JP5669058B2 - Method for producing liposome - Google Patents
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Description
本発明は、多孔質体を用いたリポソームの製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing a liposome using a porous material.
リポソームは、例えば、膜タンパク質等の生体分子を脂質膜に組み込んだ生体分子機能解析モデルや、薬物輸送担体、遺伝子導入担体等といった様々な用途で広く用いられている。近年、リポソームを細胞膜のモデルとして遺伝子発現機構を導入し、生細胞のモデルを構築する研究が行われつつある。特に、直径数μｍ〜数十μｍのミクロンオーダーの巨大リポソームは、分子センサーといった生体分子等を比較的多く保持させやすく、また、機能解析が容易になることから、この巨大リポソームを用いて膜タンパク質の遺伝子発現や機能測定等が行われている（非特許文献１及び２等）。 Liposomes are widely used in various applications such as biomolecular function analysis models in which biomolecules such as membrane proteins are incorporated into lipid membranes, drug transport carriers, gene transfer carriers, and the like. In recent years, studies have been carried out to introduce a gene expression mechanism using liposome as a model of cell membrane and to construct a model of living cells. In particular, giant liposomes of micron order with a diameter of several μm to several tens of μm can easily retain a relatively large amount of biomolecules such as molecular sensors and facilitate functional analysis. The gene expression and function measurement of these are performed (Non-patent Documents 1 and 2, etc.)
リポソームの製造方法としては、様々な方法が知られている。試験管等の内壁に乾燥脂質膜を形成した後、水和させることによってリポソームを形成する薄膜静置水和法（Voltex法）（例えば、非特許文献３及び４）、形成されたリポソームを一度凍結乾燥させ、再水和することで巨大リポソームを構成する凍結乾燥法（例えば、非特許文献５及び６）、マイクロメートルサイズのｗ／ｏエマルジョン（例えば、油中水滴、ドロップレット）を用い、脂質分子の並んだ油水界面を通過させることでユニラメラ巨大リポソームを構成するドロップレット法（例えば、非特許文献７及び８）、電場を利用して脂質薄膜からユニラメラの巨大リポソームを構成するＡＣ法（Electroformation）（例えば、非特許文献９及び１０）等がある。 Various methods are known for producing liposomes. After forming a dry lipid membrane on the inner wall of a test tube or the like, a thin film standing hydration method (Voltex method) in which liposomes are formed by hydration (for example, Non-Patent Documents 3 and 4), once the formed liposomes Freeze-dried and rehydrated to form giant liposomes (for example, Non-Patent Documents 5 and 6), micrometer-sized w / o emulsion (for example, water-in-oil droplets, droplets) A droplet method (for example, Non-Patent Documents 7 and 8) for forming unilamellar giant liposomes by passing through an oil-water interface in which lipid molecules are arranged, and an AC method for forming unilamellar giant liposomes from a lipid thin film using an electric field ( Electroformation) (for example, Non-Patent Documents 9 and 10).
本発明は、サイズの均一性及び簡便性に優れるリポソームの新たな製造方法を提供する。 The present invention provides a new method for producing liposomes excellent in size uniformity and simplicity.
本発明は、リポソームの製造方法であって、疎水性高分子の多孔質体の内部の孔に形成した乾燥脂質フィルムからリポソームを形成することを含むリポソームの製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing liposomes, which comprises forming liposomes from a dry lipid film formed in pores inside a porous body of a hydrophobic polymer.
本発明によれば、サイズの均一性に優れるリポソームを簡便に製造することができ、好ましくは膜タンパク質を含むリポソームを製造することができる。 According to the present invention, liposomes having excellent size uniformity can be easily produced, and preferably liposomes containing membrane proteins can be produced.
本発明は、疎水性高分子の多孔質体を用いることによって、体積（直径）等のサイズの均一性に優れるリポソームが簡単に得られるという知見に基づく。また、本発明は、疎水性高分子の多孔質体を用いることによって、好ましくは、所望の内包対象物が内封されたリポソームが効率よく得られうるという知見に基づく。 The present invention is based on the knowledge that liposomes having excellent uniformity in size such as volume (diameter) can be easily obtained by using a porous body of a hydrophobic polymer. In addition, the present invention is preferably based on the finding that a liposome encapsulating a desired inclusion target can be obtained efficiently by using a porous body of a hydrophobic polymer.
すなわち、本発明によれば、例えば、体積（直径）等のサイズの均一性に優れるリポソームを、煩雑な操作や複雑な機械等を使用することなく製造することができる。また、リポソームの形成の場として疎水性高分子の多孔質体の内部の空隙部（孔）を使用するため、本発明の方法によれば、例えば、所望の内包対象物が内封されたリポソームの製造効率を向上できる。さらに、本発明の方法によれば、例えば、内包対象物として無細胞タンパク質発現系を使用することにより、膜タンパク質を含むリポソームを製造することができる。 That is, according to the present invention, for example, liposomes having excellent uniformity in size such as volume (diameter) can be produced without using complicated operations or complicated machines. Further, since the voids (pores) inside the porous body of the hydrophobic polymer are used as a site for forming the liposome, according to the method of the present invention, for example, a liposome encapsulating a desired inclusion target Manufacturing efficiency can be improved. Furthermore, according to the method of the present invention, for example, a liposome containing a membrane protein can be produced by using a cell-free protein expression system as an inclusion target.
すなわち、本発明は、
[１] リポソームの製造方法であって、疎水性高分子の多孔質体の内部の孔に形成した乾燥脂質フィルムからリポソームを形成することを含むリポソームの製造方法；
[２] 前記乾燥脂質フィルムの形成が、前記疎水性高分子の多孔質体を予め減圧しておき、減圧を解除するとともに脂質を含む溶液を導入すること、及び脂質を含む溶液を導入した前記疎水性高分子の多孔質体を減圧下とすることにより前記疎水性高分子の多孔質体に乾燥脂質フィルムを形成することを含む[１]記載のリポソームの製造方法；
[３] 前記リポソームを形成することが、前記乾燥脂質フィルムを形成した多孔質体の孔に水溶液を導入することを含む[１]又は[２]に記載のリポソームの製造方法；
[４] 前記多孔質体の孔に水溶液を導入することが、乾燥脂質フィルムが形成された疎水性高分子の多孔質体に、減圧を解除するともに水溶液を導入することを含む[３]記載のリポソームの製造方法；
[５] 前記疎水性高分子が、ポリジメチルシロキサンである[１]から[４]のいずれかに記載のリポソームの製造方法；
[６] 遠心分離によって前記多孔質体からリポソームを回収することを含む、[１]から[５]のいずれかに記載のリポソームの製造方法；
[７] 少なくとも２種類のリポソームが融合した融合リポソームを製造する方法であって、疎水性高分子の多孔質体の内部の孔でリポソームを融合させることを含む融合リポソームの製造方法；
[８] 前記リポソームを融合させることが、前記疎水性高分子の多孔質体に少なくとも２種類のリポソームを含むリポソーム懸濁液を導入すること、及び前記リポソーム懸濁液を導入した前記多孔質体を減圧処理して前記疎水性高分子の多孔質体の内部の孔に乾燥脂質フィルムを形成することを含む[７]記載の融合リポソームの製造方法；
[９] 前記リポソームを融合させることが、前記乾燥脂質フィルムが形成された前記多孔質体の孔に水溶液を導入することを含む[８]記載の融合リポソームの製造方法；
[１０] 膜タンパク質を含むリポソームの製造方法であって、疎水性高分子の多孔質体の内部の孔に形成した乾燥脂質フィルムに、無細胞タンパク質発現系と膜タンパク質遺伝子とを含む水溶液を接触させることによりリポソームを形成すること、及び前記リポソーム内において前記無細胞タンパク質発現系で前記膜タンパク質を発現させることを含む膜タンパク質を含むリポソームの製造方法；及び
[１１] [１０]記載の膜タンパク質を含むリポソームの製造方法により製造された膜タンパク質を含むリポソームが配置された膜タンパク質アレイ；
に関する。
That is, the present invention
[1] A method for producing a liposome, the method comprising producing a liposome from a dry lipid film formed in pores inside a porous body of a hydrophobic polymer;
[2] In the formation of the dry lipid film, the porous body of the hydrophobic polymer is decompressed in advance, the decompression is released, a solution containing lipid is introduced, and the solution containing lipid is introduced The method for producing a liposome according to [1], comprising forming a dry lipid film on the porous body of the hydrophobic polymer by subjecting the porous body of the hydrophobic polymer to reduced pressure;
[3] The method for producing a liposome according to [1] or [2], wherein forming the liposome comprises introducing an aqueous solution into pores of the porous body on which the dry lipid film is formed;
[4] Introducing the aqueous solution into the pores of the porous body includes releasing the reduced pressure and introducing the aqueous solution into the porous body of the hydrophobic polymer on which the dry lipid film is formed [3] A method for producing liposomes of
[5] The method for producing a liposome according to any one of [1] to [4], wherein the hydrophobic polymer is polydimethylsiloxane;
[6] The method for producing a liposome according to any one of [1] to [5], comprising collecting the liposome from the porous body by centrifugation;
[7] A method for producing a fused liposome in which at least two kinds of liposomes are fused, the method comprising producing a fused liposome through pores inside a porous body of a hydrophobic polymer;
[8] Fusing the liposome introduces a liposome suspension containing at least two kinds of liposomes into the hydrophobic polymer porous body, and the porous body into which the liposome suspension is introduced A method for producing a fused liposome according to [7], which comprises subjecting to a reduced pressure treatment to form a dry lipid film in pores inside the porous body of the hydrophobic polymer;
[9] The method for producing a fusion liposome according to [8], wherein the fusion of the liposome comprises introducing an aqueous solution into the pores of the porous body on which the dry lipid film is formed;
[10] A method for producing a liposome containing a membrane protein, wherein an aqueous solution containing a cell-free protein expression system and a membrane protein gene is contacted with a dry lipid film formed in a pore inside a porous body of a hydrophobic polymer A method of producing a liposome comprising a membrane protein, comprising: forming a liposome by allowing the membrane protein to be expressed in the cell-free protein expression system in the liposome; and
[11] A membrane protein array in which liposomes containing membrane proteins produced by the method for producing liposomes containing membrane proteins according to [10] are disposed;
About.
