JP5641191B2 - ウイルスの検出方法 - Google Patents
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Description
本発明に係るウイルス検出方法の一態様は、
少なくとも1種のウイルスを含有する可能性のある生物学的試料からウイルス核酸を同一溶液中で特異的に単離してから検出する方法であって、
(a)前記生物学的試料と、ウイルス核酸を遊離させるための組成物と、を混合する工程と、
(b)前記工程(a)の混合物に、前記ウイルス核酸の少なくとも一部配列とハイブリダイズ可能で、かつ、少なくとも一方の末端にビオチン化されたオリゴヌクレオチドを添加する工程と、
(c)前記工程(b)の混合物中に、アビジンまたはストレプトアビジンが表面に固定化された固相担体を添加する工程と、
(d)前記工程(c)の混合物から前記固相担体を分離する工程と、
(e)前記固相担体を用いて前記ウイルス核酸を核酸増幅法で検出する工程と、
を含み、
前記組成物は、チオシアン酸グアニジニウム、塩酸グアニジニウム、およびヨウ化ナトリウムから選択される少なくとも1種のカオトロピック剤と、アニオン性界面活性剤と、還元剤と、を含有し、前記工程(a)の混合物中における前記アニオン性界面活性剤の濃度が、2.5質量%以上30質量%以下である。
適用例1において、
検出する前記ウイルスは、B型肝炎ウイルス(HBV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、およびヒト免疫不全ウイルス(HIV)から選択される少なくとも1種であることができる。
適用例1または適用例2において、
さらに、前記工程(e)は、前記工程(d)で得られた固相担体に溶出液を添加して、前記ウイルス核酸を溶出する工程を含むことができる。
適用例1または適用例2において、
前記工程(e)は、前記工程(d)で得られた固相担体を用いて、ウイルス核酸を単離せず、固相担体ごと核酸増幅法で検出する工程を含むことができる。
適用例1ないし適用例4のいずれか一例において、
前記固相担体は、0.1μm以上20μm以下の平均粒径を有し、かつ、重力または遠心力で固液分離可能な粒子であることができる。
適用例1ないし適用例4のいずれか一例において、
前記固相担体は、0.1μm以上20μm以下の平均粒径を有し、かつ、電磁力で固液分離可能な粒子であることができる。
本発明の一実施形態に係るウイルスの検出方法は、
少なくとも1種のウイルスを含有する可能性のある生物学的試料からウイルス核酸を同一溶液中で特異的に単離してから検出する方法であって、
(a)前記生物学的試料と、ウイルス核酸を遊離させるための組成物と、を混合する工程と、
(b)前記工程(a)の混合物に、前記ウイルス核酸の少なくとも一部配列とハイブリダイズ可能で、かつ、少なくとも一方の末端にビオチン化されたオリゴヌクレオチドを添加する工程と、
(c)前記工程(b)の混合物中に、アビジンまたはストレプトアビジンが表面に固定化された固相担体を添加する工程と、
(d)前記工程(c)の混合物から前記固相担体を分離する工程と、
(e)前記固相担体を用いて前記ウイルス核酸を核酸増幅法で検出する工程と、
を含み、
前記組成物は、チオシアン酸グアニジニウム、塩酸グアニジニウム、およびヨウ化ナトリウムから選択される少なくとも1種のカオトロピック剤と、アニオン性界面活性剤と、還元剤と、を含有し、前記工程(a)の混合物中における前記アニオン性界面活性剤の濃度が、2.5質量%以上30質量%以下である。
本工程は、前記生物学的試料と、ウイルス核酸を遊離させるための組成物と、を混合して混合物を調製し、前記生物学的試料中に含有するウイルスから核酸を遊離させる工程である。
本工程は、前記工程(a)の混合物に、前記ウイルス核酸の少なくとも一部配列とハイブリダイズ可能で、かつ、少なくとも一方の末端にビオチン化されたオリゴヌクレオチド(以下、単に「オリゴヌクレオチド」ともいう。)を添加し、該混合物を昇降温する工程である。
本工程は、前記工程(b)の混合物中に、ビオチンと特異的に反応するアビジンまたはストレプトアビジンが表面に固定化された固相担体を添加および分散する工程である。アビジン−ビオチン反応を介して、ウイルス核酸を特異的に捕捉することが本願発明の特徴の一つである。これにより、後続する核酸増幅法において他の夾雑核酸に影響されることなく、標的とするウイルス核酸を効率良く増幅させることができる。
本工程は、前記工程(c)の混合物から前記固相担体を分離する工程である。
本工程は、工程(d)で単離されたウイルス核酸を核酸増幅法で検出する工程である。固相担体の表面に捕捉されたウイルス核酸は、固相担体表面に捕捉されたまま(すなわち、固相担体の水分散液)の状態でPCR等の核酸増幅反応系に持ち込み、核酸増幅することができる。
reaction)法、ジェン・プローブ社のTMA(Transcription mediated amplification-hybridization protection assay)法、アボット社のLCR(Ligase chain reaction)法、栄研化学社のLAMP(Loop-mediated isothermal amplification of DNA)法、宝酒造社のICAN(Isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acid)法等を利用することができる。
2.1.HBV、HCV、HIVプローブ
本実施例で使用したHBVプローブ、HCVプローブ、HIVプローブの配列を以下に示す。
5’−TCCTAGGACCCCTGCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCT−ビオチン3’(以下、「配列1」という。)
[HCV捕捉プローブ配列]:
5’−GTGAAGACAGTAGTTCCTCACAGGGGAGTGATCTA−ビオチン3’(以下、「配列2」という。)
[HIV捕捉プローブ配列]:
5’−TTATGTCCAGAATGCTGGTAGGGCTATACATTCTTAC−ビオチン3’(以下、「配列3」という。)
ウイルス核酸を遊離させるための組成物として、各試薬の濃度が下記表1〜表2に記載の濃度となるように混合して、蒸留水で溶解させた。この組成物をシリンジ濾過器(0.45μm)で濾過し、使用時まで遮光して保存した。なお、各試薬の添加順序は、特に制限されるものではない。また、蒸留水に溶解しにくい成分については、50℃に温めてゆっくりと溶解させた。
2.3.1.実施例1
HBV(サブタイプC)、HCV(サブタイプIb)およびHIV(サブタイプB)を含む血漿からそれぞれ特定量を混合し、ウイルス陰性血漿で希釈することによって、各ウイルスをそれぞれ103IU/mLずつ含有する検体、102IU/mLずつ含有する検体、10IU/mLずつ含有する検体を調製した。なお、ここで調製した各ウイルスの濃度を確認するため、NIBSC社から購入したWHO標準品と同時に並べて実験し、濃度のずれを補正したものを使用した。これらの検体およびウイルス陰性血漿を各250μLずつテストチューブに取り分け、上記「2.2.ウイルス核酸を遊離させるための組成物の調製」で調製した「組成物A」250μLを等容量加えた(以上、工程(a))。
前記「2.3.1.実施例1」の工程(a)において、「組成物A」の代わりに表1に記載の組成物B〜Gを用いたこと以外は、前記「2.3.1.実施例1」の血漿検体を用いた場合と同様の工程を実施した。各検体につき5回測定を行い、陽性と判定された回数を表5〜表10にまとめた。
前記「2.3.1.実施例1」の工程(a)において、「組成物A」の代わりに表2に記載の組成物H〜Lを用いたこと以外は、前記「2.3.1.実施例1」の血漿検体を用いた場合と同様の工程を実施した。各検体につき5回測定を行い、陽性と判定された回数を表11〜表15にまとめた。
前記「2.3.1.実施例1」の工程(d)および工程(e)を以下のように変更した。
前記「2.3.1.実施例1」の工程(e)を以下のように変更した。
前記「2.3.5.実施例9」で溶出液として使用した「20mM水酸化ナトリウム水溶液」に代えて、「30mM水酸化ナトリウム水溶液」を使用した。回収した溶出液は、40μLの30mM塩酸水溶液で中和した。
前記「2.3.5.実施例9」で溶出液として使用した「20mM水酸化ナトリウム水溶液」に代えて、「40mM水酸化ナトリウム水溶液」を使用した。回収した溶出液は、40μLの40mM塩酸水溶液で中和した。
前記「2.3.5.実施例9」で溶出液として使用した「20mM水酸化ナトリウム水溶液」に代えて、「50mM水酸化ナトリウム水溶液」を使用した。回収した溶出液は、40μLの50mM塩酸水溶液で中和した。
Claims (6)
- 少なくとも1種のウイルスを含有する可能性のある生物学的試料からウイルス核酸を同一溶液中で特異的に単離してから検出する方法であって、
(a)前記生物学的試料と、ウイルス核酸を遊離させるための組成物と、を混合する工程と、
(b)前記工程(a)の混合物に、前記ウイルス核酸の少なくとも一部配列とハイブリダイズ可能で、かつ、少なくとも一方の末端にビオチン化されたオリゴヌクレオチドを添加する工程と、
(c)前記工程(b)の混合物中に、アビジンまたはストレプトアビジンが表面に固定化された固相担体を添加する工程と、
(d)前記工程(c)の混合物から前記固相担体を分離する工程と、
(e)前記固相担体を用いて前記ウイルス核酸を核酸増幅法で検出する工程と、を含み、
前記組成物は、チオシアン酸グアニジニウム、塩酸グアニジニウム、およびヨウ化ナトリウムから選択される少なくとも1種のカオトロピック剤と、アニオン性界面活性剤と、還元剤と、を含有し、
前記工程(a)の混合物中における前記アニオン性界面活性剤の濃度が、2.5質量%以上30質量%以下である、ウイルス検出方法。 - 請求項1において、
検出対象の前記ウイルスは、B型肝炎ウイルス(HBV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、およびヒト免疫不全ウイルス(HIV)から選択される少なくとも1種である、ウイルス検出方法。 - 請求項1または請求項2において、
さらに、前記工程(e)は、前記工程(d)で得られた固相担体に溶出液を添加して、前記ウイルス核酸を溶出する工程を含む、ウイルス検出方法。 - 請求項1または請求項2において、
前記工程(e)は、前記工程(d)で得られた固相担体を用いて、ウイルス核酸を単離せず、固相担体ごと核酸増幅法で検出する工程を含む、ウイルス検出方法。 - 請求項1ないし請求項4のいずれか一項において、
前記固相担体は、0.1μm以上20μm以下の平均粒径を有し、かつ、重力または遠心力で固液分離可能な粒子である、ウイルス検出方法。 - 請求項1ないし請求項4のいずれか一項において、
前記固相担体は、0.1μm以上20μm以下の平均粒径を有し、かつ、電磁力で固液分離可能な粒子である、ウイルス検出方法。
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