JP5649074B2 - Method for producing liposome by two-stage emulsification using nano-sized primary emulsion - Google Patents

Method for producing liposome by two-stage emulsification using nano-sized primary emulsion Download PDF

Info

Publication number
JP5649074B2
JP5649074B2 JP2011505984A JP2011505984A JP5649074B2 JP 5649074 B2 JP5649074 B2 JP 5649074B2 JP 2011505984 A JP2011505984 A JP 2011505984A JP 2011505984 A JP2011505984 A JP 2011505984A JP 5649074 B2 JP5649074 B2 JP 5649074B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
emulsion
liposome
average particle
liposomes
emulsification
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2011505984A
Other languages
Japanese (ja)
Other versions
JPWO2010110116A1 (en
Inventor
元杭　康之
康之 元杭
武志 和田
武志 和田
武寿 磯田
武寿 磯田
創作 市川
創作 市川
黒岩　崇
崇 黒岩
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Konica Minolta Inc
University of Tsukuba NUC
Original Assignee
Konica Minolta Inc
University of Tsukuba NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Konica Minolta Inc, University of Tsukuba NUC filed Critical Konica Minolta Inc
Priority to JP2011505984A priority Critical patent/JP5649074B2/en
Publication of JPWO2010110116A1 publication Critical patent/JPWO2010110116A1/en
Application granted granted Critical
Publication of JP5649074B2 publication Critical patent/JP5649074B2/en
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/02—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by special physical form
    • A61K8/04—Dispersions; Emulsions
    • A61K8/06—Emulsions
    • A61K8/066—Multiple emulsions, e.g. water-in-oil-in-water
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
    • A23L29/10—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing emulsifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23P—SHAPING OR WORKING OF FOODSTUFFS, NOT FULLY COVERED BY A SINGLE OTHER SUBCLASS
    • A23P10/00—Shaping or working of foodstuffs characterised by the products
    • A23P10/30—Encapsulation of particles, e.g. foodstuff additives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/02—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by special physical form
    • A61K8/14—Liposomes; Vesicles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/31—Hydrocarbons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1277—Processes for preparing; Proliposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/40—Chemical, physico-chemical or functional or structural properties of particular ingredients
    • A61K2800/41—Particular ingredients further characterized by their size
    • A61K2800/412—Microsized, i.e. having sizes between 0.1 and 100 microns
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/40—Chemical, physico-chemical or functional or structural properties of particular ingredients
    • A61K2800/41—Particular ingredients further characterized by their size
    • A61K2800/413—Nanosized, i.e. having sizes below 100 nm

Description

本発明は、医薬品、化粧品、食品などの分野で用いられるリポソームの製造方法に関する。   The present invention relates to a method for producing liposomes used in the fields of pharmaceuticals, cosmetics, foods and the like.

リポソームは、単層または複数層の脂質二重膜からなる閉鎖小胞体であり、内水相および脂質二重膜内部にそれぞれ水溶性および疎水性の薬剤類を保持させることができ、またリポソームの脂質二重膜は生体膜と類似しているため生体内での安全性が高いことなどから、たとえばＤＤＳ（ドラック・デリバリー・システム）用の医薬品など、各種の用途が注目され研究開発が進められている。   Liposomes are closed endoplasmic reticulum consisting of monolayer or multi-layer lipid bilayer membranes, which can hold water-soluble and hydrophobic drugs inside the inner aqueous phase and lipid bilayer membrane, respectively. Since lipid bilayer membranes are similar to biological membranes and are highly safe in vivo, various applications such as pharmaceuticals for DDS (Drug Delivery System) have been attracting attention and research and development have been promoted. ing.

これまでにリポソームの製造方法は数多く提案されてきたが、医薬品として承認されうるリポソームを製造できる、コスト的・工業的に優れた汎用的な技術は少ない。水溶性薬剤はリポソームの内水相に含ませることができるが、一般的には良いとされている方法でも内包率（リポソーム懸濁液に含まれる薬剤類の総質量、換言すれば製造原料として用いた薬剤類の総質量に対する、リポソームに内包された薬物類の質量の割合）は２０％程度であり、これよりも内包率の高い製造方法は再現性が悪く、工業的に適さない（たとえば逆相蒸発法）。このため、水溶性薬剤（たとえば核酸医薬やタンパク質）を効率的に内包させることができ、しかもナノサイズ（好ましくは静脈注射に適する２００ｎｍ以下）の平均粒径を有するリポソームを製造できる方法が望まれている。   Many methods for producing liposomes have been proposed so far, but there are few general-purpose techniques excellent in cost and industry that can produce liposomes that can be approved as pharmaceuticals. A water-soluble drug can be included in the inner aqueous phase of the liposome, but the inclusion rate (the total mass of drugs contained in the liposome suspension, in other words, as a production raw material, is generally accepted) The ratio of the mass of the drug encapsulated in the liposome to the total mass of the drugs used is about 20%, and a production method with a higher encapsulation rate is less reproducible and not industrially suitable (for example, Reverse phase evaporation method). Therefore, a method that can efficiently encapsulate water-soluble drugs (for example, nucleic acid drugs and proteins) and can produce liposomes having an average particle size of nano-size (preferably 200 nm or less suitable for intravenous injection) is desired. ing.

なお、日本国内では「ビジュダイン（VISUDYNE）」（登録商標）、「アムビゾーム（AmBisome）」（登録商標）および「ドキシル（DOXIL）」（登録商標）の３種類のリポソーム製剤が市販されている。しかしながら、ビジュダインおよびアムビゾームは、リポソームに内包させやすい疎水性の薬剤を内包するものである。また、ドキシルは、リポソーム形成後に外水相に薬剤を添加し、内外濃度差を利用して薬剤をリポソームに内包するリモートローディング法と呼ばれる方法により、８０％以上の高い内包率を達成しているが、この方法は、初期は水溶性であるが内水相内で塩を形成することができ、かつリポソームの脂質膜を通過することのできる特殊な低分子水溶性薬剤でなければ用いることはできない。   In Japan, three types of liposome preparations “VISUDYNE” (registered trademark), “AmBisome” (registered trademark), and “DOXIL” (registered trademark) are commercially available. However, bijudyne and ambisome encapsulate hydrophobic drugs that are easily encapsulated in liposomes. In addition, Doxil achieves a high encapsulation rate of 80% or more by a method called a remote loading method in which a drug is added to the external aqueous phase after liposome formation and the drug is encapsulated in the liposome using a difference in internal and external concentrations. However, this method can be used only when it is a special low molecular weight water-soluble drug that is initially water-soluble but can form a salt in the inner aqueous phase and can pass through the lipid membrane of the liposome. Can not.

リポソームの粒径を小さくするための工程として、比較的サイズの大きなリポソームを調製した後にエクストルーダで粒径を小さくするサイジングが従来から行われているが、この工程により粒径をナノサイズにすることはできるものの、リポソームに内包される薬剤の量は大幅に減少してしまう。   As a process for reducing the particle size of liposomes, sizing to reduce the particle size with an extruder after preparing a relatively large liposome has been conventionally performed. However, the amount of drug encapsulated in the liposome is greatly reduced.

非特許文献１では、２段階で乳化したＷ／Ｏ／Ｗエマルションを液中乾燥により油相を除去し、リポソームを形成するマイクロカプセル化法が提案されている。この方法は他の方法と比較して効率的に薬剤類を内包できるが、得られるリポソームのサイズは大きく、また水溶性の高い（logPの低い）薬剤類の内包率はあまり向上しない。   Non-Patent Document 1 proposes a microencapsulation method in which an oil phase is removed from a W / O / W emulsion emulsified in two stages by drying in liquid to form liposomes. Although this method can encapsulate drugs more efficiently than other methods, the size of the obtained liposome is large, and the encapsulation rate of drugs with high water solubility (low log P) is not improved so much.

特許文献１には、２段階の乳化工程を含むリポソーム製剤の製造方法において、リポソームの脂質成分として炭素数がより大きな脂質を用いることにより、薬剤類の内包率を向上させることができることが記載されている。しかしながら、この方法により得られるリポソームはほとんどが多胞リポソーム（多数の非同心の水性小室を内包するもの）で、かつ平均粒径もマイクロメートルサイズであり、この方法により均一なナノサイズの単層のリポソームを得ることは困難である。   Patent Document 1 describes that, in a method for producing a liposome preparation including a two-stage emulsification process, the inclusion rate of drugs can be improved by using a lipid having a larger carbon number as the lipid component of the liposome. ing. However, most of the liposomes obtained by this method are multivesicular liposomes (containing many non-concentric aqueous chambers) and have an average particle size of micrometer size. It is difficult to obtain liposomes.

また、本出願人の一部は先に、高い内包率と粒子径の制御を同時に達成することを目的として、マイクロチャネル乳化法を用いたベシクル（リポソーム）の製造方法を提案している（特願２００８−１３５００９号）。この方法によれば、内包率をたとえば７６％程度にまで向上させることができることが実施例に示されているが、得られるベシクルの平均粒径は約１μｍであり、平均粒径を静脈注射用製剤として要求される約２００ｎｍとしつつ上記と同程度の内包率を達成することは実現されていなかった。   In addition, some of the present applicants have previously proposed a method for producing vesicles (liposomes) using a microchannel emulsification method for the purpose of simultaneously achieving a high encapsulation rate and control of the particle diameter (specially) Application No. 2008-135209). According to this method, it is shown in the Examples that the encapsulation rate can be improved to, for example, about 76%, but the average particle size of the obtained vesicle is about 1 μm, and the average particle size is for intravenous injection. It has not been realized to achieve the same encapsulation rate as described above while setting the thickness to about 200 nm required as a preparation.

特表２００１−５０５５４９号公報JP-T-2001-505549

J Dispersion Sci Technol,9(1),1-15(1988)J Dispersion Sci Technol, 9 (1), 1-15 (1988)

本発明は、ナノサイズの粒径を有するリポソームが効率的に得られ、また薬剤類（特に水溶性のもの）の内包率を従来よりも高めることができる、単胞リポソームの製造方法を提供することを課題とする。   The present invention provides a method for producing single-cell liposomes, in which liposomes having a nano-sized particle size can be efficiently obtained, and the encapsulation rate of drugs (particularly water-soluble) can be increased as compared with the conventional ones. This is the issue.

本発明者は、平均粒子径９００ｎｍ以下、特に平均粒子径２００ｎｍ以下かつＣＶ値４０％以下のＷ１／Ｏエマルションを用いて二次乳化を行うことにより上記の課題を解決しうることを見出し、本発明を完成させるに至った。同量のリポソーム膜の原料（混合脂質成分）を用いてミクロンサイズのリポソームとナノサイズのリポソームを製造した場合、通常であればリポソーム内部の体積の総和が大きくなるミクロンサイズの方が内包率が高く、ナノサイズにするとかえって内包率が低下してしまうと予想されるところ、実際には意外にも、上記のような方法によりナノサイズのリポソームとした方が内包率が高くなり、課題とされていたナノサイズかつ高内包率を同時に達成することができる。   The present inventor has found that the above problem can be solved by performing secondary emulsification using a W1 / O emulsion having an average particle diameter of 900 nm or less, particularly an average particle diameter of 200 nm or less and a CV value of 40% or less. The invention has been completed. When micron-sized liposomes and nano-sized liposomes are produced using the same amount of liposome membrane raw material (mixed lipid component), the inclusion rate is usually higher for micron-sized liposomes where the total volume inside the liposome is larger. Although it is expected that the inclusion rate will decrease when it is high and nano-sized, in reality, the inclusion rate becomes higher when nano-sized liposomes are produced by the method described above, which is a problem. The nano-size and high inclusion rate that have been achieved can be achieved at the same time.

