JP5640196B2

JP5640196B2 - Method for producing microcapsules

Info

Publication number: JP5640196B2
Application number: JP2008542195A
Authority: JP
Inventors: 馬場　嘉信; 嘉信馬場; 学渡慶次; 範匡加地; 原島　秀吉; 秀吉原島; 健太朗小暮; 篠原　康雄; 康雄篠原; 裕史蔵本
Original assignee: Nagoya University NUC; Hokkaido University NUC; University of Tokushima; Tokai National Higher Education and Research System NUC
Current assignee: Nagoya University NUC; Hokkaido University NUC; University of Tokushima; Tokai National Higher Education and Research System NUC
Priority date: 2006-11-02
Filing date: 2007-11-02
Publication date: 2014-12-17
Anticipated expiration: 2027-11-02
Also published as: US8920845B2; JPWO2008053988A1; US20100143482A1; WO2008053988A1

Description

本発明は、ナノサイズのエンベロープと該エンベロープ内に封入された物質とから成る微小カプセルを製造する方法に関する。詳しくは、基材上に形成された微細なチャネル（流路）内で微小カプセルを製造する方法に関する。
なお、本国際出願は２００６年１１月２日に出願された日本国特許出願第２００６−２９９４５０号に基づく優先権を主張しており、その出願の全内容は本明細書中に参照として組み入れられている。The present invention relates to a method for producing a microcapsule comprising a nano-sized envelope and a substance enclosed in the envelope. Specifically, the present invention relates to a method of manufacturing a microcapsule in a fine channel (flow path) formed on a substrate.
This international application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2006-299450 filed on November 2, 2006, the entire contents of which are incorporated herein by reference. ing.

脂質二重層膜から成るいわゆるリポソ−ムの内部に種々の薬剤を封入して成る微小なカプセル構造物については、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）に使用される材料として多くの研究がなされてきた。近年は、微小カプセルの表面（例えばリポソーム表面）に種々の物質（各種のリガンド等）を保持させた高機能性微小カプセルも開発されるようになってきている。
例えば遺伝子治療の分野では、標的細胞内に目的の遺伝子（ＤＮＡ等）を導入するための遺伝子ベクター（ＤＮＡベクター）が大きな役割を果たしており、従前のウイルスベクターを越える優れた機能を備える人工の非ウイルス型遺伝子ベクター、換言すれば人工遺伝子ベクターとして好適に使用できる特質を備えた微小カプセル（ベクター）の開発が進められている。Much research has been conducted on materials for use in drug delivery systems (DDS) with respect to a microcapsule structure in which various drugs are encapsulated in a so-called liposome composed of a lipid bilayer membrane. In recent years, highly functional microcapsules in which various substances (such as various ligands) are held on the surface of the microcapsules (for example, the liposome surface) have been developed.
For example, in the field of gene therapy, a gene vector (DNA vector) for introducing a target gene (DNA or the like) into a target cell plays a major role. Development of a microcapsule (vector) having characteristics that can be suitably used as a viral gene vector, in other words, an artificial gene vector, is in progress.

例えば特許文献１には、遺伝子ベクターとしての利用が注目されるＭＥＮＤ（多機能性エンベロープ型ナノ構造体；Multifunctional Envelope-type Nano Device）と呼ばれる微小カプセル（微小デバイス）が記載されている。ＭＥＮＤはＤＮＡのコアを脂質膜が取り囲んだ構造をしており、標的結合リガンドや膜透過促進ペプチド等の様々な機能性分子で脂質膜表面を修飾することによって標的細胞内への導入効率を高めることが可能であり、実用化の期待が高まっている。 For example, Patent Document 1 describes a microcapsule (microdevice) called MEND (Multifunctional Envelope-type Nano Device) that is attracting attention as a gene vector. MEND has a structure in which a lipid membrane surrounds the DNA core, and improves the efficiency of introduction into target cells by modifying the lipid membrane surface with various functional molecules such as target-binding ligands and membrane permeation-promoting peptides. It is possible and the expectation of practical use is increasing.

