糖や中和剤の流加により増量した培養液を適宜培養槽外に排出した。
イソプロピルアルコール生産評価に用いた株の一覧を表3として示した。
<培地組成>
コーンスティープリカー(日本食品化工製):20g/L
Fe2SO4・7H2O:0.1g/L
K2HPO4:2g/L
KH2PO4:2g/L
MgSO4・7H2O:2g/L
(NH4)2SO4:2g/L
アデカノールLG126(株式会社ADEKA)0.1g/L
(残部:水)
また、gntRとpgiを破壊し且つzwfの発現を強化した株(pIaz/B::atoDABΔpgiΔgntR)の生産量は70.2g/L/72hであり陰性対照と比較して生産性が約1.4倍となった。このことから、gntRのみを破壊したときよりもgntRとpgiを両方破壊し且つzwfの発現を強化した方が生産性が更に向上することが分かった。
gntRを破壊し且つzwfを強発現した場合(pIaz/B::atoDABΔgntR)、pgiを破壊し且つzwfを強発現した場合(pIaz/B::atoDABΔpgi)及びpgiとgntRを両方破壊した場合(pIa/B::atoDABΔpgiΔgntR)でも生産量が各々33.3g/L/72h、41.1g/L/72h、9.6g/L/72hとなり、イソプロピルアルコールの生産性は増加せずにむしろ低下した。
また、生産性の向上が見られたpIaz/B::atoDABΔpgiΔgntR株に更にgnd破壊を施した場合、即ちpgiとgntRとgndを破壊し且つzwfを強発現させた場合(pIaz/B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR)のイソプロピルアルコール生産量は75.6g/L/72hとなり、pIaz/B::atoDABΔpgiΔgntR株を上回る高い生産性を示した。
従って、pIaz/B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR株においてみられる生産性向上の効果は、gntRとpgiとgndを同時に破壊しかつzwfを強発現させたときのみに得られるといえる。
また、得られたアセトンは、精製した後に、イソプロピルアルコール生産の原料として用いることができる。
[実施例26]
<イソプロピルアルコール、アセトンの取り出し>
上記pIaz/B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR株(実施例23)の培養評価時のトラップ水をGC分析した結果、アセトンが1.2g/L、イソプロピルアルコールは4.3g/L含有されていることがわかった。上記イソプロピルアルコールおよびアセトンを含む水溶液(培養開始72時間後のトラップ水)から蒸留により、イソプロピルアルコール及びアセトンを高濃度化し取り出した。
具体的には最初に上記水溶液2Lを、陽イオン交換樹脂(オルガノ製、アンバーリスト31WET)250mlを充填したカラムに流速500ml/hで通液し、残存するアンモニア等を除去した。この処理液を常圧下蒸留した。沸点53〜81.6℃の留分を取り出し、GC分析した結果、アセトン18.7質量%、イソプロピルアルコール62.6質量%、不明成分が0.2質量%、残りは水であった。これを以下の脱水素反応の原料として用いた。
500mlの攪拌羽付き丸底フラスコに、炭酸ナトリウム15.94g(0.15mol)及び水130mlを入れ溶解させた。得られた水溶液に、硝酸亜鉛六水和物34.36g(0.11mol)及び酸化二硝酸ジルコニウム二水和物1.30g(0.05mol)を150mlの水に溶解させた水溶液を、1時間半かけて滴下した。そのまま5日間熟成させた後、ろ過し、よく水洗した。得られた白色物を120℃で2時間、400℃で1時間乾燥し、最後に600℃で2時間焼成した。複合酸化物触媒ZnO:ZrO2(94:6)を白色の粉末として9.50gを得た。
直径1cm、長さ40cmのSUS製反応器に、前記の複合酸化物触媒ZnO:ZrO2(94:6)1.0g(20MPaで圧縮成型後、250〜500μmへ分級したもの)を充填し、10ml/minの窒素気流下、350℃で上記蒸留液(アセトン18.7質量%、イソプロピルアルコール62.6質量%、不明成分0.2質量%、残りは水)を1.50g/hrの割合で流通させた。反応器の出口を冷却し反応液と反応ガスとを捕集した。反応開始5時間後の生成物をガスクロマトグラフィーで分析した結果、表5に示したように高濃度でアセトンが生成していた。なお、表5中「IPA」はイソプロピルアルコールを表す(以下、同様)。
反応温度を400℃とした以外は実施例26と同様に行った。結果は表5に示した。表5に示したように高濃度でアセトンが生成していた。
<脱水素触媒ZnO:ZrO2(88:12)の調製>
500mlの攪拌羽付き丸底フラスコに、炭酸ナトリウム15.94g(0.15mol)及び水130mlを入れ溶解させた。得られた水溶液に、硝酸亜鉛六水和物32.86g(0.11mol)及び酸化二硝酸ジルコニウム二水和物2.66g(0.10mol)を150mlの水に溶解させた水溶液を、1時間半かけて滴下した。そのまま5日間熟成させた後、ろ過し、よく水洗した。得られた白色物を120℃で2時間、400℃で1時間乾燥し、最後に600℃で2時間焼成した。複合酸化物触媒ZnO:ZrO2(88:12)を白色の粉末として9.94gを得た。