［リポソーム］
本明細書において「リポソーム」とは、脂質から構成される膜によって覆われた小胞であって、好ましくは脂質二分子膜（脂質二重層）とその内部の水相とを含む小胞であり、より好ましくは生体膜を構成しうる脂質二分子膜とその内部の水相とを含む小胞である。本発明においてリポソームを形成する膜は、ユニラメラであることが好ましい。また、本明細書において融合リポソームとは、少なくとも２種類のリポソームが融合することにより得られるリポソームのことをいう。
[Liposome]
In the present specification, the “liposome” is a vesicle covered with a membrane composed of lipid, and preferably includes a lipid bilayer membrane (lipid bilayer) and an aqueous phase inside thereof. More preferably, it is a vesicle containing a lipid bilayer membrane capable of constituting a biological membrane and an aqueous phase inside thereof. In the present invention, the membrane forming the liposome is preferably unilamellar. In the present specification, the fused liposome refers to a liposome obtained by fusing at least two kinds of liposomes.
［疎水性高分子の多孔質体］
本明細書において「疎水性高分子の多孔質体」とは、疎水性高分子を原料として形成された多孔質体のことをいい、好ましくは連続気泡構造の空隙部（孔）を有するスポンジ状の多孔質体をいう。また、本明細書において「疎水性高分子の多孔質体」は、例えば、内部の空隙部（孔）に、脂質を含む溶液や内包対象物を含む水溶液等を導入可能な性質を有することが好ましい。疎水性高分子の多孔質体は、例えば、可撓性や柔軟性等を有していることが好ましい。
[Porous body of hydrophobic polymer]
In the present specification, the “porous body of a hydrophobic polymer” refers to a porous body formed using a hydrophobic polymer as a raw material, and preferably a sponge-like structure having voids (pores) having an open-cell structure. The porous body. Further, in the present specification, the “hydrophobic polymer porous body” has, for example, a property capable of introducing a solution containing a lipid or an aqueous solution containing an inclusion object into an internal void (pore). preferable. The porous body of the hydrophobic polymer preferably has flexibility and flexibility, for example.
多孔質体内の孔のサイズと、形成されるリポソームのサイズとは、相関関係があるとの知見が得られている。このため、サイズの均一性に優れるリポソームを製造する点から、疎水性高分子の多孔質体は、孔のサイズ分布が小さく、孔のサイズが均一であることが好ましい。孔径（直径）は、目的とするリポソームの径等に応じて適宜設定できるが、例えば、１００ｎｍ〜１０００μｍであり、好ましくは２００ｎｍ〜５０μｍである。また、疎水性高分子の多孔質体の大きさは、通常、５ｍｍｘ５ｍｍｘ５ｍｍの直方体であり、好ましくは直径５ｍｍｘ高さ５ｍｍの円筒状である。疎水性高分子の多孔質体の形状は、特に制限されず、例えば、直方体、立方体、円筒形等が挙げられ、中でも、チューブ等を用いてリポソームを製造する点からは、円筒形が好ましい。なお、疎水性高分子の多孔質体の孔径は、例えば、走査型電子顕微鏡観察により測定できる。 It has been found that there is a correlation between the size of the pores in the porous body and the size of the liposome formed. For this reason, from the viewpoint of producing liposomes having excellent size uniformity, it is preferable that the porous polymer porous body has a small pore size distribution and a uniform pore size. The pore diameter (diameter) can be appropriately set according to the diameter of the target liposome, and is, for example, 100 nm to 1000 μm, preferably 200 nm to 50 μm. The size of the porous body of the hydrophobic polymer is usually a rectangular parallelepiped of 5 mm × 5 mm × 5 mm, preferably a cylindrical shape having a diameter of 5 mm × a height of 5 mm. The shape of the porous body of the hydrophobic polymer is not particularly limited, and examples thereof include a rectangular parallelepiped, a cube, and a cylinder. Among these, a cylinder is preferable from the viewpoint of producing liposomes using a tube or the like. In addition, the pore diameter of the porous body of the hydrophobic polymer can be measured by, for example, observation with a scanning electron microscope.
疎水性高分子の多孔質体の孔に均一に溶液を導入する点から、疎水性高分子は、ガス透過性を有することが好ましい。また、疎水性高分子は、脂質を溶解する溶媒に対して耐性を有するものが好ましい。 The hydrophobic polymer preferably has gas permeability from the viewpoint that the solution is uniformly introduced into the pores of the porous body of the hydrophobic polymer. The hydrophobic polymer is preferably one having resistance to a solvent that dissolves lipids.
疎水性高分子としては、例えば、ポリシロキサン、ポリエステル、ポリカプロラクトン、ポリカーボネート、ポリフマル酸、ポリスチレン、及びポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）等が挙げられる。ポリシロキサンとしては、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等が挙げられる。ポリエステルとしては、例えば、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（乳酸／グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）等が挙げられる。疎水性高分子としては、有機溶媒耐性が高く、また複雑な構造の内部にまで溶液を浸透させるために、減圧による高分子構造内のガス交換を積極的に利用できる点から、例えば、ＰＤＭＳが好ましい。 Examples of the hydrophobic polymer include polysiloxane, polyester, polycaprolactone, polycarbonate, polyfumaric acid, polystyrene, and polymethyl methacrylate (PMMA). Examples of the polysiloxane include polydimethylsiloxane (PDMS). Examples of the polyester include polyglycolic acid (PGA), polylactic acid (PLA), poly (lactic acid / glycolic acid copolymer (PLGA), etc. The hydrophobic polymer has high resistance to organic solvents, In order to infiltrate the solution into the inside of the complicated structure, for example, PDMS is preferable because gas exchange in the polymer structure by reduced pressure can be actively used.
疎水性高分子の多孔質体は、例えば、重合前の疎水性高分子と水溶性結晶粒子とを混合して圧縮成形した後、純水中で水溶性結晶を完全に除去することによって製造することができる。この方法は、salt-leaching法として知られている（例えば、L D. Harris et al., J. Biomed. Mater. Res. 42,396-402 (1998)、G. Chen et al., Macromol. Biosci. 2, 67-77 (2002)）。水溶性結晶粒子としては、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ等のアルカリ金属塩化物塩等が使用できる。水溶性結晶粒子は、多孔質体に形成される孔の大きさを均一にし、サイズの均一なリポソームを形成する点から、サイズ分布が小さいものが好ましい。水溶性結晶粒子の径は、目的とするリポソームの径及び多孔質体の孔径等に応じて適宜設定できるが、例えば、１００ｎｍ〜１０００μｍであり、好ましくは２００ｎｍ〜５００μｍである。 A porous body of a hydrophobic polymer is produced, for example, by mixing a hydrophobic polymer before polymerization and water-soluble crystal particles, compression molding, and then completely removing the water-soluble crystals in pure water. be able to. This method is known as the salt-leaching method (for example, L D. Harris et al., J. Biomed. Mater. Res. 42,396-402 (1998), G. Chen et al., Macromol. Biosci. 2, 67-77 (2002)). As the water-soluble crystal particles, for example, alkali metal chloride salts such as NaCl and KCl can be used. The water-soluble crystal particles preferably have a small size distribution from the viewpoint of uniforming the size of the pores formed in the porous body and forming liposomes having a uniform size. The diameter of the water-soluble crystal particles can be appropriately set according to the target liposome diameter, the pore diameter of the porous body, and the like, and is, for example, 100 nm to 1000 μm, preferably 200 nm to 500 μm.
また、疎水性高分子の多孔質体を製造するにあたり、水溶性結晶粒子として、例えば、粒子系の異なる水溶性結晶粒子を混合したものを使用してもよい。このような水溶性結晶性粒子を用いて得られた多孔質体を使用することにより、例えば、多孔質体内部への溶液の導入効率を向上させることができ、好ましくはリポソームの製造効率を向上させることができる。また、水溶性結晶粒子として、例えば、比重の異なる水溶性結晶粒子を混合したものを使用し、重合前の疎水性高分子と混合後に遠心分離操作を行った後、重合成形することによって、得られる多孔質体に孔／孔径の密度分布を付与することができる。孔／孔径の密度分布が付与された多孔質体を用いることによって、例えば、特定のサイズのリポソームを複数種類同時に得ることや、サイズ分布の大きなリポソームから特定のサイズのリポソームを分離するデバイスとして利用することができる。 In producing a porous body of a hydrophobic polymer, for example, a mixture of water-soluble crystal particles having different particle systems may be used as the water-soluble crystal particles. By using a porous body obtained using such water-soluble crystalline particles, for example, the efficiency of introducing a solution into the inside of the porous body can be improved, and preferably the production efficiency of liposomes is improved. Can be made. Further, as the water-soluble crystal particles, for example, a mixture of water-soluble crystal particles having different specific gravities is used, and after mixing with a hydrophobic polymer before polymerization, a centrifugal separation operation is performed, followed by polymerization molding. A pore / pore diameter density distribution can be imparted to the resulting porous body. By using a porous material with a pore / pore size density distribution, for example, it is possible to obtain multiple types of liposomes of a specific size at the same time, or as a device for separating liposomes of a specific size from liposomes with a large size distribution can do.
［乾燥脂質フィルム］
本明細書において「乾燥脂質フィルム」とは、単層又は複数の層の脂質で構成された膜であって乾燥状態の膜をいい、好ましくは乾燥状態の脂質二分子膜のことをいう。本明細書において「乾燥状態」とは、脂質を溶解する溶媒が除去された状態のことをいい、好ましくは脂質を溶解する溶媒が除去されて乾燥した状態や、真空乾燥後の状態を含む。脂質としては、後述のものが挙げられる。
[Dry lipid film]
In the present specification, the “dry lipid film” refers to a membrane composed of a single layer or a plurality of layers of lipid and is in a dry state, preferably a dry lipid bilayer. In this specification, the “dry state” refers to a state where a solvent that dissolves lipids is removed, and preferably includes a state where a solvent that dissolves lipids is removed and dried, and a state after vacuum drying. Examples of lipids include those described below.