特開２００６−１６７５２１号公報JP 2006-167521 A

しかしながら、上記ＭＥＮＤ等の微小カプセルを製造するための従来方法は一般に煩雑であり且つ製造効率も高いものではなかった。例えば、特許文献１に記載の方法では所望する性状のＭＥＮＤを製造するのに３０時間以上が必要である。
また、遺伝子ベクターのような使用形態においては、被験者毎に異なる内容の微小カプセルが何種類も必要となるところ、従来方法ではそのような個別に対応しての少量生産を効率よく行うことは困難であった。例えば、特許文献１に記載の方法では、コア部分（例えばＤＮＡ）及び／又は外表面に保持されるリガンドの種類が異なる何種類ものＭＥＮＤを効率よく短期間に少量生産することが困難である。However, the conventional method for producing the microcapsules such as MEND is generally complicated and the production efficiency is not high. For example, in the method described in Patent Document 1, it takes 30 hours or more to produce MEND having the desired properties.
In addition, in a usage pattern such as a gene vector, several types of microcapsules with different contents are required for each subject, and it is difficult to efficiently perform small-scale production corresponding to such individual cases with the conventional method. Met. For example, in the method described in Patent Document 1, it is difficult to efficiently produce a small number of MENDs having different types of ligands held on the core portion (for example, DNA) and / or the outer surface in a short time.

そこで本発明は、上記ＭＥＮＤ等の微小カプセルの製造に関する従来の課題を解決するべく創出されたものであり、遺伝子ベクターに使用されるような微小カプセルの多種少量生産を効率よく行い得る製造方法を提供することを目的とする。また、そのような製造方法に好適な基材を提供することを他の目的とする。 Therefore, the present invention was created to solve the conventional problems related to the production of microcapsules such as the above MEND, and a production method capable of efficiently producing various small quantities of microcapsules used in gene vectors. The purpose is to provide. Another object is to provide a substrate suitable for such a production method.

本発明によると、直径１μｍ以下のエンベロープと該エンベロープ内部に封入された物質とから成る微小カプセルを製造する方法が提供される。
そして本発明の方法は、(1).複数の原料供給用マイクロチャネルと、該複数の原料供給用マイクロチャネルと連通する反応用マイクロチャネルとが形成された基材を用意すること、(2).それら複数の原料供給用マイクロチャネルのうちの少なくとも一つに前記封入される物質（以下、単に「封入物質」という。）を含む流体を供給すること、(3).それら複数の原料供給用マイクロチャネルのうちの少なくとも他の一つにはエンベロープを形成するための、リン脂質、糖脂質、ステロール、飽和又は不飽和の脂肪酸からなる群から選択される少なくとも１種の脂質を含むエンベロープ形成用流体を供給すること、(4).各マイクロチャネルから反応用マイクロチャネルに合流したエンベロープ形成用流体と封入物質含有流体とを合流時に形成されるそれら流体間の界面が継続的に維持されるようにして反応用マイクロチャネルを流動させることによって該反応用マイクロチャネル内においてエンベロープ内部に封入物質が封入された状態の微小カプセルを形成すること、および、(5).反応用マイクロチャネルを流動してきた微小カプセルを含有する流体を回収すること、を包含する。 According to the present invention, there is provided a method for manufacturing a microcapsule comprising an envelope having a diameter of 1 μm or less and a substance enclosed in the envelope.
The method of the present invention provides (1) a base material on which a plurality of raw material supply microchannels and a reaction microchannel communicating with the plurality of raw material supply microchannels are prepared, (2) Supplying a fluid containing the substance to be encapsulated (hereinafter simply referred to as “encapsulated substance”) to at least one of the plurality of raw material supply microchannels; (3). For forming an envelope containing at least one lipid selected from the group consisting of phospholipids, glycolipids, sterols, saturated or unsaturated fatty acids for forming an envelope in at least one other of the microchannels (4) that is formed at the time of merging the enveloping fluid and the envelope-forming fluid merged from each microchannel into the reaction microchannel. Forming a microcapsule in a state in which an encapsulating substance is enclosed inside the envelope in the reaction microchannel by causing the reaction microchannel to flow so that the interface between the fluids is continuously maintained; and (5). Recovering the fluid containing the microcapsules that have flowed through the reaction microchannel.

