JP5648261B2 - Cancer detection method - Google Patents

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本発明は、新規な癌抗原ポリペプチド、該ポリペプチドに対する抗体、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを発現できる組換えベクター、該ポリヌクレオチドを発現する細胞、及び癌の検出方法に関する。   The present invention relates to a novel cancer antigen polypeptide, an antibody against the polypeptide, a polynucleotide encoding the polypeptide, a recombinant vector capable of expressing the polynucleotide, a cell expressing the polynucleotide, and a method for detecting cancer. .

癌は全死亡原因の第一位を占める疾患であり、現在行われている治療は手術療法を主体に放射線療法と化学療法を組み合わせたものである。近年の新しい手術法の開発や新たな抗癌剤の発見にも関わらず、一部の癌を除いて、癌の治療成績はあまり向上していないのが現状である。近年、分子生物学や癌免疫学の進歩で癌に反応する細胞障害性T細胞により認識される癌抗原や癌抗原をコードする遺伝子が同定されてき、抗原特異性免疫療法への期待が高まっている(非特許文献1を参照)。免疫療法においては、副作用を軽減するため、その抗原として認識されるペプチド又はタンパクは、正常細胞にはほとんど存在せず、癌細胞に特異的に存在していることが必要とされる。1991年、ベルギーLudwig研究所のBoonらは自己癌細胞株と癌反応性T細胞を用いたcDNA発現クローニング法によりCD8陽性T細胞が認識するヒトメラノーマ抗原MAGE1を単離した(非特許文献2を参照)。その後、癌患者の生体内で自己の癌に反応して産生される抗体が認識する腫瘍抗原を遺伝子の発現クローニングの手法を取り入れて同定する、SEREX(serological identifications of antigens by recombinant expression cloning)法が報告され(非特許文献3;特許文献1)、各種癌抗原が単離されてきた(非特許文献4−9を参照)。その一部をターゲットにして癌免疫療法の臨床試験も開始されている。   Cancer is the leading cause of all deaths, and the current treatment is a combination of radiation therapy and chemotherapy, mainly surgery. Despite the recent development of new surgical methods and the discovery of new anti-cancer drugs, the therapeutic results of cancer have not improved much except for some cancers. In recent years, advances in molecular biology and cancer immunology have identified cancer antigens recognized by cytotoxic T cells that respond to cancer and genes encoding cancer antigens, and expectations for antigen-specific immunotherapy have increased. (See Non-Patent Document 1). In immunotherapy, in order to reduce side effects, peptides or proteins that are recognized as antigens are hardly present in normal cells, and are required to be specifically present in cancer cells. In 1991, Boon et al., Ludwig Laboratories, Belgium, isolated human melanoma antigen MAGE1 recognized by CD8 positive T cells by cDNA expression cloning using autologous cancer cell lines and cancer reactive T cells (see Non-Patent Document 2). reference). Subsequently, the SEREX (serological identifications of antigens by recombinant expression cloning) method is used to identify tumor antigens recognized by antibodies produced in response to own cancer in the body of cancer patients by incorporating gene expression cloning techniques. It has been reported (Non-Patent Document 3; Patent Document 1), and various cancer antigens have been isolated (see Non-Patent Documents 4-9). A clinical trial of cancer immunotherapy targeting some of them has also started.

一方、ヒトと同様、イヌやネコにも乳腺腫瘍、扁平上皮癌など多数の腫瘍が知られており、イヌやネコの疾病統計でも上位にランクされている。しかしながらイヌやネコの癌に対する有効な治療薬、予防薬および診断薬は現在のところ存在しない。大部分のイヌやネコの腫瘍は、進行して腫瘤が大きくなってから飼い主が気付くケースがほとんで、来院して外科的手術により切除したり、人体薬(抗癌剤など)を投与しても、すでに手遅れで処置後まもなく死亡することが多い。このような現状の中で、イヌやネコに有効な癌の治療薬、予防薬および診断薬が入手可能になれば、イヌの癌に対する用途が開かれると期待される。   On the other hand, as in humans, dogs and cats are known to have a large number of tumors such as breast tumors and squamous cell carcinomas, and are ranked high in the disease statistics of dogs and cats. However, there are currently no effective therapeutic, prophylactic and diagnostic agents for canine and feline cancer. Most dogs and cats have a tumor that has progressed to a larger mass, and the owner notices it. If you come to the hospital and have it removed by surgery, or if you are given a human medicine (such as an anticancer drug) Already too late to die soon after treatment. Under such circumstances, if cancer therapeutic agents, preventive agents and diagnostic agents effective for dogs and cats become available, it is expected that the use for canine cancer will be opened.

米国特許第5698396号US Pat. No. 5,698,396 秋吉毅,「癌と化学療法」、1997年、第24巻、p551-519Satoshi Akiyoshi, “Cancer and Chemotherapy”, 1997, Vol. 24, p551-519 Bruggen P. et al., Science, 254:1643-1647(1991)Bruggen P. et al., Science, 254: 1643-1647 (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:11810-11813(1995)Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 11810-11813 (1995) Int.J.Cancer,72:965-971(1997)Int. J. Cancer, 72: 965-971 (1997) Cancer Res., 58:1034-1041(1998)Cancer Res., 58: 1034-1041 (1998) Int.J.Cancer,29:652-658(1998)Int. J. Cancer, 29: 652-658 (1998) Int.J.Oncol.,14:703-708(1999)Int.J.Oncol., 14: 703-708 (1999) Cancer Res., 56:4766-4772(1996)Cancer Res., 56: 4766-4772 (1996) Hum. Mol. Genet6:33-39, 1997Hum. Mol. Genet 6: 33-39, 1997

本発明の目的は、癌の診断に有用な新規ポリペプチド及び新規ポリヌクレオチド、該新規ポリペプチドに対する抗体、該新規ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを発現できる組換えベクター、該ポリヌクレオチドを発現する細胞、並びに癌の検出方法を提供することである。   An object of the present invention is to provide a novel polypeptide and a novel polynucleotide useful for cancer diagnosis, an antibody against the novel polypeptide, a polynucleotide encoding the novel polypeptide, a recombinant vector capable of expressing the polynucleotide, and the polynucleotide And a method for detecting cancer.

本願発明者らは、鋭意研究の結果、イヌ精巣由来cDNAライブラリーと担癌犬の血清を用いたSEREX法により、担癌生体由来の血清中に存在する抗体と結合するタンパク質をコードするcDNAを取得し、そのcDNAを基にして、配列番号2で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを作製した。そして、該タンパク質をコードする遺伝子が精巣と癌組織に特異的に発現すること、及び、該タンパク質が担癌生体中の血清とのみ特異的に反応することを見出し、このため、該遺伝子及び該タンパク質が癌の診断に有用であることを見出し、本発明を完成した。   As a result of diligent research, the inventors of the present application have obtained a cDNA encoding a protein that binds to an antibody present in serum derived from a cancer-bearing organism by the SEREX method using a dog testis-derived cDNA library and the serum of a cancer-bearing dog. Obtained and based on the cDNA, a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 was produced. Then, it was found that a gene encoding the protein is specifically expressed in the testis and cancer tissue, and that the protein specifically reacts only with serum in the cancer-bearing living body. The present inventors have found that the protein is useful for cancer diagnosis and completed the present invention.

すなわち、本発明は、癌(ただし、肺癌を除く。)であるか否かを検出すべき患者から得た試料における、配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと抗原抗体反応する抗体を測定することを含む、癌の検出方法を提供する。さらに、本発明は、配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと抗原抗体反応する抗体又は抗原結合性断片を含む癌(ただし、肺癌を除く。)の検出剤を提供する。さらに、本発明は、配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を含む癌(ただし、肺癌を除く。)の診断剤を提供する。さらに、本発明は、癌(ただし、肺癌を除く。)であるか否かを検出すべき患者から得た試料における、配列番号2に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドと抗原抗体反応するポリクローナル抗体の対応抗原又はそれをコードする遺伝子の発現量を調べることを含む、癌の検出方法を提供する。さらに、本発明は、癌(ただし、肺癌を除く。)であるか否かを検出すべき患者から得た試料における、配列番号2に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド又はそれをコードする遺伝子の発現量を調べることを含む、癌の検出方法を提供する。 That is, the present invention provides an antibody that undergoes an antigen-antibody reaction with a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in a sample obtained from a patient to be detected whether it is cancer (however, excluding lung cancer). A method for detecting cancer, comprising measuring, is provided . Et al is, the present invention provides a detection agent for cancer comprising the antibody or antigen-binding fragment polypeptide with antigen-antibody reaction with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (except for lung cancer.) To do. Furthermore, the present invention provides a diagnostic agent for cancer (excluding lung cancer) comprising an antibody or an antigen-binding fragment thereof that reacts with an antigen with an antibody having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing . . Furthermore, the present invention relates to a polyclonal antibody that undergoes an antigen-antibody reaction with a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in a sample obtained from a patient to be detected whether or not it is cancer (excluding lung cancer). Provided is a method for detecting cancer, which comprises examining the expression level of a corresponding antigen or a gene encoding the same. Furthermore, the present invention relates to expression of a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a gene encoding the same in a sample obtained from a patient to be detected whether it is cancer (however, excluding lung cancer). A method for detecting cancer is provided that comprises examining the amount.

本発明により、癌の診断に有用な新規癌抗原ポリペプチドが提供された。下記実施例において具体的に示されるように、本発明のポリペプチドは、癌患者の血清中に有意に多く存在するポリクローナル抗体と反応する。従って、本発明のポリペプチドを用いて免疫測定を行うことにより、癌を検出することができる。また、下記実施例にある通り、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子は、癌細胞と精巣細胞に特異的に発現する。従って、本発明のポリヌクレオチドをプローブ又はプライマーとして用いることによっても、癌の検出が可能である。   The present invention provides a novel cancer antigen polypeptide useful for cancer diagnosis. As specifically shown in the Examples below, the polypeptide of the present invention reacts with a polyclonal antibody that is significantly present in the serum of cancer patients. Therefore, cancer can be detected by performing an immunoassay using the polypeptide of the present invention. In addition, as shown in the following Examples, the gene encoding the polypeptide of the present invention is specifically expressed in cancer cells and testis cells. Therefore, cancer can also be detected by using the polynucleotide of the present invention as a probe or primer.

本発明が開示する配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列は、イヌ精巣由来cDNAライブラリーと担癌犬の血清を用いたSEREX法により、担癌犬由来の血清中に特異的に存在する抗体と結合するポリペプチドとして単離された、新規なポリペプチドのアミノ酸配列である(実施例1参照)。従って、例えば配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド(以下、「配列番号2のポリペプチド」と略記することがある)は、前記抗体を免疫測定するための抗原として用いることができ、癌の検出に有用である。なお、本発明において、「アミノ酸配列を有する」又は「塩基配列を有する」とは、アミノ酸残基又は塩基がそのような順序で配列しているという意味である。従って、例えば、「配列番号3で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド」とは、aattaaccct cactaaagggの塩基配列を持つ20塩基のサイズのポリヌクレオチドを意味する。また、例えば、「配列番号3で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド」を「配列番号3のポリヌクレオチド」と略記することがある。「アミノ酸配列を有する」という表現についても同様である。   The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 of the sequence listing disclosed by the present invention is specifically present in serum derived from a cancer-bearing dog by the SEREX method using a dog testis-derived cDNA library and the serum of the cancer-bearing dog. It is the amino acid sequence of a novel polypeptide isolated as a polypeptide that binds to an antibody (see Example 1). Therefore, for example, a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (hereinafter sometimes abbreviated as “polypeptide of SEQ ID NO: 2”) can be used as an antigen for immunoassay of the antibody, Useful for cancer detection. In the present invention, “having an amino acid sequence” or “having a base sequence” means that amino acid residues or bases are arranged in such an order. Therefore, for example, the “polynucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 3” means a 20-base size polynucleotide having the base sequence of aattaaccct cactaaaggg. Further, for example, “polynucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 3” may be abbreviated as “polynucleotide of SEQ ID NO: 3”. The same applies to the expression “having an amino acid sequence”.

通常、タンパク質等のような、複雑な構造をとる分子量の大きい抗原物質の場合、分子上に構造の異なる複数の部位が存在している。従って、生体内では、そのような抗原物質に対し、複数の部位をそれぞれ認識して結合する複数種類の抗体が生産される。すなわち、生体内でタンパク質等の抗原物質に対して生産される抗体は、複数種類の抗体の混合物であるポリクローナル抗体である。本願発明者らが見出した、担癌生体由来の血清中に特異的に存在する、配列番号2のポリペプチドと抗原抗体反応により特異的に結合する抗体もまた、ポリクローナル抗体である。なお、本発明において「ポリクローナル抗体」といった場合には、抗原物質を体内に含む生体由来の血清中に含まれる、該抗原物質に対する抗体を指す。下記実施例では、該抗体の血清中存在量を免疫測定するための抗原として、配列番号2の27番アミノ酸から206番アミノ酸までの領域から成るポリペプチドを調製し、このポリペプチドと担癌生体由来の血清中の前記抗体との反応性を確認している。しかしながら、前記抗体はポリクローナル抗体であるから、配列番号2の全長から成るポリペプチドであれば当然結合するし、また、該ポリペプチドの断片であっても、前記ポリクローナル抗体中にはその断片の構造を認識する抗体が含まれ得るため、やはり担癌生体由来の血清中に含まれる前記抗体と結合できる。すなわち、配列番号2の全長から成るポリペプチドであっても、その断片であっても、同様に担癌生体血清中に特異的に含まれる前記ポリクローナル抗体の測定に用いることができ、癌の検出に有用である。従って、本発明のポリペプチドは、配列番号2の全長から成るポリペプチドのみに限定されず、配列番号2のアミノ酸配列中の連続する7個以上、好ましくは連続する10個以上のアミノ酸から成るポリペプチドであって、配列番号2のポリペプチドに対するポリクローナル抗体と特異的に反応するポリペプチドが本発明の範囲に含まれる。なお、約7アミノ酸残基以上のポリペプチドであれば抗原性を発揮することがこの分野において知られている。ただし、アミノ酸残基の数があまりに少ないと他のタンパク質とも交叉反応する可能性が高くなるので、免疫測定の抗原として用いる場合には、測定精度を高めるため、アミノ酸残基の数は好ましくは30以上、さらに好ましくは50以上、さらに好ましくは100以上とする。   Usually, in the case of an antigenic substance having a complex structure such as a protein having a large molecular weight, there are a plurality of sites having different structures on the molecule. Accordingly, in vivo, a plurality of types of antibodies that recognize and bind to a plurality of sites are produced for such antigenic substances. That is, an antibody produced in vivo against an antigenic substance such as a protein is a polyclonal antibody that is a mixture of a plurality of types of antibodies. The antibody specifically found in the serum derived from a cancer-bearing organism found by the inventors of the present application and specifically binding to the polypeptide of SEQ ID NO: 2 by an antigen-antibody reaction is also a polyclonal antibody. In the present invention, “polyclonal antibody” refers to an antibody against the antigenic substance contained in serum derived from a living body containing the antigenic substance in the body. In the following examples, a polypeptide consisting of the region from amino acid 27 to amino acid 206 of SEQ ID NO: 2 was prepared as an antigen for immunoassay of the abundance of the antibody in serum. The reactivity with the antibody in the serum derived from the serum has been confirmed. However, since the antibody is a polyclonal antibody, it naturally binds if it is a polypeptide consisting of the full length of SEQ ID NO: 2, and even if it is a fragment of the polypeptide, the structure of the fragment is contained in the polyclonal antibody. Since the antibody which recognizes can be contained, it can be combined with the antibody contained in the serum derived from a cancer-bearing organism. That is, whether it is a polypeptide consisting of the full length of SEQ ID NO: 2 or a fragment thereof, it can be used for measurement of the polyclonal antibody specifically contained in the serum of cancer-bearing living body, and detection of cancer. Useful for. Therefore, the polypeptide of the present invention is not limited only to the polypeptide consisting of the full length of SEQ ID NO: 2, but is a polypeptide consisting of 7 or more, preferably 10 or more consecutive amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. A polypeptide that specifically reacts with a polyclonal antibody against the polypeptide of SEQ ID NO: 2 is included in the scope of the present invention. In addition, it is known in this field that a polypeptide having about 7 amino acid residues or more exhibits antigenicity. However, if the number of amino acid residues is too small, the possibility of cross-reacting with other proteins increases. Therefore, when used as an antigen for immunoassay, the number of amino acid residues is preferably 30 in order to increase measurement accuracy. As mentioned above, More preferably, it is 50 or more, More preferably, you may be 100 or more.

一般に、タンパク質抗原において、該タンパク質のアミノ酸配列のうち少数のアミノ酸残基が置換され、欠失され又は挿入された場合であっても、元のタンパク質とほぼ同じ抗原性を有している場合があることは当業者において広く知られている。従って、配列番号2のアミノ酸配列のうち少数のアミノ酸残基が置換され、欠失され、及び/又は挿入された配列を有するポリペプチドであって、配列番号2の配列と80%以上、さらに好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上の相同性を有し、かつ、配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに対するポリクローナル抗体と抗原抗体反応により特異的に結合するポリペプチド(以下、便宜的に「特異反応性修飾ポリペプチド」ということがある)も、上記本発明のポリペプチドと同様に癌の検出に用いることができ、本発明の範囲に含まれる。好ましくは、該特異反応性修飾ポリペプチドは、配列番号1のポリペプチドにおいて1ないし数個のアミノ酸残基が置換され、欠失され、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を有する。ここで、アミノ酸配列の「相同性」とは、両者のアミノ酸配列残基ができるだけ多く一致するように(必要ならばギャップを挿入する)両アミノ酸配列を整列させ、一致したアミノ酸残基数を、全アミノ酸残基数(両者の配列で全アミノ酸残基数が異なる場合には長い方の配列の全アミノ酸残基数)で除したものを百分率で表したものであり、BLASTのような周知のソフトにより容易に算出することができる。なお、天然のタンパク質を構成する20種類のアミノ酸は、低極性側鎖を有する中性アミノ酸(Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro)、親水性側鎖を有する中性アミノ酸(Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr, Cys)、酸性アミノ酸(Asp, Glu)、塩基性アミノ酸(Arg, Lys, His)、芳香族アミノ酸(Phe, Tyr, Trp)のように類似の性質を有するものにグループ分けでき、これらの間での置換であればポリペプチドの性質が変化しないことが多いことが知られている。従って、配列番号2のポリペプチド中のアミノ酸残基を置換する場合には、これらの各グループの間で置換することにより、対応抗体との結合性を維持できる可能性が高くなる。 In general, a protein antigen may have almost the same antigenicity as the original protein even if a small number of amino acid residues in the amino acid sequence of the protein are substituted, deleted or inserted. It is well known to those skilled in the art. Therefore, a polypeptide having a sequence in which a small number of amino acid residues in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 have been substituted, deleted, and / or inserted, and more preferably 80% or more of the sequence of SEQ ID NO: 2. Is a polypeptide that specifically binds to a polyclonal antibody against a polypeptide having a homology of 90% or more, more preferably 95% or more and having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 by antigen-antibody reaction (hereinafter, For the sake of convenience, it may also be referred to as “specific reactive modified polypeptide”), and can be used for detection of cancer in the same manner as the polypeptide of the present invention, and is included in the scope of the present invention. Preferably, the specific reactivity-modified polypeptide has an amino acid sequence in which one to several amino acid residues are substituted, deleted, and / or inserted in the polypeptide of SEQ ID NO: 1. Here, the “homology” of amino acid sequences means that both amino acid sequences are aligned so that as many amino acid sequence residues as possible match (insert a gap if necessary), and the number of matched amino acid residues is This is a percentage expressed by dividing the total number of amino acid residues (the total number of amino acid residues in the longer sequence when the total number of amino acid residues differs between the two sequences). It can be easily calculated by software. The 20 amino acids constituting the natural protein are neutral amino acids having low side chains (Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro), and neutral amino acids having hydrophilic side chains (Asn , Gln, Thr, Ser, Tyr, Cys), acidic amino acids (Asp, Glu), basic amino acids (Arg, Lys, His), aromatic amino acids (Phe, Tyr, Trp) It is known that the properties of a polypeptide often do not change if substitution is made between these groups. Therefore, when the amino acid residue in the polypeptide of SEQ ID NO: 2 is substituted, the possibility of maintaining the binding property with the corresponding antibody is increased by substitution between these groups.

