JP5645155B2 - Molecular weight marker and method for producing molecular weight marker - Google Patents
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Description
本発明は、イムノグロブリン結合ドメインを有するタンパク質を含有する分子量マーカー及びその作製方法に関するものである。 The present invention relates to a molecular weight marker containing a protein having an immunoglobulin binding domain and a method for producing the same.
従来のタンパク質の電気泳動には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥやｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥなどがある。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、タンパク質を変性剤で処理することにより、非天然の状態で分子量に依存した分離を行う方法である。この方法によれば、分子量マーカーは正確な分子移動度を示すことができる。一方、ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥは、タンパク質を変性剤で処理せず、天然の状態で分離を行う方法である。この方法によれば、タンパク質を天然の状態で分離できるが、等電点により移動度が異なるため、正確な分子量に依存した移動度を示すことができないという欠点がある。
また、タンパク質の機能分析の主要な方法にウェスタンブロット法がある。これは、目的タンパク質に特異的な抗体（１次抗体）と１次抗体に対する化学標識がされた抗体（２次抗体）を用いる手法である。しかし、ウェスタンブロット法では分子量マーカーの検出にも各々の多様な抗体が必要であり、有用な分子量マーカーが少ないのが現状である。
Conventional protein electrophoresis includes SDS-PAGE and native-PAGE. SDS-PAGE is a method of performing separation depending on molecular weight in a non-natural state by treating a protein with a denaturing agent. According to this method, the molecular weight marker can exhibit accurate molecular mobility. On the other hand, native-PAGE is a method in which a protein is separated in a natural state without being treated with a denaturing agent. According to this method, proteins can be separated in a natural state, but since the mobility varies depending on the isoelectric point, there is a drawback that the mobility depending on the exact molecular weight cannot be shown.
The main method for protein functional analysis is Western blotting. This is a technique using an antibody specific to the target protein (primary antibody) and an antibody (secondary antibody) labeled with the primary antibody. However, Western blotting requires various antibodies for detection of molecular weight markers, and currently there are few useful molecular weight markers.
下記の特許文献１には、プロテインＡのＡＢドメインの遺伝子を１〜６個挿入したプラスミドをそれぞれ作製し、それらのプラスミドで形質転換した大腸菌ＪＭ１０９から得られるタンパク質を同量ずつ混合してウェスタンブロット用分子量マーカーを作製することが開示されている。 In Patent Document 1 below, plasmids in which 1 to 6 genes of the AB domain of protein A are inserted are prepared, and the same amount of protein obtained from E. coli JM109 transformed with these plasmids is mixed and Western blotted. Producing a molecular weight marker for use.
また、下記の特許文献２には、サルモネラ菌鞭毛線維タンパク質にギ酸を加えて溶解し、ＢｒＣＮ（ブロモシアン）のギ酸の溶液を加えて断片化反応を行い、この断片化反応によって得られた反応混合物から種々の分子量をもつタンパク質を得る分子量マーカー作製方法が開示されている。これは、一つの分子量を有するタンパク質が化学的又は酵素的に断片化されて得られる断片を、異なる分子量を持つマーカータンパク質として利用するものである。これによれば、複数のマーカータンパク質を個別に生成して混合する手間を省略することができ、コスト的にも優位性があるものである。 In Patent Document 2 below, formic acid is added to and dissolved in Salmonella flagellar fiber protein, a formic acid solution of BrCN (bromocyan) is added to perform a fragmentation reaction, and a reaction mixture obtained by this fragmentation reaction is used. A method for preparing a molecular weight marker for obtaining proteins having various molecular weights is disclosed. In this method, fragments obtained by chemically or enzymatically fragmenting a protein having one molecular weight are used as marker proteins having different molecular weights. According to this, the trouble of separately generating and mixing a plurality of marker proteins can be omitted, which is advantageous in terms of cost.
さらに、下記の特許文献３には、精製したＴｙｐｅＩ ＣＡＴをスルホヒドリル基を有する化合物が存在しない酸化状態で約３０日間放置して、ＴｙｐｅＩ ＣＡＴの会合体からなる分子量マーカーを作製することが開示されている。これは、同一サブユニットから構成される多量体タンパク質を用いることにより、サブユニット間の等電点を同一にし、天然の状態においても分子量に依存した移動度を示すことができるものである。
しかしながら、上記の特許文献１乃至３に開示されている分子量マーカー作製方法では、タンパク質をそれぞれ精製することや精製後に種々の処理をしなければならず、調製のための設備や多くの時間と費用を必要とするという問題点がある。すなわち、上記特許文献１に開示された分子量マーカー作製方法では、６種類の分子量をもつタンパク質をそれぞれ精製することが必要であり、またそれらのタンパク質を混合することも必要となる。また、上記特許文献２に開示された分子量マーカー作製方法では、タンパク質の精製後にそのタンパク質を化学的又は酵素的に切断することが必要となる。さらに、上記特許文献３に開示された分子量マーカー作製方法では、タンパク質の精製後にサブユニットを会合させることが必要であり、それには約３０日間も要してしまう。 However, in the molecular weight marker preparation methods disclosed in Patent Documents 1 to 3, the protein must be purified and subjected to various treatments after the purification, and equipment for preparation and a lot of time and cost are required. There is a problem of requiring. That is, in the molecular weight marker preparation method disclosed in Patent Document 1, it is necessary to purify proteins having six kinds of molecular weights, and it is also necessary to mix these proteins. Moreover, in the molecular weight marker preparation method disclosed in Patent Document 2, it is necessary to chemically or enzymatically cleave the protein after purification of the protein. Furthermore, in the molecular weight marker preparation method disclosed in Patent Document 3, it is necessary to associate subunits after protein purification, which takes about 30 days.
本発明は上記のような問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は短時間で簡便に低コストで作製することが可能な分子量マーカー及びその作製方法を提供することである。 The present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide a molecular weight marker that can be prepared easily in a short time and at low cost, and a method for producing the same.
本発明による分子量マーカー及びその作製方法は、上記の目的の少なくとも一部を達成するために以下の手段をとった。 The molecular weight marker and the production method thereof according to the present invention have taken the following means in order to achieve at least a part of the above object.
本発明の分子量マーカーは、イムノグロブリン結合ドメインを有する一種類のイムノグロブリン結合ドメイン分子がリンカーを介して複数個連結されたポリプロテインと、該ポリプロテインの発現宿主が前記リンカーを切断した分解生成物とを含有する、ことを要旨とする。
これにより、ポリプロテインとその分解生成物を同時に得ることができる。その結果、特別な精製方法を経ずに一回のクロマト精製を行うだけで異なった分子量をもつマーカータンパク質から構成された分子量マーカーを作製することができるので、短時間で簡便に低コストで分子量マーカーを作製することができる。また、分子量マーカーは一種類のイムノグロブリン結合ドメイン分子からなるので、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのように変性剤を用いるときだけでなく、ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥのように変性剤を用いないときでも分子量に依存した移動度を示すことができる。さらに、マーカータンパク質はイムノグロブリン結合ドメインを有するので、ウェスタンブロット法において検出が可能である。また、分解されていないポリプロテインの濃度は大きいので太いバンドとして現れ、分解生成物の濃度は小さいので細いバンドとして現れるため、目的タンパク質の分子量が一見して分かるような分子量マーカーとしての優れた視認性を備えることができる。
The molecular weight marker of the present invention includes a polyprotein in which a plurality of immunoglobulin binding domain molecules having an immunoglobulin binding domain are linked via a linker, and a degradation product obtained by cleaving the linker by the expression host of the polyprotein And containing.