本明細書において「微小カプセル」とは、上記サイズのエンベロープ（外殻）とその内部に含まれる封入物質とを主構成要素とするナノサイズの微粒状の構造体をいう。いわゆるリポソームはここでいう微小カプセルに包含される典型例である。ここで「流体」は、溶液、分散液等の種々の液状材料を包含する。
また、本明細書において「マイクロチャネル」とは、種々の方法によって基材に形成された微細な流路（典型的には幅１０００μｍ以下であるマイクロサイズの流路）をいう。In the present specification, the “microcapsule” refers to a nano-sized fine-grained structure having an envelope (outer shell) of the above size and an encapsulating substance contained therein as main components. So-called liposomes are typical examples included in the microcapsules referred to herein. Here, the “fluid” includes various liquid materials such as a solution and a dispersion.
In the present specification, “microchannel” refers to a fine channel (typically a microsize channel having a width of 1000 μm or less) formed on a substrate by various methods.

上記構成の方法では、基材上に形成されたマイクロチャネル（微細流路）に供給した流体中で所望する微小カプセル構造体（例えばリポソーム）を効率よく製造することができる。適当サイズのマイクロチャネルにおいては、供給する複数の原料流体の容積（流量）あたりの表面積を著しく高めることができる。このため原料流体間の接触面積、即ち界面の面積が大きく、かかる界面において高い反応効率を実現することができる。また、反応系自体は極めて小スケールであるため、微小カプセルの合成（生成）反応条件の設定が容易であるとともに省資源及び省エネルギーを実現できる。
従って、本発明の製造方法によると、多量の廃棄物を排出することなく且つ大規模な施設を用いることなく短時間に省エネルギーで効率よく、個々に構成の異なる（例えば封入物質の組成やエンベロープ表面の修飾物質が異なる）複数種類の微小カプセルを製造すること（即ち微小カプセルを多種少量生産すること）ができる。In the method having the above-described configuration, a desired microcapsule structure (for example, a liposome) can be efficiently produced in a fluid supplied to a microchannel (microchannel) formed on a substrate. In a microchannel of an appropriate size, the surface area per volume (flow rate) of a plurality of raw material fluids to be supplied can be significantly increased. For this reason, the contact area between the raw material fluids, that is, the area of the interface is large, and high reaction efficiency can be realized at the interface. Moreover, since the reaction system itself is very small scale, it is easy to set the reaction conditions for the synthesis (generation) of the microcapsules and realize resource saving and energy saving.
Therefore, according to the manufacturing method of the present invention, it is possible to save energy efficiently in a short time without discharging a large amount of waste and without using a large-scale facility, and the composition of each individual (for example, the composition of the encapsulated material and the envelope surface) It is possible to produce a plurality of types of microcapsules (that is, to produce a variety of microcapsules in a small amount).

好ましくは、原料供給用マイクロチャネル及び反応用マイクロチャネルの幅が１０μｍ以上５００μｍ以下であることを特徴とする。このようなサイズの微細なマイクロチャネルを採用することによって、より効率のよい流体間の界面反応（液液界面反応）による微小カプセルの製造を行うことができる。 Preferably, the width of the raw material supply microchannel and the reaction microchannel is 10 μm or more and 500 μm or less. By adopting such a fine microchannel, microcapsules can be manufactured by a more efficient interfacial reaction (liquid-liquid interfacial reaction) between fluids.

また、ここで開示される微小カプセル製造方法として好ましい一態様では、上記基材として、原料供給用マイクロチャネルを少なくとも三つ備える（典型的には三つ備える）とともに該少なくとも三つの原料供給用マイクロチャネルは一つのポイントで反応用マイクロチャネルに全て連通するように形成されていることを特徴とする基材を使用する。そして、反応用マイクロチャネルの一部の領域を流動する封入物質含有流体の両側を、エンベロープ形成用流体が当該封入物質含有流体との界面を維持しつつ流動することが実現されるように、少なくとも三つの原料供給用マイクロチャネルのうちのいずれか少なくとも二つにエンベロープ形成用流体を供給することを特徴とする。 In a preferred embodiment of the method for producing microcapsules disclosed herein, as the base material, at least three raw material supply microchannels (typically three) are provided and at least three raw material supply microchannels are provided. The substrate is formed so that the channel is formed so as to be all in communication with the reaction microchannel at one point. Then, at least so that the envelope-forming fluid flows on both sides of the encapsulating substance-containing fluid flowing in a partial region of the reaction microchannel while maintaining the interface with the encapsulating substance-containing fluid. An envelope forming fluid is supplied to at least two of the three raw material supply microchannels.