直径1cm、長さ40cmのSUS製反応器に、前記の複合酸化物触媒ZnO:ZrO2(88:12)1.0g(20MPaで圧縮成型後、250〜500μmへ分級したもの)を充填し、10ml/minの窒素気流下、350℃で上記蒸留液(アセトン18.7質量%、イソプロピルアルコール62.6質量%、不明成分0.2質量%、残りは水)を1.50g/hrの割合で流通させた。反応器の出口を冷却し反応液と反応ガスとを捕集した。反応開始5時間後の生成物をガスクロマトグラフィーで分析した結果、表5に示したように高濃度でアセトンが生成していた。
反応温度を400℃とした以外は実施例28と同様に行った。結果は表5に示した。表5に示したように高濃度でアセトンが生成していた。
本発明のイソプロピルアルコール生産大腸菌に含まれるイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子とアセト酢酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のコドン配列を変更して、イソプロピルアルコール及びアセトンの生産性を以下に示すとおりに確認した。
[実施例30]
<プラスミドpI*a*zの作製>
クロストリジウム属細菌のアセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子(adc)はGenBank accession number M55392に、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子(IPAdh)はGenBank accession number AF157307に記載されている。
上記の遺伝子群を発現させるために必要なプロモーターの塩基配列として、GenBank accession number X02662の塩基配列情報において、397−440に記されているエシェリヒア・コリ由来のグリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(以下GAPDHと呼ぶことがある)のプロモーター配列を使用することができる。
コドン改変したイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子(IPAdh*)を取得するために、Clostridium beijerinckii NRRL B−593のイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のアミノ酸配列をもとにコドン改変したイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を設計し、DNA合成により以下のDNAフラグメント(配列番号40)を作成した。配列を以下に記す。
ATGAAAGGTTTTGCAATGCTGGGTATTAATAAGCTGGGCTGGATCGAAAAAGAGCGCCCGGTTGCGGGTTCGTATGATGCGATTGTGCGCCCACTGGCCGTATCTCCGTGTACCTCAGATATCCATACCGTTTTTGAGGGAGCTCTTGGCGACCGCAAGAATATGATTTTAGGGCATGAAGCGGTGGGTGAAGTTGTGGAGGTAGGCAGTGAAGTGAAGGATTTCAAACCTGGTGACCGTGTTATCGTCCCTTGCACAACCCCGGATTGGCGGTCTTTGGAAGTTCAGGCTGGTTTTCAACAGCACTCAAACGGTATGCTCGCAGGATGGAAATTTTCCAACTTCAAGGATGGCGTCTTTGGTGAGTATTTTCATGTGAATGATGCGGATATGAATCTTGCGATTCTGCCTAAAGACATGCCCCTGGAAAACGCTGTTATGATCACAGATATGATGACTACGGGCTTCCACGGAGCCGAACTTGCAGATATTCAGATGGGTTCAAGTGTAGTGGTCATTGGCATTGGCGCGGTTGGCCTGATGGGGATAGCCGGTGCTAAATTACGTGGAGCAGGTCGGATCATTGGCGTGGGGAGCCGCCCGATTTGTGTCGAGGCTGCCAAATTTTACGGGGCCACCGACATTTTGAATTATAAAAATGGTCATATCGTTGATCAAGTCATGAAACTGACGAACGGAAAAGGCGTTGACCGCGTGATTATGGCAGGCGGTGGTAGCGAAACACTGTCCCAGGCCGTATCTATGGTCAAACCAGGCGGGATCATTTCGAATATAAATTATCATGGAAGTGGCGATGCGTTATTGATCCCGCGTGTGGAATGGGGGTGCGGAATGGCTCACAAGACTATCAAAGGCGGTCTTTGTCCCGGGGGACGTTTGAGAGCAGAGATGCTGCGAGATATGGTAGTGTACAACCGTGTTGATCTCAGCAAACTGGTCACGCATGTATATCATGGGTTCGATCACATCGAAGAAGCCCTGTTACTGATGAAAGACAAGCCAAAAGACCTGATTAAAGCAGTAGTTATATTATAA