すなわち、本発明の単胞リポソームの製造方法は、平均粒子径２０ｎｍ以上９００ｎｍ以下のＷ１／Ｏエマルションを用いて、二次乳化を行い、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを形成させ、その後液中乾燥により単胞リポソームを形成させることを特徴とする。ただし、上記Ｗ／Ｏエマルションを調製する一次乳化工程は、さらにリポソームに内包させる物質を添加した上で行ってもよい。   That is, the method for producing single cell liposomes of the present invention uses a W1 / O emulsion having an average particle diameter of 20 nm or more and 900 nm or less to perform secondary emulsification to form a W1 / O / W2 emulsion, followed by drying in liquid. It is characterized by forming single cell liposomes. However, the primary emulsification step for preparing the W / O emulsion may be performed after further adding a substance to be encapsulated in the liposome.

前記Ｗ１／Ｏエマルションは、好ましくは平均粒径２０ｎｍ以上４００ｎｍ以下であり、より好ましくは平均粒子径２０ｎｍ以上２００ｎｍ以下かつＣＶ値４０％以下である。前記二次乳化の方法としてマイクロチャネル乳化法を用いることが好ましい。前記Ｗ１／Ｏエマルションの油相の主成分はヘキサンであることが好ましい。前記リポソームに内包させる物質として医療用の薬剤類を用い、かつ得られるリポソームの平均粒径を２０ｎｍ以上３００ｎｍ以下とすることが好ましい。   The W1 / O emulsion preferably has an average particle size of 20 nm to 400 nm, more preferably an average particle size of 20 nm to 200 nm and a CV value of 40% or less. As the secondary emulsification method, a microchannel emulsification method is preferably used. The main component of the oil phase of the W1 / O emulsion is preferably hexane. It is preferable to use medical drugs as the substance to be encapsulated in the liposome, and the average particle size of the obtained liposome is 20 nm to 300 nm.

なお、本発明におけるリポソームまたはＷ／Ｏエマルションの「平均粒径」は体積平均粒子径を指す。また、「ＣＶ値」（変動係数）は、リポソームの粒径またはＷ／Ｏエマルションの数平均（上記平均粒径）および標準偏差を用いた次式により求められる値である；
ＣＶ値（％）＝（標準偏差／平均粒径）×１００The “average particle size” of the liposome or W / O emulsion in the present invention refers to the volume average particle size. Further, the “CV value” (coefficient of variation) is a value determined by the following formula using the particle size of the liposome or the number average (the above average particle size) and standard deviation of the W / O emulsion;
CV value (%) = (standard deviation / average particle size) × 100

本発明の製造方法によれば、医薬品用としても好適なナノサイズの平均粒径有する単胞リポソームを効率的に製造できるようになる。また、一次乳化工程をさらにリポソームに内包させる物質（特に水溶性の薬剤類）を添加した上で行った場合には、リポソームに上記のような性状を賦与しつつ従来よりも高い内包率（たとえば８０％以上）を達成することができる。このような本発明のリポソームの製造方法を利用することにより、各種の用途に好適なリポソームの生産性を著しく改善することができる。   According to the production method of the present invention, it becomes possible to efficiently produce single-vesicle liposomes having an average particle size of nano size suitable also for pharmaceutical use. Further, when the primary emulsification step is further performed after adding a substance (especially water-soluble drug) that encapsulates the liposome, the encapsulation rate (for example, higher than the conventional one) is imparted to the liposome while imparting the above properties. 80% or more) can be achieved. By using such a method for producing liposomes of the present invention, the productivity of liposomes suitable for various applications can be remarkably improved.

本発明の製造方法の一態様におけるリポソーム形成のイメージ図。たとえば、リン脂質１、薬剤（カルセイン色素）２、有機溶媒（ヘキサン）３および内水相（水）４を用いた一次乳化工程（step 1）により平均粒子径２０ｎｍ以上２００ｎｍ以下かつＣＶ値４０％以下のＷ／Ｏエマルション（ａ）を調製した場合、外水相としてカゼイン水溶液５を用いた二次乳化工程（step 2）により、平均粒子径が２０００ｎｍ以下のＷ／Ｏ／Ｗエマルション（ｂ）が得られ、液中乾燥（溶媒除去）工程（step 3）を経て、平均粒子径２０ｎｍ以上２００ｎｍ以下の単胞のリポソーム（ｃ）が形成される。このような製造方法では、Ｗ／Ｏ／Ｗ由来の平均粒子径が２０μｍ以下の多胞リポソーム（ｄ）や平均粒子径が２μｍ以下程度のミクロンサイズのリポソーム（ｅ）のような好ましくないリポソームの形成を抑制することができる。The image figure of liposome formation in the one aspect | mode of the manufacturing method of this invention. For example, an average particle size of 20 nm to 200 nm and a CV value of 40% by a primary emulsification step (step 1) using phospholipid 1, drug (calcein dye) 2, organic solvent (hexane) 3 and inner aqueous phase (water) 4 When the following W / O emulsion (a) is prepared, the W / O / W emulsion (b) having an average particle size of 2000 nm or less by the secondary emulsification step (step 2) using the casein aqueous solution 5 as the outer aqueous phase. Through the in-liquid drying (solvent removal) step (step 3), single cell liposomes (c) having an average particle diameter of 20 nm or more and 200 nm or less are formed. In such a production method, undesirable liposomes such as multivesicular liposomes (d) derived from W / O / W having an average particle size of 20 μm or less and micron-sized liposomes (e) having an average particle size of about 2 μm or less are used. Formation can be suppressed. 実施例１で得られたリポソーム分散液の光学顕微鏡写真。ミクロンサイズの粒子（矢印）は少ない。3 is an optical micrograph of the liposome dispersion obtained in Example 1. FIG. There are few micron-sized particles (arrows). 実施例２で得られたリポソーム分散液の光学顕微鏡写真。ミクロンサイズの粒子はほとんどない。4 is an optical micrograph of the liposome dispersion obtained in Example 2. There are few micron-sized particles. 実施例３で得られたリポソーム分散液の光学顕微鏡写真。ミクロンサイズの粒子は少ない。4 is an optical micrograph of the liposome dispersion obtained in Example 3. There are few micron-sized particles. 実施例４で得られたリポソーム分散液の光学顕微鏡写真。ミクロンサイズの粒子は多い。4 is an optical micrograph of the liposome dispersion obtained in Example 4. There are many micron-sized particles. 実施例５で得られたリポソーム分散液の光学顕微鏡写真。ミクロンサイズの粒子は多い。4 is an optical micrograph of the liposome dispersion obtained in Example 5. There are many micron-sized particles.

− 製造原料 −
・混合脂質成分（Ｆ１）・（Ｆ２）
一次乳化工程で用いる混合脂質成分（Ｆ１）は主としてリポソームの脂質二重膜の内膜を構成し、場合によっては外膜の構成にも寄与する。混合脂質成分（Ｆ２）は主として外膜を構成する。混合脂質成分（Ｆ１）および（Ｆ２）は、同一の組成であっても、異なる組成であってもよい。− Production raw material −
・ Mixed lipid component (F1) ・ (F2)
The mixed lipid component (F1) used in the primary emulsification step mainly constitutes the inner membrane of the lipid bilayer of the liposome, and in some cases also contributes to the outer membrane. The mixed lipid component (F2) mainly constitutes the outer membrane. The mixed lipid components (F1) and (F2) may have the same composition or different compositions.

これらの混合脂質成分の配合組成は特に限定されるものではないが、一般的には、リン脂質（動植物由来のレシチン；ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸またはそれらの脂肪酸エステルであるグリセロリン脂質；スフィンゴリン脂質；これらの誘導体等）と、脂質膜の安定化に寄与するステロール類（コレステロール、フィトステロール、エルゴステロール、これらの誘導体等）とを中心に構成され、さらに糖脂質、グリコール、脂肪族アミン、長鎖脂肪酸（オレイン酸、ステアリン酸、パルミチン酸等）、その他各種の機能性を賦与する化合物が配合されていてもよい。特にＦ２には、ＰＥＧ化リン脂質などＤＤＳとしての機能性の付与に必要な脂質成分を含むことで、リポソーム表面に効率的な修飾が可能となる。混合脂質成分の配合比も、脂質膜の安定性やリポソームの生体内での挙動などの性状を考慮しながら、用途に応じて適切に調整すればよい。   The composition of these mixed lipid components is not particularly limited. Consists mainly of certain glycerophospholipids; sphingophospholipids; derivatives thereof, and sterols (cholesterol, phytosterols, ergosterol, derivatives thereof, etc.) that contribute to the stabilization of lipid membranes. , Aliphatic amines, long chain fatty acids (oleic acid, stearic acid, palmitic acid, etc.), and other compounds imparting various functionalities may be blended. In particular, F2 contains a lipid component necessary for imparting functionality as a DDS, such as PEGylated phospholipid, so that the liposome surface can be efficiently modified. The blending ratio of the mixed lipid component may be appropriately adjusted according to the application while taking into consideration properties such as the stability of the lipid membrane and the behavior of the liposome in vivo.

・水性溶媒（Ｗ１）・（Ｗ２）、有機溶媒（Ｏ）
水性溶媒（Ｗ１）および（Ｗ２）ならびに有機溶媒（Ｏ）は公知の一般的なものを用いることができる。一次乳化工程で用いられる水性溶媒（Ｗ１）および有機溶媒（Ｏ）は、それぞれＷ１／Ｏエマルションの水相および油相をなし、二次乳化工程で用いられる水性溶媒（Ｗ２）は、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの外水相をなす。水性溶媒としては、たとえば純水に必要に応じて水と混合する他の溶媒、浸透圧調整のための塩類・糖類、ｐＨ調整のための緩衝液などを配合したものが挙げられる。有機溶媒としては、たとえばヘキサン（ｎ−ヘキサン）やクロロホルムなど、水性溶媒と混合しない化合物からなるものが挙げられるが、ヘキサンを主成分（５０体積％以上）とする有機溶媒、より好ましくはヘキサンが６０体積％以上である有機溶媒は、得られるナノサイズのＷ１／Ｏエマルションの単分散性が良好であるため好ましい。Aqueous solvent (W1) / (W2), organic solvent (O)
As the aqueous solvents (W1) and (W2) and the organic solvent (O), known general solvents can be used. The aqueous solvent (W1) and the organic solvent (O) used in the primary emulsification step form an aqueous phase and an oil phase of the W1 / O emulsion, respectively. The aqueous solvent (W2) used in the secondary emulsification step is W1 / O. / The outer water phase of the W2 emulsion is formed. Examples of the aqueous solvent include pure water containing other solvents mixed with water as necessary, salts / sugars for adjusting osmotic pressure, buffers for adjusting pH, and the like. Examples of the organic solvent include those composed of a compound that is not mixed with an aqueous solvent such as hexane (n-hexane) or chloroform, and an organic solvent containing hexane as a main component (50% by volume or more), more preferably hexane. An organic solvent of 60% by volume or more is preferable because the resulting nano-sized W1 / O emulsion has good monodispersibility.