このような三つ以上の原料供給用マイクロチャネルが一つの反応用マイクロチャネルに同時に連通するタイプの基材（典型的には後述する実施形態のように三つの原料供給用マイクロチャネルが一つの反応用マイクロチャネルに連通する三叉路タイプの基材）を採用し、各流体（即ちエンベロープ形成用流体、封入物質含有流体）の反応用マイクロチャネルにおける相互流動形態を上記のように設定することにより、エンベロープ形成用流体と封入物質含有流体との界面面積をより大きく確保することができ、結果、更に効率よく微小カプセルを製造することができる。 A substrate of a type in which three or more raw material supply microchannels simultaneously communicate with one reaction microchannel (typically, three raw material supply microchannels have one reaction as in the embodiments described later). By adopting a three-junction type base material communicating with the microchannel for use and setting the mutual flow form in the reaction microchannel of each fluid (ie, the fluid for forming the envelope and the fluid containing the encapsulating substance) as described above, the envelope A larger interface area between the forming fluid and the encapsulating substance-containing fluid can be secured, and as a result, the microcapsules can be manufactured more efficiently.

ここで開示される方法は特に、封入物質の一部又は全部がポリヌクレオチドであり、エンベロープが脂質から成る膜であることを特徴とする微小カプセルの多種少量生産に適する。従って本発明の方法によると、極めて小さいスケールにて効率よく上述したＭＥＮＤのような遺伝子ベクターとしての用途に適する微小カプセルを製造することができる。 The method disclosed here is particularly suitable for the production of small quantities of microcapsules characterized in that part or all of the encapsulated material is a polynucleotide and the envelope is a membrane made of lipid. Therefore, according to the method of the present invention, microcapsules suitable for use as a gene vector such as MEND described above can be efficiently produced on a very small scale.

遺伝子ベクターとして使用し得る微小カプセルの製造方法として好ましい一態様では、封入物質としてポリヌクレオチドとカチオン性化合物の複合体を使用する。
一般にＤＮＡ等のポリヌクレオチド（導入遺伝子）は通常は負に帯電しているところ、これをカチオン性化合物と組み合わせることにより静電的相互作用によって凝集化した複合体を形成することができる。凝集化により、封入物質（ここではポリヌクレオチド）のエンベロープ内への導入が容易となる。また、カチオン性化合物とポリヌクレオチドとの構成比に応じて得られる複合体を全体で正帯電または負帯電とすることができる。一般に細胞膜は負に帯電しているため、このような正に荷電した複合体を封入物質として採用することによって，細胞内への遺伝子導入効率が向上した微小カプセル（遺伝子ベクター）を製造することができる。In a preferred embodiment of a method for producing a microcapsule that can be used as a gene vector, a complex of a polynucleotide and a cationic compound is used as an encapsulating substance.
In general, polynucleotides (transgenes) such as DNA are usually negatively charged. By combining this with a cationic compound, a complex aggregated by electrostatic interaction can be formed. Aggregation facilitates the introduction of the encapsulated material (here, polynucleotide) into the envelope. Moreover, the complex obtained according to the composition ratio of the cationic compound and the polynucleotide can be positively charged or negatively charged as a whole. In general, since cell membranes are negatively charged, it is possible to produce microcapsules (gene vectors) with improved efficiency of gene transfer into cells by using such positively charged complexes as encapsulated substances. it can.