上記した本発明のポリペプチドを部分配列として含み(すなわち、本発明のポリペプチドの一端又は両端に他の(ポリ)ペプチドが付加されたもの)、かつ、配列番号2のポリペプチドに対するポリクローナル抗体と抗原抗体反応により特異的に結合するポリペプチド(以下、便宜的に「特異反応性付加ポリペプチド」ということがある)も、上記本発明のポリペプチドと同様に癌の検出に用いることができ、本発明の範囲に含まれる。   A polyclonal antibody against the polypeptide of SEQ ID NO: 2 comprising the above-described polypeptide of the present invention as a partial sequence (that is, one having both ends of the polypeptide of the present invention added with another (poly) peptide); A polypeptide that specifically binds by an antigen-antibody reaction (hereinafter, sometimes referred to as a “specific reactive addition polypeptide” for convenience) can also be used for detection of cancer in the same manner as the polypeptide of the present invention, It is included in the scope of the present invention.

上記した本発明のポリペプチドは、例えば、Fmoc法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、tBoc法(t−ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法に従って合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して常法により合成することもできる。また、公知の遺伝子工学的手法を用いて容易に調製することができる。例えば、配列番号2のポリペプチドをコードする遺伝子を発現している組織から抽出したRNAから、該遺伝子のcDNAをRT−PCRにより調製し、該cDNAの全長又は所望の一部を発現ベクターに組み込んで、宿主細胞中に導入し、目的とするペプチドを得ることができる。RNAの抽出、RT−PCR、ベクターへのcDNAの組み込み、ベクターの宿主細胞への導入は、例えば以下に記載するとおり、周知の方法により行なうことができる。また、用いるベクターや宿主細胞も周知であり、種々のものが市販されている。   The above-described polypeptide of the present invention can be synthesized according to a chemical synthesis method such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method). Moreover, it can also synthesize | combine by a conventional method using various commercially available peptide synthesizers. Moreover, it can prepare easily using a well-known genetic engineering method. For example, from the RNA extracted from the tissue expressing the gene encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 2, cDNA of the gene is prepared by RT-PCR, and the full length or a desired part of the cDNA is incorporated into an expression vector. Thus, the desired peptide can be obtained by introducing it into a host cell. Extraction of RNA, RT-PCR, incorporation of cDNA into a vector, and introduction of a vector into a host cell can be performed by well-known methods, for example, as described below. Further, vectors and host cells to be used are well known, and various types are commercially available.

上記宿主細胞としては、本発明のポリペプチドを発現可能な細胞であればいかなるものであってもよく、原核細胞の例としては大腸菌など、真核細胞の例としてはサル腎臓細胞COS 1、チャイニーズハムスター卵巣細胞CHO等の哺乳動物培養細胞、出芽酵母、***酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが挙げられる。   The host cell may be any cell that can express the polypeptide of the present invention. Examples of prokaryotic cells include Escherichia coli. Examples of eukaryotic cells include monkey kidney cell COS 1 and Chinese. Examples include mammalian cultured cells such as hamster ovary cells CHO, budding yeast, fission yeast, silkworm cells, and Xenopus egg cells.

宿主細胞として原核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、原核細胞中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、DNAクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターを用いる。大腸菌用発現ベクターとしては、pUC系、pBluescriptII、pET発現システム、pGEX発現システムなどが例示できる。本発明のポリペプチドをコードするDNAをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで原核宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、前記DNAがコードしている本発明のポリペプチドを原核宿主細胞中で発現させることができる。この際、本発明のポリペプチドを、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることもできる。なお、本発明のポリペプチドをコードするDNAは、例えば上記したようにRT-PCRによりcDNAを調製して得ることができ、また後述するように市販の核酸合成機を用いて常法により合成することもできる。該cDNAの塩基配列は配列表の配列番号1に示されている。   When a prokaryotic cell is used as a host cell, an expression vector having an origin, a promoter, a ribosome binding site, a DNA cloning site, a terminator and the like that can replicate in the prokaryotic cell is used as the expression vector. Examples of the expression vector for E. coli include pUC system, pBluescriptII, pET expression system, pGEX expression system and the like. When the DNA encoding the polypeptide of the present invention is incorporated into such an expression vector, a prokaryotic host cell is transformed with the vector, and the resulting transformant is cultured, the present invention encoded by the DNA Of the polypeptide can be expressed in prokaryotic host cells. At this time, the polypeptide of the present invention can be expressed as a fusion protein with another protein. The DNA encoding the polypeptide of the present invention can be obtained, for example, by preparing cDNA by RT-PCR as described above, and is synthesized by a conventional method using a commercially available nucleic acid synthesizer as described later. You can also. The base sequence of the cDNA is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.

宿主細胞として真核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、プロモーター、スプライシング領域、ポリ(A)付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターを用いる。そのような発現ベクターとしては、pKA1、pCDM8、pSVK3、pMSG、pSVL、pBK-CMV、pBK-RSV、EBVベクター、pRS、pcDNA3、pMSG、pYES2等が例示できる。上記と同様に、本発明のポリペプチドをコードするDNAをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで真核宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、前記DNAがコードしている本発明のポリペプチドを真核宿主細胞中で発現させることができる。発現ベクターとしてpIND/V5-His、pFLAG-CMV-2、pEGFP-N1、pEGFP-C1等を用いた場合には、Hisタグ、FLAGタグ、mycタグ、HAタグ、GFPなど各種タグを付加した融合タンパク質として、本発明のポリペプチドを発現させることができる。   When a eukaryotic cell is used as a host cell, an expression vector for a eukaryotic cell having a promoter, a splicing region, a poly (A) addition site and the like is used as an expression vector. Examples of such expression vectors include pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV vector, pRS, pcDNA3, pMSG, pYES2, and the like. In the same manner as described above, a DNA encoding the polypeptide of the present invention is incorporated into such an expression vector, and after transforming a eukaryotic host cell with the vector, the resulting transformant is cultured, and the DNA is obtained. Encoding polypeptides of the invention can be expressed in eukaryotic host cells. When pIND / V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1, etc. are used as an expression vector, fusion with various tags such as His tag, FLAG tag, myc tag, HA tag, GFP The polypeptide of the present invention can be expressed as a protein.

発現ベクターの宿主細胞への導入は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、DEAEデキストラン法等の周知の方法を用いることができる。   For introducing the expression vector into the host cell, a well-known method such as electroporation, calcium phosphate method, liposome method, DEAE dextran method or the like can be used.

宿主細胞から目的のポリペプチドを単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒分別沈殿法、透析、遠心分離、限外ろ過、ゲルろ過、SDS-PAGE、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、等が挙げられる。   Isolation and purification of the polypeptide of interest from the host cell can be performed by combining known separation operations. For example, treatment with denaturing agents and surfactants such as urea, ultrasonic treatment, enzyme digestion, salting out and solvent fractional precipitation, dialysis, centrifugation, ultrafiltration, gel filtration, SDS-PAGE, isoelectric focusing, Examples include ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, affinity chromatography, reverse phase chromatography, and the like.

以上の方法によって得られるポリペプチドには、他の任意のタンパク質との融合タンパク質の形態にあるものも含まれる。例えば、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)やHisタグとの融合タンパク質などが例示できる。このような融合タンパク質の形態のポリペプチドも、上記した特異反応性付加ポリペプチドとして本発明の範囲に含まれる。さらに、形質転換細胞で発現されたポリペプチドは、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。このような翻訳後修飾されたポリペプチドも、配列番号2のポリペプチドに対するポリクローナル抗体との結合性を有する限り、本発明の範囲に含まれる。この様な翻訳修飾としては、N末端メチオニンの脱離、N末端アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテアーゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化などが例示できる。   Polypeptides obtained by the above methods include those in the form of fusion proteins with other arbitrary proteins. For example, glutathione-S-transferase (GST), a fusion protein with a His tag, and the like can be exemplified. Such a polypeptide in the form of a fusion protein is also included in the scope of the present invention as the above-mentioned specific reactive addition polypeptide. Furthermore, the polypeptide expressed in the transformed cell may be subjected to various modifications in the cell after being translated. Such a post-translationally modified polypeptide is also included in the scope of the present invention as long as it has binding ability with a polyclonal antibody against the polypeptide of SEQ ID NO: 2. Examples of such translation modification include elimination of N-terminal methionine, N-terminal acetylation, sugar chain addition, limited degradation by intracellular protease, myristoylation, isoprenylation, phosphorylation, and the like.

下記実施例に具体的に記載される通り、担癌生体由来の血清試料中には、配列番号2のポリペプチドと抗原抗体反応により結合する抗体が、健常生体由来の血清試料中よりも有意に多く存在している。従って、患者から得た試料における該抗体を測定することにより、癌を検出することができる。例えば、該抗体の存在量を調べ、これを健常生体から得た試料における存在量と比較することにより、該患者が癌であるか否かを調べることができる。すなわち、本発明は、癌であるか否かを検出すべき患者から得た試料における、配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと抗原抗体反応する抗体を測定することを含む癌の検出方法を提供する。なお、健常生体から得た試料における存在量は、多数の健常生体について測定して正常値を定めておけば、該正常値と、測定値を比較することにより癌の検出を行なうことができる。   As specifically described in the Examples below, in a serum sample derived from a cancer-bearing organism, an antibody that binds to the polypeptide of SEQ ID NO: 2 by an antigen-antibody reaction is significantly more significant than in a serum sample derived from a healthy organism. There are many. Therefore, cancer can be detected by measuring the antibody in a sample obtained from a patient. For example, it can be determined whether or not the patient has cancer by examining the abundance of the antibody and comparing it with the abundance in a sample obtained from a healthy organism. That is, the present invention relates to detection of a cancer comprising measuring an antibody that antigen-antibody reacts with a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in a sample obtained from a patient to be detected whether or not it is cancer. Provide a method. In addition, if the abundance in the sample obtained from a healthy living body is measured for a number of healthy living bodies and a normal value is determined, cancer can be detected by comparing the normal value with the measured value.

また、癌を罹患していることが分かっている多数の患者から試料を得て、癌患者における抗体量の基準値(異常値)を定め、正常値及び異常値の両者と比較を行なってもよい。測定した抗体量が正常値より有意に高く、異常値に近ければ、その患者は癌である可能性が高いと考えられる。上記した通り、正常値との比較のみでも癌の検出は可能であるが、異常値との比較も行うことにより、さらに検出精度を高めることができる。また、既に知られている癌マーカーによる診断と組み合わせて、検出精度をさらに高めることができる。なお、異常値及び正常値は、例えば、各試料における抗体量を数値化し、その平均値を算出することによって定めることができる。異常値についても、正常値と同様、一旦定めておけばそれ以後はその異常値を比較に用いることができる。抗体の存在量は、該抗体に結合する抗原を用いた免疫測定により調べることができる。その際の抗原としては、上記本発明のポリペプチドを好ましく用いることができる。   It is also possible to obtain samples from a large number of patients who are known to suffer from cancer, determine a reference value (abnormal value) for the amount of antibody in cancer patients, and compare it with both normal and abnormal values. Good. If the measured antibody amount is significantly higher than the normal value and close to the abnormal value, the patient is considered likely to have cancer. As described above, cancer can be detected only by comparison with normal values, but detection accuracy can be further improved by performing comparison with abnormal values. In addition, the detection accuracy can be further increased in combination with a diagnosis using a known cancer marker. The abnormal value and the normal value can be determined by, for example, converting the antibody amount in each sample into a numerical value and calculating the average value. Regarding the abnormal value, like the normal value, once it is determined, the abnormal value can be used for comparison thereafter. The abundance of the antibody can be examined by immunoassay using an antigen that binds to the antibody. As the antigen in that case, the polypeptide of the present invention can be preferably used.

この分野で周知の通り、抗体には交差反応性があり、実際に免疫原となった抗原物質以外の分子であっても、分子上に免疫原のエピトープと類似した構造が存在すれば、その分子は免疫原に対して誘導された抗体と抗原抗体反応により結合し得る。そのため、本発明のポリペプチドは、イヌ以外の担癌生体内で特異的に誘導されている抗体とも抗原抗体反応により結合し得る。実際に、下記実施例に記載される通り、本発明のポリペプチドは、担癌ネコ血清中に特異的に含まれる抗体とも抗原抗体反応でき、健常ネコ血清とは反応しない。また、本発明のポリペプチドは、健常ヒト血清とも反応しない。従って、本発明のポリペプチドを抗原として用いて、該ポリペプチドと抗原抗体反応する試料中の抗体を測定することにより、イヌの癌のみならず、ネコ及びヒト等のイヌ以外の哺乳動物の癌も検出し得る。   As is well known in the art, antibodies are cross-reactive, and even molecules other than the antigenic substance that actually became the immunogen can be used as long as there is a structure similar to the epitope of the immunogen on the molecule. Molecules can bind to antibodies induced against the immunogen by an antigen-antibody reaction. Therefore, the polypeptide of the present invention can bind to an antibody specifically induced in a cancer-bearing living body other than a dog by an antigen-antibody reaction. Actually, as described in the following Examples, the polypeptide of the present invention can react with an antibody specifically contained in a tumor-bearing feline serum and does not react with a healthy feline serum. In addition, the polypeptide of the present invention does not react with healthy human serum. Accordingly, by using the polypeptide of the present invention as an antigen and measuring the antibody in a sample that reacts with the polypeptide for antigen-antibody, not only cancer of dogs but also cancer of mammals other than dogs such as cats and humans. Can also be detected.

免疫測定自体はこの分野において周知であり、反応様式で分類すると、サンドイッチ法、競合法、凝集法、ウェスタンブロット法等がある。また、標識で分類すると、放射免疫測定、蛍光免疫測定、酵素免疫測定、ビオチン免疫測定等があり、いずれの方法を用いても上記抗体の免疫測定を行うことができる。特に限定されないが、サンドイッチELISAや凝集法は、操作が簡便で大掛かりな装置等を必要としないため、上記抗体の免疫測定方法として好ましく適用することができる。抗体の標識として酵素を用いる場合、酵素としては、ターンオーバー数が大であること、抗体と結合させても安定であること、基質を特異的に着色させる等の条件を満たす物であれば特段の制限はなく、通常の酵素免疫測定法に用いられる酵素、例えば、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコース−6−リン酸化脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素等を用いることもできる。また、酵素阻害物質や補酵素等を用いることもできる。これら酵素と抗体との結合は、マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法によって行うことができる。基質としては、使用する酵素の種類に応じて公知の物質を使用することができる。例えば酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、3,3',5,5'−テトラメチルベンジシンを、また酵素としてはアルカリフォスファターゼを用いる場合には、パラニトルフェノール等を用いることができる。放射性同位体としては125Iや3H等の通常ラジオイムノアッセイで用いられている物を使用することができる。蛍光色素としては、フルオロレッセンスイソチオシアネート(FITC)やテトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)等の通常の蛍光抗体法に用いられる物を使用することができる。 Immunoassays themselves are well known in this field, and classified by reaction mode include sandwich method, competition method, agglutination method, Western blot method and the like. In addition, classification by label includes radioimmunoassay, fluorescent immunoassay, enzyme immunoassay, biotin immunoassay, and the like, and any method can be used to perform immunoassay of the antibody. Although not particularly limited, the sandwich ELISA and the agglutination method can be preferably applied as an immunoassay method for the above-mentioned antibody because it is easy to operate and does not require a large-scale apparatus. When an enzyme is used as a label for an antibody, the enzyme is not particularly limited as long as it satisfies conditions such as a large turnover number, stability even when bound to an antibody, and specific coloring of a substrate. There are no restrictions, such as peroxidase, β-galactosidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase, acetylcholinesterase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, malate dehydrogenase, etc. It can also be used. Moreover, an enzyme inhibitor, a coenzyme, etc. can also be used. These enzymes and antibodies can be bound by a known method using a crosslinking agent such as a maleimide compound. As the substrate, a known substance can be used according to the type of enzyme used. For example, when peroxidase is used as the enzyme, 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine can be used, and when alkaline phosphatase is used as the enzyme, paranitrolphenol or the like can be used. As the radioisotope, those usually used in radioimmunoassay such as 125 I and 3 H can be used. As the fluorescent dye, those used in usual fluorescent antibody methods such as fluoroless isothiocyanate (FITC) and tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) can be used.

なお、これらの免疫測定法自体は周知であり、本明細書で説明する必要はないが、簡単に記載すると、例えば、サンドイッチ法では、本発明のポリペプチドを固相に不動化し、血清等の試料と反応させ、洗浄後、適当な二次抗体を反応させ、洗浄後、固相に結合した二次抗体を測定する。本発明のポリペプチドを固相に不動化することにより、未結合の二次抗体を容易に除去することができるため、上記した本発明の癌の検出方法の態様として好ましい。二次抗体としては、例えば試料がイヌ由来であれば、抗イヌIgG抗体を用いることができる。二次抗体を上記に例示した標識物質で標識しておくことにより、固相に結合した二次抗体を測定することができる。こうして測定した二次抗体量が血清試料中の上記抗体量に相当する。標識物質として酵素を用いる場合には、酵素作用によって分解して発色する基質を加え、基質の分解量を光学的に測定することによって抗体量を測定できる。標識物質として放射性同位体を用いる場合には、放射性同位体の発する放射線量をシンチレーションカウンター等により測定することができる。   These immunoassays themselves are well known and need not be described in the present specification. However, briefly described, for example, in the sandwich method, the polypeptide of the present invention is immobilized on a solid phase, such as serum. After reacting with the sample and washing, an appropriate secondary antibody is reacted. After washing, the secondary antibody bound to the solid phase is measured. Since the unbound secondary antibody can be easily removed by immobilizing the polypeptide of the present invention on a solid phase, it is preferable as an embodiment of the cancer detection method of the present invention described above. As the secondary antibody, for example, if the sample is derived from a dog, an anti-dog IgG antibody can be used. By labeling the secondary antibody with the labeling substance exemplified above, the secondary antibody bound to the solid phase can be measured. The amount of secondary antibody measured in this way corresponds to the amount of antibody in the serum sample. When an enzyme is used as the labeling substance, the amount of antibody can be measured by adding a substrate that develops color by decomposition by enzymatic action and optically measuring the amount of degradation of the substrate. When a radioisotope is used as the labeling substance, the radiation dose emitted by the radioisotope can be measured with a scintillation counter or the like.

