JP5651856B2 - 人工皮膚の製造方法 - Google Patents
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Description
1.基本構造がデザインしやすく変更も容易である、
2.生体内での分解を制御できる、
3.細胞毒性がない、
4.細胞と物質の関係を特異的に促進または阻害する特性がある、
5.免疫反応や炎症反応をほとんど惹起しない、
6.安価で簡単に大量生産できる、
7.生理的な親和性がある、
というような点が挙げられる(非特許文献4)。
使いやすい機能を取り入れることのできる合成材料への素材の転換が必要である。
(A)真皮線維芽細胞と、繊維構造を有するペプチドハイドロゲルに混合したものを固化することにより真皮層を形成する工程と、
(B)上記工程(A)で得られた真皮層の上に表皮角化細胞を播種し培養することにより表皮層を形成する工程を含む、方法。
真皮線維芽細胞と、繊維構造を有するペプチドハイドロゲルに混合したものを固化することにより真皮層を形成する工程を含む、方法。
本発明で用いるペプチドハイドロゲルは、pHの変化によりペプチドが自己重合してβシート構造をとるナノメーター単位の繊維構造を持った担体を形成する。この担体は、細胞の付着を促進する高度に精製されたペプチド配列を持った基質であり、平均ポアサイズ50〜200nmの3次元線維構造を形成する。
(A)真皮線維芽細胞と、繊維構造を有するペプチドハイドロゲルとを混合したものを、固化することにより真皮層を形成する工程と、
(B)上記工程(A)で得られた真皮層の上に表皮角化細胞を播種し培養することにより表皮層を形成する工程とを含む。
1.細胞培養
新生児由来ヒト真皮線維芽細胞(Lonza Walkersville, Walkersville, MD)を用い、10% FBS (Invitrogen, Carlsbad, CA) 添加D-MEM(Lonza Walkersville, Walkersville, MD)を培養液として培養フラスコ内で継代培養して8継代したものを実験に使用した。新生児由来ヒト表皮角化細胞(Lonza Walkersville, Walkersville, MD)はKGM-2 (Lonza Walkersville, Walkersville, MD)を培養液として培養フラスコ内で継代培養して5継代したものを実験に使用した。詳しい材料、試薬、試料を表1にまとめた。
培養真皮の担体(Scaffold)として配列番号1のアミノ酸配列のペプチドを有する、1 %ペプチドハイドロゲルRADA16 (50%)水溶液(PuraMatrix(図1:登録商標) : 3D Matrix Japan, Japan)と、RADA16にラミニン中のYIGSR接着ペプチド(Y: チロシン, I: イソロイシン, G: グリシン, S: セリン, R: アルギニン)を付加した、配列番号7のアミノ酸配列のペプチドを有するペプチドハイドロゲル SDP (50%) 水溶液(PuraMatrix(図2:登録商標) : 3D Matrix Japan, Japan)を混合したものを担体に使用した。また、1 %ペプチドハイドロゲルRADA16 (50%)水溶液のみからなる担体を用いた実験も行った。
培養真皮は作成後5週間、培養皮膚は培養皮膚作成後1週間(培養真皮作成後4週間)培養を続けた。(図3)
3.組織免疫化学染色
1週間ごとに培養した標本を中性20 %ホルマリンで固定したのち脱水処理を行い低温パラフィンにて包埋した。6μm の厚みで組織標本を作製してHE染色、免疫染色を行い顕微鏡下で観察を行った。
培養真皮の1週間ごとに培養した標本の線維芽細胞数を計測した。測定にはCellTiter 96(登録商標) AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega Corp., Madison, WI) 用いた。
培養真皮の1週間ごとに培養した標本中とその培養液中のコラーゲン定量を行った。測定にはHuman type I collagen ELISA detection kit (AC Biotechnologies, Japan) を用いた。