このような複合体を採用する場合の好ましい一態様の方法は該複合体の生産工程を予め実施する方法である。即ち、該複合体生産工程は、(1).複数の原料供給用マイクロチャネルと、該複数の原料供給用マイクロチャネルと連通する反応用マイクロチャネルとが形成された基材を用意すること、(2).複数の原料供給用マイクロチャネルのうちの少なくとも一つにポリヌクレオチドを含む流体を供給すること、(3).複数の原料供給用マイクロチャネルのうちの少なくとも他の一つにカチオン性化合物を含む流体を供給すること、(4).各マイクロチャネルから反応用マイクロチャネルに合流したポリヌクレオチド含有流体とカチオン性化合物含有流体とを、合流時に形成されるそれら流体間の界面が継続的に維持されるようにして該反応用マイクロチャネルを流動させることによって、該反応用マイクロチャネル内において上記複合体を形成すること、および、(5).反応用マイクロチャネルを流動してきた上記複合体を含有する流体を回収すること、を包含する。
このような微小カプセル製造のための原料である上記複合体を生産するプロセスを前段階として組み込むことによって、微小カプセル製造プロセス全体を更に効率よく行うことができる。また、上記と同様の理由によって、多量の廃棄物を排出することなく且つ大規模な施設を用いることなく省エネルギーで効率よく、遺伝子ベクターとして利用する微小カプセルに具備する封入物質（即ち上記複合体）を生産することができる。A preferred embodiment of the method in the case of employing such a complex is a method in which the production process of the complex is performed in advance. That is, the composite production process includes: (1) preparing a substrate on which a plurality of raw material supply microchannels and a reaction microchannel communicating with the plurality of raw material supply microchannels are formed; 2). Supplying a fluid containing a polynucleotide to at least one of the plurality of raw material supply microchannels; (3). At least one of the plurality of raw material supply microchannels having a cationic compound. (4) The polynucleotide-containing fluid and the cationic compound-containing fluid merged from each microchannel to the reaction microchannel are continuously formed at the interface between these fluids. Forming the complex in the reaction microchannel by flowing the reaction microchannel in a maintained manner; and (5). Recovering the fluid containing the complex that has flowed through the reaction microchannel.
By incorporating a process for producing the composite as a raw material for producing such microcapsules as a previous step, the entire process for producing microcapsules can be performed more efficiently. In addition, for the same reason as described above, the encapsulated substance (that is, the above complex) included in a microcapsule used as a gene vector is efficient and energy-saving without discharging a large amount of waste and without using a large-scale facility. Can be produced.

また、上記態様の方法において、特に好ましくは、ポリヌクレオチドとカチオン性化合物の複合体を生産するための基材として、原料供給用マイクロチャネルを少なくとも三つ備えるとともに該少なくとも三つの原料供給用マイクロチャネルは一つのポイントで反応用マイクロチャネルに全て連通するように形成されていることを特徴とする基材を使用する。そして、該原料供給用マイクロチャネルのうちの少なくとも一つにはポリヌクレオチドとカチオン性化合物のいずれも含まない材料非含有流体（典型的には水その他のポリヌクレオチド及びカチオン性化合物を含まない水性溶媒）を供給し、ここで該反応用マイクロチャネルの一部の領域を流動する上記材料非含有流体の一方の側面をポリヌクレオチド含有流体が該材料非含有流体との界面を維持しつつ流動することが実現され、且つ、上記材料非含有流体の他方の側面をカチオン性化合物含有流体が該材料非含有流体との界面を維持しつつ流動することが実現されるように、原料供給用マイクロチャネルのうちのいずれか少なくとも一つにポリヌクレオチド含有流体を供給し、原料供給用マイクロチャネルのうちの他の少なくとも一つにカチオン性化合物含有流体を供給する。
このような構成の基材（典型的には後述する実施形態のように三つの原料供給用マイクロチャネルが一つの反応用マイクロチャネルに連通する三叉路タイプの基材）を採用し、各流体（即ち上記材料非含有流体、ポリヌクレオチド含有流体、カチオン性化合物含有流体の３種）の反応用マイクロチャネルにおける相互流動形態を上記のように設定することにより、上記複合体を生成するための界面面積をより大きく確保することができ、結果、更に効率よく複合体を生産することができる。In the method of the above aspect, it is particularly preferable that at least three raw material supply microchannels are provided as a base material for producing a complex of a polynucleotide and a cationic compound, and the at least three raw material supply microchannels are provided. Uses a substrate characterized in that it is formed to communicate with the reaction microchannel at one point. At least one of the raw material supply microchannels contains a material-free fluid containing neither a polynucleotide nor a cationic compound (typically, an aqueous solvent containing no other polynucleotide or cationic compound). Where the polynucleotide-containing fluid flows on one side of the material-free fluid flowing in a region of the reaction microchannel while maintaining the interface with the material-free fluid. And the material-containing microchannel of the raw material supply microchannel is realized so that the cationic compound-containing fluid flows on the other side surface of the material-free fluid while maintaining the interface with the material-free fluid. Supply a polynucleotide-containing fluid to at least one of the two and supply the other at least one of the microchannels for supplying the raw material. Supplying on-compound-containing fluids.
A base material having such a structure (typically, a three-junction type base material in which three raw material supply microchannels communicate with one reaction microchannel as in the embodiment described later) is employed, and each fluid (ie, By setting the mutual flow form in the reaction microchannel of the above-mentioned material-free fluid, polynucleotide-containing fluid, and cationic compound-containing fluid) as described above, the interfacial area for generating the complex is set. As a result, the composite can be more efficiently produced.