上記した癌の検出方法に供する試料としては、血液、血清、血漿等の体液、癌組織が挙げられ、中でも血清が好ましい。   Examples of the sample to be used for the above-described cancer detection method include blood, serum, plasma and other body fluids, and cancer tissue. Among them, serum is preferable.

本発明の癌の検出方法の対象となる癌としては、配列番号2のポリペプチドをコードする遺伝子を発現している癌であり、脳腫瘍、頭、首、子宮又は食道の扁平上皮癌、メラノーマ、乳または子宮の腺癌、腎癌等を挙げることができるがこれらに限定されない。また、対象となる動物は、哺乳動物であり、特にイヌやネコ、ヒトが好ましい。

The subject to cancer The method for detecting cancer of the present invention, a cancer expressing a gene encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 2, brain, head, neck, uterine or esophageal squamous cell carcinoma, melanoma Examples include, but are not limited to , breast or uterine adenocarcinoma, renal cancer and the like. The target animal is a mammal, and dogs, cats, and humans are particularly preferable.

上記した本発明のポリペプチドと、抗原提示細胞とをインビトロで接触させることにより、該ポリペプチドを抗原提示細胞に提示させることができる。すなわち、本発明のポリペプチドは、抗原提示細胞の処理剤として利用し得る。この場合、本発明のポリペプチドは、特に限定されないが、好ましくは約30アミノ酸残基以下、より好ましくは10〜30アミノ酸残基のサイズで用いる。ここで、抗原提示細胞としては、HLAクラスI分子を保有する樹状細胞又はB細胞を好ましく用いることができる。種々のHLAクラスI分子が同定されており、周知である。HLAクラスI分子としては、HLA-A、HLA-B、HLA-Cを挙げることができ、より具体的には、HLA-A1, HLA-A0201, HLA-A0204, HLA-A0205, HLA-A0206, HLA-A0207, HLA-A11, HLA-A24, HLA-A31, HLA-A6801, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B2705, HLA-B37, HLA-Cw0401, HLA-Cw0602などを挙げることができる。   By contacting the above-described polypeptide of the present invention with an antigen-presenting cell in vitro, the polypeptide can be presented to the antigen-presenting cell. That is, the polypeptide of the present invention can be used as a treatment agent for antigen-presenting cells. In this case, the polypeptide of the present invention is not particularly limited, but preferably has a size of about 30 amino acid residues or less, more preferably 10 to 30 amino acid residues. Here, as the antigen-presenting cell, a dendritic cell or a B cell possessing an HLA class I molecule can be preferably used. Various HLA class I molecules have been identified and are well known. Examples of HLA class I molecules include HLA-A, HLA-B, and HLA-C. More specifically, HLA-A1, HLA-A0201, HLA-A0204, HLA-A0205, HLA-A0206, HLA-A0207, HLA-A11, HLA-A24, HLA-A31, HLA-A6801, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B2705, HLA-B37, HLA-Cw0401, HLA-Cw0602 and the like.

HLAクラスI分子を保有する樹状細胞又はB細胞は、周知の方法により末梢血から調製することができる。例えば、骨髄、臍帯血あるいは患者末梢血から、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)とIL-3(あるいはIL-4)を用いて樹状細胞を誘導し、その培養系に腫瘍関連ペプチドを加えることにより、腫瘍特異的な樹状細胞を誘導することができる。この樹状細胞を有効量投与することで、癌の治療に望ましい応答を誘導できる。用いる細胞は、健康人から提供された骨髄や臍帯血、患者本人の骨髄や末梢血等を用いることができるが、患者本来の自家細胞を使う場合は、安全性が高く、重篤な副作用を回避することも期待できる。末梢血または骨髄は新鮮試料、低温保存試料及び凍結保存試料のいずれでもよい。末梢血は、全血を培養してもよいし、白血球成分だけを分離して培養してもよいが、後者の方が効率的で好ましい。さらに白血球成分の中でも単核球を分離してもよい。また、骨髄や臍帯血を起源とする場合には、骨髄を構成する細胞全体を培養してもよいし、これから単核球を分離して培養してもよい。末梢血やその白血球成分、骨髄細胞には、樹状細胞の起源となる単核球、造血幹細胞又は未成熟樹状細胞やCD4陽性細胞等が含まれている。用いられるサイトカインは、安全性と生理活性が確認された特性のものであれば、天然型、あるいは遺伝子組み換え型等、その生産手法については問わないが、好ましくは医療用に用いられる品質が確保された標品が必要最低量で用いられる。添加するサイトカインの濃度は、樹状細胞が誘導される濃度であれば特に限定されず、通常サイトカインの合計濃度で10〜1000ng/mL程度が好ましく、さらに好ましくは20〜500ng/mL程度である。培養は、白血球の培養に通常用いられている周知の培地を用いて行うことができる。培養温度は白血球の増殖が可能であれば特に限定されないが、ヒトの体温である37℃程度が最も好ましい。また、培養中の気体環境は白血球の増殖が可能であれば特に限定されないが、5%COを通気することが好ましい。さらに培養期間は、必要数の細胞が誘導される期間であれば特に限定されないが、通常3日〜2週間の間で行われる。細胞の分離や培養に供される機器は、適宜適当なものを用いることができるが、医療用に安全性が確認され、かつ操作が安定して簡便であることが好ましい。特に細胞培養装置については、シャーレ、フラスコ、ボトル等の一般的容器に拘わらず、積層型容器や多段式容器、ローラーボトル、スピナー式ボトル、バッグ式培養器、中空糸カラム等も用いることができる。 Dendritic cells or B cells carrying HLA class I molecules can be prepared from peripheral blood by well-known methods. For example, dendritic cells are induced from bone marrow, umbilical cord blood, or patient peripheral blood using granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and IL-3 (or IL-4), and tumor-related peptides are introduced into the culture system. Can be added to induce tumor-specific dendritic cells. By administering an effective amount of this dendritic cell, a desired response for cancer treatment can be induced. The cells used can be bone marrow and umbilical cord blood provided by healthy people, the patient's own bone marrow and peripheral blood, etc., but when using the patient's own autologous cells, it is highly safe and has serious side effects. It can also be expected to avoid it. Peripheral blood or bone marrow may be a fresh sample, a cryopreserved sample, or a cryopreserved sample. As the peripheral blood, whole blood may be cultured, or only the leukocyte component may be separated and cultured, but the latter is more efficient and preferable. Furthermore, mononuclear cells may be separated among the leukocyte components. Moreover, when originating in bone marrow or umbilical cord blood, the whole cells constituting the bone marrow may be cultured, or mononuclear cells may be separated and cultured from this. Peripheral blood, its white blood cell components, and bone marrow cells include mononuclear cells, hematopoietic stem cells, immature dendritic cells, CD4 positive cells, and the like that are the origin of dendritic cells. As long as the cytokine used has a property that has been confirmed to be safe and physiologically active, it does not matter whether it is a natural type or a genetically engineered type, and its production method is preferably ensured. Are used in the minimum amount required. The concentration of the cytokine to be added is not particularly limited as long as it is a concentration at which dendritic cells are induced, and is usually preferably about 10 to 1000 ng / mL, more preferably about 20 to 500 ng / mL as the total concentration of cytokines. The culture can be performed using a well-known medium usually used for culturing leukocytes. The culture temperature is not particularly limited as long as leukocyte growth is possible, but is most preferably about 37 ° C. which is the human body temperature. Further, the gas environment during the culture is not particularly limited as long as leukocytes can be grown, but it is preferable to aerate 5% CO 2 . Further, the culture period is not particularly limited as long as a necessary number of cells are induced, but it is usually performed for 3 days to 2 weeks. As a device used for cell separation and culture, an appropriate device can be used as appropriate, but it is preferable that safety is confirmed for medical use and that the operation is stable and simple. In particular, for cell culture devices, stacked containers, multistage containers, roller bottles, spinner bottles, bag-type incubators, hollow fiber columns, etc. can be used regardless of general containers such as petri dishes, flasks, and bottles. .

上記本発明のポリペプチドと抗原提示細胞をインビトロで接触させる方法自体は周知の方法により行なうことができる。例えば、抗原提示細胞を、上記ポリペプチドを含む培養液中で培養することにより行なうことができる。培地中のペプチド濃度は、特に限定されないが、通常、1μg/mlないし100μg/ml程度、好ましくは5μg/mlないし20μg/ml程度である。培養時の細胞密度は特に限定されないが、通常、10細胞/mlから107細胞/ml程度、好ましくは5x10細胞/mlから5x106細胞/ml程度である。培養は、常法に従い、37℃、5%CO2雰囲気中で行なうことが好ましい。なお、抗原提示細胞が表面上に提示できるペプチドの長さは、通常、最大で30アミノ酸残基程度である。従って、特に限定されないが、抗原提示細胞とポリペプチドをインビトロで接触させる場合、該ポリペプチドをおよそ30アミノ酸残基以下の長さに調製してもよい。 The method of contacting the polypeptide of the present invention with an antigen-presenting cell in vitro can be performed by a well-known method. For example, it can be performed by culturing antigen-presenting cells in a culture solution containing the polypeptide. The peptide concentration in the medium is not particularly limited, but is usually about 1 μg / ml to 100 μg / ml, preferably about 5 μg / ml to 20 μg / ml. The cell density at the time of culture is not particularly limited, but is usually about 10 3 cells / ml to 10 7 cells / ml, preferably about 5 × 10 4 cells / ml to 5 × 10 6 cells / ml. Cultivation is preferably carried out in a 37 ° C., 5% CO 2 atmosphere according to a conventional method. The length of the peptide that can be presented on the surface by antigen-presenting cells is usually about 30 amino acid residues at the maximum. Therefore, although not particularly limited, when the antigen-presenting cell and the polypeptide are contacted in vitro, the polypeptide may be prepared to a length of about 30 amino acid residues or less.

上記したポリペプチドの共存下において抗原提示細胞を培養することにより、ペプチドが抗原提示細胞のHLA分子に取り込まれ、抗原提示細胞の表面に提示される。従って、本発明のポリペプチドを用いて、本発明のポリペプチドとHLA分子の複合体を含む、単離抗原提示細胞を調製することができる。このような抗原提示細胞は、生体内又はインビトロにおいて、T細胞に対して該ポリペプチドを提示し、該ポリペプチドに特異的な細胞障害性T細胞を誘導し、増殖させることができる。   By culturing the antigen-presenting cell in the presence of the above-described polypeptide, the peptide is taken up by the HLA molecule of the antigen-presenting cell and presented on the surface of the antigen-presenting cell. Accordingly, an isolated antigen-presenting cell containing a complex of the polypeptide of the present invention and an HLA molecule can be prepared using the polypeptide of the present invention. Such antigen-presenting cells can present the polypeptide to T cells in vivo or in vitro, and induce and proliferate cytotoxic T cells specific for the polypeptide.

上記のようにして調製される、上記ポリペプチドとHLA分子の複合体とを含む抗原提示細胞を、T細胞とインビトロで接触させることにより、該ポリペプチドに特異的な細胞障害性T細胞を誘導し、増殖させることができる。これは、上記抗原提示細胞とT細胞とを液体培地中で共存培養することにより行なうことができる。例えば、抗原提示細胞を液体培地に懸濁して、マイクロプレートのウェル等の容器に入れ、これにT細胞を添加して培養することにより行なうことができる。共存培養時の抗原提示細胞とT細胞の混合比率は、特に限定されないが、通常、細胞数の比率で1:1〜1:100程度、好ましくは1:5〜1:20程度である。また、液体培地中に懸濁する抗原提示細胞の密度は、特に限定されないが、通常、100〜1000万細胞/ml程度、好ましくは10000〜100万細胞/ml程度である。共存培養は、常法に従い、37℃、5%CO2雰囲気中で行なうことが好ましい。培養時間は、特に限定されないが、通常、2日〜3週間、好ましくは4日〜2週間程度である。また、共存培養は、IL-2、IL-6、IL-7及びIL-12のようなインターロイキンの1種又は複数の存在下で行なうことが好ましい。この場合、IL-2及びIL-7の濃度は、通常、5U/mlから20U/ml程度、IL-6の濃度は通常、500U/mlから2000U/ml程度、IL-12の濃度は通常、5ng/mlから20ng/ml程度であるが、これらに限定されるものではない。上記の共存培養は、新鮮な抗原提示細胞を追加して1回ないし数回繰り返してもよい。例えば、共存培養後の培養上清を捨て、新鮮な抗原提示細胞の懸濁液を添加してさらに共存培養を行なうという操作を、1回ないし数回繰り返してもよい。各共存培養の条件は、上記と同様でよい。 Antigen-presenting cells containing the above-described polypeptide and HLA molecule complex prepared as described above are contacted with T cells in vitro to induce cytotoxic T cells specific for the polypeptide. And can be grown. This can be done by co-culturing the antigen-presenting cells and T cells in a liquid medium. For example, it can be carried out by suspending antigen-presenting cells in a liquid medium, placing them in a container such as a well of a microplate, adding T cells thereto, and culturing. The mixing ratio of antigen-presenting cells and T cells during co-culture is not particularly limited, but is usually about 1: 1 to 1: 100, preferably about 1: 5 to 1:20 in terms of the number of cells. The density of antigen-presenting cells suspended in the liquid medium is not particularly limited, but is usually about 1 to 10 million cells / ml, preferably about 10,000 to 1 million cells / ml. The coculture is preferably performed in a 37 ° C., 5% CO 2 atmosphere according to a conventional method. The culture time is not particularly limited, but is usually 2 days to 3 weeks, preferably about 4 days to 2 weeks. The coculture is preferably performed in the presence of one or more interleukins such as IL-2, IL-6, IL-7 and IL-12. In this case, the concentration of IL-2 and IL-7 is usually about 5 U / ml to about 20 U / ml, the concentration of IL-6 is usually about 500 U / ml to about 2000 U / ml, and the concentration of IL-12 is usually about Although it is about 5 ng / ml to 20 ng / ml, it is not limited to these. The above co-culture may be repeated once to several times by adding fresh antigen-presenting cells. For example, the operation of discarding the culture supernatant after co-culture, adding a fresh antigen-presenting cell suspension, and further co-culturing may be repeated once to several times. The conditions for each co-culture may be the same as described above.

上記の共存培養により、該ポリペプチドに特異的な細胞障害性T細胞が誘導され、増殖される。従って、本発明のポリペプチドを用いて、該ポリペプチドとHLA分子の複合体を選択的に結合する、単離T細胞を調製することができる。   By the co-culture described above, cytotoxic T cells specific for the polypeptide are induced and proliferated. Therefore, using the polypeptide of the present invention, an isolated T cell that selectively binds the complex of the polypeptide and the HLA molecule can be prepared.

下記実施例に記載される通り、配列番号2のポリペプチドをコードする遺伝子は、イヌの癌細胞と精巣に特異的に発現している。従って、癌細胞においては、配列番号2のポリペプチドが正常細胞よりも有意に多く存在していると考えられる。特に、配列番号2のポリペプチドが癌細胞表面に表出して存在している場合には、上記のようにして調製した細胞障害性T細胞を生体内に投与することにより、癌細胞を障害することができる。また、上記本発明のポリペプチドを提示する抗原提示細胞は、生体内においても該ポリペプチドに特異的な細胞障害性T細胞を誘導し、増殖させることができるので、該抗原提示細胞を生体内に投与することによっても、癌細胞を障害することができる。従って、本発明のポリペプチドは、癌の治療及び/又は予防にも有用であり得る。   As described in the Examples below, the gene encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 2 is specifically expressed in canine cancer cells and testis. Therefore, it is considered that the polypeptide of SEQ ID NO: 2 exists significantly more in cancer cells than in normal cells. In particular, when the polypeptide of SEQ ID NO: 2 is present on the surface of cancer cells, the cancer cells are damaged by administering the cytotoxic T cells prepared as described above in vivo. be able to. In addition, since the antigen-presenting cells presenting the polypeptide of the present invention can induce and proliferate cytotoxic T cells specific for the polypeptide even in vivo, the antigen-presenting cells are in vivo. The cancer cells can also be damaged by administration to the above. Thus, the polypeptides of the present invention may also be useful for the treatment and / or prevention of cancer.

上記した単離抗原提示細胞や単離T細胞を生体に投与する場合には、これらの細胞を異物として攻撃する生体内での免疫応答を回避するために、治療を受ける患者から採取した抗原提示細胞又はT細胞を、上記のように本発明のポリペプチドを用いて調製したものであることが好ましい。   When administering the above-mentioned isolated antigen-presenting cells or isolated T cells to a living body, in order to avoid in vivo immune responses that attack these cells as foreign bodies, antigen presentation collected from patients undergoing treatment Cells or T cells are preferably prepared using the polypeptide of the present invention as described above.

抗原提示細胞又はT細胞を有効成分として含む癌の治療及び/又は予防剤の投与経路は、静脈内投与や動脈内投与のような非経口投与が好ましい。また、投与量は、症状や投与目的等に応じて適宜選択されるが、通常1個〜10兆個、好ましくは100万個〜10億個であり、これを数日ないし数月に1回投与するのが好ましい。製剤は、例えば、細胞を生理緩衝食塩水に懸濁したもの等であってよく、他の抗癌剤やサイトカイン等と併用することもできる。また、製剤分野において周知の1又は2以上の添加剤を添加することもできる。   The administration route of the therapeutic and / or prophylactic agent for cancer containing antigen-presenting cells or T cells as an active ingredient is preferably parenteral administration such as intravenous administration or intraarterial administration. The dose is appropriately selected according to symptoms, purpose of administration, etc., but is usually 1 to 10 trillion, preferably 1 million to 1 billion, and this is once every few days to several months. Administration is preferred. The preparation may be, for example, one in which cells are suspended in physiological buffer saline, and can be used in combination with other anticancer agents, cytokines, and the like. In addition, one or two or more additives well known in the pharmaceutical field can be added.