［脂質を含む溶液］
本明細書において「脂質を含む溶液」は、疎水性高分子の多孔質体に乾燥脂質フィルムを形成するための溶液のことをいう。該脂質はリポソームの脂質膜、好ましくは脂質二分子膜を構成する。脂質を含む溶液は、脂質と、脂質を溶解するための溶媒とを含む。溶媒としては脂質を溶解できるものであれば特に制限されず、例えば、公知の有機溶媒等が使用できる。有機溶媒としては、例えば、ヘキサン、デカン、ジエチルエーテル、イソプロピルエーテル、クロロホルム、メタノール、エタノール、プロパノール等、およびその組み合わせによる混合溶媒が挙げられる。中でも、有機溶媒としては、例えば、多孔質体の孔や表面での脂質溶液の表面エネルギーを下げることで多孔質体の孔や多孔質体表面に溶液中の上記脂質を大きく広げることのできる組成の溶媒が好ましく、例えばクロロホルムとメタノールの混合溶媒等が好ましい。
[Liquid-containing solution]
In the present specification, the “solution containing lipid” refers to a solution for forming a dry lipid film on a porous body of a hydrophobic polymer. The lipid constitutes a lipid membrane of a liposome, preferably a lipid bilayer. The solution containing lipid includes lipid and a solvent for dissolving lipid. The solvent is not particularly limited as long as it can dissolve lipids. For example, a known organic solvent can be used. Examples of the organic solvent include mixed solvents of hexane, decane, diethyl ether, isopropyl ether, chloroform, methanol, ethanol, propanol, and the like, and combinations thereof. Among them, as the organic solvent, for example, a composition that can greatly expand the lipid in the solution to the pores and the surface of the porous body by reducing the surface energy of the lipid solution at the pores and the surface of the porous body, for example. For example, a mixed solvent of chloroform and methanol is preferable.
脂質としては、リポソームの脂質膜、好ましくは脂質二分子膜を構成しうる脂質が使用でき、例えば、公知のグリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質、コレステロール及びリン脂質等が挙げられる。 As the lipid, a lipid that can form a liposome lipid membrane, preferably a lipid bilayer membrane can be used, and examples thereof include known glyceroglycolipid, glycosphingolipid, cholesterol, and phospholipid.
グリセロ糖脂質としては、例えば、スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、及びグリコシルジグリセリド等が挙げられる。スフィンゴ糖脂質としては、例えば、ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、及びガングリオシド等が挙げられる。 Examples of the glyceroglycolipid include sulfoxyribosyl glyceride, diglycosyl diglyceride, digalactosyl diglyceride, galactosyl diglyceride, and glycosyl diglyceride. Examples of glycosphingolipids include galactosyl cerebroside, lactosyl cerebroside, and ganglioside.
リン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、及び水素添加リン脂質等の天然または合成のリン脂質が挙げられる。 Examples of phospholipids include natural or synthetic phospholipids such as phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidic acid, phosphatidylglycerol, phosphatidylinositol, lysophosphatidylcholine, sphingomyelin, egg yolk lecithin, soybean lecithin, and hydrogenated phospholipid. Is mentioned.
ホスファチジルコリンとしては、大豆ホスファチジルコリン、卵黄ホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルフォスファチジルコリン、及びジステアロイルホスファチジルコリン等が挙げられる。 ホスファチジルエタノールアミンとしては、ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、及びジステアロイルホスファチジルエタノールアミン等が挙げられる。 ホスファチジルセリンとしては、ジラウロイルホスファチジルセリン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、及びジステアロイルホスファチジルセリン等が挙げられる。 ホスファチジルグリセロールとしては、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、及びジステアロイルホスファチジルグリセロール等が挙げられる。 ホスファチジルイノシトールとしては、ジラウロイルホスファチジルイノシトール、ジミリストイルホスファチジルイノシトール、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール、及びジステアロイルホスファチジルイノシトール等が挙げられる。 Examples of the phosphatidylcholine include soybean phosphatidylcholine, egg yolk phosphatidylcholine, dilauroylphosphatidylcholine, dimyristoylphosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine, dioleoylphosphatidylcholine, distearoylphosphatidylcholine and the like. Examples of the phosphatidylethanolamine include dioleoylphosphatidylethanolamine, dilauroyl phosphatidylethanolamine, dimyristoyl phosphatidylethanolamine, dipalmitoyl phosphatidylethanolamine, and distearoyl phosphatidylethanolamine. Examples of phosphatidylserine include dilauroyl phosphatidylserine, dimyristoyl phosphatidylserine, dipalmitoylphosphatidylserine, and distearoylphosphatidylserine. Examples of the phosphatidyl glycerol include dilauroyl phosphatidyl glycerol, dimyristoyl phosphatidyl glycerol, dipalmitoyl phosphatidyl glycerol, and distearoyl phosphatidyl glycerol. Examples of phosphatidylinositol include dilauroyl phosphatidylinositol, dimyristoyl phosphatidylinositol, dipalmitoyl phosphatidylinositol, and distearoyl phosphatidylinositol.
［リポソームの製造方法］
本発明のリポソームの製造方法は、疎水性高分子の多孔質体の内部の孔に形成した乾燥脂質フィルムからリポソームを形成することを含む。本発明のリポソームの製造方法は、例えば、疎水性高分子の多孔質体の表面に形成された乾燥脂質フィルムから形成することを含んでいてもよく、すなわち、疎水性高分子の多孔質体の内部の孔表面及び該多孔質体の表面に形成された乾燥脂質フィルムから形成することを含みうる。
[Method for producing liposome]
The method for producing a liposome of the present invention includes forming a liposome from a dry lipid film formed in pores inside a porous body of a hydrophobic polymer. The method for producing a liposome of the present invention may include, for example, forming from a dry lipid film formed on the surface of a porous body of a hydrophobic polymer. Forming from a dry lipid film formed on the surface of the internal pores and the surface of the porous body.
本発明の製造方法は、例えば、疎水性高分子の多孔質体の内部の孔に乾燥脂質フィルムを形成する工程（ａ）、及び乾燥脂質フィルムを形成した多孔質体の孔に水溶液を導入してリポソームを形成する工程（ｂ）等を含んでいてもよい。 In the production method of the present invention, for example, a step (a) of forming a dry lipid film in pores inside a porous body of a hydrophobic polymer, and an aqueous solution is introduced into the pores of the porous body formed with the dry lipid film. A step (b) for forming liposomes.
工程（ａ）
工程（ａ）は、疎水性高分子の多孔質体の内部の孔（空隙部）に乾燥脂質フィルムを形成する工程である。この工程（ａ）により、好ましくは、疎水性高分子の多孔質体の空隙部全体に乾燥脂質フィルムを形成することができる。工程（ａ）において、疎水性高分子の多孔質体の内部の孔（空隙部）表面のみならず、疎水性高分子の多孔質体表面に乾燥脂質フィルムを形成してもよい。
Step (a)
Step (a) is a step of forming a dry lipid film in the pores (voids) inside the porous body of the hydrophobic polymer. By this step (a), a dry lipid film can be preferably formed over the entire void of the porous body of the hydrophobic polymer. In the step (a), a dry lipid film may be formed not only on the surface of pores (voids) inside the porous body of the hydrophobic polymer but also on the surface of the porous body of the hydrophobic polymer.
乾燥脂質フィルムは、例えば、疎水性高分子の多孔質体を予め減圧しておき、減圧を解除するとともに脂質を含む溶液を導入すること、及び脂質を含む溶液を導入した前記疎水性高分子の多孔質体を減圧下とすることにより形成することができる。このように、疎水性高分子の多孔質体を予め減圧しておき、減圧を解除するとともに脂質を含む溶液を導入することにより、例えば、疎水性高分子の多孔質体の内部の孔への脂質を含む溶液の導入効率を向上させることができる。 The dry lipid film is prepared by, for example, depressurizing a porous body of a hydrophobic polymer in advance, releasing the vacuum and introducing a solution containing the lipid, and introducing the solution containing the lipid into the hydrophobic polymer. The porous body can be formed under reduced pressure. In this way, by depressurizing the porous body of the hydrophobic polymer in advance, releasing the decompression and introducing the solution containing lipid, for example, the pores inside the porous body of the hydrophobic polymer are introduced. The introduction efficiency of the solution containing lipid can be improved.
「疎水性高分子の多孔質体を予め減圧する」とは、減圧解除することにより疎水性高分子の多孔質体の空隙部に、脂質を含む溶液を導入可能な程度にまで減圧することを含み、例えば、疎水性高分子の多孔質体を含む容器内の圧力を下げることによって該容器内と容器外とで圧力差を生じさせることを含む。減圧下とする方法は、公知の減圧方法により行うことができ、例えば、疎水性高分子の多孔質体を含む容器内を真空ポンプ等を用いて真空に近い状態とすることにより行うことができる。 “Depressurizing the porous body of the hydrophobic polymer in advance” means to depressurize the solution containing lipid into the voids of the porous body of the hydrophobic polymer by releasing the vacuum. Including, for example, generating a pressure difference between the inside of the container and the outside of the container by lowering the pressure in the container containing the porous body of the hydrophobic polymer. The method of reducing the pressure can be performed by a known pressure reducing method, for example, by bringing the inside of the container containing the porous body of the hydrophobic polymer into a state close to a vacuum using a vacuum pump or the like. .
「減圧を解除する」とは、例えば、上述の圧力差を解消することを含む。工程（ａ）においては、圧力差の解消とともに、圧力差を用いて疎水性高分子の多孔質体の空隙部に脂質を含む溶液を導入可能な状態とすることを含む。減圧を解除する方法としては、例えば、容器内外の圧力差を用いて多孔質体を含む容器に脂質を含む溶液を吸引させること等が挙げられる。 “Release decompression” includes, for example, eliminating the pressure difference. The step (a) includes releasing the pressure difference and making it possible to introduce a solution containing lipid into the voids of the porous body of the hydrophobic polymer using the pressure difference. As a method for releasing the reduced pressure, for example, a solution containing lipid is sucked into a container containing a porous body using a pressure difference between inside and outside the container.