Thereby, polyprotein and its degradation product can be obtained simultaneously. As a result, molecular weight markers composed of marker proteins with different molecular weights can be prepared by performing a single chromatographic purification without going through a special purification method. Markers can be made. In addition, since the molecular weight marker is composed of one type of immunoglobulin binding domain molecule, not only when a denaturing agent is used as in SDS-PAGE, but also when no denaturing agent is used as in native-PAGE. Degree can be shown. Furthermore, since the marker protein has an immunoglobulin binding domain, it can be detected by Western blotting. In addition, since the concentration of undegraded polyprotein is large, it appears as a thick band, and since the concentration of degradation products is small, it appears as a thin band. Can have sex.
また、本発明の分子量マーカーにおいて、ポリプロテインのＣ末端にＣｙｓ残基が導入され、そのＣｙｓ残基同士がジスルフィド結合を介して結合した多量体を含有することを特徴とすることもできる。
これにより、ポリプロテイン同士をジスルフィド結合を介して結合させて、イムノグロブリン結合ドメインを倍数保有させた多量体を作製することができる。その結果、大きい分子量のマーカータンパク質を直接的に作製する必要をなくすことができる。ここで、Ｃｙｓ残基をポリプロテインのＣ末端に導入することで、ポリプロテイン同士をジスルフィド結合を介して結合させやすくすることができる。
In addition, the molecular weight marker of the present invention may be characterized in that it contains a multimer in which a Cys residue is introduced into the C-terminus of the polyprotein and the Cys residues are bonded to each other via a disulfide bond.
As a result, polyproteins can be bound to each other via disulfide bonds to produce multimers having multiple immunoglobulin binding domains. As a result, it is possible to eliminate the need to directly produce a large molecular weight marker protein. Here, by introducing a Cys residue into the C-terminus of the polyprotein, the polyproteins can be easily bonded to each other via a disulfide bond.
また、本発明の分子量マーカーにおいて、ポリプロテインは一種類のイムノグロブリン結合ドメイン分子が２乃至７個連結していることを特徴とすることもできる。
これにより、多くの目的タンパク質に対して分子量マーカーとして利用することができる。
In the molecular weight marker of the present invention, the polyprotein may be characterized in that 2 to 7 immunoglobulin-binding domain molecules are linked.
Thereby, it can utilize as a molecular weight marker with respect to many target proteins.
また、本発明の分子量マーカーにおいて、イムノグロブリン結合ドメイン分子が、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＡ由来の抗体結合ドメイン、ＧｒｏｕｐＧストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）Ｇ１４８のＧタンパク質（ＳｐＧ）由来のＢ１ドメイン、ファインゴルディア・マグナ（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ）由来のＬタンパク質よりなる群から選ばれたものであるものとすることもできる。 In the molecular weight marker of the present invention, the immunoglobulin binding domain molecule is an antibody binding domain derived from Staphylococcus protein A, a B1 domain derived from Group G Streptococcus G148 G protein (SpG), Fine Gordia -It can also be chosen from the group which consists of L protein derived from Magna (Finegoldia magna).
また、本発明の分子量マーカーにおいて、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＡ由来の抗体結合ドメインが、下記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドであることを特徴とすることもできる。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
In the molecular weight marker of the present invention, the antibody binding domain derived from Staphylococcus protein A may be a polypeptide comprising the following amino acid sequence (a) or (b).
(A) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (b) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, wherein one or several amino acids are deleted, substituted or added
また、本発明の分子量マーカーにおいて、ＧｒｏｕｐＧストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）Ｇ１４８のＧタンパク質（ＳｐＧ）由来のＢ１ドメインが、下記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドであることを特徴とすることもできる。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
In the molecular weight marker of the present invention, the B1 domain derived from G protein (SpG) of Group G Streptococcus G148 is a polypeptide comprising the following amino acid sequence (a) or (b): You can also.
(A) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (b) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, wherein one or several amino acids are deleted, substituted or added
また、本発明の分子量マーカーにおいて、ファインゴルディア・マグナ（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ）由来のＬタンパク質が、下記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドであることを特徴とすることもできる。
（ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
Further, in the molecular weight marker of the present invention, the L protein derived from Finegoldia magna may be a polypeptide comprising the following amino acid sequence (a) or (b).
(A) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 (b) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, wherein one or several amino acids have been deleted, substituted or added
本発明の分子量マーカー作製方法は、イムノグロブリン結合ドメインを有する一種類のイムノグロブリン結合ドメイン分子をリンカーを介して複数個連結されたポリプロテインを作成し、ついで、該ポリプロテインの発現宿主が前記リンカーを切断することにより複数の分子量を有する分子量マーカーを作製する、ことを要旨とする。
これにより、ポリプロテインとその分解生成物を同時に得ることができる。その結果、特別な精製方法を経ずに一回のクロマト精製を行うだけで異なった分子量をもつマーカータンパク質から構成された分子量マーカーを作製することができるので、短時間で簡便に低コストで分子量マーカーを作製することができる。また、分子量マーカーは一種類のイムノグロブリン結合ドメイン分子からなるので、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのように変性剤を用いるときだけでなく、ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥのように変性剤を用いないときでも分子量に依存した移動度を示すことができる。さらに、マーカータンパク質はイムノグロブリン結合ドメインを有するので、ウェスタンブロット法において検出が可能である。また、分解されていないポリプロテインの濃度は大きいので太いバンドとして現れ、分解生成物の濃度は小さいので細いバンドとして現れるため、目的タンパク質の分子量が一見して分かるような分子量マーカーとしての優れた視認性を備えることができる。
In the molecular weight marker production method of the present invention, a polyprotein in which a plurality of immunoglobulin binding domain molecules having an immunoglobulin binding domain are linked via a linker is prepared, and then the expression host of the polyprotein is the linker. The gist is that a molecular weight marker having a plurality of molecular weights is produced by cleaving.
Thereby, polyprotein and its degradation product can be obtained simultaneously. As a result, molecular weight markers composed of marker proteins with different molecular weights can be prepared by performing a single chromatographic purification without going through a special purification method. Markers can be made. In addition, since the molecular weight marker is composed of one type of immunoglobulin binding domain molecule, not only when a denaturing agent is used as in SDS-PAGE, but also when no denaturing agent is used as in native-PAGE. Degree can be shown. Furthermore, since the marker protein has an immunoglobulin binding domain, it can be detected by Western blotting. In addition, since the concentration of undegraded polyprotein is large, it appears as a thick band, and since the concentration of degradation products is small, it appears as a thin band. Can have sex.