また、本発明のポリペプチドをワクチンとして生体に投与することにより、生体に予め該ポリペプチドに対する細胞性免疫等の免疫を誘導することができる。従って、本発明のポリペプチドを提示する抗原提示細胞や本発明のポリペプチドに特異的な細胞障害性T細胞が癌の治療及び/又は予防に有効である場合には、本発明のポリペプチドを有効成分とするワクチンは、癌の治療及び/又は予防に有効である。すなわち、本発明のポリペプチドは、ワクチンとしても有用であり得る。   In addition, by administering the polypeptide of the present invention to a living body as a vaccine, immunity such as cellular immunity against the polypeptide can be induced in the living body in advance. Therefore, when the antigen-presenting cell presenting the polypeptide of the present invention or the cytotoxic T cell specific for the polypeptide of the present invention is effective for the treatment and / or prevention of cancer, the polypeptide of the present invention is used. A vaccine as an active ingredient is effective for the treatment and / or prevention of cancer. That is, the polypeptide of the present invention may be useful as a vaccine.

本発明のポリペプチドをワクチンとして投与する場合には、本発明のポリペプチドに加えてアジュバントを含むことが好ましい。アジュバントは、抗原の貯蔵所(細胞外またはマクロファージ内)を提供し、マクロファージを活性化し、かつ特定組のリンパ球を刺激することにより、免疫学的応答を強化し得る。多数の種類のアジュバントが、当業界で周知である。具体例としては、MPL(SmithKline Beecham)、サルモネラ属のSalmonella minnesota Re 595リポ多糖類の精製および酸加水分解後に得られる同類物;QS21(SmithKline Beecham)、Quillja saponaria抽出物から精製される純QA−21サポニン;PCT出願WO96/33739(SmithKline Beecham)に記載されたDQS21;QS−7、QS−17、QS−18およびQS−L1(ソ(So)、外10名、「モレキュルズ・アンド・セル(Molecules and cells)」、1997年、第7巻、p.178−186);フロイントの不完全アジュバント;フロイントの完全アジュバント;ビタミンE;モンタニド;ミョウバン;CpGオリゴヌクレオチド(例えば、クレイグ(Kreig)、外7名、「ネイチャー(Nature)」、第374巻、p.546−549)を参照);ならびにスクアレンおよび/またはトコフェロールのような生分解性油から調製される種々の油中水エマルションが挙げられる。好ましくは、ペプチドは、DQS21/MPLの組合せと混合されて投与される。DQS21対MPLの比は、典型的には約1:10〜10:1,好ましくは約1:5〜5:1、さらに好ましくは約1:1である。典型的には、ヒト投与に関しては、DQS21およびMPLは、約1μg〜約100μgの範囲でワクチン処方物中に存在する。その他のアジュバントが当業界で既知であり、本発明のポリペプチドをワクチンとして投与する場合に用いられ得る(例えば、ゴッディング(Goding)著,「モノクローナル・アンチボディーズ:プリンシプル・アンド・プラクティス(Monoclonal Antibodies:Principles and Practice)」、第2版、1986年を参照)。ポリペプチドおよびアジュバントの混合物またはエマルションの調製方法は、予防接種の当業者には周知である。   When administering the polypeptide of the present invention as a vaccine, it is preferable to include an adjuvant in addition to the polypeptide of the present invention. Adjuvants can enhance the immunological response by providing a reservoir of antigen (extracellular or in macrophages), activating macrophages and stimulating specific sets of lymphocytes. Many types of adjuvants are well known in the art. Specific examples include MPL (SmithKline Beecham), Salmonella minnesota Re 595 lipopolysaccharide of the genus Salmonella and the like obtained after acid hydrolysis; QS21 (SmithKline Beecham), pure QA- purified from Quillja saponaria extract 21 saponins; DQS21 described in PCT application WO 96/33739 (SmithKline Beecham); QS-7, QS-17, QS-18 and QS-L1 (So, outside 10 persons, “Molecules and Cell ( Molecules and cells), 1997, 7, p. 178-186); Freund's incomplete adjuvant; Freund's complete adjuvant; Vitamin E; Montanide; Alum; CpG oligonucleotide (eg, Kreig, et al. 7 people, see “Nature”, Vol. 374, pages 546-549)); Examples include various water-in-oil emulsions prepared from biodegradable oils such as qualene and / or tocopherol. Preferably, the peptide is administered mixed with the DQS21 / MPL combination. The ratio of DQS21 to MPL is typically about 1:10 to 10: 1, preferably about 1: 5 to 5: 1, more preferably about 1: 1. Typically, for human administration, DQS21 and MPL are present in the vaccine formulation in the range of about 1 μg to about 100 μg. Other adjuvants are known in the art and can be used when administering a polypeptide of the invention as a vaccine (eg, by Godding, “Monoclonal Antibodies: Monoclonal Antibodies: Principles and Practice ”, 2nd edition, 1986). Methods for preparing polypeptide and adjuvant mixtures or emulsions are well known to those skilled in vaccination.

対象の免疫応答を刺激するその他の因子も、対象に投与され得る。例えばその他のサイトカインも、リンパ球刺激特性の結果として、予防接種プロトコルに有用である。このような目的のために有用な多数のサイトカインは当業者に既知であり、その例としては、ワクチンの防御作用を強化することが示されているインターロイキン−12(IL−12)、GM−CSF、IL−18およびFlt3リガンドが挙げられる。投与される場合、本発明のポリペプチドは、製薬上許容可能な調製物中で投与される。このような調製物は、製薬上許容可能な濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、相溶性担体、補助免疫増強剤、例えばアジュバントおよびサイトカイン、ならびに任意にその他の療法的作用物質をルーチンに含有し得る。   Other factors that stimulate the subject's immune response may also be administered to the subject. For example, other cytokines are also useful in vaccination protocols as a result of lymphocyte stimulatory properties. Numerous cytokines useful for such purposes are known to those of skill in the art, examples include interleukin-12 (IL-12), GM-, which have been shown to enhance the protective effects of vaccines. CSF, IL-18 and Flt3 ligands. When administered, the polypeptides of the invention are administered in a pharmaceutically acceptable preparation. Such preparations routinely contain pharmaceutically acceptable concentrations of salts, buffers, preservatives, compatible carriers, co-immune enhancing agents such as adjuvants and cytokines, and optionally other therapeutic agents. obtain.

本発明はまた、上記本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、種々の細胞や組織、例えばイヌ精巣由来のcDNAやmRNA、cRNA(相補的RNA)、ゲノムDNA、または合成DNAのいずれであっても良い。また本発明のポリヌクレオチドは1本鎖および2本鎖のいずれの形態もとることができる。配列番号2のポリペプチドをコードするcDNAは、下記実施例において実際にクローニングされ、その塩基配列が配列表の配列番号1に示されている。従って、上記本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号1に示される塩基配列の全長から成るものであってよく、また、配列番号1に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの断片であって、配列番号2のポリペプチドに対するポリクローナル抗体と抗原抗体反応するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド断片であってもよい。上記した通り、7アミノ酸残基以上から成る配列番号2のポリペプチドの断片であれば、配列番号2のポリペプチドに対するポリクローナル抗体と抗原抗体反応し得るため、配列番号1に示される塩基配列のコード領域内の連続する21塩基以上から成るポリヌクレオチドであれば、該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドは、配列番号2のポリペプチドに対するポリクローナル抗体との結合性を有し得る。あるいは、それらの保存的置換塩基配列(コードするアミノ酸配列が同じで塩基配列が異なるもの)を用いることができる。なお、各アミノ酸をコードするコドンは公知であるから、特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの塩基配列は容易に特定することができる。従って、上記した特異反応性修飾ポリペプチド及び特異反応性付加ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列も容易に特定することができる。   The present invention also provides a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention. The polynucleotide may be any of various cells and tissues, such as cDNA and mRNA derived from dog testis, cRNA (complementary RNA), genomic DNA, or synthetic DNA. In addition, the polynucleotide of the present invention can be in either single-stranded or double-stranded form. The cDNA encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 2 was actually cloned in the following Examples, and its base sequence is shown in SEQ ID NO: 1 of the Sequence Listing. Therefore, the polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention may consist of the full length of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and is a fragment of the polynucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. Further, it may be a polynucleotide fragment encoding a polypeptide that undergoes an antigen-antibody reaction with a polyclonal antibody against the polypeptide of SEQ ID NO: 2. As described above, since a fragment of the polypeptide of SEQ ID NO: 2 consisting of 7 amino acid residues or more can undergo an antigen-antibody reaction with a polyclonal antibody against the polypeptide of SEQ ID NO: 2, the nucleotide sequence code shown in SEQ ID NO: 1 If it is a polynucleotide comprising 21 or more consecutive bases in the region, the polypeptide encoded by the polynucleotide may have a binding property with a polyclonal antibody against the polypeptide of SEQ ID NO: 2. Alternatively, those conservatively substituted base sequences (same amino acid sequences but different base sequences) can be used. In addition, since the codon which codes each amino acid is well-known, the base sequence of the polynucleotide which codes a specific amino acid sequence can be specified easily. Accordingly, the base sequences of the polynucleotides encoding the above-mentioned specific reactivity-modified polypeptide and specific reactivity-added polypeptide can be easily specified.

本発明のポリペプチドをコードする上記ポリヌクレオチドは、例えば以下のようにして調製することができる。配列番号1の塩基配列を有するDNAは、イヌ染色体DNA又はcDNAライブラリーを鋳型として使用し、配列番号1に記載した塩基配列を増幅できるように設計した一対のプライマーを用いてPCRを行うことにより調製することができる。PCRの反応条件は適宜設定することができ、例えば、94℃で30秒間(変性)、55℃で30秒〜1分間(アニーリング)、72℃で2分間(伸長)からなる反応行程を1サイクルとして、例えば30サイクル行った後、72℃で7分間反応させる条件などを挙げることができるが、これに限定されない。また、本明細書中の配列表の配列番号1および配列番号2に記載した塩基配列およびアミノ酸配列の情報に基づいて適当なプローブやプライマーを調製し、それを用いてイヌなどのcDNAライブラリーをスクリーニングする事により本発明のDNAを単離することができる。cDNAライブラリーは、本発明のDNAを発現している細胞、器官又は組織から作製することが好ましい。上記したプローブ又はプライマーの調製、cDNAライブラリーの構築、cDNAライブラリーのスクリーニング、ならびに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、モレキュラークロニング第2版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラバイオロジー等に記載された方法に準じて行うことができる。また、上記した通り、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列は容易に特定できるので、そのようなポリヌクレオチドは、市販の核酸合成機を用いて常法により合成することができる。   The above-mentioned polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention can be prepared, for example, as follows. DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 1 is obtained by performing PCR using a pair of primers designed to amplify the base sequence described in SEQ ID NO: 1, using canine chromosomal DNA or cDNA library as a template. Can be prepared. PCR reaction conditions can be set as appropriate. For example, one cycle of a reaction step consisting of 94 ° C. for 30 seconds (denaturation), 55 ° C. for 30 seconds to 1 minute (annealing), and 72 ° C. for 2 minutes (extension) Examples of the conditions include, but are not limited to, conditions of reacting at 72 ° C. for 7 minutes after 30 cycles. In addition, appropriate probes and primers are prepared based on the nucleotide sequence and amino acid sequence information described in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 in the sequence listing in the present specification, and a cDNA library such as a dog is prepared using the probe or primer. By screening, the DNA of the present invention can be isolated. The cDNA library is preferably prepared from cells, organs or tissues expressing the DNA of the present invention. Operations such as the preparation of the probe or primer, construction of the cDNA library, screening of the cDNA library, and cloning of the target gene are known to those skilled in the art. For example, Molecular Cloning 2nd Edition, Current Protocols, It can be carried out according to the method described in In-Molecular Biology and the like. Further, as described above, since the base sequence of the polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention can be easily specified, such a polynucleotide can be synthesized by a conventional method using a commercially available nucleic acid synthesizer.

本発明は、上記本発明のポリヌクレオチドを含み、細胞中で該ポリヌクレオチドを発現することができる組換えベクターをも提供する。細胞は、哺乳動物細胞であっても、大腸菌や酵母菌のような原核又は真核微生物であってもよい。哺乳動物細胞に遺伝子導入するためのベクターとしては、プラスミドベクターでもウイルスベクターでもよく、これら自体は周知であり、種々のものが市販されているので、市販のベクターを利用することができる。市販のベクターのマルチクローニング部位に上記した本発明のポリヌクレオチドを挿入することにより本発明の組換えベクターを得ることができる。   The present invention also provides a recombinant vector comprising the above-described polynucleotide of the present invention and capable of expressing the polynucleotide in a cell. The cell may be a mammalian cell or a prokaryotic or eukaryotic microorganism such as E. coli or yeast. The vector for introducing a gene into a mammalian cell may be a plasmid vector or a viral vector, and these are well known per se, and various vectors are commercially available, and commercially available vectors can be used. The recombinant vector of the present invention can be obtained by inserting the above-described polynucleotide of the present invention into the multicloning site of a commercially available vector.

哺乳動物細胞に遺伝子導入するためのベクターに本発明のポリヌクレオチドを組み込んだ組換えベクターは、癌の治療及び/又は予防のための遺伝子ワクチンとして有用であり得る。遺伝子ワクチンの投与経路は、好ましくは筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与等の非経口投与経路であり、投与量は、抗原の種類等に応じて適宜選択することができるが、通常、体重1kg当たり、遺伝子ワクチンの重量で0.1μg〜100mg程度、好ましくは1μg〜10mg程度である。   A recombinant vector in which the polynucleotide of the present invention is incorporated into a vector for gene transfer into mammalian cells can be useful as a gene vaccine for the treatment and / or prevention of cancer. The administration route of the gene vaccine is preferably a parenteral administration route such as intramuscular administration, subcutaneous administration, intravenous administration or intraarterial administration, and the dosage can be appropriately selected according to the type of antigen and the like. Usually, the weight of the genetic vaccine per kg body weight is about 0.1 μg to 100 mg, preferably about 1 μg to 10 mg.

ウイルスベクターによる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス等のRNAウイルスまたはDNAウイルスに本発明のDNAを組み込んで導入する方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス等を用いた方法が特に好ましい。   As a method using a viral vector, for example, the DNA of the present invention is incorporated into a retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes virus, vaccinia virus, poxvirus, poliovirus, Sindbis virus or the like by incorporating the DNA of the present invention. A method is mentioned. Of these, methods using retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, vaccinia viruses and the like are particularly preferred.

その他の方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法(DNAワクチン法)、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にDNAワクチン法、リポソーム法が好ましい。   Examples of other methods include a method in which an expression plasmid is directly administered into muscle (DNA vaccine method), a liposome method, a lipofectin method, a microinjection method, a calcium phosphate method, an electroporation method, and the like. The method is preferred.

本発明のペプチドをコードする遺伝子を実際に医薬として作用させるには、遺伝子を直接体内に導入するin vivo方法、およびヒトからある種の細胞を採取し体外で遺伝子を該細胞に導入しその細胞を体内に戻すex vivo方法がある(日経サイエンス,1994年4月,p20−45、月刊薬事,1994年,第36巻,第1号,p.23−48、実験医学増刊,1994年,第12巻,第15号、およびこれらの引用文献等)。in vivo方法がより好ましい。   In order for the gene encoding the peptide of the present invention to actually act as a medicine, an in vivo method in which the gene is directly introduced into the body, and certain cells are collected from humans and introduced into the cells outside the body. There is an ex vivo method for returning the body to the body (Nikkei Science, April 1994, p20-45, Monthly Pharmaceutical Affairs, 1994, Vol. 36, No. 1, p. 23-48, Experimental Medicine Extra Number, 1994, No. Vol. 12, No. 15, and references cited therein). In vivo methods are more preferred.

in vivo方法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、筋肉内などに投与することが出来る。in vivo方法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一般的には有効成分である本発明のDNAを含有する注射剤等とされ、必要に応じて、慣用の担体を加えてもよい。また、本発明のDNAを含有するリポソームまたは膜融合リポソーム(センダイウイルス(HVJ)−リポソーム等)においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。   When administered by an in vivo method, it can be administered by an appropriate route according to the disease, symptom or the like for the purpose of treatment. For example, it can be administered intravenously, artery, subcutaneously, intramuscularly. When administered by an in vivo method, for example, it can be in the form of a pharmaceutical preparation such as a liquid, but is generally an injection containing the DNA of the present invention which is an active ingredient, and if necessary, a conventional carrier May be added. Further, the liposome or membrane fusion liposome (Sendai virus (HVJ) -liposome etc.) containing the DNA of the present invention can be in the form of a liposome preparation such as a suspension, a freezing agent, a centrifugal concentration freezing agent and the like. .

一方、大腸菌や酵母菌などの微生物用のベクターも周知であり、種々のものが市販されている。その具体例は上記したとおりである。微生物用のベクターに本発明のポリヌクレオチドを組み込んだ組換えベクターは、上記した通り、本発明のペプチドを遺伝子工学的に大量生産するために用いることができる。遺伝子工学的手法による本発明のポリペプチドの生産方法は、上記したとおりである。   On the other hand, vectors for microorganisms such as Escherichia coli and yeast are well known, and various types are commercially available. Specific examples thereof are as described above. As described above, the recombinant vector in which the polynucleotide of the present invention is incorporated into a vector for microorganisms can be used for mass production of the peptide of the present invention by genetic engineering. The method for producing the polypeptide of the present invention by genetic engineering techniques is as described above.

下記実施例に記載される通り、本発明により、精巣と癌細胞において特異的に発現している新規ポリペプチドのcDNAの塩基配列(配列番号1)が明らかになった。すなわち、本発明は、配列番号1に示される塩基配列中の連続する18塩基以上から成るポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。該ポリヌクレオチドは、上記新規ポリペプチドのmRNAやcDNAを測定するためのポリヌクレオチド(以下「測定用ポリヌクレオチド」という)として用いることができる。   As described in the following Examples, the present invention revealed the cDNA base sequence (SEQ ID NO: 1) of a novel polypeptide specifically expressed in testis and cancer cells. That is, the present invention provides a polynucleotide comprising 18 or more consecutive nucleotides in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a polynucleotide that specifically hybridizes with the polynucleotide. The polynucleotide can be used as a polynucleotide for measuring mRNA or cDNA of the novel polypeptide (hereinafter referred to as “measurement polynucleotide”).