・内包させる物質
本発明において、リポソームに内包させる物質（薬剤類と総称する）は特に限定されるものではなく、リポソームの用途に応じて医薬品、化粧品、食品などの分野で知られている各種の物質を用いることができる。-Substances to be encapsulated In the present invention, substances to be encapsulated in liposomes (collectively referred to as drugs) are not particularly limited, and various substances known in the fields of pharmaceuticals, cosmetics, foods and the like are used depending on the use of liposomes. Substances can be used.

薬剤類のうち医療用の水溶性のものとしては、たとえば、造影剤（Ｘ線造影用の非イオン性ヨード化合物、ＭＲＩ造影用のガドリニウムとキレート化剤とからなる錯体等）、抗がん剤（アドリアマイシン、ビラルビシン、ビンクリスチン、タキソール、シスプラチン、マイトマイシン、５−フルオロウラシル、イリノテカン、エストラサイト、エピルビシン、カルボプラチン、イントロン、ジェムザール、メソトレキセート、シタラビン等）、抗菌剤、抗酸化性剤、抗炎症剤、血行促進剤、美白剤、肌荒れ防止剤、老化防止剤、発毛促進性剤、保湿剤、ホルモン剤、ビタミン類、核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡのセンス鎖もしくはアンチセンス鎖、プラスミド、ベクター、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ等）、タンパク質（酵素、抗体、ペプチド等）、ワクチン製剤（破傷風などのトキソイドを抗原とするもの；ジフテリア、日本脳炎、ポリオ、風疹、おたふくかぜ、肝炎などのウイルスを抗原とするもの；DNAまたはRNAワクチン等）などの薬理的作用を有する物質や、色素・蛍光色素、キレート化剤、安定化剤、保存剤などの製薬助剤が挙げられる。   Examples of water-soluble drugs for medical use include, for example, contrast agents (nonionic iodine compounds for X-ray contrast, complexes composed of gadolinium and chelating agents for MRI contrast), anticancer agents, and the like. (Adriamycin, viralubicin, vincristine, taxol, cisplatin, mitomycin, 5-fluorouracil, irinotecan, estrasite, epirubicin, carboplatin, intron, gemzar, methotrexate, cytarabine, etc.), antibacterial agent, antioxidant agent, anti-inflammatory agent, blood circulation promotion Agent, whitening agent, rough skin prevention agent, anti-aging agent, hair growth promoting agent, moisturizer, hormone agent, vitamins, nucleic acid (DNA or RNA sense strand or antisense strand, plasmid, vector, mRNA, siRNA, etc.) , Proteins (enzymes, antibodies, peptides, etc.), A substance having a pharmacological action, such as a cutin preparation (one having a toxoid such as tetanus as an antigen; one having a virus such as diphtheria, Japanese encephalitis, polio, rubella, mumps, hepatitis; a DNA or RNA vaccine), Pharmaceutical aids such as dyes / fluorescent dyes, chelating agents, stabilizers, preservatives and the like can be mentioned.

− リポソームの製造方法 −
本発明のリポソームの製造方法は、下記工程（１）〜（３）を有し、必要に応じてその他の工程を適宜組み合わせることができるものである。以下、図面を参照しながら各工程について説明する。− Method for producing liposome −
The manufacturing method of the liposome of this invention has the following process (1)-(3), and can combine another process suitably as needed. Hereinafter, each process will be described with reference to the drawings.

（１）一次乳化工程
一次乳化工程は、有機溶媒（Ｏ）、水性溶媒（Ｗ１）、および混合脂質成分（Ｆ１）を乳化することにより、平均粒子径２０ｎｍ以上９００ｎｍ以下のＷ１／Ｏエマルションを調製する工程である（図１参照）。平均粒子径２０ｎｍ未満のＷ１／Ｏエマルションないしリポソームを調製することは困難とされている。上記Ｗ１／Ｏエマルションは、好ましくは平均粒子径が２０ｎｍ以上４００ｎｍ以下であり、より好ましくは、平均粒子径が２０ｎｍ以上２００ｎｍ以下かつＣＶ値が４０％以下である。本発明の製造方法により得られるリポソーム分散液を光学顕微鏡で観察すると、ミクロンオーダーの粒子（ミクロンオーダーの単胞リポソームと推定される）も多胞リポソームと同時に観察されるが（サブミクロン以下にできた、目的のリポソームは光学顕微鏡ではほとんど見えない）、そのような粒子は、Ｗ１／Ｏエマルションの平均粒径を４００ｎｍ以下にすることで少なくなり（図２，４参照）、さらに平均粒径２００ｎｍ以下かつＣＶ値４０％以下とすることでほとんど観察されなくなる（図３参照）。本発明の製造方法によれば、多胞リポソームの割合（フィルターろ過等で分離した多胞リポソームに内包されている薬剤類の重量から算出）は、たとえば５％以下、好ましくは２％以下にまで抑制することも可能である。(1) Primary emulsification step The primary emulsification step prepares a W1 / O emulsion having an average particle size of 20 nm to 900 nm by emulsifying the organic solvent (O), the aqueous solvent (W1), and the mixed lipid component (F1). (See FIG. 1). It has been difficult to prepare W1 / O emulsions or liposomes having an average particle size of less than 20 nm. The W1 / O emulsion preferably has an average particle size of 20 nm or more and 400 nm or less, more preferably an average particle size of 20 nm or more and 200 nm or less and a CV value of 40% or less. When the liposome dispersion obtained by the production method of the present invention is observed with an optical microscope, micron-order particles (presumed to be micron-order single cell liposomes) are also observed at the same time as multivesicular liposomes (submicron or less). In addition, the target liposome is hardly visible with an optical microscope), and such particles are reduced by making the average particle size of the W1 / O emulsion 400 nm or less (see FIGS. 2 and 4), and the average particle size is 200 nm. If the CV value is 40% or less, it is hardly observed (see FIG. 3). According to the production method of the present invention, the ratio of multivesicular liposomes (calculated from the weight of drugs encapsulated in multivesicular liposomes separated by filter filtration or the like) is, for example, 5% or less, preferably 2% or less. It is also possible to suppress it.

Ｗ１／Ｏエマルションを調製するための方法は、上記の要件を満たすＷ１／Ｏエマルションが得られる限り特に限定されるものではなく、超音波乳化機、撹拌乳化機、膜乳化機、高圧ホモジナイザーなどの装置を用いて行うことができるが、たとえば平均粒径２０ｎｍ以上２００ｎｍ以下かつＣＶ値４０％以下のエマルションを製造するような場合には超音波処理または高圧ホモジナイザーにより乳化を行う方法が好適である。特に手段は限定されないが、平均粒径を広い範囲で制御でき、かつ得られるＷ１／Ｏエマルションが単分散であることが好ましい。平均粒径２０ｎｍ以上２００ｎｍ以下かつＣＶ値４０％以下のＷ１／Ｏエマルションを用いた場合には、特に多胞リポソームやミクロンサイズのリポソームの粒子数を大幅に減少しほとんどない状態にできる。   The method for preparing the W1 / O emulsion is not particularly limited as long as a W1 / O emulsion satisfying the above requirements is obtained, such as an ultrasonic emulsifier, a stirring emulsifier, a membrane emulsifier, and a high-pressure homogenizer. For example, when an emulsion having an average particle size of 20 nm or more and 200 nm or less and a CV value of 40% or less is produced, a method of emulsifying by ultrasonic treatment or a high-pressure homogenizer is preferable. The means is not particularly limited, but it is preferable that the average particle diameter can be controlled in a wide range and the obtained W1 / O emulsion is monodispersed. When a W1 / O emulsion having an average particle size of 20 nm or more and 200 nm or less and a CV value of 40% or less is used, the number of particles of multivesicular liposomes and micron-sized liposomes can be greatly reduced and made almost impossible.

水性溶媒（Ｗ１）のｐＨは３〜１０の範囲に選択され、ｐＨの調整には適切な緩衝液を用いればよい。たとえば、混合脂質成分にオレイン酸を用いる場合、ｐＨは６〜８．５とすることが好ましい。   The pH of the aqueous solvent (W1) is selected in the range of 3 to 10, and an appropriate buffer may be used to adjust the pH. For example, when oleic acid is used for the mixed lipid component, the pH is preferably 6 to 8.5.

一次乳化工程における、有機溶媒（Ｏ）に添加する混合脂質成分（Ｆ１）の割合、有機溶媒（Ｏ）と水性溶媒（Ｗ１）の体積比、その他の操作条件は、続く二次乳化工程の条件や最終的に調製するリポソームの態様などを考慮しながら、採用する乳化方法に応じて適宜調整することができる。通常、混合脂質成分（Ｆ１）の割合は有機溶媒（Ｏ）に対して１〜５０質量％であり、有機溶媒（Ｏ）と水性溶媒（Ｗ１）の体積比は１００：１〜１：２である。   In the primary emulsification step, the ratio of the mixed lipid component (F1) added to the organic solvent (O), the volume ratio of the organic solvent (O) and the aqueous solvent (W1), and other operating conditions are the conditions of the subsequent secondary emulsification step. In addition, it can be appropriately adjusted according to the emulsification method to be employed, taking into consideration the aspect of the liposome finally prepared. Usually, the ratio of the mixed lipid component (F1) is 1 to 50% by mass with respect to the organic solvent (O), and the volume ratio of the organic solvent (O) and the aqueous solvent (W1) is 100: 1 to 1: 2. is there.

本発明では、リポソームに内包したい水溶性薬剤類を、一次乳化工程の水性溶媒（Ｗ１）にあらかじめ溶解または懸濁させておく。これにより、二次乳化工程／溶媒除去工程を通じて、それを内包するリポソームが得られる。本発明の製造方法では、上記の方法を用いた場合であっても内包率が高く、効率的にリポソームに水溶性薬剤類を内包させることができる。なお、非水溶性薬剤類についても、一次乳化工程の時点であらかじめ油相に溶解または懸濁しておくことにより、リポソームに内包させることができる。   In the present invention, water-soluble drugs to be encapsulated in liposomes are dissolved or suspended in advance in the aqueous solvent (W1) in the primary emulsification step. Thereby, the liposome which encloses it through a secondary emulsification process / solvent removal process is obtained. In the production method of the present invention, even when the above method is used, the encapsulation rate is high, and the liposome can efficiently encapsulate water-soluble drugs. In addition, water-insoluble drugs can also be encapsulated in liposomes by dissolving or suspending them in the oil phase in advance at the time of the primary emulsification step.