また、本発明によると、ここで開示される種々の態様の微小カプセル製造方法（或いは上述した前段階の封入物質生産プロセス）を実施するのに好適に使用し得るマイクロチャネルを備える基材が提供される。
好ましくは、直径１μｍ以下のエンベロープと該エンベロープ内部に封入された物質とから成る微小カプセルを製造するための基材であって、少なくとも三つの原料供給用マイクロチャネルと、該複数の原料供給用マイクロチャネルと連通する反応用マイクロチャネルとを備えている。そして、少なくとも三つの原料供給用マイクロチャネルは一つのポイントで反応用マイクロチャネルに全て連通するように形成されている。好ましくは、原料供給用マイクロチャネル及び反応用マイクロチャネルの幅が１０μｍ以上５００μｍ以下であることを特徴とする。
なお、本明細書において「基材」とは上記マイクロチャネルが形成され、本発明の微小カプセル製造方法（或いは上述した前段階の封入物質生産プロセス）を実施するためのマイクロリアクターとして機能し得るものであればその形状は限定されない。典型的には、フラットな基板（いわゆるマイクロチップと呼称され得る小スケールのものを包含する）であるがこれに限定されず、例えば内空部が上記マイクロチャネルを構成するような微細なチューブ形状であってもよい。In addition, according to the present invention, there is provided a substrate provided with a microchannel that can be suitably used for carrying out the microcapsule manufacturing method of the various aspects disclosed herein (or the above-described encapsulated material production process described above). Is done.
Preferably, a base material for manufacturing a microcapsule comprising an envelope having a diameter of 1 μm or less and a substance enclosed inside the envelope, wherein the microcapsule has at least three raw material supply microchannels and the plurality of raw material supply microchannels. And a reaction microchannel in communication with the channel. At least three raw material supply microchannels are formed to communicate with the reaction microchannels at one point. Preferably, the width of the raw material supply microchannel and the reaction microchannel is 10 μm or more and 500 μm or less.
In the present specification, the “substrate” is one in which the microchannel is formed, and can function as a microreactor for carrying out the microcapsule manufacturing method of the present invention (or the above-mentioned encapsulated material production process described above). If so, the shape is not limited. Typically, it is a flat substrate (including a small-scale substrate that can be referred to as a so-called microchip), but is not limited to this, for example, a fine tube shape in which the inner space constitutes the microchannel. It may be.