ここで、「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイズの条件下において、配列番号1に示される塩基配列中の連続する18塩基以上から成るポリヌクレオチドとのみハイブリダイズし、その他のポリヌクレオチドとは実質的にハイブリダイズしないという意味である。「通常のハイブリダイズの条件下」とは、通常のPCRのアニーリングやプローブによる検出に用いられる条件下のことをいい、例えば、Taqポリメラーゼを用いたPCRの場合には、50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH 8.3〜9.0)、1.5mM MgCl2といった一般的な緩衝液を用いて、54℃〜60℃程度の適当なアニーリング温度で反応を行なうことをいい、また、例えばノーザンハイブリダイゼーションの場合には、5 x SSPE、50%ホルムアミド、5 x Denhardt's solution、0.1〜0.5%SDSといった一般的なハイブリダイゼーション溶液を用いて、42℃〜65℃程度の適当なハイブリダイゼーション温度で反応を行なうことをいう。ただし、適当なアニーリング温度又はハイブリダイゼーション温度は、上記例示に限定されず、プライマー又はプローブとして用いる測定用ポリヌクレオチドのTm値及び実験者の経験則に基づいて定められ、当業者であれば容易に定めることができる。「実質的にハイブリダイズしない」とは、全くハイブリダイズしないか、するとしても検出対象のポリヌクレオチドにハイブリダイズする量よりも大幅に少なく、相対的に無視できる程度の微量しかハイブリダイズしないという意味である。そのような条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドとしては、対象のポリヌクレオチドの塩基配列と一定以上の相同性を有するポリヌクレオチドが挙げられ、例えば70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは93%以上、特に好ましくは95%以上、最も好ましくは98%以上の相同性を有するポリヌクレオチドが挙げられる。相同性の定義は、上記したアミノ酸配列の相同性と同様である。なお、測定用ポリヌクレオチドの末端に対象とハイブリダイズしない領域が含まれていても、プローブの場合には、ハイブリダイズする領域がプローブ全体のおよそ半分以上を占めていれば検出に用いることができるし、また、プライマーの場合には、ハイブリダイズする領域がプライマー全体のおよそ半分以上を占め、かつ3'末端側にあれば、正常にアニーリングして伸長反応を生じ得るので、検出に用いることができる。そのように、測定用ポリヌクレオチドの末端にハイブリダイズしない領域が含まれている場合において、対象の塩基配列との相同性を算出するときは、ハイブリダイズしない領域は考慮せず、ハイブリダイズする領域のみに着目して算出するものとする。 Here, “specifically hybridize” means to hybridize only with a polynucleotide comprising 18 or more consecutive bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 under normal hybridization conditions, It means that the polynucleotide does not substantially hybridize. “Normal hybridization conditions” refer to the conditions used for normal PCR annealing and probe detection. For example, in the case of PCR using Taq polymerase, 50 mM KCl, 10 mM Tris- The reaction is performed using a general buffer solution such as HCl (pH 8.3 to 9.0) and 1.5 mM MgCl 2 at an appropriate annealing temperature of about 54 ° C. to 60 ° C. For example, in the case of Northern hybridization Is to perform the reaction at an appropriate hybridization temperature of about 42 ° C. to 65 ° C. using a general hybridization solution such as 5 × SSPE, 50% formamide, 5 × Denhardt's solution, 0.1 to 0.5% SDS. . However, the appropriate annealing temperature or hybridization temperature is not limited to the above examples, and is determined based on the Tm value of the measurement polynucleotide used as the primer or probe and the rule of thumb of the experimenter. Can be determined. “Substantially does not hybridize” means that it does not hybridize at all, or even if it is significantly less than the amount that hybridizes to the polynucleotide to be detected and hybridizes only in a negligible amount. It is. Examples of the polynucleotide that specifically hybridizes under such conditions include polynucleotides having a certain degree of homology with the base sequence of the target polynucleotide, such as 70% or more, preferably 80% or more. Preferably, a polynucleotide having a homology of 90% or more, more preferably 93% or more, particularly preferably 95% or more, and most preferably 98% or more. The definition of homology is the same as the homology of the amino acid sequence described above. Even if a region that does not hybridize with the target is included at the end of the measurement polynucleotide, in the case of a probe, it can be used for detection if the hybridizing region occupies approximately half or more of the entire probe. However, in the case of a primer, if the hybridizing region occupies approximately half or more of the entire primer and is on the 3 ′ end side, it can be normally annealed to cause an extension reaction. it can. As such, when a region that does not hybridize is included at the end of the polynucleotide for measurement, the region that hybridizes without considering the region that does not hybridize when calculating the homology with the target base sequence It is assumed that the calculation is focused on only the above.

なお、本発明において、「配列番号1に示される塩基配列」と言った場合には、配列番号1に実際に示されている塩基配列の他、これと相補的な配列も包含する。従って、「配列番号1に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド」と言った場合には、配列番号1に実際に示されている塩基配列を有する一本鎖ポリヌクレオチド、その相補的な塩基配列を有する一本鎖ポリヌクレオチド、及びこれらから成る二本鎖ポリヌクレオチドが包含される。上記した測定用ポリヌクレオチドを調製する場合には、適宜いずれかの塩基配列を選択することとなるが、当業者であれば容易にその選択をすることができる。   In the present invention, the term “base sequence shown in SEQ ID NO: 1” includes the base sequence actually shown in SEQ ID NO: 1 as well as a complementary sequence thereto. Therefore, when saying “polynucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1”, the single-stranded polynucleotide having the base sequence actually shown in SEQ ID NO: 1, its complementary base sequence Single-stranded polynucleotides having and double-stranded polynucleotides comprising these are included. When preparing the above-described polynucleotide for measurement, any base sequence is appropriately selected, but those skilled in the art can easily select it.

上記測定用ポリヌクレオチドは、プローブ又は核酸増幅法におけるプライマーとして用いることができる。特異性を確保するために、測定用ポリヌクレオチドの塩基数は18塩基以上が好ましい。サイズは、プローブとして用いる場合には、好ましくは18塩基以上、さらに好ましくは20塩基以上、コード領域の全長以下が好ましく、プライマーとして用いる場合には、18塩基以上が好ましく、50塩基以下が好ましい。被検核酸の部分領域と相補的な配列を有するポリヌクレオチドをPCRのような遺伝子増幅法のプライマー、又はプローブとして用いて被検核酸を測定する方法自体は周知であり、例えば下記実施例に具体的に詳述されるRT-PCRの他、ノーザンブロット、インサイチューハイブリダイゼーション等が挙げられる。なお、本明細書において、「測定」には、検出、定量、半定量のいずれもが包含される。   The measurement polynucleotide can be used as a probe or a primer in a nucleic acid amplification method. In order to ensure specificity, the measurement polynucleotide preferably has 18 or more bases. When used as a probe, the size is preferably 18 bases or more, more preferably 20 bases or more and preferably not more than the entire length of the coding region, and when used as a primer, 18 bases or more is preferable and 50 bases or less is preferable. A method of measuring a test nucleic acid using a polynucleotide having a sequence complementary to a partial region of the test nucleic acid as a primer or probe for a gene amplification method such as PCR is well known. In addition to RT-PCR detailed in detail, Northern blot, in situ hybridization and the like can be mentioned. In the present specification, “measurement” includes any of detection, quantification, and semi-quantification.

PCRのような核酸増幅法自体は、この分野において周知であり、そのための試薬キット及び装置も市販されているので容易に行うことができる。すなわち、例えば、鋳型となる被検核酸(例えば、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子のcDNA)と本発明の測定用ポリヌクレオチド(プライマー)の一対とを、公知の緩衝液中で、Taqポリメラーゼ及びdNTPの存在下で、変性、アニーリング、伸長の各工程を反応液の温度を変化させることにより行う。通常、変性工程は、90〜95℃、アニーリング工程は、鋳型とプライマーのTm又はその近傍(好ましくは±4℃以内)、伸長工程はTaqポリメラーゼの至適温度である72℃で行われる。各工程は30秒〜2分程度で適宜選択される。この熱サイクルを例えば25〜40回程度繰り返すことにより、一対のプライマーで挟まれた鋳型核酸の領域が増幅される。なお、核酸増幅法はPCRに限定されるものではなく、この分野において周知の他の核酸増幅法も用いることができる。このように、上記した本発明の測定用ポリヌクレオチドの一対をプライマーとして用い、被検核酸を鋳型として用いて核酸増幅法を行うと、被検核酸が増幅されるのに対し、検体中に被検核酸が含まれない場合には増幅が起きないので、増幅産物を検出することにより検体中に被検核酸が存在するか否かを知ることができる。増幅産物の検出は、増幅後の反応溶液を電気泳動し、バンドをエチジウムブロミド等で染色する方法や、電気泳動後の増幅産物をナイロン膜等の固相に不動化し、被検核酸と特異的にハイブリダイズする標識プローブとハイブリダイズさせ、洗浄後、該標識を検出することにより行うことができる。また、クエンチャー蛍光色素とレポーター蛍光色素を用いたいわゆるリアルタイム検出PCRを行うことにより、検体中の被検核酸の量を定量することも可能である。なお、リアルタイム検出PCR用のキットも市販されているので、容易に行うことができる。さらに、電気泳動バンドの強度に基づいて被検核酸を半定量することも可能である。なお、被検核酸は、mRNAでも、mRNAから逆転写したcDNAであってもよい。被検核酸としてmRNAを増幅する場合には、上記一対のプライマーを用いたNASBA法(3SR法、TMA法)を採用することもできる。NASBA法自体は周知であり、そのためのキットも市販されているので、上記一対のプライマーを用いて容易に実施することができる。   Nucleic acid amplification methods such as PCR are well known in this field, and reagent kits and devices for that purpose are also commercially available and can be easily performed. That is, for example, a test nucleic acid to be a template (for example, cDNA of a gene encoding the polypeptide of the present invention) and a pair of measurement polynucleotides (primers) of the present invention in a known buffer, Taq polymerase And in the presence of dNTP, each step of denaturation, annealing, and extension is performed by changing the temperature of the reaction solution. Usually, the denaturation step is performed at 90 to 95 ° C., the annealing step is performed at or near Tm of the template and the primer (preferably within ± 4 ° C.), and the extension step is performed at 72 ° C. which is the optimum temperature for Taq polymerase. Each step is appropriately selected in about 30 seconds to 2 minutes. By repeating this thermal cycle, for example, about 25 to 40 times, the region of the template nucleic acid sandwiched between the pair of primers is amplified. The nucleic acid amplification method is not limited to PCR, and other nucleic acid amplification methods well known in this field can also be used. Thus, when the nucleic acid amplification method is performed using the above-described pair of measurement polynucleotides of the present invention as primers and the test nucleic acid as a template, the test nucleic acid is amplified, whereas the test nucleic acid is amplified in the sample. Since amplification does not occur when no test nucleic acid is contained, it is possible to know whether or not the test nucleic acid is present in the sample by detecting the amplification product. For amplification product detection, the reaction solution after amplification is electrophoresed, and the band is stained with ethidium bromide, etc., or the amplification product after electrophoresis is immobilized on a solid phase such as nylon membrane, so that it is specific to the test nucleic acid. This can be carried out by hybridizing with a labeled probe that hybridizes to, and detecting the label after washing. It is also possible to quantify the amount of test nucleic acid in a sample by performing so-called real-time detection PCR using a quencher fluorescent dye and a reporter fluorescent dye. In addition, since the kit for real-time detection PCR is also marketed, it can carry out easily. Furthermore, the test nucleic acid can be semi-quantified based on the intensity of the electrophoresis band. The test nucleic acid may be mRNA or cDNA reverse transcribed from mRNA. When amplifying mRNA as a test nucleic acid, the NASBA method (3SR method, TMA method) using the above-mentioned pair of primers can also be employed. The NASBA method itself is well known, and kits therefor are also commercially available. Therefore, the NASBA method can be easily carried out using the above pair of primers.

プローブとしては、上記測定用ポリヌクレオチドに蛍光標識、放射標識、ビオチン標識等の標識を付した標識プローブを用いることができる。ポリヌクレオチドの標識方法自体は周知である。被検核酸又はその増幅物を固相化し、標識プローブとハイブリダイズさせ、洗浄後、固相に結合された標識を測定することにより、検体中に被検核酸が存在するか否かを調べることができる。あるいは、測定用ポリヌクレオチドを固相化し、被検核酸をハイブリダイズさせ、固相に結合した被検核酸を標識プローブ等で検出することも可能である。このような場合、固相に結合した測定用ポリヌクレオチドもプローブと呼ばれる。なお、ポリヌクレオチドプローブを用いた被検核酸の測定方法もこの分野において周知であり、緩衝液中、ポリヌクレオチドプローブを被検核酸とTm又はその近傍(好ましくは±4℃以内)で接触させることによりハイブリダイズさせ、洗浄後、ハイブリダイズした標識プローブ又は固相プローブに結合された鋳型核酸を測定することにより行うことができる。このような方法には、例えばノーザンブロット、インサイチューハイブリダイゼーション、サザンブロット法等の周知の方法が包含される。   As the probe, a labeled probe obtained by attaching a label such as a fluorescent label, a radiolabel, or a biotin label to the measurement polynucleotide can be used. The polynucleotide labeling method itself is well known. To examine whether the test nucleic acid is present in the sample by immobilizing the test nucleic acid or its amplification product, hybridizing with the labeled probe, washing, and measuring the label bound to the solid phase Can do. Alternatively, the measurement polynucleotide can be solid-phased, the test nucleic acid can be hybridized, and the test nucleic acid bound to the solid phase can be detected with a labeled probe or the like. In such a case, the measurement polynucleotide bound to the solid phase is also called a probe. A method for measuring a test nucleic acid using a polynucleotide probe is also well known in this field, and the polynucleotide probe is brought into contact with the test nucleic acid at Tm or in the vicinity thereof (preferably within ± 4 ° C.) in a buffer solution. And washing, and then measuring the template nucleic acid bound to the hybridized labeled probe or solid phase probe. Such methods include well-known methods such as Northern blotting, in situ hybridization, Southern blotting.

また、本発明により、配列番号2のポリペプチドが提供されたので、これと抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を調製することもできる。該抗体又は抗原結合性断片を用いて免疫測定することにより、配列番号2のポリペプチドを測定することができる。ここで、抗原結合性断片とは、抗体分子中に含まれるFab断片やF(ab')2断片のような、抗原との結合能を有する抗体断片を意味する。免疫測定方法については上記したとおりであり、サンドイッチ法による方法であれば、例えば本発明の抗体又は抗原結合性断片を固相に不動化することにより、試料中の配列番号2のポリペプチドを測定することができる。また、固定した体組織切片を試料として用いる場合には、例えば、体組織試料を本発明の抗体又は抗原結合性断片と反応させ、洗浄後、蛍光標識した適当な二次抗体と反応させ、洗浄後、蛍光顕微鏡を組み合わせた測定装置によって測定を行うことにより、体組織中の配列番号2のポリペプチドの局在や存在量を調べることができる。 In addition, since the polypeptide of SEQ ID NO: 2 is provided by the present invention, an antibody or antigen-binding fragment thereof that reacts with the polypeptide can be prepared. The polypeptide of SEQ ID NO: 2 can be measured by immunoassay using the antibody or antigen-binding fragment. Here, the antigen-binding fragment means an antibody fragment having the ability to bind to an antigen, such as a Fab fragment or F (ab ′) 2 fragment contained in an antibody molecule. The immunoassay method is as described above. If the method is based on the sandwich method, the polypeptide of SEQ ID NO: 2 in the sample is measured, for example, by immobilizing the antibody or antigen-binding fragment of the present invention on the solid phase. can do. In the case of using a fixed body tissue section as a sample, for example, the body tissue sample is reacted with the antibody or antigen-binding fragment of the present invention, washed, and then reacted with a suitable fluorescently labeled secondary antibody and washed. Then, by measuring with a measuring device combined with a fluorescence microscope, the localization and abundance of the polypeptide of SEQ ID NO: 2 in the body tissue can be examined.

本発明の抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、免疫測定等のためには、再現性の高いモノクローナル抗体が好ましい。ペプチドを免疫原とするポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の調製方法は周知であり、常法により容易に行なうことができる。例えば、ペプチドをキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)やカゼイン等のキャリアタンパク質に結合させたものを免疫原とし、アジュバントと共に動物に免疫することにより該ペプチドに対する抗体を誘起することができる。免疫した動物から採取した脾細胞やリンパ球のような抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを調製し、本発明のペプチドと結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択し、これを増殖させて培養上清から本発明のポリペプチドを対応抗原とするモノクローナル抗体を得ることができる。なお、上記の方法は周知の常法である。   The antibody of the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but a highly reproducible monoclonal antibody is preferred for immunoassay and the like. Methods for preparing polyclonal and monoclonal antibodies using a peptide as an immunogen are well known and can be easily performed by conventional methods. For example, an antibody against a peptide can be induced by immunizing an animal with an adjuvant using a peptide bound to a carrier protein such as keyhole limpet hemocyanin (KLH) or casein as an immunogen. Hybridomas are prepared by fusing antibody-producing cells such as spleen cells and lymphocytes collected from immunized animals with myeloma cells, and hybridomas producing antibodies that bind to the peptides of the present invention are selected and proliferated. A monoclonal antibody having the polypeptide of the present invention as a corresponding antigen can be obtained from the culture supernatant. The above method is a well-known ordinary method.

下記実施例にある通り、配列番号2のポリペプチドをコードする遺伝子は、精巣と癌細胞に特異的に発現しており、従って、癌細胞中では配列番号2のポリペプチドが健常細胞よりも有意に多く存在していると考えられる。従って、癌の疑いのある患者から得た試料における、該ポリペプチド又はそれをコードする遺伝子の発現量を調べることにより、該患者が癌であるか否かを調べることができる。すなわち、本発明は、癌であるか否かを検出すべき患者から得た試料における、配列番号2に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド又はそれをコードする遺伝子の発現量を調べることを含む、癌の検出方法を提供する。該検出方法は、例えば、患者から得た試料中の前記ポリペプチド又は前記遺伝子の発現量を調べ、これを健常生体から得た試料における発現量と比較することにより行うことができる。健常生体から得た試料における発現量は、一旦多数の健常生体について測定して正常値を定めておけば、それ以後は該正常値と測定値とを比較することにより癌の検出を行うことができる。また、癌を罹患していることが分かっている多数の患者から試料を得て、癌患者における発現量の基準値(異常値)を定め、正常値及び異常値の両者と比較を行なってもよい。発現量が正常値より有意に高く、異常値に近ければ、その患者は癌である可能性が高いと考えられる。正常値との比較のみでも癌の検出は可能であるが、異常値との比較も行うことにより、さらに検出精度を高めることができる。異常値についても、正常値と同様、一旦定めておけばそれ以後はその異常値を比較に用いることができる。なお、正常値及び異常値は、例えば、各試料における発現量を数値化し、その平均値を算出することによって定めることができる。遺伝子やタンパク質の発現量は常法により測定することができる。例えば、遺伝子の発現量は、mRNAを鋳型とするリアルタイム検出RT-PCRのような常法により定量することができ、常法であるノーザンブロットにおける染色強度等によっても概ね定量することができる。また、タンパク質の発現量は、常法である免疫測定により定量することができる。試料としては、例えば哺乳動物由来の体組織等を用いることができる。対象となる患者は哺乳動物であり、好ましくはイヌ、ネコ又はヒトである。   As shown in the Examples below, the gene encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 2 is specifically expressed in testis and cancer cells, and therefore the polypeptide of SEQ ID NO: 2 is more significant in cancer cells than in healthy cells. It is thought that there are many. Therefore, by examining the expression level of the polypeptide or a gene encoding the polypeptide in a sample obtained from a patient suspected of having cancer, it can be determined whether or not the patient has cancer. That is, the present invention relates to a cancer comprising examining the expression level of a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a gene encoding the same in a sample obtained from a patient to be detected whether or not it is cancer. Provide a detection method. The detection method can be performed, for example, by examining the expression level of the polypeptide or the gene in a sample obtained from a patient and comparing it with the expression level in a sample obtained from a healthy living body. The amount of expression in a sample obtained from a healthy organism can be detected by comparing the normal value with the measured value once the normal value is determined by measuring a number of healthy organisms. it can. It is also possible to obtain samples from a large number of patients who are known to have cancer, determine the reference value (abnormal value) of the expression level in cancer patients, and compare it with both normal and abnormal values. Good. If the expression level is significantly higher than the normal value and close to the abnormal value, the patient is considered likely to have cancer. Although detection of cancer is possible only by comparison with normal values, detection accuracy can be further improved by comparison with abnormal values. Regarding the abnormal value, like the normal value, once it is determined, the abnormal value can be used for comparison thereafter. The normal value and the abnormal value can be determined by, for example, converting the expression level in each sample into a numerical value and calculating the average value. The expression level of a gene or protein can be measured by a conventional method. For example, the expression level of a gene can be quantified by a conventional method such as real-time detection RT-PCR using mRNA as a template, and can generally be quantified also by staining intensity in a Northern blot which is a conventional method. The protein expression level can be quantified by a conventional immunoassay. As the sample, for example, a body tissue derived from a mammal can be used. The subject patient is a mammal, preferably a dog, cat or human.