このように、本発明の分子量マーカー及びその作製方法によれば、ポリプロテインとその分解生成物を同時に得ることができるので、複雑な設備・プロセスを用いることなく短時間で簡便に低コストで分子量マーカーを作製することができる。また、分子量マーカーは一種類のイムノグロブリン結合ドメイン分子からなるので、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのように変性剤を用いるときだけでなく、ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥのように変性剤を用いないときでも分子量に依存した移動度を示すことができる。さらに、マーカータンパク質はイムノグロブリン結合ドメインを有するので、ウェスタンブロット法において検出が可能である。また、分解されていないポリプロテインの濃度は大きいので太いバンドとして現れ、分解生成物の濃度は小さいので細いバンドとして現れるため、目的タンパク質の分子量が一見して分かるような分子量マーカーとしての優れた視認性を備えることができる。 As described above, according to the molecular weight marker of the present invention and the production method thereof, polyprotein and its degradation product can be obtained at the same time. Therefore, the molecular weight can be easily and at low cost in a short time without using complicated facilities and processes. Markers can be made. In addition, since the molecular weight marker is composed of one type of immunoglobulin binding domain molecule, not only when a denaturing agent is used as in SDS-PAGE, but also when no denaturing agent is used as in native-PAGE. Degree can be shown. Furthermore, since the marker protein has an immunoglobulin binding domain, it can be detected by Western blotting. In addition, since the concentration of undegraded polyprotein is large, it appears as a thick band, and since the concentration of degradation products is small, it appears as a thin band, so that it can be seen at a glance as a molecular weight marker that shows the molecular weight of the target protein. Can have sex.
本発明の分子量マーカーは、異なる分子量をもつマーカータンパク質から構成させるものである。そして、それぞれのマーカータンパク質は、イムノグロブリン結合ドメインを有するイムノグロブリン結合ドメイン分子を複数タンデムに連結させたポリプロテイン、そのポリプロテインの分解生成物、又はそれらがジスルフィド結合を介して結合した多量体である。さらに、イムノグロブリン結合ドメイン分子同士はリンカーを介して連結されている。なお、ポロプロテインには倍数体を形成する為のＣｙｓを導入することができる。 The molecular weight marker of the present invention is composed of marker proteins having different molecular weights. Each marker protein is a polyprotein in which an immunoglobulin binding domain molecule having an immunoglobulin binding domain is linked in multiple tandems, a degradation product of the polyprotein, or a multimer in which they are bound via a disulfide bond. is there. Furthermore, immunoglobulin binding domain molecules are linked via a linker. In addition, Cys for forming a polyploid can be introduce | transduced into a poloprotein.
イムノグロブリン結合ドメイン分子とは、イムノグロブリンを結合することができる領域を含む分子をいう。たとえば、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＡ由来の抗体結合ドメイン、Ｇｒｏｕｐ Ｇ ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）Ｇ１４８由来Ｇタンパク質（ＳｐＧ）のＢ１ドメイン（ＳｐＧ−Ｂ）、ファインゴルディア・マグナ（ペプトストレプトコッカス・マグナス）（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｇｎｕｓ））由来のＬタンパク質等が挙げられるが、これに限定されるものではない。
配列番号１はプロテインＡ由来の抗体結合ドメイン（Ｚドメイン）、配列番号２はストレプトコッカスＧ１４８由来Ｇタンパク質のＢ１ドメイン、配列番号３はファインゴルディア・マグナ（ペプトストレプトコッカス・マグナス）由来のＬタンパク質を示す。本明細書において、イムノグロブリン結合ドメイン分子には、上記特定のアミノ酸配列で示されるタンパク質だけでなく、これらのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが包含される。すなわち、上記アミノ酸配列との相同性が、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドも包含される。
図１に、一個のＺドメインを有しそのＣ末端にＣｙｓ残基が導入されているマーカータンパク質（Ｚｈ（１）Ｃｙｓ）、二個のＺドメインを有しそのＣ末端にＣｙｓ残基が導入されているマーカータンパク質（Ｚｈ（２）Ｃｙｓ）、三個のＺドメインを有しそのＣ末端にＣｙｓ残基が導入されているマーカータンパク質（Ｚｈ（３）Ｃｙｓ）、四個のＺドメインを有しそのＣ末端にＣｙｓ残基が導入されているマーカータンパク質（Ｚｈ（４）Ｃｙｓ）、五個のＺドメインを有しそのＣ末端にＣｙｓ残基が導入されているマーカータンパク質（Ｚｈ（５）Ｃｙｓ）、六個のＺドメインを有しそのＣ末端にＣｙｓ残基が導入されているマーカータンパク質（Ｚｈ（６）Ｃｙｓ）、ポリプロテインすなわち七個のＺドメインを有しそのＣ末端にＣｙｓ残基が導入されているマーカータンパク質（Ｚｈ（７Ｃｙｓ））を示す。
図２に、Ｚｈ（１）Ｃｙｓ二量体のマーカータンパク質、Ｚｈ（２）Ｃｙｓ二量体のマーカータンパク質、Ｚｈ（３）Ｃｙｓ二量体のマーカータンパク質、Ｚｈ（４）Ｃｙｓ二量体のマーカータンパク質、Ｚｈ（５）Ｃｙｓ二量体のマーカータンパク質、Ｚｈ（６）Ｃｙｓ二量体のマーカータンパク質、Ｚｈ（７）Ｃｙｓ二量体のマーカータンパク質を示す。なお、ここでは、二量体を示すが、二量体に限定されず三量体以上の多量体でもよい。
An immunoglobulin binding domain molecule refers to a molecule comprising a region that can bind an immunoglobulin. For example, an antibody binding domain derived from Staphylococcus protein A, a B1 domain (SpG-B) of Group G Streptococcus G148-derived G protein (SpG), Fine Gordia magna (Peptostreptococcus magnus) Examples include L protein derived from (Finegoldia magna (Peptostreptococcus magnus)), but are not limited thereto.
SEQ ID NO: 1 is an antibody binding domain (Z domain) derived from protein A, SEQ ID NO: 2 is a B1 domain of G protein derived from Streptococcus G148, SEQ ID NO: 3 is an L protein derived from Fine Gordia magna (Peptostreptococcus magnus) Show. In the present specification, the immunoglobulin binding domain molecule includes not only the protein represented by the specific amino acid sequence but also an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in these amino acid sequences. Polypeptides are included. That is, a polypeptide comprising an amino acid sequence having a homology with the amino acid sequence of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more is also included.
Figure 1 shows a marker protein (Zh (1) Cys) that has one Z domain and a Cys residue introduced at its C-terminus, and a Cys residue that has two Z domains and its C-terminus. Marker protein (Zh (2) Cys), a marker protein (Zh (3) Cys) that has three Z domains and a Cys residue introduced at its C-terminus, has four Z domains And a marker protein having a Cys residue introduced at its C-terminus (Zh (4) Cys), a marker protein having five Z domains and having a Cys residue introduced at its C-terminus (Zh (5) Cys), a marker protein having six Z domains and having a Cys residue introduced at its C-terminus (Zh (6) Cys), a polyprotein, that is, having seven Z domains and having C at its C-terminus Marker proteins s residues are introduced showing the (Zh (7Cys)).
FIG. 2 shows a marker protein of Zh (1) Cys dimer, marker protein of Zh (2) Cys dimer, marker protein of Zh (3) Cys dimer, marker of Zh (4) Cys dimer Protein, Zh (5) Cys dimer marker protein, Zh (6) Cys dimer marker protein, Zh (7) Cys dimer marker protein. In addition, although a dimer is shown here, it is not limited to a dimer, A multimer more than a trimer may be sufficient.