「疎水性高分子の多孔質体を減圧下とする」とは、脂質溶液を含浸させた疎水性高分子の多孔質体を減圧処理することを含み、好ましくは該多孔質体を減圧処理により脂質を溶解した溶媒を除去すること、より好ましくは該多孔質体を真空乾燥することにより行うことができる。脂質溶液を含浸させた疎水性高分子の多孔質体を減圧処理することにより、例えば、該多孔質体の内部の孔に乾燥脂質フィルムを容易に形成することができる。 “Depressing the porous body of a hydrophobic polymer under reduced pressure” includes subjecting the porous body of the hydrophobic polymer impregnated with the lipid solution to reduced pressure, preferably by subjecting the porous body to reduced pressure. It can be carried out by removing the solvent in which the lipid is dissolved, more preferably by vacuum drying the porous body. By subjecting the porous body of the hydrophobic polymer impregnated with the lipid solution to a reduced pressure, for example, a dry lipid film can be easily formed in the pores inside the porous body.
また、乾燥脂質フィルムは、例えば、疎水性高分子の多孔質体を脂質を含む溶液に含浸させた後、疎水性高分子の多孔質体を減圧処理することができる。「脂質溶液を含浸させた疎水性高分子の多孔質体を減圧処理する」とは、空隙部（孔）内の溶媒を除去可能な程度にまで減圧して乾燥させること、より好ましくは真空乾燥させることを含みうる。減圧処理方法は、上述の通りである。 In addition, the dry lipid film can be, for example, impregnated with a hydrophobic polymer porous material in a lipid-containing solution and then subjected to a vacuum treatment on the hydrophobic polymer porous material. “Pressure treatment of a porous body of a hydrophobic polymer impregnated with a lipid solution” means drying under reduced pressure to such an extent that the solvent in the voids (pores) can be removed, more preferably vacuum drying. Can be included. The decompression processing method is as described above.
工程（ｂ）
工程（ｂ）は、乾燥脂質フィルムを形成した疎水性高分子の多孔質体の孔に水溶液を導入してリポソームを形成する工程である。この工程により、多孔質体に形成された乾燥脂質フィルムが水和し、例えば、多孔質体の孔内でリポソームが形成される。工程（ｂ）において、疎水性高分子の多孔質体の内部の孔（空隙部）に形成された乾燥脂質フィルムのみならず、疎水性高分子の多孔質体表面に形成された乾燥脂質フィルムからリポソームが形成されてもよい。
Step (b)
Step (b) is a step of forming a liposome by introducing an aqueous solution into the pores of a porous body of a hydrophobic polymer that has formed a dry lipid film. By this step, the dried lipid film formed on the porous body is hydrated, and, for example, liposomes are formed in the pores of the porous body. In step (b), not only from the dried lipid film formed in the pores (voids) inside the porous body of the hydrophobic polymer, but also from the dried lipid film formed on the surface of the porous body of the hydrophobic polymer Liposomes may be formed.
工程（ｂ）において、疎水性高分子の多孔質体内への水溶液の導入は、簡便かつ効率よくリポソームを製造する点からは、例えば、乾燥脂質フィルムが形成された減圧下の疎水性高分子の多孔質体に、減圧を解除するともに水溶液を導入することが好ましい。 In the step (b), the introduction of the aqueous solution of the hydrophobic polymer into the porous body is easy and efficient from the viewpoint of producing liposomes. For example, the hydrophobic polymer under reduced pressure on which the dry lipid film is formed is used. It is preferable to release the reduced pressure and introduce an aqueous solution into the porous body.
「減圧の解除」は、上記工程（ａ）と同様であり、上記工程（ａ）に記載した方法と同様に行うことができる。工程（ｂ）においては、圧力差の解消とともに、圧力差を用いて疎水性高分子の多孔質体の内部の空隙部（孔）に水溶液を導入可能な状態とすることを含む。このように疎水性高分子の多孔質体の内部の空隙部に水溶液が導入されることによって、好ましくは、疎水性高分子の多孔質体の空隙部表面に形成された乾燥脂質フィルムが水和し、空隙部（孔）内においてリポソームが形成され得る。 “Release of decompression” is the same as in the step (a), and can be performed in the same manner as the method described in the step (a). In the step (b), the pressure difference is eliminated and the aqueous solution can be introduced into the voids (holes) inside the porous body of the hydrophobic polymer using the pressure difference. By introducing the aqueous solution into the void inside the porous body of the hydrophobic polymer in this way, it is preferable that the dried lipid film formed on the surface of the void of the porous body of the hydrophobic polymer is hydrated. In addition, liposomes can be formed in the voids (pores).
疎水性高分子の多孔質体内への水溶液の導入は、例えば、乾燥脂質フィルムを形成した疎水性高分子の多孔質体に水溶液を接触させた状態で電界を印加することによって行ってもよい。電界の印加による水溶液の導入は、例えば、電極が配置されたチャンバー内に、乾燥脂質フィルムを形成した疎水性高分子の多孔質体及び水溶液を収容し、該電極間に電界を印加することによって行うことができる。印加する電界は特に制限されないが、例えば、該電極間に、１０Ｈｚで０．５〜５Ｖの交流電場を印加することにより行うことができる。 The introduction of the aqueous solution of the hydrophobic polymer into the porous body may be performed, for example, by applying an electric field in a state where the aqueous solution is in contact with the porous body of the hydrophobic polymer on which the dry lipid film is formed. The introduction of an aqueous solution by applying an electric field is performed by, for example, storing a porous body of a hydrophobic polymer in which a dry lipid film is formed and an aqueous solution in a chamber in which electrodes are arranged, and applying an electric field between the electrodes. It can be carried out. Although the electric field to be applied is not particularly limited, for example, it can be performed by applying an AC electric field of 0.5 to 5 V at 10 Hz between the electrodes.
乾燥脂質フィルムが形成された多孔質体に導入する水溶液は、例えば、リポソームの内部に封入する内包対象物を含んでいてもよい。内包対象物は、製造するリポソームの用途等に応じて適宜決定できる。内包対象物としては、例えば、無細胞タンパク質発現系等が挙げられる。無細胞タンパク質発現系とは、細胞抽出液を用いて試験管内でタンパク質を発現させる系であり、例えば、ｍＲＮＡの情報を読み取ってリボゾーム上でタンパク質を発現させる無細胞翻訳系、ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを合成する無細胞転写系と無細胞翻訳系の両者を含む系が挙げられる。上記細胞抽出液としては、リポソーム、ｔＲＮＡ等のタンパク質合成に必要な成分を含む真核細胞や原核細胞の抽出液が使用可能である。真核細胞及び原核細胞としては、公知のものが使用でき、好熱性細菌、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球、マウスＬ−細胞、エールリッヒ腹水癌細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞及び出芽酵母などが挙げられる。薬物輸送担体といったリポソーム製剤の場合、例えば、哺乳動物に投与可能な任意の化合物又は組成物等であればよく、造影剤、抗腫瘍剤、カルシウム剤、抗菌剤、抗消炎剤、ホルモン剤、免疫抑制剤、抗リウマチ薬等が例示できる。遺伝子導入担体の場合、例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ等が挙げられる。 The aqueous solution introduced into the porous body on which the dry lipid film is formed may include, for example, an inclusion target to be encapsulated inside the liposome. The inclusion target can be appropriately determined according to the use of the liposome to be produced. Examples of the inclusion target include a cell-free protein expression system. The cell-free protein expression system is a system for expressing a protein in a test tube using a cell extract. For example, a cell-free translation system that reads mRNA information and expresses a protein on a ribosome, RNA using DNA as a template And a system containing both a cell-free transcription system and a cell-free translation system. As the cell extract, eukaryotic or prokaryotic cell extracts containing components necessary for protein synthesis such as liposomes and tRNA can be used. Known eukaryotic cells and prokaryotic cells can be used, and examples include thermophilic bacteria, wheat germ, rabbit reticulocytes, mouse L-cells, Ehrlich ascites tumor cells, HeLa cells, CHO cells, and budding yeast. In the case of a liposome preparation such as a drug delivery carrier, for example, any compound or composition that can be administered to mammals may be used, such as a contrast agent, an antitumor agent, a calcium agent, an antibacterial agent, an anti-inflammatory agent, a hormone agent, an immunity agent. Examples thereof include inhibitors and anti-rheumatic drugs. In the case of a gene transfer carrier, examples thereof include DNA and mRNA.
なお、本発明のリポソームの製造方法は、乾燥脂質フィルムが形成された多孔質体に導入する水溶液として、無細胞タンパク質発現系と膜タンパク質遺伝子とを含む水溶液を用いた場合、膜タンパク質を含むリポソームを製造することができ、好ましくは、膜脂質に膜タンパク質が存在するリポソームを製造することができる。膜タンパク質としては、特に制限されないが、例えば、チトクロムｂ５等といったＣ末アンカー型の膜タンパク質、チトクロムｂ５６１やムスカリン性アセチルコリン受容体、バクテリオロドプシン等といった数回膜貫通型の膜タンパク質、Ｐ４５０レダクターゼ等といったＮ末一回膜貫通型の膜タンパク質等が挙げられる。 The liposome production method of the present invention is a liposome containing a membrane protein when an aqueous solution containing a cell-free protein expression system and a membrane protein gene is used as the aqueous solution to be introduced into the porous body on which the dry lipid film is formed. Preferably, liposomes in which membrane proteins are present in membrane lipids can be produced. The membrane protein is not particularly limited, but for example, a C-terminal anchor type membrane protein such as cytochrome b5, several times transmembrane type membrane protein such as cytochrome b561, muscarinic acetylcholine receptor, bacteriorhodopsin, P450 reductase, etc. N-terminal once transmembrane type membrane protein and the like can be mentioned.