また、上述した通り、ネコ及びヒトにおいても、本発明のポリペプチドと抗原抗体反応するポリクローナル抗体を癌患者特異的に検出し得る(下記実施例参照)。従って、ネコ及びヒト等のイヌ以外の哺乳動物においても、該ポリクローナル抗体の対応抗原であるポリペプチド及びそれをコードする遺伝子が高発現していると考えられるので、該対応抗原又は該遺伝子の発現を調べることによって、該哺乳動物の癌を検出することができる。   In addition, as described above, in cats and humans, a polyclonal antibody that reacts with the polypeptide of the present invention with an antigen-antibody can be detected specifically for cancer patients (see Examples below). Therefore, in mammals other than dogs such as cats and humans, it is considered that the polypeptide that is the corresponding antigen of the polyclonal antibody and the gene encoding it are highly expressed. Can be used to detect cancer in the mammal.

対応抗原ポリペプチドの測定は、周知の免疫測定により容易に行うことができる。ここで、イヌ由来の配列(配列番号2)をもとに調製された本発明のポリペプチドであっても、担癌ネコ等のイヌ以外の担癌生体内で特異的に誘導されている抗体と抗原抗体反応するのであるから、担癌イヌ体内で高発現している抗原ポリペプチド(配列番号2)と、ネコ等のイヌ以外の担癌生体内で高発現している抗原ポリペプチドとは、アミノ酸配列の相同性が高く、エピトープの構造がほぼ一致しているものと考えられる。従って、本発明のポリペプチドを免疫原として用いて調製した抗体は、イヌ以外の担癌生体で高発現している抗原ポリペプチドとも抗原抗体反応し得るので、該抗体を上記した対応抗原ポリペプチドの免疫測定に好ましく用いることができる。すなわち、配列番号2のポリペプチドと抗原抗体反応する上記本発明の抗体又はその抗原結合性断片を用いて、上記した対応抗原ポリペプチドを免疫測定することができる。   The corresponding antigen polypeptide can be easily measured by a well-known immunoassay. Here, even if it is the polypeptide of the present invention prepared based on the sequence derived from a dog (SEQ ID NO: 2), the antibody is specifically induced in a cancer-bearing living body other than a dog, such as a tumor-bearing cat The antigen polypeptide (SEQ ID NO: 2) that is highly expressed in cancer-bearing dogs and the antigen polypeptide that is highly expressed in cancer-bearing organisms other than dogs such as cats It is considered that the homology of amino acid sequences is high and the epitope structures are almost the same. Therefore, an antibody prepared using the polypeptide of the present invention as an immunogen can also react with an antigen polypeptide that is highly expressed in a cancer-bearing organism other than dogs. It can preferably be used for immunoassay. That is, the above-mentioned corresponding antigen polypeptide can be immunoassayed using the antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof that reacts with the polypeptide of SEQ ID NO: 2 by antigen-antibody reaction.

また、担癌生体内で高発現している抗原ポリペプチドをコードする遺伝子も、相互に相同性が高いと考えられるので、配列番号2のポリペプチドをコードする遺伝子(配列番号1)のmRNAと特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、イヌ以外の担癌生体内で高発現する該遺伝子のmRNAとも特異的にハイブリダイズし得る。従って、配列番号1のポリヌクレオチドを測定するための測定用ポリヌクレオチドを用いて、上記した対応抗原ポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を調べることができる。   In addition, since the genes encoding antigen polypeptides highly expressed in cancer-bearing organisms are also considered to be highly homologous to each other, the mRNA of the gene encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 1) and A polynucleotide that specifically hybridizes can also specifically hybridize with mRNA of the gene that is highly expressed in cancer-bearing organisms other than dogs. Therefore, the expression level of the gene encoding the corresponding antigen polypeptide can be examined using the measurement polynucleotide for measuring the polynucleotide of SEQ ID NO: 1.

本発明の抗体又は抗原結合性断片には、マンガンや鉄等の金属を結合させることもできる。そのような金属結合抗体又は抗原結合性断片を体内に投与すると、抗原タンパク質が存在する部位に該抗体又は抗原結合性断片が集積するので、MRI等によって金属を測定すれば、抗原タンパク質を産生する癌細胞の存在を検出することができる。従って、本発明の抗体又は抗原結合性断片は、このような癌の診断剤としても有用であり得る。   A metal such as manganese or iron can be bound to the antibody or antigen-binding fragment of the present invention. When such a metal-binding antibody or antigen-binding fragment is administered into the body, the antibody or antigen-binding fragment accumulates at the site where the antigen protein is present, so if the metal is measured by MRI or the like, an antigen protein is produced. The presence of cancer cells can be detected. Therefore, the antibody or antigen-binding fragment of the present invention can be useful as a diagnostic agent for such cancer.

以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。   Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples.

実施例1:SEREX法による新規癌抗原タンパクの取得
(1)cDNAライブラリの作製
健常な犬の精巣組織から酸−グアニジウム−フェノール−クロロフォルム法(Acid guanidium-Phenol-Chloroform法)により全RNAを抽出し、Oligotex-dT30 mRNA purification Kit(宝酒造社製)を用いてキット添付のプロトコールに従ってポリA RNAを精製した。
Example 1: Acquisition of novel cancer antigen protein by SEREX method (1) Preparation of cDNA library Total RNA was extracted from the testis tissue of a healthy dog by the acid-guanidium-phenol-chloroform method (Acid guanidium-Phenol-Chloroform method). PolyA RNA was purified using Oligotex-dT30 mRNA purification Kit (Takara Shuzo) according to the protocol attached to the kit.

この得られたmRNA(5μg)を用いてイヌ精巣cDNAファージライブラリを合成した。cDNAファージライブラリの作製にはcDNA Synthesis Kit,ZAP-cDNA Synthesis Kit,ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit(STRATAGENE社製)を用い、キット添付のプロトコールに従ってライブラリを作製した。作製したcDNAファージライブラリのサイズは1.3×10pfu/mlであった。 A dog testis cDNA phage library was synthesized using the obtained mRNA (5 μg). The cDNA phage library was prepared using cDNA Synthesis Kit, ZAP-cDNA Synthesis Kit, and ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit (manufactured by STRATAGENE) according to the protocol attached to the kit. The size of the prepared cDNA phage library was 1.3 × 10 6 pfu / ml.

(2)血清によるcDNAライブラリのスクリーニング
上記作製したイヌ精巣由来cDNAファージライブラリを用いて、イムノスクリーニングを行った。具体的にはΦ90×15mmのNZYアガロースプレートに2340 クローンとなるように宿主大腸菌(XL1-Blue MRF')に感染させ、42℃、3〜4時間培養し、溶菌班(プラーク)を作らせ、IPTG(イソプロピル−β−D−チオガラクトシド)を浸透させたニトロセルロースメンブレン(Hybond C Extra: GE Healthecare Bio-Science社製)でプレートを37℃で4時間覆うことによりタンパク質を誘導・発現させ、メンブレンにタンパク質を転写した。その後メンブレンを回収し0.5%脱脂粉乳を含むTBS(10mM Tris-HCl,150mM NaCl pH7.5)に浸し4℃で一晩振盪することによって非特異反応を抑制した。このフィルターを250倍希釈した患犬血清と室温で2〜3時間反応させた。
(2) Screening of cDNA library with serum Immunoscreening was performed using the canine testis-derived cDNA phage library prepared above. Specifically, Φ90 × 15 mm NZY agarose plate was infected with host E. coli (XL1-Blue MRF ′) so as to become 2340 clones, and cultured at 42 ° C. for 3 to 4 hours to make a lysis plaque (plaque). Proteins are induced and expressed by covering the plate with nitrocellulose membrane (Hybond C Extra: GE Healthecare Bio-Science) impregnated with IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) at 37 ° C. for 4 hours. Transcribed protein. Thereafter, the membrane was recovered, immersed in TBS (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl pH 7.5) containing 0.5% nonfat dry milk, and shaken at 4 ° C. overnight to suppress nonspecific reaction. This filter was reacted with a sera of a patient dog diluted 250 times at room temperature for 2 to 3 hours.

上記患犬血清としては、扁平上皮癌の患犬より採取した血清を用いた。これらの血清は−80℃で保存し、使用直前に前処理を行った。血清の前処理方法は、以下の方法による。すなわち、外来遺伝子を挿入していないλ ZAP Express ファージを宿主大腸菌(XL1-BLue MRF')に感染させた後、NZYプレート培地上で37℃、一晩培養した。次いで0.5M NaClを含む0.2M NaHCO3 pH8.3のバッファーをプレートに加え、4℃で15時間静置後、上清を大腸菌/ファージ抽出液として回収した。次に、回収した大腸菌/ファージ抽出液をNHS-カラム (GE Healthecare Bio-Science社製)に通液して、大腸菌・ファージ由来のタンパク質を固定化した。このタンパク固定化カラムに患犬血清を通液・反応させ、大腸菌およびファージに吸着する抗体を血清から取り除いた。カラムを素通りした血清画分は、0.5%脱脂粉乳を含むTBS−T(0.05% Tween20/TBS)にて250倍希釈し、これをイムノスクリーンニング材料とした。 As the above-mentioned dog serum, serum collected from a dog with squamous cell carcinoma was used. These sera were stored at −80 ° C. and pretreated immediately before use. The serum pretreatment method is as follows. That is, λ ZAP Express phage into which no foreign gene was inserted was infected with host E. coli (XL1-BLue MRF ′), and then cultured overnight at 37 ° C. on NZY plate medium. Next, 0.2 M NaHCO 3 pH 8.3 buffer containing 0.5 M NaCl was added to the plate, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. for 15 hours, and then the supernatant was recovered as an E. coli / phage extract. Next, the recovered E. coli / phage extract was passed through an NHS-column (GE Healthecare Bio-Science) to immobilize the E. coli / phage derived protein. Serum dog serum was passed through this protein-immobilized column and reacted, and antibodies adsorbed to E. coli and phage were removed from the serum. The serum fraction passed through the column was diluted 250 times with TBS-T (0.05% Tween20 / TBS) containing 0.5% nonfat dry milk, and this was used as an immunoscreening material.

かかる処理血清と上記融合タンパク質をブロットしたメンブレンをTBST(0.05% Tween20/TBS)にて4回洗浄を行った後、二次抗体として0.5%脱脂粉乳を含むTBSにて3000倍希釈を行ったヤギ抗イヌIgG(Goat anti Dog IgG-h+I HRP conjugated: BETHYL Laboratories社製)を、室温1時間反応させ、NBT/BCIP反応液(Roche社製)を用いた酵素発色反応により検出し、発色反応陽性部位に一致するコロニーをΦ90×15mmのNZYアガロースプレート上から採取し、SM緩衝液(100mM NaCl、10mM MgClSO4、50mM Tris-HCl、0.01% ゼラチン pH7.5)500μlに溶解させた。発色反応陽性コロニーが単一化するまで上記と同様の方法で、二次、三次スクリーニングを繰り返し、血清中のIgGと反応する35360個のファージクローンをスクリーニングして、1個の陽性クローンを単離した。 The membrane on which the treated serum and the fusion protein were blotted was washed 4 times with TBST (0.05% Tween20 / TBS), and then diluted 3000 times with TBS containing 0.5% nonfat dry milk as a secondary antibody. Goat anti-dog IgG (Goat anti Dog IgG-h + I HRP conjugated: manufactured by BETHYL Laboratories) was reacted at room temperature for 1 hour, and detected by an enzyme color reaction using an NBT / BCIP reaction solution (manufactured by Roche) Colonies that coincided with the chromogenic reaction positive site were picked from a Φ90 × 15 mm NZY agarose plate and dissolved in 500 μl of SM buffer (100 mM NaCl, 10 mM MgClSO 4 , 50 mM Tris-HCl, 0.01% gelatin pH 7.5). Repeat the secondary and tertiary screening in the same way as above until the chromogenic positive colonies are unified, and screen for 35360 phage clones that react with IgG in the serum to isolate one positive clone did.

(3)単離抗原遺伝子の相同性検索
上記方法により単離した1個の陽性クローンを塩基配列解析に供するため、ファージベクターからプラスミドベクターに転換する操作を行った。具体的には宿主大腸菌(XL1-Blue MRF')を吸光度OD600が1.0となるよう調製した溶液200μlと、精製したファージ溶液100μlさらにExAssist helper phage (STRATAGENE社製)1μlを混合した後37℃で15分間反応後、LB培地を4ml添加し37℃で2〜3時間培養を行い、直ちに70℃の水浴にて20分間保温した後、4℃ 5000rpm 20分間遠心を行い上清をファージミド溶液として回収した。次いでファージミド宿主大腸菌(SOLR)を吸光度OD600が1.0となるよう調製した溶液100μlと、精製したファージ溶液100μlを混合した後37℃で15分間反させ、100μlをアンピシリン(終濃度50μg/ml)含有LB寒天培地に播き37℃一晩培養した。トランスフォームしたSOLRのシングルコロニーを採取し、アンピシリン(終濃度50μg/ml)含有LB培地37℃にて培養後、PureLink Quick plasmid Miniprep Kit(invitrogen社製)を使って目的のインサートを持つプラスミドDNAを精製した。
(3) Homology search of isolated antigen gene In order to use one positive clone isolated by the above method for base sequence analysis, an operation of converting a phage vector into a plasmid vector was performed. Specifically, 200 μl of a host E. coli (XL1-Blue MRF ′) prepared to have an absorbance OD 600 of 1.0 is mixed with 100 μl of a purified phage solution and 1 μl of ExAssist helper phage (manufactured by STRATAGENE). After reaction at 15 ° C. for 15 minutes, add 4 ml of LB medium, incubate at 37 ° C. for 2 to 3 hours, immediately incubate in a 70 ° C. water bath for 20 minutes, then centrifuge at 4 ° C. and 5000 rpm for 20 minutes to obtain the supernatant as a phagemid solution As recovered. Next, 100 μl of phagemid host Escherichia coli (SOLR) prepared to have an absorbance OD 600 of 1.0 and 100 μl of the purified phage solution were mixed and then inverted at 37 ° C. for 15 minutes, and 100 μl was ampicillin (final concentration 50 μg / ml). ) Seeded on LB agar medium and cultured overnight at 37 ° C. A single colony of transformed SOLR is collected, cultured at 37 ° C. in LB medium containing ampicillin (final concentration 50 μg / ml), and then plasmid DNA having the target insert is prepared using PureLink Quick plasmid Miniprep Kit (manufactured by Invitrogen). Purified.

精製したプラスミドは、配列番号3に記載のT3プライマーと配列番号4に記載のT7プライマーを用いて、プライマーウォーキング法によるインサート全長配列の解析を行った。このシークエンス解析により配列番号1に記載の遺伝子配列を取得した。この遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列を用いて、相同性検索プログラムBLASTサーチ(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)を行い既知遺伝子との相同性検索を行った結果、得られた遺伝子は新規遺伝子であることが判明した。   The purified plasmid was analyzed for the full-length insert sequence by the primer walking method using the T3 primer shown in SEQ ID NO: 3 and the T7 primer shown in SEQ ID NO: 4. By this sequence analysis, the gene sequence described in SEQ ID NO: 1 was obtained. Using the base sequence and amino acid sequence of this gene, a homology search program BLAST search (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) was performed, and homology search with a known gene was performed. The obtained gene was found to be a novel gene.

(4)各組織での発現解析
上記方法により得られた遺伝子に対しイヌ正常組織および各種癌細胞株における発現をRT-PCR(Reverse Transcription-PCR)法により調べた。逆転写反応は以下の通り行なった。すなわち、各組織50−100mgおよび各細胞株5−10×10個の細胞からTRIZOL試薬(invitrogen社製)を用いて添付のプロトコールに従い全RNAを抽出した。この全RNAを用いてSuperscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR(invitrogen社製)により添付のプロトコールに従いcDNAを合成した。PCR反応は、取得した遺伝子特異的なプライマー(配列番号5および6に記載)を用いて以下の通り行った。すなわち、逆転写反応により調製したサンプル0.25μl、上記プライマーを各2μM、0.2mM各dNTP、0.65UのExTaqポリメラーゼ(宝酒造社製)となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を25μlとし、Thermal Cycler(BIO RAD社製)を用いて、94℃−1分、55℃−1分、72℃−30秒のサイクルを30回繰り返して行った。なお、上記遺伝子特異的プライマーは、配列番号1の塩基配列中の40番〜526番塩基の領域を増幅するものであった。比較対照のため、β−アクチン特異的なプライマー(配列番号7および8に記載)も同時に用いた。その結果、図1に示すように、健常なイヌ組織では精巣特異的に強く発現しており、癌細胞株では乳癌細胞株で強い発現が確認された。また、取得した遺伝子の相同因子の発現を併せて確認したところ、ヒト脳腫瘍、マウス大腸癌、マウス悪性黒色腫で強い発現が検出された。
(4) Expression analysis in each tissue Expressions in normal dog tissues and various cancer cell lines were examined by RT-PCR (Reverse Transcription-PCR) for the genes obtained by the above methods. The reverse transcription reaction was performed as follows. That is, total RNA was extracted from 50-100 mg of each tissue and 5-10 × 10 6 cells of each cell line using TRIZOL reagent (manufactured by Invitrogen) according to the attached protocol. Using this total RNA, cDNA was synthesized by Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR (manufactured by Invitrogen) according to the attached protocol. The PCR reaction was performed as follows using the obtained gene-specific primers (described in SEQ ID NOs: 5 and 6). That is, 0.25 μl of the sample prepared by the reverse transcription reaction, 2 μM each of the above primers, 0.2 mM of each dNTP, 0.65 U of ExTaq polymerase (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), each reagent and attached buffer were added, and the total amount was 25 μl The cycle of 94 ° C.-1 min, 55 ° C.-1 min, 72 ° C.-30 sec was repeated 30 times using Thermal Cycler (manufactured by BIO RAD). The gene-specific primer was used to amplify a region of bases 40 to 526 in the base sequence of SEQ ID NO: 1. For comparison, β-actin specific primers (described in SEQ ID NOs: 7 and 8) were also used. As a result, as shown in FIG. 1, it was strongly expressed specifically in testis in healthy dog tissues, and strong expression was confirmed in breast cancer cell lines in cancer cell lines. Moreover, when the expression of the homologous factor of the acquired gene was confirmed together, strong expression was detected in human brain tumor, mouse colon cancer, and mouse malignant melanoma.