ここで、リンカーとは、イムノグロブリン結合ドメイン分子同士を連結させるペプチドであり、発現宿主に存在するプロテアーゼによって切断可能なペプチドであり、５〜３０個のアミノ酸残基好ましくは５〜１０個のアミノ酸残基を有するペプチドである。たとえば、ＧＰＧＰを含んだ配列にＧＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）を組み合わせた配列や、（Ｇ４Ｓ）が１〜４回繰り返された配列（（Ｇ４Ｓ）１〜（Ｇ４Ｓ）３）や、ＧＰＧＰが繰り返された配列が挙げられるが、これに限定されるものではない。なお、リンカーは切断認識部位以外は特に限定されない。切断部位は、通常ＧＰＧＰと考えられるが、その他の部位が少量混在していても良い。また、連結されるイムノグロブリン結合ドメイン分子は好ましくは７個であり、これにより分子量の範囲を７．２ｋＤａ〜１０２．０ｋＤａまでカバーすることができる。さらに、連結されるイムノグロブリン結合ドメイン分子を増やすことで、より広い分子量の範囲をカバーすることができる。 Here, the linker is a peptide that links immunoglobulin-binding domain molecules, is a peptide that can be cleaved by a protease present in the expression host, and has 5 to 30 amino acid residues, preferably 5 to 10 amino acids. It is a peptide having a residue. For example, a sequence in which GGGGS (G 4 S) is combined with a sequence containing GPGP, a sequence in which (G 4 S) is repeated 1 to 4 times ((G 4 S) 1 to (G 4 S) 3 ), , GPGP is repeated, but is not limited thereto. The linker is not particularly limited except for the cleavage recognition site. The cleavage site is usually considered GPGP, but a small amount of other sites may be mixed. In addition, the number of immunoglobulin binding domain molecules to be linked is preferably 7, which can cover the molecular weight range from 7.2 kDa to 102.0 kDa. Furthermore, a wider range of molecular weights can be covered by increasing the number of immunoglobulin binding domain molecules linked.
ここで、発現宿主とは導入された遺伝子に基づいてタンパク質を発現するものをいう。たとえば、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株、ＤＨ５アルファ株、ＪＭ１０９株、ＸＬ−１Ｂｌｕｅ株などのタンパク質発現が可能な原核生物（枯草菌、乳酸菌など）や、酵母などのタンパク質発現系が確立できている真核生物（酵母、培養細胞）などが挙げられるが、これに限定されるものではない。また、化学的又は酵素的にもポリプロテインを低分子量化できるのはもちろんであるが、発現宿主を利用すれば、発現宿主に遺伝子を導入するだけで発現宿主がポリプロテインを様々なリンカーで切断することができる Here, the expression host refers to one that expresses a protein based on the introduced gene. For example, prokaryotic organisms (such as Bacillus subtilis and lactic acid bacteria) capable of expressing proteins such as Escherichia coli BL21 (DE3) strain, DH5 alpha strain, JM109 strain, and XL-1 Blue strain, and protein expression systems such as yeast have been established. Examples include, but are not limited to, nuclear organisms (yeast, cultured cells). In addition, it is possible to reduce the molecular weight of a polyprotein chemically or enzymatically, but if an expression host is used, the expression host can cleave the polyprotein with various linkers simply by introducing the gene into the expression host. can do
以下、実施例を用いて本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated further in detail using an Example, this invention is not limited to a following example.
実施例１：
イムノグロブリン結合ドメイン分子をタンデムに繋いだ遺伝子の構築
下記の方法により、イムノグロブリン結合ドメイン分子としてスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＡ由来の抗体結合ドメインであるＺドメイン（Ｚｈ）を採用し、それをクローニングした。具体的にはタンパク質のＣ末端にＣｙｓを導入する為に、大腸菌のＣｙｓのコドンに最適化するようにＴＧＣの塩基配列を含んだオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＺドメインにＣｙｓを導入した。用いたプライマーは配列番号４のセンスプライマーおよび配列番号５のアンチセンスプライマーであり、これらの合成オリゴを作製し、アニールさせた後にｐＣＲ２．１ベクターに導入し、大腸菌ＤＨ５アルファに一般的なリン酸カルシウム法によって形質転換させた。さらにベクターに存在する薬剤耐性マーカーであるアンピシリンによってスクリーニングを行い、目的の遺伝子導入クローンを選択し、Ｚドメインのクローニングを完了した。塩基配列を確認後、配列番号６のセンスプライマーおよび配列番号７のアンチセンスプライマーの合成オリゴを作製し、ＰＣＲで増幅し、制限酵素ＮｃｏＩ、ＸｈｏＩで処理した後にｐＥＴ−２１ｄベクターのＮｃｏＩ、ＸｈｏＩ部位に再度クローニング（サブクローニング）を行い、一個のＺドメインを有しそのＣ末端にＣｙｓ残基が導入されているマーカータンパク質をコードする遺伝子（ｐＥＴ−２１ｄ−Ｚｈ（１）Ｃｙｓ）の構築を完了した。
次に、配列番号８のアンチセンスプライマーの合成オリゴを作製し、先に合成した配列番号６のセンスプライマーとの組み合わせで、複数個遺伝子的に連結した形（タンデム）に挿入するＺドメイン遺伝子をＰＣＲで増幅し、ＮｃｏＩ、ＰｃｉＩで処理した後に、ｐＥＴ−２１ｄ−Ｚｈ（１）ＣｙｓのＮｃｏＩ部位にクローニングし、塩基配列を確認して、二個のＺドメインを有しそのＣ末端にＣｙｓ残基が導入されているマーカータンパク質をコードする遺伝子（ｐＥＴ−２１ｄ−Ｚｈ（２）Ｃｙｓ）の構築を完了させた。このようにＺドメインの挿入を繰り返すことで、三個のＺドメインを有しそのＣ末端にＣｙｓ残基が導入されているマーカータンパク質をコードする遺伝子（ｐＥＴ−２１ｄ−Ｚｈ（３）Ｃｙｓ）、四個のＺドメインを有しそのＣ末端にＣｙｓ残基が導入されているマーカータンパク質をコードする遺伝子（ｐＥＴ−２１ｄ−Ｚｈ（４）Ｃｙｓ）、五個のＺドメインを有しそのＣ末端にＣｙｓ残基が導入されているマーカータンパク質をコードする遺伝子（ｐＥＴ−２１ｄ−Ｚｈ（５）Ｃｙｓ）、六個のＺドメインを有しそのＣ末端にＣｙｓ残基が導入されているマーカータンパク質をコードする遺伝子（ｐＥＴ−２１ｄ−Ｚｈ（６）Ｃｙｓ）、七個のＺドメインを有しそのＣ末端にＣｙｓ残基が導入されているマーカータンパク質をコードする遺伝子（ｐＥＴ−２１ｄ−Ｚｈ（７）Ｃｙｓ）を構築した。
これらのイムノグロブリン結合ドメイン分子の連結を担っているリンカーはＧＰＧＰＧＨからなるアミノ酸配列であり、本配列が大腸菌に存在するプロテアーゼによって特異的に認識され、部分分解を起こすことができる。
Example 1:
Construction of gene in which immunoglobulin-binding domain molecule is linked in tandem According to the following method, a Z-domain (Zh) which is an antibody-binding domain derived from Staphylococcus protein A is adopted as an immunoglobulin-binding domain molecule. Cloned. Specifically, in order to introduce Cys into the C-terminus of the protein, Cys was introduced into the Z domain using an oligonucleotide primer containing a TGC base sequence so as to optimize the Cys codon of E. coli. The primers used were the sense primer of SEQ ID NO: 4 and the antisense primer of SEQ ID NO: 5. These synthetic oligos were prepared, annealed, introduced into the pCR2.1 vector, and the calcium phosphate method commonly used for E. coli DH5alpha Was transformed by. Furthermore, screening was carried out with ampicillin, which is a drug resistance marker present in the vector, and the target gene-introduced clone was selected to complete the cloning of the Z domain. After confirming the base sequence, a synthetic oligo of the sense primer of SEQ ID NO: 6 and the antisense primer of SEQ ID NO: 7 was prepared, amplified by PCR, treated with restriction enzymes NcoI and XhoI, and then the NcoI and XhoI sites of the pET-21d vector Cloning (subcloning) was completed, and the construction of a gene (pET-21d-Zh (1) Cys) encoding a marker protein having one Z domain and having a Cys residue introduced at the C-terminus thereof was completed. .