ATGCTGAAAGATGAAGTGATTAAACAGATTAGCACGCCATTAACTTCGCCTGCATTTCCGCGCGGTCCGTATAAATTTCATAATCGTGAATATTTTAACATTGTATACCGTACCGATATGGACGCCCTGCGTAAAGTTGTGCCAGAGCCTCTGGAAATTGATGAGCCCTTAGTCCGGTTCGAAATCATGGCAATGCATGATACGAGTGGCCTGGGTTGCTATACAGAATCAGGTCAGGCTATTCCCGTGAGCTTTAATGGTGTTAAGGGCGACTACCTTCACATGATGTATCTGGATAACGAGCCGGCAATTGCCGTAGGTCGGGAATTAAGTGCATACCCTAAAAAGCTCGGGTATCCAAAGCTGTTTGTGGATTCAGACACTCTGGTGGGCACGTTAGACTATGGAAAACTGCGTGTTGCGACCGCGACAATGGGGTACAAACATAAAGCCCTGGATGCTAATGAAGCAAAGGATCAAATTTGTCGCCCGAACTATATGTTGAAAATCATCCCCAATTATGACGGCTCCCCTCGCATATGCGAGCTTATCAACGCGAAAATCACCGATGTTACCGTACATGAAGCTTGGACAGGACCGACTCGACTGCAGTTATTCGATCACGCTATGGCGCCACTGAATGACTTGCCGGTCAAAGAGATTGTTTCTAGCTCTCACATTCTTGCCGATATAATCTTGCCGCGCGCGGAAGTCATATACGATTATCTCAAGTAA
<pI*a*/B::atoDAB△gntR株の作成>
実施例6で作製したエシェリヒア・コリ、B::atoDAB△gntR株コンピテントセルに実施例30で作製したプラスミドpI*a*を形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpI*a*/B::atoDAB△gntR株を得た。
<pI*a*z/B::atoDAB△pgi△gntR株の作成>
実施例9で作製したエシェリヒア・コリ、B::atoDAB△pgi△gntR株コンピテントセルに実施例30で作製したプラスミドpIa*を形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpI*a*z/B::atoDAB△pgi△gntRを得た。
<pI*a*z/B::atoDAB△pgi△gnd△gntR株の作製>
実施例21で作製したエシェリヒア・コリ、B::atoDAB△pgi△gnd△gntR株コンピテントセルに実施例30で作製したプラスミドpI*a*zを形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpI*a*z/B::atoDAB△pgi△gnd△gntR株を得た。
<pI*a*/B::atoDAB株の作製>
実施例1で作製したエシェリヒア・コリ、B::atoDAB株コンピテントセルに実施例30で作製したプラスミドpI*a*を形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpI*a*/B::atoDAB株を得た。
(イソプロピルアルコールの生産)
上記[試験例1]と同様にイソプロピルアルコールの生産評価を行った。評価に用いた株の一覧を表6に示した。また、評価結果を表7に示した。
(スクロースからのイソプロピルアルコール生産)
pI*a*z/B::atoDAB△pgi△gnd△gntR株に更にスクロースを分解するための酵素インベルターゼ遺伝子(cscA)を導入し、スクロースからのイソプロピルアルコール発酵生産を行った。更に得られた発酵液からアセトン又はプロピレンを製造した。
<pI*a*z−cscA/B::atoDAB△pgi△gnd△gntR株の作製>
エシェリヒア・コリO157株のゲノムDNAの全塩基配列は公知であり(GenBank accession number AE005174 )、エシェリヒア・コリO157株のインベルターゼをコードする遺伝子(以下、cscAと略することがある)の塩基配列も報告されている。すなわちcscAはGenBank accession number AE005174に記載のエシェリヒア・コリO157株ゲノム配列の3274383〜3275816に記載されている。
なおエシェリヒア・コリO157のゲノムは標準物質及び計量技術研究所より入手することができる。
(イソプロピルアルコールおよびアセトンの製造)
エシェリヒア・コリpI*a*z−cscA/B::atoDAB△pgi△gnd△gntR株を用いた以外は上記[試験例1]と同様にして、イソプロピルアルコールおよびアセトンの製造を行った。ただし培地は50wt/wt%グルコース水溶液の代わりに40wt/wt%スクロース水溶液を用いて行った。その結果、培養72時間目で82.0g/Lのイソプロピルアルコールと23.7g/Lのアセトンが生成した。1台目のトラップ水をHPLC分析した結果、アセトンが0.14質量%、イソプロピルアルコールは0.55質量%含有されていることが分かった。