なお、図1中、縦軸の参照番号1は、取得した新規遺伝子の発現パターンを、参照番号2は、比較対照であるβ−アクチンの遺伝子の発現パターンを示す。   In FIG. 1, reference number 1 on the vertical axis indicates the expression pattern of the acquired novel gene, and reference number 2 indicates the expression pattern of the gene for β-actin, which is a comparative control.

実施例2:担癌検体由来血清を用いた癌診断
(1)組換えタンパク質の作製(昆虫細胞)
実施例1で取得した遺伝子を基に、以下の方法にて組換えタンパク質を作製した。PCRは、実施例1で得られたファージミド溶液より調製し配列解析に供したベクターを1μl、BamHIおよびEcoRI制限酵素切断配列とエンテロキナーゼ切断部位を含む2種類のプライマー(配列番号9および10に記載)を各1μM, 0.2mM dNTP,1mM MgSO4,1UのKODポリメラーゼ(東洋紡社製)となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を50μlとし、Thermal Cycler (BIO RAD社製)を用いて、94℃−15秒、53℃−30秒、68℃−40秒のサイクルを35回繰り返すことにより行った。なお、上記2種類のプライマーは、配列番号2のアミノ酸配列中の27番アミノ酸から206番アミノ酸までの領域をコードする領域を増幅するものであった。PCR後、増幅されたDNAを1%アガロースゲルにて電気泳動し、QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製)を用いて約560bpのDNA断片を精製した。
Example 2: Cancer diagnosis using cancer-bearing specimen-derived serum (1) Production of recombinant protein (insect cells)
Based on the gene obtained in Example 1, a recombinant protein was produced by the following method. PCR was prepared from the phagemid solution obtained in Example 1 and subjected to sequence analysis. 1 μl of the vector, BamHI and EcoRI restriction enzyme cleavage sequences and two types of primers containing an enterokinase cleavage site (described in SEQ ID NOs: 9 and 10) ) 1 μM, 0.2 mM dNTP, 1 mM MgSO 4 , 1 U of KOD polymerase (Toyobo Co., Ltd.), each reagent and attached buffer are added to make a total volume of 50 μl, and Thermal Cycler (BIO RAD Co.) is used. The cycle of 94 ° C. for 15 seconds, 53 ° C. for 30 seconds, and 68 ° C. for 40 seconds was repeated 35 times. The two kinds of primers mentioned above amplify the region encoding the region from the 27th amino acid to the 206th amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. After PCR, the amplified DNA was electrophoresed on a 1% agarose gel, and a DNA fragment of about 560 bp was purified using QIAquick Gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN).

精製したDNA断片をクローニングベクターpCR-Blunt(invitrogen社製)にライゲーションした。これを大腸菌に形質転換後プラスミドを回収し、増幅された遺伝子断片が目的配列と一致することをシークエンスで確認した。目的配列と一致したプラスミドをBamHI、EcoRI制限酵素で処理し、QIAquick Gel Extraction Kitで精製後、目的遺伝子配列を、BamHI、EcoRI制限酵素で処理した昆虫細胞用発現ベクターpAcGHLT-A(BD Biosciences Pharmingen社製)に挿入した。このベクターの使用によりGST融合型の組み換えタンパク質が産生できる。このプラスミドを用いて目的遺伝子を含む組み換えウイルス体を作製した。組み換えウイルス体作製には、昆虫細胞Sf9とBD baculoGold Transfection Kit(BD Biosciences Pharmingen社製)を用いて、キット添付のプロトコールに従い、目的の遺伝子配列を含む組み換えウイルス体を作製した。このウイルスを昆虫細胞に感染させることで目的タンパク質を昆虫細胞内で発現させた。   The purified DNA fragment was ligated to the cloning vector pCR-Blunt (manufactured by Invitrogen). After transforming this into E. coli, the plasmid was recovered, and it was confirmed by sequencing that the amplified gene fragment matched the target sequence. A plasmid that matches the target sequence was treated with BamHI and EcoRI restriction enzymes, purified with QIAquick Gel Extraction Kit, and then the target gene sequence was treated with BamHI and EcoRI restriction enzymes pAcGHLT-A (BD Biosciences Pharmingen) Inserted). By using this vector, a GST-fused recombinant protein can be produced. A recombinant virus body containing the target gene was prepared using this plasmid. For the production of a recombinant virus body, an insect cell Sf9 and a BD baculoGold Transfection Kit (manufactured by BD Biosciences Pharmingen) were used to prepare a recombinant virus body containing the target gene sequence according to the protocol attached to the kit. The target protein was expressed in insect cells by infecting insect cells with this virus.

Sf9およびSf21昆虫細胞(約2×10個)を150cmフラスコを用いて27℃で3〜4日間TFN−FH昆虫細胞培地(BD Biosciences Pharmingen社製)中で培養した後、Sf-900 SFM無血清培地(invitrogen社製)に置き換え、組み換えウイルス溶液を50〜500μlを培地に添加しさらに27℃で4日間培養後、上清を回収した。 Sf9 and Sf21 insect cells (about 2 × 10 7 cells) were cultured in TFN-FH insect cell medium (BD Biosciences Pharmingen) at 27 ° C. for 3 to 4 days using a 150 cm 2 flask, and then Sf-900 SFM. The serum-free medium (manufactured by Invitrogen) was replaced, 50 to 500 μl of the recombinant virus solution was added to the medium, and further cultured at 27 ° C. for 4 days, and then the supernatant was collected.

組換えタンパク質の産生をウェスタンブロットにより以下の方法で確認した。回収した培養上清に等量の2×泳動バッファー(0.125M Tris-HCl pH6.8, 10% 2ME, 4%SDS,10%Succrose,0.01% BPB)を添加し、95℃で5分間熱処理を行った。その後、サンプルをSDS-PAGEにより分離し、PVDF膜に転写した。タンパクが転写されたPVDF膜を10%ブロックエース(雪印社製)を含むPBSで4℃、一晩、ブロッキングし、その後、抗GSTに対するヤギポリクローナル抗体(GE Healthecare Bio-Science社製)を室温で1時間反応させた。PBSTで3回洗浄し、HRP標識抗ヤギIgG抗体(GE Healthecare Bio-Science社製)を室温で1時間反応させた。PBSTで3回洗浄後、SuperSignal WestFemto(ピアス社製)に反応させ、X線フィルムに感光することで、図2の参照番号3で示されるように、組換えタンパク質の発現を確認した。なお、当該組換えタンパク質は、配列番号2に示すアミノ酸配列のうち、27番アミノ酸から206番アミノ酸までの領域を含むものであった。   Production of the recombinant protein was confirmed by Western blotting in the following manner. Add an equal volume of 2X running buffer (0.125M Tris-HCl pH6.8, 10% 2ME, 4% SDS, 10% Succrose, 0.01% BPB) to the collected culture supernatant and heat-treat at 95 ° C for 5 minutes. went. Thereafter, the sample was separated by SDS-PAGE and transferred to a PVDF membrane. The protein-transferred PVDF membrane was blocked with PBS containing 10% Block Ace (manufactured by Snow Brand) at 4 ° C overnight, and then goat polyclonal antibody against anti-GST (manufactured by GE Healthecare Bio-Science) at room temperature. The reaction was carried out for 1 hour. After washing 3 times with PBST, HRP-labeled anti-goat IgG antibody (GE Healthecare Bio-Science) was reacted at room temperature for 1 hour. After washing with PBST three times, the reaction was carried out with SuperSignal WestFemto (Pierce) and exposed to X-ray film, thereby confirming the expression of the recombinant protein as indicated by reference numeral 3 in FIG. The recombinant protein contained a region from the 27th amino acid to the 206th amino acid in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.

上記方法により得られた可溶性画分を5mlのHi-Trap GSTカラム(GE Healthecare Bio-Science社製)に通液した後、未吸着画分をPBSにて洗浄後、直ちに20mM グルタチオンを含む50mM Tris-HCl pH8.0の緩衝液にて溶出を行い精製画分とし、以降この精製画分を診断用および投与試験用の材料とした。   After passing the soluble fraction obtained by the above method through a 5 ml Hi-Trap GST column (GE Healthecare Bio-Science), the non-adsorbed fraction was washed with PBS, and immediately 50 mM Tris containing 20 mM glutathione. Elution was performed with a buffer solution of -HCl pH 8.0 to obtain a purified fraction, which was subsequently used as a material for diagnosis and administration test.

(2)組換えタンパク質の作製(大腸菌)
さらに、実施例1で取得した遺伝子を基に、以下の方法にて組換えタンパク質を作製した。PCRは、実施例1で得られたファージミド溶液より調製し配列解析に供したベクターを1μl、NdeIおよびXhoI制限酵素切断配列を含む2種類のプライマー(配列番号11および12に記載)を各1μM, 0.2mM dNTP,1mM MgSO4,1UのKODポリメラーゼ(東洋紡社製)となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を50μlとし、Thermal Cycler (BIO RAD社製)を用いて、94℃−15秒、53℃−30秒、68℃−40秒のサイクルを35回繰り返すことにより行った。なお、上記2種類のプライマーは、配列番号2のアミノ酸配列中の27番アミノ酸から206番アミノ酸までの領域をコードする領域を増幅するものであった。PCR後、増幅されたDNAを1%アガロースゲルにて電気泳動し、QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製)を用いて約560bpのDNA断片を精製した。
(2) Production of recombinant protein (E. coli)
Furthermore, based on the gene obtained in Example 1, a recombinant protein was produced by the following method. For PCR, 1 μl of a vector prepared from the phagemid solution obtained in Example 1 and subjected to sequence analysis, 2 μm of primers containing NdeI and XhoI restriction enzyme cleavage sequences (described in SEQ ID NOs: 11 and 12) were each 1 μM, Reagents and attached buffer were added to make 0.2 mM dNTP, 1 mM MgSO 4 , 1 U of KOD polymerase (Toyobo Co., Ltd.) to a total volume of 50 μl, and 94 ° C. for 15 seconds using Thermal Cycler (BIO RAD Co.). The cycle of 53 ° C. for 30 seconds and 68 ° C. for 40 seconds was repeated 35 times. The above two kinds of primers amplify the region encoding the region from the 27th amino acid to the 206th amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. After PCR, the amplified DNA was electrophoresed on a 1% agarose gel, and a DNA fragment of about 560 bp was purified using QIAquick Gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN).

精製したDNA断片をクローニングベクターpCR-Blunt(invitrogen社製)にライゲーションした。これを大腸菌に形質転換後プラスミドを回収し、増幅された遺伝子断片が目的配列と一致することをシークエンスで確認した。目的配列と一致したプラスミドをNdeI、XhoI制限酵素で処理し、QIAquick Gel Extraction Kitで精製後、目的遺伝子配列を、NdeI、XhoI制限酵素で処理した大腸菌用発現ベクターpET16b(Novagen社製)に挿入した。このベクターの使用によりHisタグ融合型の組み換えタンパク質が産生できる。このプラスミドを発現用大腸菌BL21(DE3)に形質転換し、1mM IPTGによる発現誘導を行なうことで目的タンパク質を大腸菌内で発現させた。   The purified DNA fragment was ligated to the cloning vector pCR-Blunt (manufactured by Invitrogen). After transforming this into E. coli, the plasmid was recovered, and it was confirmed by sequencing that the amplified gene fragment matched the target sequence. The plasmid corresponding to the target sequence was treated with NdeI and XhoI restriction enzymes, purified with QIAquick Gel Extraction Kit, and then the target gene sequence was inserted into expression vector pET16b (Novagen) treated with NdeI and XhoI restriction enzymes. . By using this vector, a His-tagged recombinant protein can be produced. This plasmid was transformed into E. coli BL21 (DE3) for expression, and the target protein was expressed in E. coli by inducing expression with 1 mM IPTG.

上記で得られた配列番号1を発現する組換え大腸菌を2%グルコースおよび100μg/mLアンピシリン含有LB培地にて600nmでの吸光度が0.3−0.4付近になるまで25℃で培養後、イソプロピル−β−D-1チオガラクトピラノシド終濃度が0.5mM、クロラムフェニコールが終濃度20μg/mLとなるよう添加し、さらに25℃で一晩培養した。培養後、大腸菌を5000×gで4℃、30分間遠心し、沈殿物を0.1%CHAPSとプロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma社製)の存在下で超音波にて破砕した。その後、16000×gで4℃、30分間遠心し、得られた上精を可溶性画分、沈殿物を不溶性画分とした。   The recombinant E. coli expressing SEQ ID NO: 1 obtained above was cultured at 25 ° C. in an LB medium containing 2% glucose and 100 μg / mL ampicillin until the absorbance at 600 nm was around 0.3-0.4, and then isopropyl-β- D-1 thiogalactopyranoside was added to a final concentration of 0.5 mM and chloramphenicol to a final concentration of 20 μg / mL, and further cultured overnight at 25 ° C. After culturing, E. coli was centrifuged at 5000 × g at 4 ° C. for 30 minutes, and the precipitate was sonicated in the presence of 0.1% CHAPS and protease inhibitor cocktail (Sigma). Thereafter, the mixture was centrifuged at 16000 × g for 30 minutes at 4 ° C., and the resulting supernatant was used as the soluble fraction and the precipitate as the insoluble fraction.

組換えタンパク質の産生をウェスタンブロットにより以下の方法で確認した。回収した培養上清に等量の2×泳動バッファー(0.125M Tris-HCl pH6.8, 10% 2ME, 4%SDS,10%Succrose,0.01% BPB)を添加し、95℃で5分間熱処理を行った。その後、サンプルをSDS-PAGEにより分離し、PVDF膜に転写した。タンパクが転写されたPVDF膜を10%ブロックエース(雪印社製)を含むPBSで4℃、一晩、ブロッキングし、その後、抗His−Tagに対する抗体(Anti-His Antibody Selector Kit、QIAGEN社製)を室温で2−3時間反応させた。PBSTで3回洗浄し、SuperSignal WestFemto(ピアス社製)に反応させ、X線フィルムに感光することで、組換えタンパク質の発現を確認した。なお、当該組換えタンパク質は、配列番号2に示すアミノ酸配列のうち、27番アミノ酸から206番アミノ酸までの領域を含むものであった。   Production of the recombinant protein was confirmed by Western blotting in the following manner. Add an equal volume of 2X running buffer (0.125M Tris-HCl pH6.8, 10% 2ME, 4% SDS, 10% Succrose, 0.01% BPB) to the collected culture supernatant and heat-treat at 95 ° C for 5 minutes. went. Thereafter, the sample was separated by SDS-PAGE and transferred to a PVDF membrane. The protein-transferred PVDF membrane was blocked with PBS containing 10% Block Ace (manufactured by Snow Brand) at 4 ° C overnight, and then an antibody against anti-His-Tag (Anti-His Antibody Selector Kit, manufactured by QIAGEN) Was allowed to react for 2-3 hours at room temperature. The protein was washed 3 times with PBST, reacted with SuperSignal WestFemto (Pierce), and exposed to X-ray film to confirm the expression of the recombinant protein. The recombinant protein contained a region from the 27th amino acid to the 206th amino acid in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.

上記方法により得られた可溶性画分を5mlのHis-Trapカラム(GE Healthecare Bio-Science社製)に通液した後、未吸着画分をPBSにて洗浄後、直ちに10mMイミダゾールを含む50mM Tris-HCl pH8.0の緩衝液にて溶出を行い精製画分とし、以降この精製画分を診断用および投与試験用の材料とした。   The soluble fraction obtained by the above method was passed through a 5 ml His-Trap column (GE Healthecare Bio-Science), and the unadsorbed fraction was washed with PBS, and then immediately containing 50 mM Tris- containing 10 mM imidazole. Elution was performed with a buffer solution of HCl pH 8.0 to obtain a purified fraction, and this purified fraction was used as a material for diagnosis and administration test.

(3)イヌの癌診断
病理診断で悪性と診断された腫瘍を持つ患犬133頭と健常犬6頭より血液を採取し血清を分離した。作製した組換えタンパク質と採取した血清および抗イヌIgG抗体を用いて、ELISA法にて組換えタンパク質特異的IgG抗体を測定した。具体的には、上記(2)で大腸菌を用いて作製した組み換えタンパクをNunc社製96穴イムノプレートに固相化後、0.5% BSAを含む50mM NaHCO3 pH8.3の緩衝液100μlを添加後室温1時間反応させた後、各種癌血清を0.5% BSAを含む50mM NaHCO3 pH8.3の緩衝液にて250倍に希釈を行い反応させた。その後、PBS-T(0.05% Tween 20を含むPBS)にて洗浄した後、ヤギ抗イヌIgG(Goat anti Dog IgG-H+I HRP conjugated:BETHYL Laboratories社製)と基質であるO-フェニレンジアミンを加えて吸光度計を用いて吸光度を測定した。その結果の一部を図3に示す。図3に示すように、担癌生体由来の血清においてのみ有意に高い組換えタンパク質に対する抗体価が検出された。図3中、参照番号4は乳癌の患犬由来の血清を用いた結果であり、参照番号5から参照番号7までは健常犬由来の血清を用いた結果である。
(3) Cancer diagnosis of dogs Blood was collected from 133 diseased dogs with tumors diagnosed as malignant by pathological diagnosis and 6 healthy dogs, and serum was separated. Recombinant protein-specific IgG antibody was measured by ELISA using the prepared recombinant protein, collected serum and anti-dog IgG antibody. Specifically, the recombinant protein prepared using E. coli in (2) above was immobilized on a Nunc 96-well immunoplate, and 100 μl of 50 mM NaHCO 3 pH8.3 buffer containing 0.5% BSA was added. After reacting for 1 hour at room temperature, various cancer sera were reacted by diluting 250 times with a buffer solution of 50 mM NaHCO 3 pH 8.3 containing 0.5% BSA. After washing with PBS-T (PBS containing 0.05% Tween 20), goat anti-dog IgG (Goat anti Dog IgG-H + I HRP conjugated: manufactured by BETHYL Laboratories) and O-phenylenediamine as a substrate were added. In addition, the absorbance was measured using an absorptiometer. A part of the result is shown in FIG. As shown in FIG. 3, a significantly high antibody titer against the recombinant protein was detected only in serum derived from a cancer-bearing organism. In FIG. 3, reference number 4 is a result using serum derived from a breast cancer patient dog, and reference numbers 5 to 7 are results using serum derived from a healthy dog.