Next, a synthetic oligo of the antisense primer of SEQ ID NO: 8 is prepared, and a Z domain gene to be inserted into a plurality of genetically linked forms (tandem) in combination with the previously synthesized sense primer of SEQ ID NO: 6 After amplification by PCR and treatment with NcoI and PciI, cloning into the NcoI site of pET-21d-Zh (1) Cys, confirming the nucleotide sequence, it has two Z domains and the Cys residue at the C-terminus Construction of the gene (pET-21d-Zh (2) Cys) encoding the marker protein into which the group was introduced was completed. By repeating the insertion of the Z domain in this way, a gene (pET-21d-Zh (3) Cys) encoding a marker protein having three Z domains and having a Cys residue introduced at the C-terminus thereof, A gene (pET-21d-Zh (4) Cys) encoding a marker protein having four Z domains and having a Cys residue introduced at the C-terminus, and having five Z domains at the C-terminus Gene encoding a marker protein into which a Cys residue has been introduced (pET-21d-Zh (5) Cys), which encodes a marker protein having six Z domains and having a Cys residue introduced at the C-terminus Gene (pET-21d-Zh (6) Cys), which encodes a marker protein having seven Z domains and having a Cys residue introduced at its C-terminus That was constructed gene (pET-21d-Zh (7) Cys).
The linker responsible for linking these immunoglobulin binding domain molecules is an amino acid sequence consisting of GPPGPH, and this sequence can be specifically recognized by proteases present in E. coli and can cause partial degradation.
実施例２：
Ｚｈ（７）Ｃｙｓの製造
ｐＥＴ−２１ｄ−Ｚｈ（７）Ｃｙｓの構築完了後、タンパク質発現大腸菌株であるＢＬ２１（ＤＥ３）に再度、リン酸カルシウム法によって形質転換させ、アンピシリンによってスクリーニング後、ポリプロテインであるＺｈ（７）Ｃｙｓの発現コンストラクトを構築した。Ｚｈ（７）Ｃｙｓの発現としてはｐＥＴ−２１ｄ−Ｚｈ（７）Ｃｙｓを含有するＢＬ２１（ＤＥ３）株のフリーズストックから１０μｌを一般的なＬＢ−アンピシリン含有培地１００ｍｌに植菌し、３７℃一昼夜、前培養した。つづいて２５０ｍｌのＬＢ−アンピシリン培地４本に植えつぎ（Ｔｏｔａｌ １Ｌ）、３７℃で１．５時間培養した。この時点で吸光度測定装置を使って濁度ＯＤ ６００ ｎｍを測定し、ＯＤ ＝ ０．４から０．６であることを確認し、最終濃度が１ｍＭになるようにイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加えて、３７℃で一昼夜培養し、タンパク質の発現誘導を行なった。これにより、ポリプロテインに導入されているＣｙｓ残基同士がジスルフィド結合を介して結合した多量体のマーカータンパク質を得ることができた。ここで、ＢＬ２１（ＤＥ３）株にタンパク質の発現を誘導し、またポリプロテインに導入されているＣｙｓ残基同士がジスルフィド結合を介して結合するためには、実験温度を３０℃〜３７℃好ましくは３７℃にすることが必要である。発現誘導後、菌体と培養上清を８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、培養上清を０．４５μｍのフィルターで濾過したものを粗精製サンプルとした。
精製法としてはＩｇＧセファロース樹脂（ＧＥヘルスケア社）１０ｍｌをオープンカラムに詰めて精製カラムを用意した。カラムの平衡化溶液としてカラム容量の２〜３倍量のＴＳＴ緩衝液（ｐＨ ８．０）でｐＨが８．０になるまで平衡化し、次にカラム容量の２〜３倍量の０．５Ｍ酢酸溶液（ｐＨ ３．５）を流し、ｐＨが３．５になるまで平衡化し、このステップを二回繰り返し、最終的にＴＳＴ緩衝液（ｐＨ８．０）でｐＨが８．０になるまで平衡化した（ＴＳＴ→酢酸→ＴＳＴ→酢酸→ＴＳＴ）。粗精製サンプルを自然落下、もしくはペリスタポンプ等でカラムに通し、アフィニティークロマトグラフィーを実施した。
粗精製サンプルのクロマト展開後、１０倍量のＴＳＴ緩衝液（ｐＨ ８．０）で洗浄し、次に２倍量の０．５Ｍ酢酸アンモニウム溶液（ｐＨ ５．５）で洗浄した。洗浄後、溶出緩衝液（０．５ Ｍ酢酸溶液（ｐＨ ３．５）を用いて５０ｍｌで溶出した。精製過程で各々分取している培養上清、素通り画分、洗浄画分、溶出画分を１５％アクリルアミド濃度ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。電気泳動後のＣＢＢ染色によって、タンパク質の発現様相を確認し、溶出画分にＺｈ（７）Ｃｙｓの発現が確認出来た後で限外濾過膜（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４、３０Ｋ）にて濃縮し、ＰＢＳで置換した。ＰＩＥＲＣＥ社のＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ （ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ）試薬を用いたＢＣＡ法により定量したところ、Ｚｈ（７）Ｃｙｓ融合タンパク質の濃度は８．１８ｍｇ／ｍｌであり、１Ｌの培養から回収できる総タンパク質量は８．１８ｍｇとなった。
Example 2:
Production of Zh (7) Cys After completion of construction of pET-21d-Zh (7) Cys, BL21 (DE3), a protein-expressing Escherichia coli strain, was transformed again by the calcium phosphate method, and after screening with ampicillin, it was a polyprotein. An expression construct for Zh (7) Cys was constructed. For expression of Zh (7) Cys, 10 μl of BL21 (DE3) strain freeze stock containing pET-21d-Zh (7) Cys was inoculated into 100 ml of a general LB-ampicillin-containing medium, and kept at 37 ° C. overnight. Pre-cultured. Subsequently, the cells were planted in 4 250 ml LB-ampicillin media (Total 1 L) and cultured at 37 ° C. for 1.5 hours. At this point, the turbidity OD 600 nm is measured using an absorbance measurement apparatus, and it is confirmed that OD = 0.4 to 0.6, and isopropyl-β-thiogalactopyrano is obtained so that the final concentration is 1 mM. Sid (IPTG) was added and cultured overnight at 37 ° C. to induce protein expression. Thereby, it was possible to obtain a multimeric marker protein in which Cys residues introduced into the polyprotein were bonded via a disulfide bond. Here, in order to induce protein expression in the BL21 (DE3) strain and to bind Cys residues introduced into the polyprotein via disulfide bonds, the experimental temperature is preferably 30 ° C. to 37 ° C. It is necessary to bring the temperature to 37 ° C. After the expression induction, the cells and the culture supernatant were centrifuged at 8000 rpm for 20 minutes, and the culture supernatant was filtered through a 0.45 μm filter to obtain a crudely purified sample.