上記イソプロピルアルコールおよびアセトンを含むトラップ水から蒸留により、イソプロピルアルコール及びアセトンを高濃度化し取り出した。
具体的には最初に上記水溶液9Lを、陽イオン交換樹脂(オルガノ製、アンバーリスト31WET)250mlを充填したカラムに流速500ml/hで通液し、残存するアンモニア等を除去した。この処理液を常圧下蒸留した。沸点53℃〜81.6℃の留分を取り出し、GC分析した結果、アセトン19.1質量%、イソプロピルアルコール60.5質量%、不明成分が0.5質量%、残りは水であった。これを以下の実施例36〜実施例39の脱水素反応、及び実施例40のプロピレン生産の原料として用いた。
(アセトンの製造)
<脱水素触媒ZnO:ZrO2(94:6)の調製>
500mlの攪拌羽付き丸底フラスコに、炭酸ナトリウム15.94g(0.15mol)及び水130mlを入れ溶解させた。得られた水溶液に、硝酸亜鉛六水和物34.36g(0.11mol)及び酸化二硝酸ジルコニウム二水和物1.30g(0.05mol)を150mlの水に溶解させた水溶液を、1時間半かけて滴下した。そのまま5日間熟成させた後、ろ過し、よく水洗した。得られた白色物を120℃で2時間、400℃で1時間乾燥し、最後に600℃で2時間焼成した。複合酸化物触媒ZnO:ZrO2(94:6)を白色の粉末として9.50gを得た。
直径1cm、長さ40cmのSUS製反応器に、前記の複合酸化物触媒ZnO:ZrO2(94:6)1.0g(20MPaで圧縮成型後、250〜500μmへ分級したもの)を充填し、10ml/minの窒素気流下、350℃で上記蒸留液(アセトン19.1質量%、イソプロピルアルコール60.5質量%、不明成分0.5質量%、残りは水)を1.50g/hrの割合で流通させた。反応器の出口を冷却し反応液と反応ガスとを捕集した。反応開始5時間後の生成物をガスクロマトグラフィーで分析した結果、表8に示したように大量の水、およびバイオ由来の不純物を含んだアセトンとイソプロピルアルコールを用いた場合でも高濃度でアセトンが生成していた。なお、表8中「IPA」はイソプロピルアルコールを表す(以下、同様)。
反応温度を400℃とした以外は実施例36と同様に行った。結果は表8に示した。表8に示したように高濃度でアセトンが生成していた。
<脱水素触媒ZnO:ZrO2(88:12)の調製>
500mlの攪拌羽付き丸底フラスコに、炭酸ナトリウム15.94g(0.15mol)及び水130mlを入れ溶解させた。得られた水溶液に、硝酸亜鉛六水和物32.86g(0.11mol)及び酸化二硝酸ジルコニウム二水和物2.66g(0.10mol)を150mlの水に溶解させた水溶液を、1時間半かけて滴下した。そのまま5日間熟成させた後、ろ過し、よく水洗した。得られた白色物を120℃で2時間、400℃で1時間乾燥し、最後に600℃で2時間焼成した。複合酸化物触媒ZnO:ZrO2(88:12)を白色の粉末として9.94gを得た。
直径1cm、長さ40cmのSUS製反応器に、前記の複合酸化物触媒ZnO:ZrO2(88:12)1.0g(20MPaで圧縮成型後、250〜500μmへ分級したもの)を充填し、10ml/minの窒素気流下、350℃で上記蒸留液(アセトン19.1質量%、イソプロピルアルコール60.5質量%、不明成分0.5質量%、残りは水)を1.50g/hrの割合で流通させた。反応器の出口を冷却し反応液と反応ガスとを捕集した。反応開始5時間後の生成物をガスクロマトグラフィーで分析した結果、表8に示したように高濃度でアセトンが生成していた。
反応温度を400℃とした以外は実施例38と同様に行った。結果は表8に示した。表8に示したように高濃度でアセトンが生成していた。
(プロピレンの製造)
実施例35の試験例3に記載の培養液より得られた蒸留液を原料とし、高圧用フィードポンプ、高圧用水素マスフロー、高圧用窒素マスフロー、電気炉、触媒充填部分を有する反応器、背圧弁を設置した固定床反応装置を用い、ダウンフローによる加圧液相流通反応を行った。
内径1cmのSUS316製反応器に、反応器の出口側からまず、銅−亜鉛触媒(SudChemie社製、製品名ShiftMax210、元素質量%Cu 32〜35%、Zn 35〜40%、Al 6〜7%)粉末(250〜500μへ分級したもの)を上流側の触媒層として1.0g充填した。触媒層を分離するため石英ウールを詰めた後、β−ゼオライト(触媒化成社製、20MPaで圧縮成型後、250〜500μへ分級したもの)1.0gを下流側の触媒層として充填した。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に援用されて取り込まれる。
Claims (13)
- イソプロピルアルコール生産系を備え、転写抑制因子GntRの活性が不活化されており、該不活化に伴うイソプロピルアルコール生産能を維持又は強化する酵素活性発現パターンとして下記(1)〜(3)のいずれかを備えた、イソプロピルアルコール生産大腸菌。
(1)グルコース−6−リン酸イソメラーゼ(Pgi)活性、グルコース−6−リン酸−1−デヒドロゲナーゼ(Zwf)活性、及びホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(Gnd)活性の野生型の維持。