上記癌診断に用いた133検体は、各癌種を含む。具体的には、悪性黒色腫、悪性混合腫瘍、肝細胞癌、基底細胞癌、勅細胞腫様歯肉腫、口腔内腫瘤、肛門周囲腺癌、肛門嚢腫瘤、肛門嚢アポクリン腺癌、セルトリ細胞腫、膣前庭癌、皮脂腺癌、皮脂腺上皮腫、脂腺腺腫、汗腺癌、鼻腔内腺癌、鼻腺癌、甲状腺癌、大腸癌、気管支腺癌、腺癌、腺管癌、乳腺癌、複合型乳腺癌、乳腺悪性混合腫瘍、乳管内乳頭状腺癌、線維肉腫、血管周皮腫、骨肉腫、軟骨肉腫、軟部組織肉腫、組織球肉腫、粘液肉腫、未分化肉腫、肺癌、肥満細胞腫、皮膚平滑筋腫、腹腔内平滑筋腫、平滑筋腫、扁平上皮癌、慢性型リンパ球性白血病、リンパ腫、消化管型リンパ腫、消化器型リンパ腫、小〜中細胞型リンパ腫、副腎髄質腫瘍、顆粒膜細胞腫、褐色細胞腫などである。これら担癌犬生体由来の血清は、有意に高い組換えタンパク質に対する抗体価を示した。本診断法による悪性癌判断を健常犬平均値の2倍以上とした場合、約26%(35検体)で悪性癌と診断できることがわかった。   The 133 specimens used for the cancer diagnosis include each cancer type. Specifically, malignant melanoma, malignant mixed tumor, hepatocellular carcinoma, basal cell carcinoma, sputum cell-like gingival tumor, oral mass, perianal adenocarcinoma, anal cyst mass, anal sac apocrine adenocarcinoma, Sertoli cell tumor Vaginal vestibular cancer, sebaceous gland cancer, sebaceous gland epithelioma, sebaceous adenoma, sweat gland cancer, intranasal adenocarcinoma, nasal gland cancer, thyroid cancer, colon cancer, bronchial adenocarcinoma, adenocarcinoma, ductal carcinoma, mammary gland cancer, complex type Breast cancer, Breast malignant mixed tumor, Intraductal papillary adenocarcinoma, Fibrosarcoma, Hemangioperiosteum, Osteosarcoma, Chondrosarcoma, Soft tissue sarcoma, Histiocytosarcoma, Myxosarcoma, Undifferentiated sarcoma, Lung cancer, Mast cell tumor, Cutaneous leiomyoma, intraperitoneal leiomyoma, leiomyoma, squamous cell carcinoma, chronic lymphocytic leukemia, lymphoma, gastrointestinal lymphoma, gastrointestinal lymphoma, small to medium cell lymphoma, adrenal medullary tumor, granulosa cell tumor Pheochromocytoma. These serum derived from cancer-bearing dogs exhibited a significantly high antibody titer against the recombinant protein. It was found that malignant cancer can be diagnosed in about 26% (35 specimens) when the malignant cancer judgment by this diagnostic method is more than twice the average value of healthy dogs.

(4)ネコの癌診断
次に担癌猫および健常猫の診断を行った。上記(2)で大腸菌を用いて作製した組換えタンパク質と抗ネコIgG抗体を用いて、上記と同様にして、該組換えタンパクに特異的に反応するネコ血清中のIgG抗体価を測定した。2次抗体は、HRP修飾抗ネコIgG抗体(PEROXIDASE-CONJUGATED GOAT IgG FRACTION TO CAT IgG (WHOLE MOLECULE): CAPPEL RESERCH REAGENTS社製)をブロッキング溶液にて8000倍希釈して用いた。
(4) Diagnosis of Cat Cancer Next, the diagnosis of cancer-bearing cats and healthy cats was performed. Using the recombinant protein prepared using E. coli in the above (2) and an anti-cat IgG antibody, the IgG antibody titer in cat serum specifically reacting with the recombinant protein was measured in the same manner as described above. As the secondary antibody, an HRP-modified anti-cat IgG antibody (PEROXIDASE-CONJUGATED GOAT IgG FRACTION TO CAT IgG (WHOLE MOLECULE): manufactured by CAPPEL RESERCH REAGENTS) was diluted 8000 times with a blocking solution.

その結果、病理診断で悪性癌と判定された担癌猫3匹では、450nmでの吸光度でいずれも0.3以上の値が検出された。一方、健常猫では全く検出されなかった。   As a result, in three cancer-bearing cats determined to be malignant cancer by pathological diagnosis, a value of 0.3 or more was detected in all at an absorbance at 450 nm. On the other hand, it was not detected at all in healthy cats.

従って犬と同様、ネコの場合も、癌を患った検体では値が検出され、一方健常の検体ではまったく検出されなかったため、ネコについても犬と同様に、本手法にて癌診断が可能であることがわかった。   Therefore, as with dogs, cats can detect cancer with this technique, as with dogs, because values are detected in specimens suffering from cancer, but not in healthy specimens. I understood it.

(5)健常人の診断
上記で作製した組換えタンパク質と抗ヒトIgG抗体を用いて、上記と同様にして、該組換えタンパクに特異的に反応する健常人血清中のIgG抗体価を測定した。2次抗体は、HRP修飾抗ヒトIgG抗体(HRP-Goat Anti-Human IgG(H+L) Conjugate: Zymed Laboratories社製)をブロッキング溶液にて10000倍希釈して用いた。ポジティブコントロールとしてリン酸緩衝化生理食塩水にて50μg/mlに調整した卵白アルブミン抗原を固相化したものを用いた。その結果、450nmでの吸光度は卵白アルブミン抗原では、健常人6人でいずれも0.2以上であったのに対し、この組換えタンパク質には0と全く検出されなかった。
(5) Diagnosis of healthy person Using the recombinant protein and anti-human IgG antibody prepared above, the IgG antibody titer in the serum of a healthy person specifically reacting with the recombinant protein was measured in the same manner as described above. . As the secondary antibody, an HRP-modified anti-human IgG antibody (HRP-Goat Anti-Human IgG (H + L) Conjugate: manufactured by Zymed Laboratories) was diluted 10,000 times with a blocking solution. As a positive control, an ovalbumin antigen that had been adjusted to 50 μg / ml with phosphate buffered saline was used. As a result, the absorbance at 450 nm of the ovalbumin antigen was 0.2 or more in 6 healthy individuals, whereas 0 was not detected at all in this recombinant protein.

実施例3:組み換えタンパク質のイヌ生体内での免疫誘導能評価
実施例2(1)で昆虫細胞を用いて作製した組み換えタンパクの内GST部分を特異的酵素で切断後、精製したものを用いて、健常犬に投与し免疫誘導能の評価を行った。具体的には、Hi-Trap GSTカラムにて精製した画分200μlを1mlの反応緩衝液(20mM Tris-HCl,50mM NaCl,2mM CaCl2 pH7.4)に分注を行った後、エンテロキナーゼ(Novagen社製)2μl添加した後、室温にて一晩静置・反応を行い、GSTを切断し、Enterokinase Cleavage Capture Kit(Novagen社製)を用いてその添付プロトコールに従って精製を行った。
Example 3: Evaluation of immunity induction ability of recombinant protein in dog in vivo Using the recombinant protein prepared by using insect cells in Example 2 (1) after digestion with a specific enzyme and purification. The immunity induction ability was evaluated after administration to healthy dogs. Specifically, 200 μl of the fraction purified with the Hi-Trap GST column was dispensed into 1 ml of a reaction buffer (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl 2 pH 7.4), and then enterokinase ( After adding 2 μl of Novagen), the mixture was allowed to stand and react overnight at room temperature, GST was cleaved, and purification was performed using Enterokinase Cleavage Capture Kit (Novagen) according to the attached protocol.

次に、上記方法によって得られた精製標品1.2mlを、限外ろ過NANOSEP 10K OMEGA(PALL社製)に分注後、4℃、14,000×g、15分遠心を行った後、上層に500μlの生理用リン酸緩衝液(ダルベッコ社製)を添加、この操作を3回繰り返すことにより、精製標品の緩衝液を生理用リン酸緩衝液に置き換えた。この方法によって得られた精製標品を、イヌ生体内での免疫誘導能評価を行うため、精製標品500μlと等量の不完全フロイントアジュバント(和光純薬社製)を混合し、これを健常なイヌの皮下に投与を行った。比較対照となるイヌにおいては生理用リン酸緩衝液(PBS)500μlと等量の不完全フロイントアジュバント(和光純薬社製)を混合調製したものを投与した。免疫誘導能の評価については、一週間経過した時点で前肢より採血した後、血清画分を用いてELISA法により抗体価の測定を行い、免疫誘導能を評価した。その結果、図4に示すように、比較対照となるPBSを投与したコントロールのイヌに対して、有意に高い組み換えタンパクに対する抗体価が検出され、本物質が高い抗原性を持つタンパク質であることが示された。なお、図4中参照番号8,10,12は、それぞれ組換えタンパクを投与後0日、4日、7日後に採取した血清を用いた結果であり、参照番号9,11,13は、それぞれPBSを投与後0日、4日、7日後に採取した血清を用いた結果である。   Next, 1.2 ml of the purified sample obtained by the above method was dispensed to ultrafiltration NANOSEP 10K OMEGA (manufactured by PALL), centrifuged at 4 ° C., 14,000 × g for 15 minutes, and then 500 μl in the upper layer. The physiological buffer solution (manufactured by Dulbecco) was added and this operation was repeated three times to replace the purified sample buffer solution with the physiological phosphate buffer solution. The purified preparation obtained by this method was mixed with 500 μl of the purified preparation and an equal amount of incomplete Freund's adjuvant (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in order to evaluate immunity induction ability in dogs. Administration was performed subcutaneously in a healthy dog. In a comparative dog, a mixture prepared by mixing 500 μl of a physiological phosphate buffer (PBS) and an equal amount of incomplete Freund's adjuvant (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was administered. Regarding the evaluation of immunity induction ability, blood was collected from the forelimbs at the time when one week passed, and then the antibody titer was measured by ELISA using the serum fraction to evaluate the immunity induction ability. As a result, as shown in FIG. 4, a significantly higher antibody titer against the recombinant protein was detected in the control dog administered with PBS as a comparative control, indicating that the substance is a highly antigenic protein. Indicated. In addition, reference numbers 8, 10, and 12 in FIG. 4 are results obtained using sera collected on days 0, 4, and 7 after administration of the recombinant protein, respectively. It is the result using the serum extract | collected on the 0th, 4th, and 7th day after PBS administration.

本発明で新規に同定した遺伝子の、イヌ正常組織および腫瘍細胞株での発現パターンを示す図である。参照番号1;新規遺伝子の発現パターン、参照番号2;β−アクチン遺伝子の発現パターンを示す。It is a figure which shows the expression pattern in the dog normal tissue and tumor cell line of the gene newly identified by this invention. Reference number 1; expression pattern of novel gene, reference number 2; expression pattern of β-actin gene. 昆虫細胞で製造した本発明のポリペプチドとGSTとの融合タンパク質を抗GST抗体で検出した図である。参照番号3;融合タンパク質のバンドを示す。FIG. 3 is a view showing a fusion protein of the polypeptide of the present invention produced in insect cells and GST detected with an anti-GST antibody. Reference number 3; indicates the band of the fusion protein. 実施例で調製した本発明のポリペプチド(組換えタンパク質)に対する、担癌犬由来血清中の抗体の反応性を示す図である。参照番号4;乳癌の患犬由来の血清を用いた結果、参照番号5ないし7;健常犬由来の血清を用いた結果を示す。It is a figure which shows the reactivity of the antibody in the cancer-bearing dog-derived serum with respect to polypeptide (recombinant protein) of this invention prepared in the Example. Reference number 4; results using sera from dogs with breast cancer, reference numbers 5 to 7; results using sera from healthy dogs. 組換えタンパク質を投与したイヌから採取した血清中の、組換えタンパク質に対する抗体価を示す図である。参照番号8;組換えタンパク質、0日後、参照番号9;PBS、0日後、参照番号10;組換えタンパク質、4日後、参照番号11;PBS、4日後、参照番号12;組換えタンパク質、7日後、参照番号13;PBS、7日後の結果を示す。It is a figure which shows the antibody titer with respect to recombinant protein in the serum extract | collected from the dog which administered recombinant protein. Reference number 8; recombinant protein, 0 days later, reference number 9; PBS, 0 days later, reference number 10; recombinant protein, 4 days later, reference number 11; PBS, 4 days later, reference number 12; recombinant protein, 7 days later Reference number 13: PBS, the result after 7 days is shown.

Claims (10)

(ただし、肺癌を除く。)であるか否かを検出すべき患者から得た試料における、配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと抗原抗体反応する抗体を測定することを含む、癌の検出方法。 Measuring an antibody that antigen-antibody reacts with a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in a sample obtained from a patient to be detected whether it is cancer (however, excluding lung cancer). Cancer detection method. 前記試料が血清である請求項記載の方法。 The method of claim 1 wherein said sample is serum. 前記癌が悪性黒色腫、悪性混合腫瘍、肝細胞癌、基底細胞癌、勅細胞腫様歯肉腫、口腔内腫瘤、肛門周囲腺癌、肛門嚢腫瘤、肛門嚢アポクリン腺癌、セルトリ細胞腫、膣前庭癌、皮脂腺癌、皮脂腺上皮腫、脂腺腺腫、汗腺癌、鼻腔内腺癌、鼻腺癌、甲状腺癌、大腸癌、気管支腺癌、腺癌、腺管癌、乳腺癌、複合型乳腺癌、乳腺悪性混合腫瘍、乳管内乳頭状腺癌、線維肉腫、血管周皮腫、骨肉腫、軟骨肉腫、軟部組織肉腫、組織球肉腫、粘液肉腫、未分化肉腫、肥満細胞腫、皮膚平滑筋腫、腹腔内平滑筋腫、平滑筋腫、扁平上皮癌、慢性型リンパ球性白血病、リンパ腫、消化管型リンパ腫、消化器型リンパ腫、小〜中細胞型リンパ腫、副腎髄質腫瘍、顆粒膜細胞腫又は褐色細胞腫である請求項1又は2記載の方法。The cancer is malignant melanoma, malignant mixed tumor, hepatocellular carcinoma, basal cell carcinoma, sputum cell-like gingival tumor, oral mass, perianal adenocarcinoma, anal cyst mass, anal sac apocrine adenocarcinoma, Sertoli cell tumor, vagina Vestibular cancer, sebaceous gland cancer, sebaceous gland epithelioma, sebaceous adenoma, sweat gland cancer, intranasal adenocarcinoma, nasal gland cancer, thyroid cancer, colon cancer, bronchial adenocarcinoma, adenocarcinoma, ductal carcinoma, mammary carcinoma, combined breast cancer Malignant mixed tumor of the breast, intraductal papillary adenocarcinoma, fibrosarcoma, hemangioperiosteum, osteosarcoma, chondrosarcoma, soft tissue sarcoma, histiocytosarcoma, myxosarcoma, anaplastic sarcoma, mastocytoma, cutaneous leiomyoma, Intraperitoneal leiomyoma, leiomyoma, squamous cell carcinoma, chronic lymphocytic leukemia, lymphoma, gastrointestinal lymphoma, gastrointestinal lymphoma, small to medium cell lymphoma, adrenal medullary tumor, granulosa cell tumor or pheochromocytoma The method according to claim 1 or 2. 配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと抗原抗体反応する抗体又は抗原結合性断片を含む癌(ただし、肺癌を除く。)の検出剤。 An agent for detecting cancer (excluding lung cancer) comprising an antibody or antigen-binding fragment that undergoes an antigen-antibody reaction with a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing. 配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を含む癌(ただし、肺癌を除く。)の診断剤。 A diagnostic agent for cancer (excluding lung cancer) comprising an antibody or an antigen-binding fragment thereof that undergoes an antigen-antibody reaction with a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing. (ただし、肺癌を除く。)であるか否かを検出すべき患者から得た試料における、配列番号2に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドと抗原抗体反応するポリクローナル抗体の対応抗原又はそれをコードする遺伝子の発現量を調べることを含む、癌の検出方法。 Corresponding antigen of a polyclonal antibody that reacts with a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in an antigen-antibody reaction in a sample obtained from a patient to be detected whether it is cancer (excluding lung cancer) or the same A method for detecting cancer, comprising examining the expression level of a gene to be treated. (ただし、肺癌を除く。)であるか否かを検出すべき患者から得た試料における、配列番号2に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド又はそれをコードする遺伝子の発現量を調べることを含む、癌の検出方法。 Including examining the expression level of a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a gene encoding the same in a sample obtained from a patient to be detected whether it is cancer (however, excluding lung cancer) , Cancer detection method. 配列表の配列番号1に示される塩基配列中の連続する18塩基以上から成るポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドを用いて、前記試料における、前記遺伝子から生産されるmRNAの存在量を調べることにより、前記遺伝子の発現量を調べる、請求項又は記載の方法。 Produced from the gene in the sample using a polynucleotide consisting of 18 or more consecutive nucleotides in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, or a polynucleotide that specifically hybridizes to the polynucleotide. The method according to claim 6 or 7 , wherein the expression level of the gene is examined by examining the abundance of mRNA. 配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと抗原抗体反応する抗体又は抗原結合性断片を用いて、前記試料における、前記対応抗原の存在量を調べることにより、前記対応抗原の発現量を調べる、請求項記載の方法。 Expression of the corresponding antigen by examining the abundance of the corresponding antigen in the sample using an antibody or antigen-binding fragment that reacts with the polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. The method of claim 6 , wherein the amount is examined. 配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと抗原抗体反応する抗体又は抗原結合性断片を用いて、前記試料における、配列番号2に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドの存在量を調べることにより、前記ポリペプチドの発現量を調べる、請求項記載の方法。 The amount of the polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sample is examined using an antibody or antigen-binding fragment that undergoes an antigen-antibody reaction with the polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing. The method according to claim 7 , wherein the expression level of the polypeptide is examined.
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