As a purification method, 10 ml of IgG sepharose resin (GE Healthcare) was packed in an open column to prepare a purification column. Equilibrate until the pH reaches 8.0 with 2-3 times the column volume of TST buffer (pH 8.0) as the column equilibration solution, and then 0.5 to 3 times the column volume to 0.5 M Flow acetic acid solution (pH 3.5), equilibrate until pH is 3.5, repeat this step twice and finally equilibrate with TST buffer (pH 8.0) until pH is 8.0 (TST → acetic acid → TST → acetic acid → TST). The crudely purified sample was naturally dropped or passed through a column with a peristaltic pump or the like, and affinity chromatography was performed.
After chromatographic development of the crudely purified sample, it was washed with 10 volumes of TST buffer (pH 8.0), and then washed with 2 volumes of 0.5 M ammonium acetate solution (pH 5.5). After washing, elution was carried out with 50 ml using an elution buffer (0.5 M acetic acid solution (pH 3.5). Culture supernatant, flow-through fraction, washing fraction, elution fraction each collected during the purification process. The protein was analyzed by 15% acrylamide concentration SDS-PAGE, and the protein expression was confirmed by CBB staining after electrophoresis, and the expression of Zh (7) Cys was confirmed in the eluted fraction. It was concentrated with (Amicon Ultra-4, 30K) and replaced with PBS, and the concentration of Zh (7) Cys fusion protein was determined by BCA method using BCA Protein Assay Reagent (bicinchonic acid) reagent of PIERCE. The total amount of protein recovered from 1 L of culture was 8.18 mg.
実施例３：Ｚｈ（７）Ｃｙｓの分子量の確認
発現精製したポリプロテインであるＺｈ（７）ＣｙｓをＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を行った結果、Ｚｈ（１）ＣｙｓからＺｈ（７）Ｃｙｓ、及びそれらのＣｙｓ残基がジスルフィド結合により結合した各二量体が存在していることを確認した。具体的には、１５％アクリルアミド濃度ＳＤＳ−ＰＡＧＥにＺｈ（７）Ｃｙｓを２μｇ／レーンの濃度でアプライし、電気泳動後ＣＢＢ染色を行った結果、下記の表１に示す分子量をもつタンパク質の存在が確認できた。
Example 3: Confirmation of molecular weight of Zh (7) Cys As a result of SDS-PAGE analysis of Zh (7) Cys, which is an expression-purified polyprotein, Zh (1) Cys to Zh (7) Cys and their It was confirmed that each dimer in which a Cys residue was bonded by a disulfide bond was present. Specifically, as a result of applying Zh (7) Cys at a concentration of 2 μg / lane to 15% acrylamide concentration SDS-PAGE, and performing CBB staining after electrophoresis, the presence of proteins having the molecular weights shown in Table 1 below Was confirmed.
上記の表１から分かるように、単量体については、Ｚｈ（１）Ｃｙｓの分子量である７．２ｋＤａ、Ｚｈ（２）Ｃｙｓの分子量である１４．５ｋＤａ、Ｚｈ（３）Ｃｙｓの分子量である２１．７ｋＤａ、Ｚｈ（４）Ｃｙｓの分子量である２９．０ｋＤａ、Ｚｈ（５）Ｃｙｓの分子量である３６．３ｋＤａ、Ｚｈ（６）Ｃｙｓの分子量である４３．５ｋＤａ、Ｚｈ（７）Ｃｙｓの分子量である５０．８ｋＤａのタンパク質の存在が確認できた。さらに、Ｚｈ（１）ＣｙｓからＺｈ（７）ＣｙｓのＣｙｓ残基がジスルフィド結合により結合した各二量体については、Ｚｈ（１）Ｃｙｓ二量体の分子量である１４．５ｋＤａ、Ｚｈ（２）Ｃｙｓ二量体の分子量である２９．０ｋＤａ、Ｚｈ（３）Ｃｙｓ二量体の分子量である４３．５ｋＤａ、Ｚｈ（４）Ｃｙｓ二量体の分子量である５８．０ｋＤａ、Ｚｈ（５）Ｃｙｓ二量体の分子量である７２．６ｋＤａ、Ｚｈ（６）Ｃｙｓ二量体の分子量である８７．０ｋＤａ、Ｚｈ（７）Ｃｙｓ二量体の分子量である１０２．０ｋＤａのタンパク質の存在が確認できた。 As can be seen from Table 1 above, the monomers are 7.2 kDa which is the molecular weight of Zh (1) Cys, 14.5 kDa which is the molecular weight of Zh (2) Cys, and the molecular weight of Zh (3) Cys. 21.7 kDa, the molecular weight of Zh (4) Cys 29.0 kDa, the molecular weight of Zh (5) Cys 36.3 kDa, the molecular weight of Zh (6) Cys, 43.5 kDa, the molecular weight of Zh (7) Cys The presence of 50.8 kDa protein was confirmed. Furthermore, for each dimer in which the Cys residues of Zh (1) Cys to Zh (7) Cys are linked by a disulfide bond, the molecular weight of Zh (1) Cys dimer is 14.5 kDa, Zh (2) The molecular weight of the Cys dimer is 29.0 kDa, the molecular weight of the Zh (3) Cys dimer is 43.5 kDa, the molecular weight of the Zh (4) Cys dimer is 58.0 kDa, the Zh (5) Cys dimer The presence of a protein of 72.6 kDa which is the molecular weight of the monomer, 87.0 kDa which is the molecular weight of the Zh (6) Cys dimer, and 102.0 kDa which is the molecular weight of the Zh (7) Cys dimer was confirmed.