（２）二次乳化工程
二次乳化工程は、上記工程（１）により得られたＷ１／Ｏエマルションを用いて、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを形成する工程である（図１参照）。(2) Secondary emulsification step The secondary emulsification step is a step of forming a W1 / O / W2 emulsion using the W1 / O emulsion obtained by the above step (1) (see FIG. 1).

この二次乳化では種々の乳化方法を用いることができるが、乳化操作時の液滴の崩壊および液滴からの内包物質の漏出を抑えるため、乳化処理に大きな機械的剪断力を必要としないマイクロチャネル乳化法を用いることが好適である。その他にも膜乳化法などを用いることができる。   In this secondary emulsification, various emulsification methods can be used, but in order to suppress the collapse of the droplets during the emulsification operation and the leakage of the encapsulated material from the droplets, the microemulsification that does not require a large mechanical shearing force in the emulsification process It is preferred to use the channel emulsification method. In addition, a membrane emulsification method or the like can be used.

マイクロチャネル乳化法では、たとえば、シリコン製マイクロチャネル基板（ａ）およびこの基板上部を覆うガラス板（ｂ）から構成される、マイクロチャネル乳化装置モジュールを使用する。上記（ａ）および（ｂ）により形成される溝型マイクロチャネルの出口側、あるいは上記（ａ）上に加工された貫通型マイクロチャネルの出口側には、外水相をなす水性溶媒（Ｗ２）を満たしておき、マイクロチャネルの入口側からＷ１／Ｏエマルションを圧入することで、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを形成できる。マイクロチャネル基板（ａ）としては、デッドエンド型、クロスフロー型、貫通孔型など、種々の形態のものを用いることができる。   In the microchannel emulsification method, for example, a microchannel emulsification device module composed of a silicon microchannel substrate (a) and a glass plate (b) covering the upper portion of the substrate is used. An aqueous solvent (W2) that forms an outer aqueous phase on the outlet side of the groove-type microchannel formed by (a) and (b) or on the outlet side of the through-type microchannel processed on (a). The W1 / O / W2 emulsion can be formed by press-fitting the W1 / O emulsion from the inlet side of the microchannel. As the microchannel substrate (a), various forms such as a dead end type, a cross flow type, and a through hole type can be used.

二次乳化工程では、水性溶媒（Ｗ２）およびＷ１／Ｏエマルション以外にさらに、混合脂質成分（Ｆ２）の一部として、またはこれに代えて、混合脂質成分（Ｆ１）からなるリポソーム脂質膜を破壊しない水溶性乳化剤を用いてもよい。界面化学の分野では多くの乳化剤が知られており、代表的には、タンパク質、多糖類および非イオン性界面活性剤などが、水溶性乳化剤として乳化・分散プロセスに用いられている。タンパク質としてはカゼインナトリウム、多糖類としてはデキストラン、非イオン性界面活性剤としてはポリアルキレングリコール誘導体が例示できる。たとえば、混合脂質成分（Ｆ１）にホスファチジルコリンを配合する場合、カゼインナトリウムのようなタンパク質乳化剤はそのような水溶性乳化剤として好ましい。   In the secondary emulsification step, in addition to the aqueous solvent (W2) and the W1 / O emulsion, the liposome lipid membrane composed of the mixed lipid component (F1) is broken as a part of the mixed lipid component (F2) or instead of this. A water-soluble emulsifier may be used. Many emulsifiers are known in the field of surface chemistry, and typically, proteins, polysaccharides, nonionic surfactants, and the like are used in the emulsification / dispersion process as water-soluble emulsifiers. Examples of the protein include sodium caseinate, examples of the polysaccharide include dextran, and examples of the nonionic surfactant include polyalkylene glycol derivatives. For example, when phosphatidylcholine is blended with the mixed lipid component (F1), a protein emulsifier such as sodium caseinate is preferable as such a water-soluble emulsifier.

上記水性溶媒（Ｗ２）、Ｗ１／Ｏエマルション、水溶性乳化剤および／または混合脂質成分（Ｆ２）の混合態様（添加順序等）は特に限定されるものではなく、適切な態様を選択すればよい。たとえばＦ２が主として水溶性脂質からなる場合、あらかじめそのようなＦ２および／または水溶性乳化剤をＷ２に添加しておき、それにＷ１／Ｏエマルションを添加して乳化処理を行うことができる。一方、Ｆ２が主として脂溶性脂質からなる場合、あらかじめ（Ｗ１／Ｏエマルション調製後）そのようなＦ２をＷ１／Ｏエマルションの油相に添加しておき、それを、必要に応じて水溶性乳化剤が添加されているＷ２に添加して乳化処理を行うことができる。   The mixing mode (addition order, etc.) of the aqueous solvent (W2), W1 / O emulsion, water-soluble emulsifier and / or mixed lipid component (F2) is not particularly limited, and an appropriate mode may be selected. For example, when F2 is mainly composed of a water-soluble lipid, such F2 and / or a water-soluble emulsifier can be added to W2 in advance, and a W1 / O emulsion can be added thereto for emulsification. On the other hand, when F2 is mainly composed of a fat-soluble lipid, (after preparation of the W1 / O emulsion) such F2 is added to the oil phase of the W1 / O emulsion in advance, and if necessary, a water-soluble emulsifier is added. The emulsification treatment can be performed by adding to the added W2.

二次乳化工程における、水性溶媒（Ｗ２）ないしＷ１／Ｏエマルションの有機溶媒（Ｏ）に添加する混合脂質成分（Ｆ２）の割合、Ｗ１／Ｏエマルションと水性溶媒（Ｗ２）の体積比、その他の操作条件は、最終的に調製するリポソームの用途などを考慮しながら適宜調節することができる。   In the secondary emulsification step, the ratio of the mixed lipid component (F2) to be added to the aqueous solvent (W2) to the organic solvent (O) of the W1 / O emulsion, the volume ratio of the W1 / O emulsion to the aqueous solvent (W2), other The operating conditions can be appropriately adjusted in consideration of the application of the liposome to be finally prepared.

（３）溶媒除去工程
溶媒除去工程は、前記二次乳化工程により得られたＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションに含まれる有機溶媒相（Ｏ）を除去し、リポソームを形成させる工程である（図１参照）。すなわち、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを回収し、開放容器内に移し静置あるいは撹拌することで、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションに含まれる有機溶媒（Ｏ）を蒸発除去することができる。これにより、混合脂質膜成分（Ｆ１）および（Ｆ２）からなる脂質膜を内水相の周囲に形成し、リポソームを得ることができる。(3) Solvent Removal Step The solvent removal step is a step of removing the organic solvent phase (O) contained in the W1 / O / W2 emulsion obtained by the secondary emulsification step to form liposomes (see FIG. 1). ). That is, the organic solvent (O) contained in the W1 / O / W2 emulsion can be removed by evaporation by collecting the W1 / O / W2 emulsion, transferring it into an open container, and allowing it to stand or stir. Thereby, a lipid membrane composed of the mixed lipid membrane components (F1) and (F2) can be formed around the inner aqueous phase to obtain liposomes.

Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションからの溶媒除去の方法は、定法に従い加温や減圧によってＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの溶媒を溜去できるが、これに限定されない。用いる溶媒種に影響されるが、溶媒が突沸することのない条件範囲が設定され、温度条件は０〜６０℃の範囲が好ましく、０〜２５℃がより好ましい。また、減圧条件は溶媒の飽和蒸気圧〜大気圧の範囲内に設定されることが好ましく、溶媒の飽和蒸気圧の＋１％〜１０％の範囲内に設定されることがより好ましい。異なる溶媒を混合して用いる場合、より飽和蒸気圧の高い溶媒種に合わせた条件が好ましい。これらの除去条件は、溶媒が突沸しない範囲で組み合わせてもよく、例えば、熱に弱い薬剤を使用する際は、より低温側でかつ減圧条件で溶媒を溜去することが好ましい。溶媒除去にはＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの攪拌が無くともよいが、攪拌をしたほうがより均一に溶媒除去が進む。   The method for removing the solvent from the W1 / O / W2 emulsion is not limited to this, although the solvent of the W1 / O / W2 emulsion can be distilled off by heating or decompression according to a conventional method. Although affected by the type of solvent to be used, a condition range in which the solvent does not bump suddenly is set, and the temperature condition is preferably in the range of 0 to 60 ° C, more preferably 0 to 25 ° C. The decompression condition is preferably set within the range of the saturated vapor pressure of the solvent to atmospheric pressure, and more preferably within the range of + 1% to 10% of the saturated vapor pressure of the solvent. When different solvents are used in combination, conditions that match the solvent species having a higher saturated vapor pressure are preferred. These removal conditions may be combined within a range in which the solvent does not suddenly boil. For example, when a chemical that is weak against heat is used, it is preferable that the solvent is distilled off at a lower temperature and under reduced pressure. The solvent removal may not require stirring of the W1 / O / W2 emulsion, but the solvent removal proceeds more uniformly with stirring.

本発明の製造方法により得られるリポソームには、製法の工程上、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルション由来の多胞リポソームがある程度の割合含まれることがあるが、これを減じるのに、撹拌と減圧が、さらにはそれらを組み合わせて行うことが効果的である。重要なのは、溶媒の大半が抜ける時間より長く減圧と撹拌を行なうことにある。このことによりリポソームを構成する脂質の水和が進み、多胞リポソームが解けて、単胞のリポソーム状態にばらばらになると考えている。さらに驚くべきことに、これらの操作をおこなっても内包物の漏出は起こらない。このような操作をしても残った多胞リポソームがある場合には、フィルターにより除去することもできる。   Liposomes obtained by the production method of the present invention may contain a certain proportion of W / O / W emulsion-derived multivesicular liposomes in the production process. To reduce this, stirring and depressurization are performed. Further, it is effective to combine them. What is important is that the pressure reduction and stirring are performed longer than the time required for most of the solvent to escape. As a result, hydration of the lipids constituting the liposome proceeds, the multivesicular liposome is dissolved, and it is considered that the liposome state of the single vesicle is separated. Even more surprisingly, these operations do not cause leakage of inclusions. If there are multivesicular liposomes remaining after such operation, they can be removed by a filter.

（単分散性、平均粒径の測定方法）
本発明において、単分散性とは、粒径の標準偏差／平均粒径をいい、下記の測定方法で測定した値（ＣＶ値）をいう。平均粒径は体積平均粒径である。(Monodispersity, average particle size measurement method)
In the present invention, monodispersity refers to the standard deviation of particle diameter / average particle diameter, and refers to a value (CV value) measured by the following measurement method. The average particle diameter is a volume average particle diameter.

Ｗ１／Ｏエマルションあるいはリポソーム水溶液をクロロホルム／ヘキサン混合溶媒（体積比：４／６）で１０倍に希釈し、動的光散乱式ナノトラック粒度分析計（ＵＰＡ−ＥＸ１５０、日機装株式会社）を用いて粒度分布（単分散性）、体積平均粒径を算出する。   A W1 / O emulsion or an aqueous liposome solution is diluted 10 times with a chloroform / hexane mixed solvent (volume ratio: 4/6), and a dynamic light scattering nanotrack particle size analyzer (UPA-EX150, Nikkiso Co., Ltd.) is used. The particle size distribution (monodispersity) and the volume average particle size are calculated.