本発明のリポソームの製造方法は、さらに、疎水性高分子の多孔質体からリポソームを回収する工程（ｃ）を含んでいてもよい。リポソームの回収は、例えば、遠心分離や、疎水性高分子の多孔質体を絞ること等を用いて行うことができる。 The method for producing a liposome of the present invention may further include a step (c) of recovering the liposome from a porous body of a hydrophobic polymer. The recovery of the liposome can be performed by, for example, centrifugation or squeezing the porous body of the hydrophobic polymer.
上述のようにして得られたリポソームは、従来公知のリポソームと同様に、例えば、体分子機能解析モデル、薬物輸送担体、遺伝子導入担体等として使用できる。 The liposomes obtained as described above can be used as, for example, a body molecular function analysis model, a drug transport carrier, a gene transfer carrier and the like, as in the case of conventionally known liposomes.
［融合リポソームの製造方法］
本発明の融合リポソームの製造方法は、少なくとも２種類のリポソームが融合した融合リポソームを製造する方法であって、疎水性高分子の多孔質体の内部の孔でリポソームを融合させることを含む。本発明の融合リポソームの製造方法によれば、疎水性高分子の多孔質体の内部の孔でリポソームを融合させることを含むため、簡便かつ効率よく融合リポソームを製造することができる。
[Method for producing fused liposome]
The method for producing a fused liposome of the present invention is a method for producing a fused liposome in which at least two kinds of liposomes are fused, and comprises fusing the liposome with pores inside a porous body of a hydrophobic polymer. According to the method for producing a fused liposome of the present invention, since the liposome is fused with pores inside the porous body of the hydrophobic polymer, the fused liposome can be produced simply and efficiently.
本発明の融合リポソームの製造方法は、例えば、疎水性高分子の多孔質体にリポソーム懸濁液を導入して、該多孔質体の内部の孔に乾燥脂質フィルムを形成する工程（ａ’）、及び乾燥脂質フィルムを形成した多孔質体の孔に水溶液を導入してリポソームを形成する工程（ｂ’）等を含んでいてもよい。 In the method for producing a fused liposome of the present invention, for example, a step of introducing a liposome suspension into a porous body of a hydrophobic polymer and forming a dry lipid film in pores inside the porous body (a ′) And a step (b ′) of forming an liposome by introducing an aqueous solution into the pores of the porous body on which the dry lipid film is formed.
工程（ａ’）
工程（ａ’）は、例えば、疎水性高分子の多孔質体に少なくとも２種類のリポソームを含むリポソーム懸濁液を導入すること、及びリポソーム懸濁液を導入した疎水性高分子の多孔質体を減圧処理して疎水性高分子の多孔質体の内部の孔に乾燥脂質フィルムを形成することを含んでいてもよい。リポソーム懸濁液を導入した疎水性高分子の多孔質体を減圧処理することにより、効率よく疎水性高分子の多孔質体の内部の孔に乾燥脂質フィルムを形成することができる。
Step (a ′)
In the step (a ′), for example, a liposome suspension containing at least two kinds of liposomes is introduced into a porous body of a hydrophobic polymer, and a porous body of the hydrophobic polymer into which the liposome suspension is introduced To form a dry lipid film in the pores in the porous body of the hydrophobic polymer by reducing the pressure. By subjecting the porous body of the hydrophobic polymer introduced with the liposome suspension to reduced pressure, a dry lipid film can be efficiently formed in the pores of the porous body of the hydrophobic polymer.
疎水性高分子の多孔質体へのリポソーム懸濁液の導入は、例えば、疎水性高分子の多孔質体の内部の空隙部（孔）へのリポソーム懸濁液の導入効率の点からは、減圧下の疎水性高分子の多孔質体に、減圧を解除するとともに少なくとも２種類のリポソームを含むリポソーム懸濁液を導入することにより行うことが好ましい。工程（ａ’）における減圧及び減圧解除は、上述のリポソームの製造方法における工程（ａ）と同様である。 The introduction of the liposome suspension into the porous body of the hydrophobic polymer is, for example, from the point of introduction efficiency of the liposome suspension into the void (pore) inside the porous body of the hydrophobic polymer, It is preferable to carry out by releasing the reduced pressure and introducing a liposome suspension containing at least two kinds of liposomes into the porous body of the hydrophobic polymer under reduced pressure. The decompression and release of the decompression in the step (a ′) are the same as those in the step (a) in the above-described liposome production method.
リポソームの懸濁液は、例えば、少なくとも２種類のリポソームを含み、少なくとも２種類のリポソームが液体中で分散した状態のことをいう。少なくとも２種類のリポソームを含むリポソーム懸濁液は、リポソーム内に封入された物質の種類が異なるリポソームを少なくとも２種類含むことが好ましい。物質の種類が異なるとは、例えば、組成、機能、性質等が異なる物質のことをいう。リポソーム内に封入された物質としては、例えば、上記の内包対象物が挙げられる。 The liposome suspension includes, for example, a state in which at least two types of liposomes are included and at least two types of liposomes are dispersed in a liquid. The liposome suspension containing at least two kinds of liposomes preferably contains at least two kinds of liposomes having different kinds of substances encapsulated in the liposomes. Different types of substances refer to substances having different compositions, functions, properties, etc., for example. Examples of the substance encapsulated in the liposome include the above-mentioned inclusion target.
乾燥脂質フィルムは、例えば、リポソーム懸濁液を導入した疎水性高分子の多孔質体を減圧処理することにより形成することができ、好ましくは該多孔質体を減圧処理によりリポソーム懸濁液に含まれる溶液を除去すること、より好ましくは該多孔質体を真空乾燥することにより行うことができる。リポソーム懸濁液を導入した疎水性高分子の多孔質体を減圧処理することにより、例えば、該多孔質体の内部の孔に乾燥脂質フィルムを容易に形成することができる。減圧処理は、本発明のリポソームの製造方法の工程（ａ）と同様に行うことができる。 The dry lipid film can be formed, for example, by subjecting a hydrophobic polymer porous body into which the liposome suspension is introduced to a reduced pressure treatment, and preferably the porous body is contained in the liposome suspension by a reduced pressure treatment. The solution can be removed, more preferably by vacuum drying the porous body. By subjecting the porous polymer porous body into which the liposome suspension has been introduced to a reduced pressure, for example, a dry lipid film can be easily formed in the pores inside the porous body. The reduced pressure treatment can be performed in the same manner as in the step (a) of the method for producing the liposome of the present invention.
工程（ｂ’）
工程（ｂ’）は、乾燥脂質フィルムを形成した多孔質体の孔に水溶液を導入してリポソームを形成する工程である。疎水性高分子の多孔質体の内部の空隙部（孔）に水溶液が導入されることによって、好ましくは、疎水性高分子の多孔質体の内部の孔に形成された乾燥乾燥脂質フィルムが水和し、空隙部（孔）内においてリポソームが融合されて融合リポソームが形成され得る。リポソームが融合するとは、例えば、別々のリポソームそれぞれに含まれていた物質を内部に有する１つのリポソームとすることを含む。水溶液の導入は、例えば、本発明のリポソームの製造方法における工程（ｂ）と同様に行うことができる。
Step (b ′)
Step (b ′) is a step of forming liposomes by introducing an aqueous solution into the pores of the porous body on which the dry lipid film has been formed. By introducing an aqueous solution into the voids (pores) inside the porous body of the hydrophobic polymer, it is preferable that the dry and dried lipid film formed in the pores inside the porous body of the hydrophobic polymer be water. The liposomes can be fused and fused in the voids (pores) to form fused liposomes. Fusion of liposomes includes, for example, making one liposome having a substance contained in each of the separate liposomes therein. The introduction of the aqueous solution can be performed, for example, in the same manner as in the step (b) in the liposome production method of the present invention.
本発明の融合リポソームの製造方法は、工程（ａ’）及び工程（ｂ’）を繰り返し行ってもよい。繰り返し行うことにより、好ましくは、異なる種類の物質が複数内封されたリポソームを製造することができる。 In the method for producing the fusion liposome of the present invention, the step (a ′) and the step (b ′) may be repeated. By repeatedly performing, it is possible to produce a liposome in which a plurality of different kinds of substances are encapsulated.
本発明の融合リポソームの製造方法は、さらに、疎水性高分子の多孔質体から融合リポソームを回収する工程（ｃ’）を含んでいてもよい。融合リポソームの回収は、例えば、遠心分離や、疎水性高分子の多孔質体を絞ること等を用いて行うことができる。 The method for producing a fusion liposome of the present invention may further include a step (c ′) of recovering the fusion liposome from a porous body of a hydrophobic polymer. The recovery of the fused liposome can be performed by, for example, centrifugation or squeezing a porous body of a hydrophobic polymer.
上述のようにして得られた融合リポソームは、従来公知のリポソームと同様に、例えば、体分子機能解析モデル、薬物輸送担体、遺伝子導入担体等として使用できる。 The fused liposome obtained as described above can be used as, for example, a body molecule function analysis model, a drug transport carrier, a gene transfer carrier and the like, as in the case of conventionally known liposomes.
［膜タンパク質アレイ］
本発明は、さらにその他の態様として、本発明のリポソームの製造方法により製造された膜タンパク質を含むリポソームが配置された膜タンパク質アレイに関する。本発明の膜タンパク質アレイによれば、例えば、膜タンパク質の機能解析や様々なスクリーニング等を行うことができる。
[Membrane protein array]
In still another aspect, the present invention relates to a membrane protein array in which liposomes containing membrane proteins produced by the method for producing liposomes of the present invention are arranged. According to the membrane protein array of the present invention, for example, functional analysis of membrane proteins and various screenings can be performed.