図３は、同様にして作製したＺｈ（１）ＣｙｓからＺｈ（７）Ｃｙｓまでの分子量マーカーをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、そのゲルをＣＢＢ染色した図面である。ここでは、Ｚｈ（１）ＣｙｓからＺｈ（７）Ｃｙｓまでの分子量マーカーを２μｇずつ１２．５％アクリルアミドゲルに供与して電気泳動を行った後、染色している。各レーンはそれぞれ次のものを示す。すなわち、レーンＭはＢｉｏ−Ｒａｄ社の分子量マーカーを、レーン１はＺｈ（１）Ｃｙｓを、レーン２はＺｈ（２）Ｃｙｓを、レーン３はＺｈ（３）Ｃｙｓを、レーン４はＺｈ（４）Ｃｙｓを、レーン５はＺｈ（５）Ｃｙｓを、レーン６はＺｈ（６）Ｃｙｓを、レーン７はＺｈ（７）Ｃｙｓをそれぞれ示す。各レーンにおける実線で囲まれたバンドは、単量体のマーカータンパク質を示す。また、各レーンにおける点線で囲まれたバンドは、二量体のマーカータンパク質を示す。そして、単量体と二量体のマーカータンパク質を示すバンド以外のバンドは、単量体又は二量体のマーカータンパク質に存在するリンカーに部分切断が起きることにより生じた分解生成物を示す。また、図面の左側に指標となる分子量を示す。 FIG. 3 is a drawing in which molecular weight markers from Zh (1) Cys to Zh (7) Cys prepared in the same manner were subjected to SDS-PAGE and the gel was stained with CBB. Here, 2 μg of molecular weight markers from Zh (1) Cys to Zh (7) Cys are donated to a 12.5% acrylamide gel, and then stained. Each lane shows the following: That is, Lane M is a molecular weight marker of Bio-Rad, Lane 1 is Zh (1) Cys, Lane 2 is Zh (2) Cys, Lane 3 is Zh (3) Cys, Lane 4 is Zh (4 ) Cys, Lane 5 represents Zh (5) Cys, Lane 6 represents Zh (6) Cys, and Lane 7 represents Zh (7) Cys. A band surrounded by a solid line in each lane indicates a monomeric marker protein. In addition, a band surrounded by a dotted line in each lane indicates a dimeric marker protein. Bands other than those indicating the monomeric and dimeric marker proteins indicate degradation products generated by partial cleavage of the linker present in the monomeric or dimeric marker protein. Moreover, the molecular weight used as a parameter | index is shown on the left side of drawing.
実施例４：
Ｚｈ（７）Ｃｙｓのイムノグロブリン結合ドメインの機能確認
発現精製したポリプロテインであるＺｈ（７）ＣｙｓをＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、アクリルアミドゲルをＰｏｌｙＶｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ＤｉＦｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＶＤＦ）膜に転写後にウエスタンブロットによってＺｈ（７）Ｃｙｓのイムノグロブリン結合ドメインの機能を確認した。すなわち、１５％アクリルアミド濃度ＳＤＳ−ＰＡＧＥにＺｈ（７）Ｃｙｓを２μｇ／レーンの濃度でアプライし、電気泳動後、ＰＶＤＦ膜に泳動ゲルを電気的に転写させた。転写の条件としてはＡＴＴＯ社のＥｚＢｌｏｔ試薬を用いて１００ｍＡ一定、１時間で反応させた。転写後のＰＶＤＦ膜をＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ）で１０分間の洗浄を三回繰り返し、さらにＰＢＳで１０分間の洗浄を三回行う。引き続いて１０％のスキンミルクを室温で１時間反応させることでブロッキング反応を行う。この作業により非特異的な抗体の結合を押さえる。ブロッキング反応後、ＰＶＤＦ膜をＰＢＳＴで１０分間の洗浄を三回繰り返し、さらにＰＢＳで１０分間の洗浄を三回行う。続いてＨＲＰ標識イムノグロブリンを適切な希釈倍率（例えば４０００倍）に３％スキンミルク溶液を用いて調製を行い、室温で３０分間浸透させて反応させる。その後、ＰＢＳＴで１０分間の洗浄を三回繰り返し、さらにＰＢＳで１０分間の洗浄を三回行う。化学発光ＨＲＰ基質を用いてＸ線フィルムに適切な時間で感光させる。イムノグロブリン結合能があれば、各種分子量のバンドがシグナルとして検出され、ウエスタンブロット法におけるマーカーとして機能することが分かる。
Example 4:
Confirmation of function of immunoglobulin binding domain of Zh (7) Cys Zh (7) Cys, which is a purified polyprotein, is subjected to SDS-PAGE, and the acrylamide gel is transferred to a polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane, followed by Western blotting. ) The function of the Cys immunoglobulin binding domain was confirmed. That is, Zh (7) Cys was applied to 15% acrylamide concentration SDS-PAGE at a concentration of 2 μg / lane, and after electrophoresis, the electrophoresis gel was electrically transferred to a PVDF membrane. As conditions for transcription, reaction was carried out at constant 100 mA for 1 hour using EzBlot reagent manufactured by ATTO. The PVDF membrane after transfer is washed with PBST (0.05% Tween-20-containing PBS) for 10 minutes three times, and further washed with PBS for 10 minutes three times. Subsequently, a blocking reaction is performed by reacting 10% skin milk for 1 hour at room temperature. This operation suppresses nonspecific antibody binding. After the blocking reaction, the PVDF membrane is washed with PBST for 10 minutes three times, and further washed with PBS for 10 minutes three times. Subsequently, HRP-labeled immunoglobulin is prepared using a 3% skin milk solution at an appropriate dilution ratio (eg, 4000 times), and allowed to permeate for 30 minutes at room temperature for reaction. Thereafter, washing with PBST for 10 minutes is repeated three times, and further washing with PBS for 10 minutes is performed three times. Expose the x-ray film for an appropriate time using a chemiluminescent HRP substrate. If there is an immunoglobulin binding ability, it can be seen that bands of various molecular weights are detected as signals and function as markers in Western blotting.
図４は、本発明の分子量マーカーのうち特に汎用性が高いと思われるＺｈ（５）Ｃｙｓ、Ｚｈ（６）Ｃｙｓ、Ｚｈ（７）Ｃｙｓを用いてウエスタンブロット法を行った図面である。ここでは、Ｚｈ（５）ＣｙｓからＺｈ（７）Ｃｙｓまでのタンパク質を２μｇずつ１２．５％アクリルアミドゲルに供与し、電気泳動を行った後、アクリルアミドゲルをＰＶＤＦ膜に転写後、１０％スキンミルクで非特異的な検出を抑えるためのブロッキング反応を行った後、検出抗体としてＨＲＰ標識ＧｏａｔＩｇＧ
またはＨＲＰ標識ｍｏｕｓｅＩｇＧを用いて室温で約３０分間反応させた。その後、余分な抗体を洗浄後、化学蛍光基質と反応させ、Ｘ線フィルムに適切な時間露光させたものである。各レーンはそれぞれ次のものを示す。すなわち、レーンＭはＢｉｏ−Ｒａｄ社の分子量マーカーを、レーン１はＺｈ（５）Ｃｙｓを、レーン２はＺｈ（６）Ｃｙｓを、レーン３はＺｈ（７）Ｃｙｓ、レーンＤはオリエンタル酵母社の分子量マーカーをそれぞれ示す。また、図面の左側及び右側に指標となる分子量を示す。
FIG. 4 is a drawing of Western blotting using Zh (5) Cys, Zh (6) Cys, and Zh (7) Cys, which are considered to be particularly versatile among the molecular weight markers of the present invention. Here, 2 μg of protein from Zh (5) Cys to Zh (7) Cys was donated to a 12.5% acrylamide gel, subjected to electrophoresis, transferred to a PVDF membrane, 10% skin milk After performing a blocking reaction to suppress non-specific detection with HRP labeled GoatIgG as a detection antibody
Alternatively, the reaction was performed at room temperature for about 30 minutes using HRP-labeled mouse IgG. Thereafter, excess antibody is washed, reacted with a chemical fluorescent substrate, and exposed to an X-ray film for an appropriate time. Each lane shows the following: That is, Lane M is a molecular weight marker of Bio-Rad, Lane 1 is Zh (5) Cys, Lane 2 is Zh (6) Cys, Lane 3 is Zh (7) Cys, Lane D is Oriental Yeast. Each molecular weight marker is indicated. Further, molecular weights serving as indices are shown on the left and right sides of the drawing.