以上のような本発明の製造方法により最終的に得られるリポソームの平均粒径は、好ましくは２０ｎｍ以上３００ｎｍ以下とすることができる。このようなサイズのリポソームは、毛細血管を閉塞するおそれがほとんどなく、またがん組織近辺の血管にできる間隙を通過することもできるため、医薬品等として人体に投与されて使用する上で好都合である。   The average particle diameter of the liposome finally obtained by the production method of the present invention as described above can be preferably 20 nm or more and 300 nm or less. Liposomes with such a size have little risk of occluding capillaries and can pass through gaps formed in blood vessels in the vicinity of cancer tissue, so they are convenient for use by being administered to the human body as pharmaceuticals. is there.

（単分散性、平均粒径の測定）
以下に述べる実施例および比較例の一次乳化工程で得られたＷ１／Ｏエマルションをクロロホルム／ヘキサン混合溶媒（体積比：４／６、内水相と比重を同じくした）で１０倍に希釈し、動的光散乱式ナノトラック粒度分析計（ＵＰＡ−ＥＸ１５０、日機装株式会社）を用いて体積平均粒径および単分散性（ＣＶ値）を測定した。なお、ＣＶ値は（標準偏差／平均粒径）×１００［％］である。(Measurement of monodispersity and average particle size)
The W1 / O emulsion obtained in the primary emulsification step of Examples and Comparative Examples described below was diluted 10 times with a chloroform / hexane mixed solvent (volume ratio: 4/6, the same specific gravity as the inner aqueous phase), The volume average particle diameter and monodispersity (CV value) were measured using a dynamic light scattering nanotrack particle size analyzer (UPA-EX150, Nikkiso Co., Ltd.). The CV value is (standard deviation / average particle diameter) × 100 [%].

実施例１
（一次乳化工程によるＷ１／Ｏエマルションの製造）
ホスファチジルコリン含量が９５％である卵黄レシチン「COATSOME NC-50」（日油株式会社）０．３ｇ、コレステロール（Chol）０．１５２ｇおよびオレイン酸（OA）０．１０８ｇを含むヘキサン１５ｍＬを有機溶媒相（Ｏ）とし、カルセイン（０．４ｍＭ）を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）５ｍＬを内水相用の水分散相（Ｗ１）とした。５０ｍＬのビーカーにこれらの混合液を入れ、直径２０ｍｍのプローブをセットした超音波分散装置（ＵＨ−６００Ｓ、株式会社エスエムテー）により、２５℃にて１５分間超音波を照射し（出力５．５）、乳化処理を行った。上記方法に従って測定したところ、この一次乳化工程で得られたＷ１／Ｏエマルションは平均粒径２２０ｎｍの単分散Ｗ／Ｏエマルションであることが確認され、ＣＶ値は３３％であった。 Example 1
(Production of W1 / O emulsion by primary emulsification process)
15 ml of hexane containing 0.3 g of egg yolk lecithin “COATSOME NC-50” (NOF Corporation) having a phosphatidylcholine content of 95%, 0.152 g of cholesterol (Chol) and 0.108 g of oleic acid (OA) ( O) and 5 mL of tris-hydrochloric acid buffer solution (pH 8, 50 mmol / L) containing calcein (0.4 mM) was used as the aqueous dispersion phase (W1) for the inner aqueous phase. These mixed liquids were put into a 50 mL beaker, and ultrasonic waves were irradiated at 25 ° C. for 15 minutes by an ultrasonic dispersion apparatus (UH-600S, SMT Co., Ltd.) in which a probe having a diameter of 20 mm was set (output 5.5). The emulsification treatment was performed. When measured according to the above method, it was confirmed that the W1 / O emulsion obtained in this primary emulsification step was a monodispersed W / O emulsion having an average particle size of 220 nm, and the CV value was 33%.

（二次乳化工程によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造）
続いて、上記一次乳化工程により得られたＷ１／Ｏエマルションを分散相とし、実験用デッドエンド型マイクロチャネル乳化装置モジュールを使用して、マイクロチャネル乳化法によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造を行った。(Production of W1 / O / W2 emulsion by secondary emulsification process)
Subsequently, the W1 / O emulsion obtained by the primary emulsification step was used as a dispersed phase, and a W1 / O / W2 emulsion was produced by a microchannel emulsification method using an experimental dead-end type microchannel emulsifier module. It was.

上記モジュールのマイクロチャネル基板はシリコン製であり、マイクロチャネル基板のテラス長、チャネル深さおよびチャネル幅はそれぞれ約６０μｍ、約１１μｍおよび約１６μｍであった。上記マイクロチャネル基板にガラス板を圧着させてチャネルを形成し、このチャネルの出口側に外水相溶液（Ｗ２）である３％のカゼインナトリウムを含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）を満たしておき、チャネルの入口側から前記Ｗ１／Ｏエマルションを供給して、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを製造した。   The microchannel substrate of the module was made of silicon, and the terrace length, channel depth and channel width of the microchannel substrate were about 60 μm, about 11 μm and about 16 μm, respectively. A glass plate is pressure-bonded to the microchannel substrate to form a channel, and a tris-hydrochloric acid buffer solution (pH 8, 50 mmol / L) containing 3% sodium caseinate as an external aqueous phase solution (W2) on the outlet side of the channel. And the W1 / O emulsion was supplied from the inlet side of the channel to produce a W1 / O / W2 emulsion.

（有機溶媒相の除去によるリポソームの製造）
次に、上記Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを蓋のない開放ガラス製容器に移し替え、室温下で約２０時間静置し、ヘキサンを揮発させた。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られ、この粒子内にはカルセインが含まれていることが確認された。(Production of liposomes by removal of organic solvent phase)
Next, the W1 / O / W2 emulsion was transferred to an open glass container without a lid, and allowed to stand at room temperature for about 20 hours to volatilize hexane. A suspension of fine liposome particles was obtained, and it was confirmed that calcein was contained in the particles.

実施例２
（一次乳化工程によるＷ１／Ｏエマルションの製造）
ホスファチジルコリン含量が９５％である卵黄レシチン「COATSOME NC-50」（日油株式会社）１．０８ｇ、コレステロール（Chol）０．５４７ｇおよびオレイン酸（OA）０．３８９ｇを含むヘキサン５４ｍＬを有機溶媒相（Ｏ）とし、カルセイン（０．４ｍＭ）を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）１８ｍＬを内水相用の水分散相（Ｗ１）とした。１５０ｍＬの容器にこれらの混合液を入れ、直径２５ｍｍのプローブをセットしたホモミキサー（ULTRA TURRAX T25 basic、IKA社）により、２５℃にて２４０００ｒｐｍで１０分間、プレ分散処理を行った。その後、このプレ分散液を、卓上湿式微粒化装置ＮＶ-２００-Ｄ（吉田機械株式会社）を用いて、１５０MPaで１０パス処理した。上記方法に従って測定したところ、この一次乳化工程で得られたＷ１／Ｏエマルションは平均粒径１７０ｎｍの単分散Ｗ／Ｏエマルションであることが確認され、ＣＶ値は３３％であった。 Example 2
(Production of W1 / O emulsion by primary emulsification process)
54 mL of hexane containing 1.08 g of egg yolk lecithin “COATSOME NC-50” (NOF Corporation), 0.547 g of cholesterol (Chol) and 0.389 g of oleic acid (OA) having a phosphatidylcholine content of 95% (organic solvent phase) O) and 18 mL of tris-hydrochloric acid buffer (pH 8, 50 mmol / L) containing calcein (0.4 mM) was used as the aqueous dispersion phase (W1) for the inner aqueous phase. These mixed liquids were put into a 150 mL container, and pre-dispersion treatment was performed at 25 ° C. and 24,000 rpm for 10 minutes using a homomixer (ULTRA TURRAX T25 basic, IKA) with a 25 mm diameter probe set. Then, this pre-dispersion was processed for 10 passes at 150 MPa using a desktop wet atomizer NV-200-D (Yoshida Kikai Co., Ltd.). When measured according to the above method, it was confirmed that the W1 / O emulsion obtained in this primary emulsification step was a monodispersed W / O emulsion having an average particle size of 170 nm, and the CV value was 33%.

（二次乳化工程によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造）
続いて、上記一次乳化工程により得られたＷ１／Ｏエマルションを分散相とし、実験用デッドエンド型マイクロチャネル乳化装置モジュールを使用して、マイクロチャネル乳化法によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造を行った。(Production of W1 / O / W2 emulsion by secondary emulsification process)
Subsequently, the W1 / O emulsion obtained by the primary emulsification step was used as a dispersed phase, and a W1 / O / W2 emulsion was produced by a microchannel emulsification method using an experimental dead-end type microchannel emulsifier module. It was.

上記モジュールのマイクロチャネル基板はシリコン製であり、マイクロチャネル基板のテラス長、チャネル深さおよびチャネル幅はそれぞれ約６０μｍ、約１１μｍおよび約１６μｍであった。上記マイクロチャネル基板にガラス板を圧着させてチャネルを形成し、このチャネルの出口側に外水相溶液（Ｗ２）である３％のカゼインナトリウムを含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）を満たしておき、チャネルの入口側から前記Ｗ１／Ｏエマルションを供給して、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを製造した。   The microchannel substrate of the module was made of silicon, and the terrace length, channel depth and channel width of the microchannel substrate were about 60 μm, about 11 μm and about 16 μm, respectively. A glass plate is pressure-bonded to the microchannel substrate to form a channel, and a tris-hydrochloric acid buffer solution (pH 8, 50 mmol / L) containing 3% sodium caseinate as an external aqueous phase solution (W2) on the outlet side of the channel. And the W1 / O emulsion was supplied from the inlet side of the channel to produce a W1 / O / W2 emulsion.

（有機溶媒相の除去によるリポソームの製造）
次に、上記Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを蓋のない開放ガラス製容器に移し替え、室温下で約２０時間静置し、ヘキサンを揮発させた。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られ、この粒子内にはカルセインが含まれていることが確認された。(Production of liposomes by removal of organic solvent phase)
Next, the W1 / O / W2 emulsion was transferred to an open glass container without a lid, and allowed to stand at room temperature for about 20 hours to volatilize hexane. A suspension of fine liposome particles was obtained, and it was confirmed that calcein was contained in the particles.

実施例３
（一次乳化工程によるＷ１／Ｏエマルションの製造）
カルセイン（０．４ｍＭ）を含むトリス−塩酸緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ）のｐＨを９に変更し、超音波処理時間を５ｍｉｎとしたこと以外は、実施例１と同様にして、乳化処理を行った。上記方法に従って測定したところ、この一次乳化工程で得られたＷ１／Ｏエマルションは平均粒径３２０ｎｍの単分散Ｗ／Ｏエマルションであることが確認され、ＣＶ値は４２％であった。 Example 3
(Production of W1 / O emulsion by primary emulsification process)
The emulsification treatment was performed in the same manner as in Example 1 except that the pH of Tris-HCl buffer solution (50 mmol / L) containing calcein (0.4 mM) was changed to 9 and the ultrasonic treatment time was changed to 5 min. It was. When measured according to the above method, it was confirmed that the W1 / O emulsion obtained in this primary emulsification step was a monodispersed W / O emulsion having an average particle size of 320 nm, and the CV value was 42%.