破砕した標本にペプシン液を加え4℃にて一晩振盪したのちペプシンを中和したものを標本由来の試料とした。
実施例1と同様の方法を用いて、体重250−300gのオスHairless rat 背部より皮膚を採取して線維芽細胞と表皮角化細胞を採取して増殖させハイブリッド型人工皮膚材料を作製する。4週間後に同じ固体の背部の別な部位に長径1cmの皮膚全層切開層を作製してハイブリッド型人工皮膚材料を移植する。その後1、2、3、4週間後に移植部のバイオプシーを行い、病理組織学的に評価を行う。
1.組織標本のHE染色(図4)
RADA16のみでは荒い泡沫状の真皮層の隔壁内に線維芽細胞が存在しており、真皮上層に線維芽細胞の密度が高い部分があり(Fibroblast rich upper layer :FRUL), その上に表面の角化を伴った重層角化細胞による表皮層が存在していた。
免疫組織化学染色では、隔壁内の細胞周囲に抗ヒトI型コラーゲン抗体による陽性所見を認めヒト線維芽細胞から分泌されたI型コラーゲン存在を確認できた。特にSDPを混合したものでは、隔壁内の多数の線維芽細胞と厚いFRULに一致してRADA16のみを用いた結果よりも強い発現を認めた。(図5)
RADA16のみを用いた人工皮膚では基底膜形成の指標となる蛋白のうちファイブロネクチンとヒトIV型コラーゲンは発現を認めラミニンは陰性であった。
表皮層の角化細胞はほぼ1層で細胞Nuclear transcription factor p63で陽性を示し未分化で***能の高い基底細胞が主体であった。(図7)
3.細胞数計測
細胞数は1週目まではRADA16のみを用いた方が多い(p<0.01)が、2週目に急速にSDPを混合した方が多くなりそれ以降はSDPを混合した方が多く、2週目(p<0.05)と5週目(p<0.01)で有意差を認めた。(図8)
4.コラーゲン定量
培養真皮内コラーゲン量は培養期間中SDPを混合した方が多くすべての週で有意差を認めた。(p<0.01)。(図9)
培養液中コラーゲン濃度は4週目まではSDPを混合した方が多いが5週目でほぼ同じになり、1〜4週で有意差を認めた。(0,2週目(p<0.01)、1,3週目(p<0.05))(図10)
RADA16のみを用いた方では真皮層内にコラーゲンを保持できず培養液中に流出させているが(図11)、SDPを混合した方では真皮層内にコラーゲンを保持してさらになお培養液中にもRADA16のみを用いた方と同程度流出させており、より多くのコラーゲンを真皮内において線維芽細胞が合成していることが推察される。(図12)
Claims (4)
- 人工皮膚の製造方法であって、
(A)真皮線維芽細胞と、繊維構造を有するペプチドハイドロゲルに混合したものを固化することにより真皮層を形成する工程と、
(B)上記工程(A)で得られた真皮層の上に表皮角化細胞を播種し培養することにより表皮層を形成する工程を含み、
前記ペプチドハイドロゲルが、ペプチド1〜0.1%(w/v)と水99〜99.9%(w/v)から構成される合成マトリックスであり、
前記ペプチドハイドロゲルのペプチドが、配列番号7で表されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、方法。 - 人工真皮の製造方法であって、
真皮線維芽細胞と、繊維構造を有するペプチドハイドロゲルに混合したものを固化することにより真皮層を形成する工程を含み、
前記ペプチドハイドロゲルが、ペプチド1〜0.1%(w/v)と水99〜99.9%(w/v)から構成される合成マトリックスであり、
前記ペプチドハイドロゲルのペプチドが、配列番号7で表されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、
方法。 - 前記ペプチドハイドロゲルが、酸性であることを特徴とする請求項1または2に記載の人工皮膚または、人工真皮の製造方法。
- 前記固化が、酸性のペプチドハイドロゲルを中和させることによって生じる固化であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
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