膜タンパク質アレイにおいて、配置される膜タンパク質を含むリポソームの数は特に制限されず、例えば、基板の大きさ、検出目的、検出方法等に応じて適宜設定できる。膜タンパク質アレイにおいて、膜タンパク質を含むリポソームは、例えば、基板上に固定化されていることが好ましい。リポソームの基板への固定化は、公知の方法により行うことができる。膜タンパク質アレイは、従来公知のタンパク質アレイやＤＮＡアレイ等と同様の方法により製造することができる。 In the membrane protein array, the number of liposomes containing membrane proteins to be arranged is not particularly limited, and can be appropriately set according to, for example, the size of the substrate, the purpose of detection, the detection method, and the like. In the membrane protein array, the liposome containing the membrane protein is preferably immobilized on a substrate, for example. The liposome can be immobilized on the substrate by a known method. The membrane protein array can be produced by the same method as a conventionally known protein array or DNA array.
以下に、本発明を好適な実施の形態を示しながら詳細に説明する。但し、本発明は以下に示す実施の形態に限定されない。 Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to preferred embodiments. However, the present invention is not limited to the embodiments described below.
（実施の形態１）
本実施の形態１では、ＰＤＭＳの多孔質体を用いてリポソームの製造方法を例にとり説明する。
(Embodiment 1)
In the first embodiment, a liposome production method using a PDMS porous material will be described as an example.
まず、ＰＤＭＳの多孔質体（以下、「マイクロスポンジ」ともいう）を準備する。多孔質体としては、市販のものを使用してもよいし、上述した方法により製造してもよい。本実施の形態１では、多孔質体として図１に示す構造のものを使用した。図１Ａは、ＰＤＭＳで形成した多孔質体の一例を示す模式図であり、図１Ｂは、その多孔質体のＳＥＭ（走査型電子顕微鏡）写真の一例である。図１に示すように、多孔質体は、連続気泡構造を有しており、孔のサイズの大きさが略均一であることが好ましい。 First, a porous body of PDMS (hereinafter also referred to as “micro sponge”) is prepared. As a porous body, a commercially available thing may be used and you may manufacture by the method mentioned above. In this Embodiment 1, the thing of the structure shown in FIG. 1 was used as a porous body. FIG. 1A is a schematic diagram illustrating an example of a porous body formed by PDMS, and FIG. 1B is an example of an SEM (scanning electron microscope) photograph of the porous body. As shown in FIG. 1, it is preferable that the porous body has an open cell structure and the size of the pores is substantially uniform.
次に、マイクロスポンジを容器に入れ、容器内を減圧する。減圧は、例えば、デシケータや真空チャンバー内で真空ポンプ用いて行うことができる。減圧処理条件は、容器の大きさ等に応じて適宜決定できるが、１．５ｍＬ容量の樹脂製マイクロチューブを用いる場合は、例えば、１００ｋＰａ以下、好ましくは０．１ｋＰａ〜１００ｋＰａで３０分行うことで実現される。 Next, the microsponge is put in a container, and the inside of the container is decompressed. The decompression can be performed, for example, using a vacuum pump in a desiccator or a vacuum chamber. The decompression treatment conditions can be appropriately determined according to the size of the container, etc., but when a 1.5 mL resin microtube is used, for example, 100 kPa or less, preferably 0.1 kPa to 100 kPa for 30 minutes. Realized.
ついで、マイクロスポンジを含む容器内の減圧を解除するとともに、マイクロスポンジを含む容器内に脂質を含む溶液を導入する。このとき、上記のようにマイクロスポンジを含む容器を減圧することによって、マイクロスポンジ内の空隙部（孔）も減圧状態となってことから、減圧が解除されることにより圧力差によって、脂質を含む溶液が容器内に導入されるとともに、マイクロスポンジ内の空隙部（孔）の全体に脂質を含む溶液が導入される。なお、マイクロスポンジ内の空隙部（孔）の全体に脂質を含む溶液が導入する点からは、脂質を含む溶液の導入は、マイクロスポンジ内の空隙部（孔）の減圧状態が維持された状態で行うことが好ましい。 Next, the pressure reduction in the container containing the microsponge is released, and a solution containing lipid is introduced into the container containing the microsponge. At this time, by reducing the pressure of the container containing the microsponge as described above, the voids (holes) in the microsponge are also in a depressurized state. While the solution is introduced into the container, a solution containing lipid is introduced into the entire void (hole) in the microsponge. In addition, from the point that the solution containing lipid is introduced into the entire voids (pores) in the microsponge, the introduction of the lipid-containing solution maintains the reduced pressure state of the voids (pores) in the microsponge. It is preferable to carry out with.
ついで、マイクロスポンジ内の空隙部（孔）内に脂質を含む溶液が導入された状態で、マイクロスポンジを含む容器を減圧することによって真空乾燥させて、脂質を溶解する溶媒を除去する。これにより、マイクロスポンジ内の空隙部（孔）の表面が乾燥脂質フィルムによって覆われる。 Next, in a state where the lipid-containing solution is introduced into the voids (pores) in the microsponge, the container containing the microsponge is vacuum-dried by reducing the pressure to remove the solvent that dissolves the lipid. Thereby, the surface of the space | gap part (hole) in micro sponge is covered with a dry lipid film.
そして、マイクロスポンジを含む容器内の減圧状態を解除するとともに、乾燥脂質フィルムで空隙部（孔）の表面が覆われたマイクロスポンジを含む容器に、内包対象物を含む水溶液を導入する。これにより、減圧状態となったマイクロスポンジ内の空隙部（孔）全体に、内包対象物を含む水溶液が導入され、空隙部（孔）の表面を覆う乾燥脂質フィルムが水和されることにより、マイクロスポンジの内部においてリポソームが形成されるとともに、リポソームの内部に内包対象物が封入される。これにより、内部に内包対象物が封入されたリポソームを得ることができる。 And while releasing the pressure-reduced state in the container containing a micro sponge, the aqueous solution containing an inclusion target object is introduce | transduced into the container containing the micro sponge in which the surface of the space | gap part (hole) was covered with the dry lipid film. Thereby, the aqueous solution containing the inclusion target is introduced into the entire void portion (hole) in the microsponge in a reduced pressure state, and the dried lipid film covering the surface of the void portion (pore) is hydrated, Liposomes are formed inside the microsponge, and the inclusion target is enclosed inside the liposome. Thereby, the liposome by which the inclusion target object was enclosed can be obtained.
また、上記減圧状態の解除及び溶液の導入は、操作性の点から、例えば、三方コックを使用し、三方コックの１つをマクロスポンジを入れた容器、１つをマイクロスポンジ内に導入する溶液等を含む容器、１つを真空ポンプにそれぞれつなぎ、コックを動かすことによって行うことが好ましい。三方コックのコックを移動させることにより、減圧の解除及び溶液の導入を容易に行うことができる。 In addition, from the viewpoint of operability, for example, a three-way cock is used to release the reduced pressure state and a solution in which one of the three-way cocks is filled with a macro sponge and one is introduced into the micro sponge. It is preferable to carry out by moving the cock by connecting one container including the like to a vacuum pump. By moving the cock of the three-way cock, the decompression can be released and the solution can be easily introduced.
マイクロスポンジからのリポソームの回収は、例えば、遠心分離、マイクロスポンジを絞ること等に行うことができる。 The recovery of the liposome from the microsponge can be performed, for example, by centrifugation, squeezing the microsponge, or the like.
上記のようにして、本実施の形態１の方法によれば、マイクロスポンジの減圧及び大気圧開放による溶液導入によって、サイズが均一なリポソームを簡単に製造することができる。また、本実施の形態１の方法によれば、多孔質構造のマイクロスポンジ内でリポソームの形成を行うため、短時間で水和させることが可能となり、また、目的の内包対象物が封入されたリポソームの製造効率を向上することができる。 As described above, according to the method of Embodiment 1, liposomes having a uniform size can be easily produced by introducing the solution by reducing the pressure of the microsponge and releasing the atmospheric pressure. In addition, according to the method of the first embodiment, since the liposome is formed in the micro-sponge having a porous structure, it can be hydrated in a short time, and the target inclusion object is enclosed. The production efficiency of liposome can be improved.
マイクロスポンジの孔径を変化させることによって所望の径のリポソームを得ることができるが、得られるリポソームの径は、一般的には、２０ｎｍ〜１００μｍであり、好ましくは２００ｎｍ〜１０μｍである。 Liposomes having a desired diameter can be obtained by changing the pore diameter of the microsponge, and the obtained liposome diameter is generally 20 nm to 100 μm, preferably 200 nm to 10 μm.
（実施の形態２）
本実施の形態２では、膜タンパク質を含むリポソームの製造方法について説明する。
(Embodiment 2)
In this Embodiment 2, the manufacturing method of the liposome containing a membrane protein is demonstrated.
まず、無細胞タンパク質発現系と無細胞タンパク質発現系で発現可能な膜タンパク質遺伝子とを内包するリポソームを形成する。リポソームの形成は、多孔質体の空隙部を覆う乾燥脂質フィルムを水和させる際の水溶液として、無細胞タンパク質発現系と無細胞タンパク質発現系で発現可能な膜タンパク質遺伝子とを含む水溶液を使用する以外は、実施の形態１のリポソームの製造方法と同様にして行うことができる。 First, a liposome encapsulating a cell-free protein expression system and a membrane protein gene that can be expressed in the cell-free protein expression system is formed. For the formation of liposomes, an aqueous solution containing a cell-free protein expression system and a membrane protein gene that can be expressed in the cell-free protein expression system is used as an aqueous solution for hydrating the dry lipid film covering the voids of the porous body. Except for this, it can be carried out in the same manner as in the liposome production method of the first embodiment.
ついで、リポソーム内において、無細胞タンパク質発現系で膜タンパク質を発現させる。膜タンパク質の発現は、多孔質体内で行ってもよいし、リポソームを多孔質体から回収した後に行ってもよいが、好ましくは多孔質体内で膜タンパク質を発現させた後、多孔質体からリポソームを回収することが好ましい。リポソームの回収は、実施の形態１と同様にして行うことができる。 Subsequently, a membrane protein is expressed in a liposome in a cell-free protein expression system. The expression of the membrane protein may be performed in the porous body or may be performed after the liposome is recovered from the porous body, but preferably after the membrane protein is expressed in the porous body, the liposome is transformed from the porous body. Is preferably recovered. The liposome can be collected in the same manner as in the first embodiment.