(2)グルコース−6−リン酸イソメラーゼ(Pgi)活性の不活化と、グルコース−6−リン酸−1−デヒドロゲナーゼ(Zwf)活性の強化。
(3)グルコース−6−リン酸イソメラーゼ(Pgi)活性の不活化と、グルコース−6−リン酸−1−デヒドロゲナーゼ(Zwf)活性の強化と、ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(Gnd)活性の不活化。 - 前記グルコース−6−リン酸−1−デヒドロゲナーゼ(Zwf)活性が、エシェリヒア属細菌由来のグルコース−6−リン酸−1−デヒドロゲナーゼ(Zwf)をコードする遺伝子に由来するものである請求項1に記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
- 前記イソプロピルアルコール生産系が、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ、CoAトランスフェラーゼ及びチオラーゼの各酵素遺伝子により構築されたものである請求項1又は請求項2に記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
- 前記イソプロピルアルコール生産系が、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ、CoAトランスフェラーゼ及びチオラーゼの各酵素遺伝子により構築されたものであり、かつ各酵素遺伝子が、それぞれ独立に、クロストリジウム属細菌、バチルス属細菌及びエシェリヒア属細菌からなる群より選択された少なくとも1種の原核生物に由来するものである請求項1〜請求項3のいずれか1項記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
- 前記アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性が、クロストリジウム・アセトブチリカム由来の酵素をコードする遺伝子に由来するものであり、前記イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性がクロストリジウム・ベイジェリンキ由来の酵素をコードする遺伝子に由来するものであり、前記CoAトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性がエシェリヒア・コリ由来の各酵素をコードする遺伝子に由来するものである請求項3又は請求項4に記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
- 前記イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ及び前記アセト酢酸デカルボキシラーゼの少なくとも1つの活性が、遺伝子改変体として導入された遺伝子に由来する請求項3〜請求項5のいずれか1項に記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
- 前記イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼの遺伝子改変体が配列番号40で表される塩基配列であり、前記アセト酢酸デカルボキシラーゼの遺伝子改変体が配列番号43で表される塩基配列である請求項6に記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
- さらに、スクロース非PTS遺伝子群のうちスクロース加水分解酵素遺伝子を少なくとも有する請求項1〜請求項7のいずれか1項記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
- 請求項1〜請求項8のいずれか1項記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いて植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産することを含むイソプロピルアルコール生産方法。
- 請求項1〜請求項8のいずれか1項記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いて植物由来原料からイソプロピルアルコールを得ること、及び
得られたイソプロピルアルコールに、触媒として、酸化亜鉛と、第4族の元素を含む少なくとも1種の酸化物とを含有し且つ共沈法で調製された複合酸化物を接触させることを含む、アセトン生産方法。 - 請求項1〜請求項8のいずれか1項記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いて植物由来原料から得られ且つアセトンを含有するイソプロピルアルコールに、反応温度50〜300℃の範囲で、触媒として固体酸物質およびCuを含む水添触媒を接触させることを含む、プロピレンの製造方法。
- 前記Cuを含む水添触媒が、さらに第6族、第12族、および第13族のうち少なくとも一つの元素を含む触媒である請求項11に記載のプロピレンの製造方法。
- 前記固体酸物質がゼオライトである請求項11又は請求項12に記載のプロピレンの製造方法。
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