（二次乳化工程によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造）
外水相溶液（Ｗ２）である３％のカゼインナトリウムを含むトリス−塩酸緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ）のｐＨを９に変更した以外は実施例１と同様にして、マイクロチャネル乳化法によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造を行った。(Production of W1 / O / W2 emulsion by secondary emulsification process)
In the same manner as in Example 1 except that the pH of the Tris-hydrochloric acid buffer solution (50 mmol / L) containing 3% sodium casein, which is the outer aqueous phase solution (W2), was changed to W1 / by microchannel emulsification. An O / W2 emulsion was produced.

（有機溶媒相の除去によるリポソームの製造）
次に、上記Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを蓋のない開放ガラス製容器に移し替え、室温下で約２０時間静置し、ヘキサンを揮発させた。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られ、この粒子内にはカルセインが含まれていることが確認された。(Production of liposomes by removal of organic solvent phase)
Next, the W1 / O / W2 emulsion was transferred to an open glass container without a lid, and allowed to stand at room temperature for about 20 hours to volatilize hexane. A suspension of fine liposome particles was obtained, and it was confirmed that calcein was contained in the particles.

実施例４
（一次乳化工程によるＷ１／Ｏエマルションの製造）
超音波処理出力を３．０としたこと以外は、実施例３と同様にして、乳化処理を行った。上記方法に従って測定したところ、この一次乳化工程で得られたＷ１／Ｏエマルションは平均粒径５５０ｎｍの単分散Ｗ／Ｏエマルションであることが確認され、ＣＶ値は５５％であった。 Example 4
(Production of W1 / O emulsion by primary emulsification process)
The emulsification treatment was performed in the same manner as in Example 3 except that the ultrasonic treatment output was 3.0. When measured according to the above method, it was confirmed that the W1 / O emulsion obtained in this primary emulsification step was a monodispersed W / O emulsion having an average particle size of 550 nm, and the CV value was 55%.

（二次乳化工程によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造）
実施例３と同様にして、マイクロチャネル乳化法によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造を行った。(Production of W1 / O / W2 emulsion by secondary emulsification process)
In the same manner as in Example 3, a W1 / O / W2 emulsion was produced by the microchannel emulsification method.

（有機溶媒相の除去によるリポソームの製造）
次に、上記Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを蓋のない開放ガラス製容器に移し替え、室温下で約２０時間静置し、ヘキサンを揮発させた。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られ、この粒子内にはカルセインが含まれていることが確認された。(Production of liposomes by removal of organic solvent phase)
Next, the W1 / O / W2 emulsion was transferred to an open glass container without a lid, and allowed to stand at room temperature for about 20 hours to volatilize hexane. A suspension of fine liposome particles was obtained, and it was confirmed that calcein was contained in the particles.

実施例５
（一次乳化工程によるＷ１／Ｏエマルションの製造）
超音波処理出力を２．５としたこと、処理時間を３ｍｉｎとした以外は、実施例３と同様にして、乳化処理を行った。上記方法に従って測定したところ、この一次乳化工程で得られたＷ１／Ｏエマルションは平均粒径８８０ｎｍの単分散Ｗ／Ｏエマルションであることが確認され、ＣＶ値は６９％であった。 Example 5
(Production of W1 / O emulsion by primary emulsification process)
Emulsification was performed in the same manner as in Example 3 except that the ultrasonic treatment output was 2.5 and the treatment time was 3 min. When measured according to the above method, it was confirmed that the W1 / O emulsion obtained in this primary emulsification step was a monodispersed W / O emulsion having an average particle size of 880 nm, and the CV value was 69%.

（二次乳化工程によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造）
実施例３と同様にして、マイクロチャネル乳化法によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造を行った。(Production of W1 / O / W2 emulsion by secondary emulsification process)
In the same manner as in Example 3, a W1 / O / W2 emulsion was produced by the microchannel emulsification method.

（有機溶媒相の除去によるリポソームの製造）
次に、上記Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを蓋のない開放ガラス製容器に移し替え、室温下で約２０時間静置し、ヘキサンを揮発させた。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られ、この粒子内にはカルセインが含まれていることが確認された。(Production of liposomes by removal of organic solvent phase)
Next, the W1 / O / W2 emulsion was transferred to an open glass container without a lid, and allowed to stand at room temperature for about 20 hours to volatilize hexane. A suspension of fine liposome particles was obtained, and it was confirmed that calcein was contained in the particles.

実施例６
（一次乳化工程によるＷ１／Ｏエマルションの製造）
カルセイン（０．４ｍＭ）を含む緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ）をｐＨを６に調整したクエン酸緩衝液に変更したこと以外は、実施例１と同様にして、乳化処理を行った。上記方法に従って測定したところ、この一次乳化工程で得られたＷ１／Ｏエマルションは平均粒径２２０ｎｍの単分散Ｗ／Ｏエマルションであることが確認され、ＣＶ値は３６％であった。 Example 6
(Production of W1 / O emulsion by primary emulsification process)
An emulsification treatment was performed in the same manner as in Example 1 except that the buffer solution (50 mmol / L) containing calcein (0.4 mM) was changed to a citrate buffer solution adjusted to pH 6. When measured according to the above method, it was confirmed that the W1 / O emulsion obtained in this primary emulsification step was a monodispersed W / O emulsion having an average particle size of 220 nm, and the CV value was 36%.

（二次乳化工程によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造）
外水相溶液（Ｗ２）である３％のカゼインナトリウムを含むトリス−塩酸緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ）を３％のカゼインナトリウムを含むｐＨを６に調整したクエン酸緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ）に変更した以外は実施例１と同様にして、マイクロチャネル乳化法によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造を行った。(Production of W1 / O / W2 emulsion by secondary emulsification process)
Tris-hydrochloric acid buffer solution (50 mmol / L) containing 3% sodium caseinate, which is the outer aqueous phase solution (W2), was changed to a citrate buffer solution (50 mmol / L) adjusted to pH 6 containing 3% sodium caseinate. A W1 / O / W2 emulsion was produced by the microchannel emulsification method in the same manner as in Example 1 except for the change.

（有機溶媒相の除去によるリポソームの製造）
次に、上記Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを蓋のない開放ガラス製容器に移し替え、室温下で約２０時間静置し、ヘキサンを揮発させた。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られ、この粒子内にはカルセインが含まれていることが確認された。(Production of liposomes by removal of organic solvent phase)
Next, the W1 / O / W2 emulsion was transferred to an open glass container without a lid, and allowed to stand at room temperature for about 20 hours to volatilize hexane. A suspension of fine liposome particles was obtained, and it was confirmed that calcein was contained in the particles.

実施例７
（一次乳化工程によるＷ１／Ｏエマルションの製造）
リン脂質を「ＮＣ−５０」からホスファチジルコリン含量が８０％である卵黄レシチン「ＰＬ−１００Ｍ」（キューピー株式会社）に変更したことを除いては、実施例１と同様にして、乳化処理を行った。上記方法に従って測定したところ、この一次乳化工程で得られたＷ１／Ｏエマルションは平均粒径２５０ｎｍの単分散Ｗ／Ｏエマルションであることが確認され、ＣＶ値は３５％であった。 Example 7
(Production of W1 / O emulsion by primary emulsification process)
The emulsification treatment was performed in the same manner as in Example 1 except that the phospholipid was changed from “NC-50” to egg yolk lecithin “PL-100M” (Kupy Corp.) having a phosphatidylcholine content of 80%. . When measured according to the above method, it was confirmed that the W1 / O emulsion obtained in this primary emulsification step was a monodispersed W / O emulsion having an average particle size of 250 nm, and the CV value was 35%.

（二次乳化工程によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造）
実施例１と同様にして、マイクロチャネル乳化法によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造を行った。(Production of W1 / O / W2 emulsion by secondary emulsification process)
In the same manner as in Example 1, a W1 / O / W2 emulsion was produced by a microchannel emulsification method.

（有機溶媒相の除去によるリポソームの製造）
次に、上記Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを蓋のない開放ガラス製容器に移し替え、室温下で約２０時間静置し、ヘキサンを揮発させた。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られ、この粒子内にはカルセインが含まれていることが確認された。(Production of liposomes by removal of organic solvent phase)
Next, the W1 / O / W2 emulsion was transferred to an open glass container without a lid, and allowed to stand at room temperature for about 20 hours to volatilize hexane. A suspension of fine liposome particles was obtained, and it was confirmed that calcein was contained in the particles.

実施例８
（一次乳化工程によるＷ１／Ｏエマルションの製造）
ホスファチジルコリン含量が９５％である卵黄レシチン「COATSOME NC-50」（日油株式会社）０．３ｇ、コレステロール（Chol）０．１５２ｇおよびオレイン酸（OA）０．１０８ｇを含むヘキサン１５ｍＬを有機溶媒相（Ｏ）とし、カルセイン（０．４ｍＭ）を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）５ｍＬを内水相用の水分散相（Ｗ１）とした。５０ｍＬのビーカーにこれらの混合液を入れ、高圧ホモジナイザー（ナノマイザー、吉田機械興業社製）を用いて１００ＭＰａの圧力条件で乳化処理を行った。上記方法に従って測定したところ、この一次乳化工程で得られたＷ１／Ｏエマルションは平均粒径１２５ｎｍの単分散Ｗ／Ｏエマルションであることが確認され、ＣＶ値は３９％であった。 Example 8
(Production of W1 / O emulsion by primary emulsification process)
15 ml of hexane containing 0.3 g of egg yolk lecithin “COATSOME NC-50” (NOF Corporation) having a phosphatidylcholine content of 95%, 0.152 g of cholesterol (Chol) and 0.108 g of oleic acid (OA) ( O) and 5 mL of tris-hydrochloric acid buffer solution (pH 8, 50 mmol / L) containing calcein (0.4 mM) was used as the aqueous dispersion phase (W1) for the inner aqueous phase. These mixed liquids were put into a 50 mL beaker and emulsified under a pressure condition of 100 MPa using a high-pressure homogenizer (Nanomizer, manufactured by Yoshida Kikai Kogyo Co., Ltd.). When measured according to the above method, it was confirmed that the W1 / O emulsion obtained in this primary emulsification step was a monodispersed W / O emulsion having an average particle size of 125 nm, and the CV value was 39%.

（二次乳化工程によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造）
続いて、上記一次乳化工程により得られたＷ１／Ｏエマルションを分散相とし、実験用デッドエンド型マイクロチャネル乳化装置モジュールを使用して、マイクロチャネル乳化法によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造を行った。(Production of W1 / O / W2 emulsion by secondary emulsification process)
Subsequently, the W1 / O emulsion obtained by the primary emulsification step was used as a dispersed phase, and a W1 / O / W2 emulsion was produced by a microchannel emulsification method using an experimental dead-end type microchannel emulsifier module. It was.