リポソームで発現した膜タンパク質は、リポソームから回収してもよいし、そのままの状態でアレイ等に用いてもよい。 The membrane protein expressed in the liposome may be recovered from the liposome, or may be used in an array or the like as it is.
リポソームからの膜タンパク質の回収は、公知の方法により行うことができる。例えば、リポソームと無細胞タンパク質発現系とを分離した後、リポソームを溶解すること等により行うことができる。分離は、例えば、遠心分離、ゲルろ過、ショ糖密度勾配遠心法等により行うことができる。また、リポソームの溶解は、例えば、界面活性剤等により行うことができる。 The membrane protein can be collected from the liposome by a known method. For example, after separating the liposome and the cell-free protein expression system, the liposome can be dissolved. Separation can be performed, for example, by centrifugation, gel filtration, sucrose density gradient centrifugation, or the like. Moreover, the liposome can be dissolved, for example, with a surfactant or the like.
本実施の形態２の方法によれば、リポソームに目的の膜タンパク質のみを発現させることができるため、機能が知られていない膜タンパク質の機能解析等のために有用である。 According to the method of Embodiment 2, since only the target membrane protein can be expressed in the liposome, it is useful for functional analysis of a membrane protein whose function is unknown.
また、本実施の形態２の方法によれば、好ましくは、膜脂質に膜タンパク質が存在するリポソームを製造することができうる。このため、本実施の形態２の方法を用いて異なる膜タンパク質を発現させたリポソームを複数種類製造し、そのリポソームを基板等に配置することによって膜タンパク質アレイを製造することができる。 In addition, according to the method of Embodiment 2, it is possible to produce a liposome preferably having a membrane protein in the membrane lipid. For this reason, a membrane protein array can be produced by producing a plurality of types of liposomes expressing different membrane proteins using the method of Embodiment 2 and placing the liposomes on a substrate or the like.
以下に、実施例及び比較例を用いて本発明をさらに説明する。但し、本発明は以下の実施例に限定して解釈されない。 Hereinafter, the present invention will be further described using examples and comparative examples. However, the present invention is not construed as being limited to the following examples.
（実施例１）
〔リポソームの調製〕
ＰＤＭＳにサイズ分布の小さいＫＣｌ顆粒を埋め込み硬化させた後、純水中で超音波洗浄を繰り返し行い、多孔質体を示すマイクロスポンジ（孔径：５０〜２００μｍ、含水率：６７〜７６％）（以下、「ＧＶＲ」ともいう）を作製した。
Example 1
(Preparation of liposome)
After embedding and curing KCl granules having a small size distribution in PDMS, ultrasonic cleaning is repeatedly performed in pure water, and a micro sponge showing a porous body (pore diameter: 50 to 200 μm, moisture content: 67 to 76%) (below) , Also referred to as “GVR”).
得られたＧＶＲをマイクロチューブに入れ、真空乾燥させた。この状態で、ジオレオイルフォスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）の有機溶媒（ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ＝１／５０）溶液を添加し、真空乾燥により溶媒を蒸発させた。これにより、ＧＶＲ内の孔を含むスポンジ表面を乾燥脂質フィルムでコートした。ついで、減圧下のマイクロチューブ内にＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ＝７．０）を添加することによって該溶液をＧＶＲ内部に導入した。これにより、ＧＶＲをコートする脂質フィルムが水和されることによってリポソームが形成される。そして、遠心分離を行うことにより形成されたリポソームを回収した。 The obtained GVR was put into a microtube and vacuum-dried. In this state, a solution of dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) in an organic solvent (CHCl 3 / MeOH = 1/50) was added, and the solvent was evaporated by vacuum drying. Thereby, the sponge surface including the pores in the GVR was coated with the dry lipid film. The solution was then introduced into the GVR by adding HEPES buffer (10 mM, pH = 7.0) into the microtube under reduced pressure. Thereby, the lipid film which coats GVR is hydrated to form liposomes. And the liposome formed by centrifuging was collect | recovered.
実施例１の方法で得られたリポソームの孔径は１０〜３０μｍであり、得られたリポソームの孔径とＧＶＲの孔径との間に相関関係が見られた。 The pore size of the liposome obtained by the method of Example 1 was 10 to 30 μm, and a correlation was observed between the pore size of the obtained liposome and the pore size of GVR.
（実施例２）
〔ＧＦＰを発現するリポソームの調製〕
実施例１と同様の方法で、乾燥脂質フィルムでコートされたＧＶＲを調製した。ついで、ＧＦＰをコードしたプラスミドを添加した無細胞タンパク質発現系溶液を添加し、３７℃で２時間静置した。これにより、ＧＶＲの内部にリポソームを形成させた。
(Example 2)
[Preparation of liposomes expressing GFP]
A GVR coated with a dry lipid film was prepared in the same manner as in Example 1. Subsequently, a cell-free protein expression system solution to which a plasmid encoding GFP was added was allowed to stand at 37 ° C. for 2 hours. As a result, liposomes were formed inside the GVR.
（比較例１）
比較例１として、薄膜Voltex法によりリポソームを調製した。すなわち、ジオレオイルフォスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）の有機溶媒（ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ＝１／５０）溶液をマイクロチューブに入れ、真空乾燥により溶媒を蒸発させた。ついで、ＧＦＰをコードしたプラスミドを添加した無細胞タンパク質発現系溶液を添加し、Vortexミキサーを用いて撹拌することによってリポソームを得た。
(Comparative Example 1)
As Comparative Example 1, liposomes were prepared by the thin film Voltex method. That is, an organic solvent (CHCl 3 / MeOH = 1/50) solution of dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) was put in a microtube, and the solvent was evaporated by vacuum drying. Subsequently, a cell-free protein expression system solution to which a plasmid encoding GFP was added, and the mixture was stirred using a Vortex mixer to obtain liposomes.
実施例２により得られたリポソームについてレーザー共焦点顕微鏡による顕微鏡観察を行った。その顕微鏡写真の一例を図２に示す。図２は、ＧＶＲ内に形成されたリポソームにおいて発現したＧＦＰの顕微鏡写真の一例である。図２に示すように、形成されたすべてのリポソームにおいてＧＦＰの蛍光が確認された。 The liposome obtained in Example 2 was observed with a laser confocal microscope. An example of the micrograph is shown in FIG. FIG. 2 is an example of a photomicrograph of GFP expressed in liposomes formed in GVR. As shown in FIG. 2, GFP fluorescence was confirmed in all formed liposomes.
また、実施例２及び比較例１により得られたリポソームそれぞれについてレーザー共焦点顕微鏡による顕微鏡観察を行い、ＧＦＰ発現を行うリポソームの数を定量したところ、乾燥脂質フィルムでコートされたＧＶＲを用いた実施例２の方法によれば、比較例１の方法と比べて、約７倍の封入効率でリポソームを調製することができた。つまり、本発明の方法は、Ｖｏｌｔｅｘ法と比較して効率よくリポソームを合成できることが確認できた。 In addition, each of the liposomes obtained in Example 2 and Comparative Example 1 was observed with a laser confocal microscope, and the number of liposomes that expressed GFP was quantified. As a result, GVR coated with a dry lipid film was used. According to the method of Example 2, liposomes could be prepared with an encapsulation efficiency about 7 times that of the method of Comparative Example 1. That is, it was confirmed that the method of the present invention can synthesize liposomes more efficiently than the Voltex method.
（実施例３）
〔リポソームにおける膜タンパク質の発現〕
膜タンパク質Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３（Ｃｘ４３）をコードしたプラスミドをウサギ網状赤血球の抽出系である無細胞タンパク質合成溶液（商品名：ＴｎＴ（登録商標） ｑｕｉｃｋ、ＰＲＯＭＥＧＡ製）と混合した。それを、実施例１と同様の方法で調製した乾燥脂質フィルムでコートされたＧＶＲ（孔径：５００μｍ）を含む容器に添加し、３７℃で５時間反応させた後、４℃で保存した。
Example 3
[Membrane protein expression in liposomes]
A plasmid encoding the membrane protein Connexin 43 (Cx43) was mixed with a cell-free protein synthesis solution (trade name: TnT (registered trademark) quick, manufactured by PROMEGA) which is an extraction system for rabbit reticulocytes. It was added to a container containing GVR (pore size: 500 μm) coated with a dry lipid film prepared in the same manner as in Example 1, reacted at 37 ° C. for 5 hours, and stored at 4 ° C.
得られたサンプル５０μＬにＳＤＳ−ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ ＤＴＴを含む）２００μＬを添加し、室温混合した後，直ちに４℃で保存した。Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＳＤＳ−ｂｕｆｆｅｒでＰＡＧＥ（１２．５％ ＰＡＧＥＬ、４０ｍＡ定電流、１時間）を行った後、ウエスタンブロッティングを行い、ＳＮＡＰ ｉ．ｄ．（登録商標）（商品名、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）で下記の条件で抗体反応を行った。ついで、ＥＣＬ ｐｌｕｓ（商品名、ＧＥヘルスケア製）で５分間発色した後、ＬＡＳ ４０００（商品名、富士フイルム社製）で化学発光を検出した。その結果を図３に示す。
（抗体反応条件）
ブロッキング：０．２５％Ｓｋｉｍｍｉｌｋ
１次抗体：Ａｎｔｉ−Ｃｘ４３ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）、１／１００（ｖ／ｖ）、１０分
２次抗体：Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ Ｇｏｒｔ、ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＢＤ）、１／１００（ｖ／ｖ）、１０分
なお、洗浄用を含むバッファは全てＴＢＳ−Ｔ（Ｂｉｏｒａｄ社製，０．２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いた。
To 50 μL of the obtained sample, 200 μL of SDS-buffer (containing 100 mM DTT) was added, mixed at room temperature, and immediately stored at 4 ° C. After performing PAGE (12.5% PAGEL, 40 mA constant current, 1 hour) with Tris-Glycine-SDS-buffer, Western blotting was performed, and SNAP i. d. (Registered trademark) (trade name, manufactured by Millipore), antibody reaction was performed under the following conditions. Then, after coloring for 5 minutes with ECL plus (trade name, manufactured by GE Healthcare), chemiluminescence was detected with LAS 4000 (trade name, manufactured by FUJIFILM Corporation). The result is shown in FIG.