また、上記実施例では一種類の遺伝子（ｐＥＴ−２１ｄ−Ｚｈ（７）Ｃｙｓ）を発現宿主に導入しているが、複数種類の遺伝子（たとえば、ｐＥＴ−２１ｄ−Ｚｈ（３）ＣｙｓとｐＥＴ−２１ｄ−Ｚｈ（７）Ｃｙｓ）を発現宿主に導入することもできる。 In the above examples, one kind of gene (pET-21d-Zh (7) Cys) is introduced into the expression host, but a plurality of kinds of genes (for example, pET-21d-Zh (3) Cys and pET-) are introduced. 21d-Zh (7) Cys) can also be introduced into the expression host.
上記結果から分かるように、本発明の分子量マーカー及びその作製方法によれば、ポリプロテインとその分解生成物を同時に得ることができるので、複雑な設備・プロセスを用いることなく短時間で簡便に低コストで分子量マーカーを作製することができる。また、分子量マーカーは一種類のイムノグロブリン結合ドメイン分子からなるので、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのように変性剤を用いるときだけでなく、ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥのように変性剤を用いないときでも分子量に依存した移動度を示すことができる。さらに、マーカータンパク質はイムノグロブリン結合ドメインを有するので、ウェスタンブロット法において検出が可能である。また、分解されていないポリプロテインの濃度は大きいので太いバンドとして現れ、分解生成物の濃度は小さいので細いバンドとして現れるため、目的タンパク質の分子量が一見して分かるような分子量マーカーとしての優れた視認性を備えることができる。
なお、本発明の分子量マーカーにおいてポリプロテインにＣｙｓ残基を導入すれば、ポリプロテイン同士をジスルフィド結合を介して結合させて、イムノグロブリン結合ドメインを倍数保有させた多量体を作製することができ、大きい分子量のタンパク質を直接的に作製する必要をなくすこともできる。ここで、Ｃｙｓ残基をポリプロテインのＣ末端に導入すれば、ポリプロテイン同士をジスルフィド結合を介して結合させやすくすることができる。
さらに、本発明の分子量マーカーにおいてポリプロテインを一種類のイムノグロブリン結合ドメイン分子が２乃至７個連結しているものとすれば、多くの目的タンパク質に対して分子量マーカーとして利用することもできる。
また、複数種類の遺伝子（たとえば、ｐＥＴ−２１ｄ−Ｚｈ（６）ＣｙｓとｐＥＴ−２１ｄ−Ｚｈ（７）Ｃｙｓ）を発現宿主に導入すれば、マーカータンパク質の濃度、すなわちバンドの太さを調節することもできる。
As can be seen from the above results, according to the molecular weight marker of the present invention and the method for producing the same, polyprotein and its degradation product can be obtained at the same time. A molecular weight marker can be produced at a low cost. In addition, since the molecular weight marker is composed of one type of immunoglobulin binding domain molecule, not only when a denaturing agent is used as in SDS-PAGE, but also when no denaturing agent is used as in native-PAGE. Degree can be shown. Furthermore, since the marker protein has an immunoglobulin binding domain, it can be detected by Western blotting. In addition, since the concentration of undegraded polyprotein is large, it appears as a thick band, and since the concentration of degradation products is small, it appears as a thin band, so that it can be seen at a glance as a molecular weight marker that shows the molecular weight of the target protein. Can have sex.
In addition, if a Cys residue is introduced into a polyprotein in the molecular weight marker of the present invention, a polymer can be produced by linking polyproteins via a disulfide bond and retaining an immunoglobulin binding domain in multiples, It is also possible to eliminate the need to directly produce large molecular weight proteins. Here, if a Cys residue is introduced into the C-terminus of the polyprotein, the polyproteins can be easily bonded to each other via a disulfide bond.
Furthermore, in the molecular weight marker of the present invention, if 2 to 7 kinds of immunoglobulin binding domain molecules are linked to a polyprotein, it can be used as a molecular weight marker for many target proteins.
In addition, if multiple types of genes (for example, pET-21d-Zh (6) Cys and pET-21d-Zh (7) Cys) are introduced into the expression host, the concentration of the marker protein, that is, the thickness of the band is adjusted. You can also.
本発明の分子量マーカーの用途としては、たとえば、タンパク質の電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ）やウエスタンブロット解析としての用途等が挙げられる。等電点に影響されずに分子量に依存した移動度が実現できるので、ＳＤＳ等の変性在中では崩壊してしまうようなタンパク質及び多量体形成タンパク質の正確な分子量解析にも適用できる。 Examples of the use of the molecular weight marker of the present invention include use for protein electrophoresis (SDS-PAGE, native-PAGE) and Western blot analysis. Since the mobility depending on the molecular weight can be realized without being influenced by the isoelectric point, it can be applied to an accurate molecular weight analysis of proteins and multimer-forming proteins that are disintegrated in the presence of denaturation such as SDS.
Claims (8)
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列 4. The molecular weight marker according to claim 3 , wherein the antibody binding domain derived from Staphylococcus protein A is a polypeptide having the following amino acid sequence (a) or (b): Molecular weight marker.
(A) amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (b) amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列 The molecular weight marker according to claim 3 , wherein the B1 domain derived from the G protein (SpG) of the Group G Streptococcus G148 is a polypeptide comprising the following amino acid sequence (a) or (b): Characteristic molecular weight marker.
(A) amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (b) amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
（ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列 4. The molecular weight marker according to claim 3 , wherein the L protein derived from Finegoldia magna is a polypeptide comprising the following amino acid sequence (a) or (b): Molecular weight marker.
(A) Amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 (b) Amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3
The molecular weight marker according to claim 1, which has a monomer and a dimer having the molecular weight described in the following table.
イムノグロブリン結合ドメインを有する一種類のイムノグロブリン結合ドメイン分子がリンカーを介して複数個連結されたポリプロテインを作成する工程と、
該ポリプロテインの発現宿主が前記リンカーを切断することにより複数の分子量を有する分子量マーカーを作製する工程と
を有し、前記ポリプロテインはそのＣ末端にＣｙｓ残基が導入され、該Ｃｙｓ残基同士がジスルフィド結合を介して結合していることを特徴とする分子量マーカー作製方法。 A method for producing a molecular weight marker comprising:
A step of one type of immunoglobulin-binding domain molecules with immunoglobulin-binding domain to create a plurality linked polyprotein via a linker,
Producing a molecular weight marker having a plurality of molecular weights by cleaving the linker from the polyprotein expression host ;
A method for preparing a molecular weight marker , wherein a Cys residue is introduced into the C-terminus of the polyprotein, and the Cys residues are bonded to each other via a disulfide bond .
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