上記モジュールのマイクロチャネル基板はシリコン製であり、マイクロチャネル基板のテラス長、チャネル深さおよびチャネル幅はそれぞれ約６０μｍ、約１１μｍおよび約１６μｍであった。上記マイクロチャネル基板にガラス板を圧着させてチャネルを形成し、このチャネルの出口側に外水相溶液（Ｗ２）である３％のカゼインナトリウムを含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）を満たしておき、チャネルの入口側から前記Ｗ１／Ｏエマルションを供給して、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを製造した。   The microchannel substrate of the module was made of silicon, and the terrace length, channel depth and channel width of the microchannel substrate were about 60 μm, about 11 μm and about 16 μm, respectively. A glass plate is pressure-bonded to the microchannel substrate to form a channel, and a tris-hydrochloric acid buffer solution (pH 8, 50 mmol / L) containing 3% sodium caseinate as an external aqueous phase solution (W2) on the outlet side of the channel. And the W1 / O emulsion was supplied from the inlet side of the channel to produce a W1 / O / W2 emulsion.

（有機溶媒相の除去によるリポソームの製造）
次に、上記Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを蓋のない開放ガラス製容器に移し替え、室温下で約２０時間静置し、ヘキサンを揮発させた。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られ、この粒子内にはカルセインが含まれていることが確認された。(Production of liposomes by removal of organic solvent phase)
Next, the W1 / O / W2 emulsion was transferred to an open glass container without a lid, and allowed to stand at room temperature for about 20 hours to volatilize hexane. A suspension of fine liposome particles was obtained, and it was confirmed that calcein was contained in the particles.

実施例９
水分散相（Ｗ１）のトリス−塩酸緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ）のｐＨを９に変更し、有機溶媒相（Ｏ）を酢酸エチル／ヘキサン＝２／８（体積比）の混合物に変更したことを除いては、実施例１と同様にして、リポソーム粒子の懸濁液を作製した。この一次乳化工程で得られたＷ１／Ｏエマルションの平均粒径は２６１ｎｍであり、ＣＶ値は４１％であった。 Example 9
The pH of the tris-hydrochloric acid buffer (50 mmol / L) in the aqueous dispersion phase (W1) was changed to 9, and the organic solvent phase (O) was changed to a mixture of ethyl acetate / hexane = 2/8 (volume ratio). Except for, a liposome particle suspension was prepared in the same manner as in Example 1. The average particle size of the W1 / O emulsion obtained in this primary emulsification step was 261 nm, and the CV value was 41%.

実施例１０
水分散相（Ｗ１）のトリス−塩酸緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ）のｐＨを９に変更し、有機溶媒相（Ｏ）をクロロホルム／ヘキサン＝２／８（体積比）の混合物に変更したことを除いては、実施例１と同様にして、リポソーム粒子の懸濁液を作製した。この一次乳化工程で得られたＷ１／Ｏエマルションの平均粒径は３００ｎｍであり、ＣＶ値は３５％であった。 Example 10
The pH of the tris-hydrochloric acid buffer (50 mmol / L) in the aqueous dispersion phase (W1) was changed to 9, and the organic solvent phase (O) was changed to a mixture of chloroform / hexane = 2/8 (volume ratio). Except for the above, a suspension of liposome particles was prepared in the same manner as in Example 1. The average particle size of the W1 / O emulsion obtained in this primary emulsification step was 300 nm, and the CV value was 35%.

実施例１１
水分散相（Ｗ１）のトリス−塩酸緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ）のｐＨを９に変更し、有機溶媒相（Ｏ）をクロロホルム／ヘキサン＝４／８（体積比）の混合物に変更したことを除いては、実施例１と同様にして、リポソーム粒子の懸濁液を作製した。この一次乳化工程で得られたＷ１／Ｏエマルションの平均粒径は３１０ｎｍであり、ＣＶ値は５０％であった。 Example 11
The pH of the tris-hydrochloric acid buffer (50 mmol / L) in the aqueous dispersion phase (W1) was changed to 9, and the organic solvent phase (O) was changed to a mixture of chloroform / hexane = 4/8 (volume ratio). Except for the above, a suspension of liposome particles was prepared in the same manner as in Example 1. The average particle size of the W1 / O emulsion obtained in this primary emulsification step was 310 nm, and the CV value was 50%.

比較例１
一次乳化工程によるＷ１／Ｏエマルションの製造において、カルセイン（０．４ｍＭ）を含むトリス−塩酸緩衝液のｐＨを９に調整したものを使用し、超音波処理による乳化を超音波水槽（出力３００Ｗ）中で緩やかに振とうすることにより行ない、Ｗ２に使用する３％のカゼインナトリウムを含むトリス−塩酸緩衝液のｐＨを９に変更した以外は、実施例１と同様にして、リポソーム分散液を作製した。この一次乳化工程で得られたＷ１／Ｏエマルションの平均粒径は１．６μｍであり、ＣＶ値は４０％であった。 Comparative Example 1
In the production of the W1 / O emulsion by the primary emulsification step, a tris-hydrochloric acid buffer solution containing calcein (0.4 mM) adjusted to pH 9 is used, and emulsification by ultrasonic treatment is performed in an ultrasonic water tank (output 300 W). A liposome dispersion was prepared in the same manner as in Example 1, except that the pH of the Tris-HCl buffer containing 3% sodium caseinate used for W2 was changed to 9. did. The average particle size of the W1 / O emulsion obtained in this primary emulsification step was 1.6 μm, and the CV value was 40%.

比較例２
一次乳化工程によるＷ１／Ｏエマルションの製造において、内水相用の水分散相（Ｗ１）として、カルセイン（０．４ｍＭ）を含むトリス−塩酸緩衝液のｐＨを９に調整したものを使用し、有機溶媒相（Ｏ）をクロロホルム／ヘキサン＝２／８の混合物とし、リン脂質を「ＮＣ−５０」からホスファチジルコリン含量が８０％である卵黄レシチン「ＰＬ−１００Ｍ」（キューピー株式会社）に変更し、Ｗ２に使用する３％のカゼインナトリウムを含むトリス−塩酸緩衝液のｐＨを９に変更したことを除いては、実施例１と同様にして、リポソーム粒子の懸濁液を作製した。この一次乳化工程で得られたＷ１／Ｏエマルションの平均粒径は９２０ｎｍであった。また、この粒径分布としては約２００ｎｍにメインピークがあるものの、約１．２μｍにもかなり大きなサブピークがあり、ＣＶ値も５２％であった。 Comparative Example 2
In the production of the W1 / O emulsion by the primary emulsification step, an aqueous dispersion phase (W1) for the inner aqueous phase is prepared by adjusting the pH of a Tris-HCl buffer solution containing calcein (0.4 mM) to 9, The organic solvent phase (O) is a mixture of chloroform / hexane = 2/8, and the phospholipid is changed from “NC-50” to egg yolk lecithin “PL-100M” (Cuppy Inc.) having a phosphatidylcholine content of 80%, A suspension of liposome particles was prepared in the same manner as in Example 1 except that the pH of the Tris-HCl buffer containing 3% sodium caseinate used for W2 was changed to 9. The average particle size of the W1 / O emulsion obtained in this primary emulsification step was 920 nm. Further, the particle size distribution had a main peak at about 200 nm, but had a considerably large sub-peak at about 1.2 μm, and the CV value was 52%.

実施例１２
水分散相（Ｗ１）に、カルセイン（０．４ｍＭ）に代えて、シタラビン（４ｍＭ）を溶解させた以外は、実施例３と同様にして、リポソーム粒子の懸濁液を作製した。この一次乳化工程で得られたＷ１／Ｏエマルションの平均粒径は３２０ｎｍであり、ＣＶ値は４８％であった。また、最終的に得られたリポソーム粒子の平均粒子径は２５８ｎｍであった。 Example 12
A liposome particle suspension was prepared in the same manner as in Example 3 except that cytarabine (4 mM) was dissolved in the aqueous dispersion phase (W1) instead of calcein (0.4 mM). The average particle size of the W1 / O emulsion obtained in this primary emulsification step was 320 nm, and the CV value was 48%. Moreover, the average particle diameter of the liposome particles finally obtained was 258 nm.

実施例１３
水分散相（Ｗ１）に、カルセイン（０．４ｍＭ）に代えて、シタラビン（４ｍＭ）を溶解させた以外は、実施例４と同様にして、リポソーム粒子の懸濁液を作製した。この一次乳化工程で得られたＷ１／Ｏエマルションの平均粒径は６０７ｎｍであり、ＣＶ値は３０％であった。また、最終的に得られたリポソーム粒子の平均粒子径は５８１ｎｍであった。 Example 13
A suspension of liposome particles was prepared in the same manner as in Example 4 except that cytarabine (4 mM) was dissolved in the aqueous dispersion phase (W1) instead of calcein (0.4 mM). The average particle diameter of the W1 / O emulsion obtained in this primary emulsification step was 607 nm, and the CV value was 30%. Moreover, the average particle diameter of the liposome particles finally obtained was 581 nm.

比較例３
水分散相（Ｗ１）に、カルセイン（０．４ｍＭ）に代えて、シタラビン（４ｍＭ）を溶解させた以外は、比較例１と同様にして、リポソーム粒子の懸濁液を作製した。この一次乳化工程で得られたＷ１／Ｏエマルションの平均粒径は１８２０ｎｍであり、ＣＶ値は５１％であった。また、最終的に得られたリポソーム粒子の平均粒子径は１９１０ｎｍであった。 Comparative Example 3
A liposome particle suspension was prepared in the same manner as in Comparative Example 1 except that cytarabine (4 mM) was dissolved in the aqueous dispersion phase (W1) instead of calcein (0.4 mM). The average particle diameter of the W1 / O emulsion obtained in this primary emulsification step was 1820 nm, and the CV value was 51%. Moreover, the average particle diameter of the liposome particles finally obtained was 1910 nm.

上記実施例および比較例で得られたリポソームの、カルセインまたはシタラビンの内包率を、下記の方法に従って測定した。結果は表１に示す通りであった。また、上記実施例により得られたリポソームは何れも単分散性の高いものであった。   The encapsulating rate of calcein or cytarabine in the liposomes obtained in the above Examples and Comparative Examples was measured according to the following method. The results were as shown in Table 1. In addition, all the liposomes obtained in the above examples were highly monodispersed.