(Antibody reaction conditions)
Blocking: 0.25% Skimilk
Primary antibody: Anti-Cx43 mouse IgG (SantaCruz), 1/100 (v / v), 10 minutes Secondary antibody: Anti-mouse IgG Gort, HRP conjugate (BD), 1/100 (v / v), 10 Note that TBS-T (manufactured by Biorad, 0.2% (v / v) Tween-20) was used as the buffer for washing.
（比較例２）
比較例２として、薄膜静置水和法を用いてリポソームの形成を行った。すなわち、乾燥脂質フィルムでコートされたＧＶＲ（孔径：５００μｍ）に替えて、ＤＯＰＣの有機溶媒をマイクロチューブに入れて真空乾燥により溶媒を蒸発させたものを使用した以外は、実施例３と同様にして行った。その結果を図３に示す。
(Comparative Example 2)
As Comparative Example 2, liposomes were formed using a thin film stationary hydration method. That is, in the same manner as in Example 3 except that instead of GVR coated with a dry lipid film (pore size: 500 μm), an organic solvent of DOPC was put into a microtube and the solvent was evaporated by vacuum drying. I went. The result is shown in FIG.
図３は、実施例３及び比較例２における膜タンパク質（Ｃｘ４３）の発現のＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇの結果の一例を示す写真である。図３において左側のバンドが実施例３の結果、右側が比較例２の結果をそれぞれ示す。図３に示すように、乾燥脂質フィルムでコートされたＧＶＲを用いた実施例３での膜タンパク質（Ｃｘ４３）の発現量は、薄膜静置水和法を用いた比較例２の発現量の１．３〜１．５倍であった。したがって、本発明の方法は、膜タンパク質の発現を行う上で、効率のよいリポソーム合成系であることが確認できた。 FIG. 3 is a photograph showing an example of Western blotting results of expression of membrane protein (Cx43) in Example 3 and Comparative Example 2. In FIG. 3, the left band shows the result of Example 3, and the right side shows the result of Comparative Example 2. As shown in FIG. 3, the expression level of the membrane protein (Cx43) in Example 3 using GVR coated with a dry lipid film is 1 of the expression level of Comparative Example 2 using the thin film static hydration method. .3 to 1.5 times. Therefore, it was confirmed that the method of the present invention is an efficient liposome synthesis system in expressing membrane proteins.
（実施例４）
〔リポソームのサイズ分布の確認〕
多孔質体を示すマイクロスポンジの作製においてＰＤＭＳ １ｇに下記表１に示すＮａＣｌ顆粒又はＫＣｌ顆粒を埋め込み硬化させたこと、リポソーム形成においてＨＥＰＥＳ緩衝液に替えて水溶性蛍光色素Ｃａｌｃｅｉｎ（０．２ｍＭ）を含むＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ＝７．０）を使用した以外は、実施例１と同様にしてリポソームを調製した。得られたＧＶＲの孔径及びリポソームサイズの平均値を下記表１に示す。なお、リポソームサイズ分布の測定は、調製後のリポソーム溶液に、Ｃｏ（ＩＩ）Ｃｌ2 ５０ｍＭの水溶液を添加して外部のＣａｌｃｅｉｎの蛍光を消光した後、蛍光顕微鏡により観察して行った。また、ＧＶＲの孔径は、断面に対してＣｒ蒸着を行った後、走査型電子顕微鏡（商品名：ＪＣＭ−５０００、ＪＥＯＬ製、１０ｋＶ）観察により測定した。
Example 4
[Confirmation of liposome size distribution]
In preparation of a microsponge showing a porous body, NaCl granules or KCl granules shown in Table 1 below were embedded and cured in 1 g of PDMS, and a water-soluble fluorescent dye Calcein (0.2 mM) was used instead of the HEPES buffer in liposome formation. Liposomes were prepared in the same manner as in Example 1 except that the HEPES buffer solution (10 mM, pH = 7.0) was used. The average values of the pore size and liposome size of the obtained GVR are shown in Table 1 below. The liposome size distribution was measured by adding a 50 mM aqueous solution of Co (II) Cl 2 to the prepared liposome solution to quench the fluorescence of external calcein and then observing it with a fluorescence microscope. The pore diameter of GVR was measured by observation with a scanning electron microscope (trade name: JCM-5000, manufactured by JEOL, 10 kV) after Cr was deposited on the cross section.
（比較例３）
比較例３として、公知の薄膜静置水和法を用いてリポソームを形成した。その結果を下記表１に示す。
(Comparative Example 3)
As Comparative Example 3, liposomes were formed using a known thin film stationary hydration method. The results are shown in Table 1 below.
上記表１に示すように、乾燥脂質フィルムでコートされたＧＶＲを用いた実施例４−１〜４−３の方法により得られたリポソームは偏差幅が平均値よりも小さいことから、本発明の方法によって正規分布近似が可能であることが確認できた。また、上記表１に示すように、本発明の方法によれば、ＧＶＲの孔径を調節することによって、所望のサイズのリポソームを形成できることが確認できた。 As shown in Table 1 above, the liposomes obtained by the methods of Examples 4-1 to 4-3 using GVR coated with a dry lipid film have a deviation width smaller than the average value. It was confirmed that the normal distribution approximation was possible by the method. Moreover, as shown in Table 1 above, according to the method of the present invention, it was confirmed that liposomes having a desired size can be formed by adjusting the pore size of GVR.
（実施例５）
〔リポソーム融合試験〕
まず、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄ（登録商標） ＤＨＰＥ（商品名、Ｂｉｏｔｉｕｍ製）を内部に導入したＤＯＰＣリポソームと、ＮＢＤ−ＰＥ（商品名、Ｂｉｏｔｉｕｍ製）を内部に導入したＤＯＰＣリポソームとそれぞれ０．１ｍｏｌ％含むＤＯＰＣリポソーム溶液を準備した。なお、リポソーム形成のための水和には純水を使用した。実施例１と同様の方法でＧＶＲを調製し、得られたＧＶＲを真空乾燥した。ついで、上記ＤＯＰＣリポソーム溶液を添加し、真空乾燥を行った。そして、ＨＥＰＥＳ溶液（１０ｍＭ、ｐＨ＝７．０）を添加して再水和することによりＧＶＲ内でリポソームを融合させた。
(Example 5)
[Liposome fusion test]
First, 0.1 mol% each of DOPC liposome into which Texas-Red (registered trademark) DHPE (trade name, manufactured by Biotium) was introduced and DOPC liposome into which NBD-PE (trade name, manufactured by Biotium) was introduced. A DOPC liposome solution was prepared. Pure water was used for hydration for liposome formation. GVR was prepared in the same manner as in Example 1, and the obtained GVR was vacuum dried. Next, the DOPC liposome solution was added and vacuum-dried. Then, a liposome was fused in the GVR by adding a HEPES solution (10 mM, pH = 7.0) and rehydrating.
リポソーム融合効率を蛍光分光光度計及び共焦点顕微鏡による観察から求めた。その結果図４に示す。図４は、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄ（登録商標）及びＮＢＤの相対蛍光強度を示すグラフであって、縦軸がＴｅｘａｓ−Ｒｅｄ（登録商標）、横軸がＮＢＤを示す。左側のグラフはＧＶＲ内のリポソーム、右側のグラフはＧＶＲ外のリポソームの結果を示す。図４に示すように、ＧＶＲ内（左側のグラフ）では２種の蛍光分子の位置の相関がＧＶＲ外のリポソーム（右側のグラフ）と比べてより強いことから、真空乾燥・再水和等を行うことにより、ＧＶＲ内においてリポソームを融合し、融合リポソームを形成できることが確認できた。 Liposome fusion efficiency was determined from observation with a fluorescence spectrophotometer and a confocal microscope. The result is shown in FIG. FIG. 4 is a graph showing the relative fluorescence intensity of Texas-Red (registered trademark) and NBD, in which the vertical axis represents Texas-Red (registered trademark) and the horizontal axis represents NBD. The graph on the left shows the results for liposomes in the GVR, and the graph on the right shows the results for liposomes outside the GVR. As shown in FIG. 4, since the correlation between the positions of the two fluorescent molecules is stronger in the GVR (left graph) than in the liposome outside the GVR (right graph), vacuum drying, rehydration, etc. As a result, it was confirmed that the liposome was fused in the GVR to form a fused liposome.
本発明は、リポソームを用いた生体分子機能解析モデルや、薬物輸送担体、遺伝子導入担体等といった様々な分野に有用である。 The present invention is useful in various fields such as biomolecular function analysis models using liposomes, drug transport carriers, gene transfer carriers, and the like.
Claims (8)
疎水性高分子の多孔質体の内部の孔に形成した乾燥脂質フィルムからリポソームを形成することを含む、リポソームの製造方法。 A method for producing a liposome, comprising:
The manufacturing method of a liposome including forming a liposome from the dry lipid film formed in the pore inside the porous body of hydrophobic polymer.
疎水性高分子の多孔質体の内部の孔に形成した乾燥脂質フィルムに、無細胞タンパク質発現系と膜タンパク質遺伝子とを含む水溶液を接触させることによりリポソームを形成すること、及び
前記リポソーム内において前記無細胞タンパク質発現系で前記膜タンパク質を発現させることを含む、膜タンパク質を含むリポソームの製造方法。 A method for producing liposomes containing membrane proteins,
Forming a liposome by bringing an aqueous solution containing a cell-free protein expression system and a membrane protein gene into contact with a dry lipid film formed in pores inside the porous body of the hydrophobic polymer; A method for producing a liposome containing a membrane protein, comprising expressing the membrane protein in a cell-free protein expression system.
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