（カルセインの内包率の測定方法）
リポソーム水溶液（３ｍＬ）全体の蛍光強度（Ｆtotal）を分光光度計（Ｕ−３３１０、日本分光株式会社）により測定した。次に０．０１Ｍ，ＣｏＣｌ2トリス塩酸緩衝液３０μＬを加えて外水相に漏出したカルセインの蛍光をＣｏ2+により消光することで、ベシクル内の蛍光強度（Ｆin）を測定した。さらに、カルセインを加えないでサンプルと同じ条件でベシクルを作製し、脂質自身が発する蛍光（Ｆl）を測定した。内包率は下記式より算出した；
内包率Ｅ（％） ＝ (Ｆin−Ｆl)／(Ｆtotal−Ｆl)×１００(Measurement method of calcein inclusion rate)
The fluorescence intensity (F total ) of the entire liposome aqueous solution (3 mL) was measured with a spectrophotometer (U-3310, JASCO Corporation). Next, 30 μL of 0.01 M CoCl 2 Tris-HCl buffer was added and the fluorescence of calcein leaked into the outer aqueous phase was quenched by Co 2+ to measure the fluorescence intensity (F in ) in the vesicle. Furthermore, vesicles were prepared under the same conditions as the sample without adding calcein, and the fluorescence (F 1 ) emitted by the lipids themselves was measured. The inclusion rate was calculated from the following formula;
Inclusion rate E (%) = (F in −F l ) / (F total −F l ) × 100

（シタラビンの内包率の測定方法）
超遠心装置で固形分(リポソーム)を分離(デカント)し、上澄と固形分をそれぞれＨＰＬＣで定量した。ＨＰＬＣカラムとしてVarian Polaris C18-A （3μm, 2x40 mm）を用いてアッセイされた。内包されていない当該化合物と内包されている当該化合物の絶対値から、シタラビンの内包率を算出した。(Measurement method of inclusion rate of cytarabine)
The solid content (liposome) was separated (decanted) with an ultracentrifugation device, and the supernatant and the solid content were each quantified by HPLC. Assayed using Varian Polaris C18-A (3 μm, 2 × 40 mm) as the HPLC column. The inclusion rate of cytarabine was calculated from the compound not included and the absolute value of the compound included.

（ミクロンサイズの粒子の数の観察方法）
上記実施例および比較例で得られたリポソーム分散液に残るミクロンサイズの粒子の数を、光学顕微鏡で観察することにより評価した。結果は表１および図１〜５に示す通りであった。このとき、前述のＷ／Ｏ／Ｗエマルション由来の多胞リポソームが少しの割合、残存するので、より観察しやすくすることを目的として、多胞リポソームを減らして、単胞リポソームにするために、１日撹拌をし続けたものを用いて、評価した（多胞リポソームがばらばらにならないと（単胞リポソームにならないと）正確なミクロンサイズの粒子の数の差を比較できないため）。(Method for observing the number of micron-sized particles)
The number of micron-sized particles remaining in the liposome dispersions obtained in the above Examples and Comparative Examples was evaluated by observing with an optical microscope. The results were as shown in Table 1 and FIGS. At this time, since the above-mentioned W / O / W emulsion-derived multivesicular liposomes remain in a small proportion, in order to reduce the number of multivesicular liposomes for the purpose of easier observation, Evaluations were made using the ones that had been agitated for one day (because the multivesicular liposomes would not be separated (because they would not be single cell liposomes), the difference in the number of accurate micron-sized particles could not be compared).

１：リン脂質
２：薬剤（カルセイン色素）
３：有機溶媒（ヘキサン）
４：内水相（水）
５：外水相（カゼイン水溶液）1: Phospholipid 2: Drug (calcein dye)
3: Organic solvent (hexane)
4: Inner water phase (water)
5: External water phase (casein aqueous solution)

Claims (3)

水性溶媒（Ｗ１）、有機溶媒（Ｏ）、ならびにリン脂質、ステロール類、糖脂質、グリコール、脂肪族アミンおよび長鎖脂肪酸から選ばれるリポソーム脂質膜を構成する脂質成分を用いて一次乳化することにより得られた体積平均粒子径２０ｎｍ以上２００ｎｍ以下かつＣＶ値４０％以下のＷ１／Ｏエマルションと、水性溶媒（Ｗ２）とを用い、外水相となる前記水性溶媒（Ｗ２）にリポソーム脂質膜を破壊しないタンパク質乳化剤を含有させて、マイクロチャネル乳化法により二次乳化を行い、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを形成させ、その後Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションから有機溶媒相を除去して単胞リポソームを形成させることを特徴とする単胞リポソームの製造方法。 By primary emulsification using an aqueous solvent (W1), an organic solvent (O) , and a lipid component constituting a liposomal lipid membrane selected from phospholipids, sterols, glycolipids, glycols, aliphatic amines and long chain fatty acids. Using the obtained W1 / O emulsion having a volume average particle diameter of 20 nm or more and 200 nm or less and a CV value of 40% or less and an aqueous solvent (W2), a liposomal lipid membrane is applied to the aqueous solvent (W2) serving as an outer aqueous phase. A protein emulsifier that does not break down is contained and secondary emulsification is performed by the microchannel emulsification method to form a W1 / O / W2 emulsion, and then the organic solvent phase is removed from the W1 / O / W2 emulsion to form single cell liposomes. A method for producing a single-cell liposome characterized by comprising: 前記Ｗ１／Ｏエマルションの油相の主成分がヘキサンであることを特徴とする請求項１に記載の単胞リポソームの製造方法。 The method for producing single vesicle liposomes according to claim 1 , wherein the main component of the oil phase of the W1 / O emulsion is hexane. 前記リポソームに内包させる物質として医療用の薬剤類を用い、かつ得られるリポソームの体積平均粒子径を２０ｎｍ以上３００ｎｍ以下とすることを特徴とする請求項１または２に記載の単胞リポソームの製造方法。 The method for producing a single-cell liposome according to claim 1 or 2 , wherein a medical drug is used as the substance to be encapsulated in the liposome, and the volume average particle size of the obtained liposome is 20 nm to 300 nm. .
JP2011505984A 2009-03-23 2010-03-16 Method for producing liposome by two-stage emulsification using nano-sized primary emulsion Active JP5649074B2 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2011505984A JP5649074B2 (en) 2009-03-23 2010-03-16 Method for producing liposome by two-stage emulsification using nano-sized primary emulsion

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2009069879 2009-03-23
JP2009069879 2009-03-23
JP2011505984A JP5649074B2 (en) 2009-03-23 2010-03-16 Method for producing liposome by two-stage emulsification using nano-sized primary emulsion
PCT/JP2010/054399 WO2010110116A1 (en) 2009-03-23 2010-03-16 Method for producing liposomes by two-stage emulsification using nano-sized primarily emulsified product

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPWO2010110116A1 JPWO2010110116A1 (en) 2012-09-27
JP5649074B2 true JP5649074B2 (en) 2015-01-07

Family

ID=42780808

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2011505984A Active JP5649074B2 (en) 2009-03-23 2010-03-16 Method for producing liposome by two-stage emulsification using nano-sized primary emulsion

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP5649074B2 (en)
WO (1) WO2010110116A1 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200022920A (en) * 2018-08-24 2020-03-04 (주)엠앤씨생명과학 Natural liposome comprising red yeast rice, process for the preparation thereof, and food composition comprising the same

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013100252A (en) * 2011-11-09 2013-05-23 Univ Of Fukui Energy and information generating film system following example of living tissue

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5246382A (en) * 1975-10-11 1977-04-13 Lion Corp Method of preparing compound emulsion
WO2005053643A1 (en) * 2003-12-01 2005-06-16 Mitsubishi Pharma Corporation Liposome
JP2006272196A (en) * 2005-03-29 2006-10-12 Toshiba Corp Production method of composite type particulate and production apparatus of composite type particulate

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5246382A (en) * 1975-10-11 1977-04-13 Lion Corp Method of preparing compound emulsion
WO2005053643A1 (en) * 2003-12-01 2005-06-16 Mitsubishi Pharma Corporation Liposome
JP2006272196A (en) * 2005-03-29 2006-10-12 Toshiba Corp Production method of composite type particulate and production apparatus of composite type particulate

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN6011009013; 黒岩崇ら: '多相エマルションを基材とした脂質カプセル作製における水相組成の影響' 化学工学会　第７４回年会（２００９年）要旨集（ＣＤ-ＲＯＭ版） , 20090218, Ｇ２０１ *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200022920A (en) * 2018-08-24 2020-03-04 (주)엠앤씨생명과학 Natural liposome comprising red yeast rice, process for the preparation thereof, and food composition comprising the same
KR102107304B1 (en) * 2018-08-24 2020-05-06 (주)엠앤씨생명과학 Natural liposome comprising red yeast rice, process for the preparation thereof, and food composition comprising the same

Also Published As

Publication number Publication date
WO2010110116A1 (en) 2010-09-30
JPWO2010110116A1 (en) 2012-09-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4900536B2 (en) Method for producing single cell liposomes by a two-stage emulsification method using an external aqueous phase containing a specific dispersant, and a method for producing a single cell liposome dispersion or a dry powder thereof using the method for producing single cell liposomes
Duong et al. Preparation of solid lipid nanoparticles and nanostructured lipid carriers for drug delivery and the effects of preparation parameters of solvent injection method
Pandey et al. Nanoemulsion: a novel drug delivery approach for enhancement of bioavailability
Tsai et al. Liposomal microencapsulation using the conventional methods and novel supercritical fluid processes
JP5494054B2 (en) Method for producing liposomes by two-stage emulsification
Sahu et al. Nanoemulsion: A novel eon in cancer chemotherapy
JP5983608B2 (en) Liposome-containing preparation using dissolution aid and method for producing the same
JP2006508126A (en) Protein-stabilized liposome formulation of pharmaceutical formulation
JP5741442B2 (en) Method for producing liposome
Choi et al. Encapsulation of a bioactive peptide in a formulation of W1/O/W2-type double emulsions: Formation and stability
JP5853453B2 (en) Method for producing liposomes
Eskandari et al. Physical and chemical properties of nano-liposome, application in nano medicine
JP2010222282A (en) Method for producing liposome comprising fixing internal water phase
WO2009142018A1 (en) Method for producing vesicle, vesicle obtained by the production method, and w/o/w emulsion for producing vesicle
Nayak et al. Systems of nanovesicular drug delivery
Zhang et al. Submicron lipid emulsions: a versatile platform for drug delivery
JP5649074B2 (en) Method for producing liposome by two-stage emulsification using nano-sized primary emulsion
JP2011104572A (en) Method for manufacturing liposome and flow manufacturing apparatus
JP5838970B2 (en) Method for producing single-cell liposome by two-stage emulsification method in which water-soluble lipid is added to the inner aqueous phase, and single-cell liposome obtained by the production method
US20160089443A1 (en) Protein-graphene nanocomposite drug carrier
WO2011062255A1 (en) Process for production of liposome through two-stage emulsification using mixed organic solvent as oily phase
JP2019042679A (en) pH-SENSITIVE LIPOSOME
JP2012102043A (en) Method for producing univesicular liposome, univesicular liposome dispersion and dry powder thereof, and method for producing the univesicular liposome dispersion and dry powder thereof
KR20220092106A (en) pH-responsive capsosome using chitosan-coated solid lipid nanoparticles as core
Atanase Nanoemulsions for drug delivery

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20130228

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20130228

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20140422

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20140619

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20141007

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20141105

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 5649074

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

S111 Request for change of ownership or part of ownership

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250