図１は、本発明の一実施形態に係る基材の構成を模式的に示す平面図である。FIG. 1 is a plan view schematically showing the configuration of a substrate according to an embodiment of the present invention. 図２は、図１に示す基材の要部を模式的に示す拡大平面図である。FIG. 2 is an enlarged plan view schematically showing the main part of the substrate shown in FIG. 図３は、本発明の方法を実施するのに適するマイクロリアクターの構成の一例を模式的に示す説明図である。FIG. 3 is an explanatory view schematically showing an example of the configuration of a microreactor suitable for carrying out the method of the present invention. 図４は、一試験例で使用する材料及び生成物を模式的に示す説明図である。FIG. 4 is an explanatory diagram schematically showing materials and products used in one test example. 図５は、一試験例の製造プロセスの流れを模式的に示す説明図である。FIG. 5 is an explanatory diagram schematically showing the flow of the manufacturing process of one test example. 図６は、一試験例で得られたＤＮＡ／ポリリジン複合体（ＤＰＣ）の粒度分布を示すグラフである。FIG. 6 is a graph showing the particle size distribution of the DNA / polylysine complex (DPC) obtained in one test example. 図７は、一試験例で得られた微小カプセル（リポソーム）の粒度分布を示すグラフである。FIG. 7 is a graph showing the particle size distribution of microcapsules (liposomes) obtained in one test example. 図８は、マイクロリアクターの構成の一例を模式的に示す説明図である。FIG. 8 is an explanatory diagram schematically showing an example of the configuration of the microreactor. 図９は、一試験例で得られたＤＮＡ／ポリリジン複合体（ＤＰＣ）の粒径（ピーク粒径）と、使用したＰＬＬの濃度との関係を示すグラフである。FIG. 9 is a graph showing the relationship between the particle diameter (peak particle diameter) of the DNA / polylysine complex (DPC) obtained in one test example and the concentration of PLL used. 図１０は、別の一試験例で得られたＤＮＡ／ポリリジン複合体（ＤＰＣ）の粒径（ピーク粒径）と、使用したＰＬＬの濃度との関係を示すグラフである。FIG. 10 is a graph showing the relationship between the particle size (peak particle size) of the DNA / polylysine complex (DPC) obtained in another test example and the concentration of the PLL used. 図１１は、別の一試験例で得られたＤＮＡ／ポリリジン複合体（ＤＰＣ）の粒径（ピーク粒径）と、使用した原料溶液の流速との関係を示すグラフである。FIG. 11 is a graph showing the relationship between the particle size (peak particle size) of the DNA / polylysine complex (DPC) obtained in another test example and the flow rate of the raw material solution used.

以下、本発明の好適な実施形態を説明する。なお、本明細書において特に言及している事項（例えば、マイクロチャネルの好適な形態、封入物質及びエンベロープの構成やその製法）以外の事柄であって本発明の実施に必要な事柄（例えば、マイクロチャネルを備える基板の製法、マイクロチャネルへの流体供給手段）は、当該分野における従来技術に基づく当業者の設計事項として把握され得る。本発明は、本明細書に開示されている内容と当該分野における技術常識とに基づいて実施することができる。 Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described. It should be noted that matters other than matters specifically mentioned in the present specification (for example, suitable forms of microchannels, configurations of encapsulating substances and envelopes, and manufacturing methods thereof) and matters necessary for the implementation of the present invention (for example, microchannels) The manufacturing method of the substrate including the channel and the fluid supply means to the microchannel) can be grasped as a design matter of a person skilled in the art based on the prior art in the field. The present invention can be carried out based on the contents disclosed in this specification and common technical knowledge in the field.

ここで開示される方法は、微細なマイクロチャネルに供給する異なる二つの流体間の界面での反応によって微小カプセルを製造する方法であり、かかる目的を実現する限り、使用する基材（マイクロリアクター）の形状や材質には特に制限はない。典型的にはプレート状のマイクロチップ（基板）であり得るがその他の形状であってもよい。
基材を構成する材料は特に限定されない。従来からよく知られたマイクロチップ構成材料が適当である。例えば、石英ガラス等のガラス製基材、シリコン製基材、或いはポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリジメチルシロキサン等から成る合成樹脂製基材が好適例として挙げられる。The method disclosed here is a method of producing a microcapsule by a reaction at an interface between two different fluids supplied to a fine microchannel. As long as this purpose is realized, a substrate to be used (microreactor) is used. There are no particular restrictions on the shape and material of the material. Typically, it may be a plate-like microchip (substrate), but may have other shapes.
The material which comprises a base material is not specifically limited. Conventionally well known microchip constituent materials are suitable. For example, glass substrates such as quartz glass, silicon substrates, or synthetic resin substrates made of polyethylene, polypropylene, polycarbonate, polystyrene, polymethyl methacrylate, polytetrafluoroethylene, polydimethylsiloxane, etc. It is done.

典型例として、図１に本発明の方法を実施するのに好適なマイクロチップ状の基材（マイクロリアクター）１０を模式的に示す。この基板（マイクロチップ）１０は、計三つの原料供給用マイクロチャネル１２，１３，１４と、一つの反応用マイクロチャネル１８とが形成されている。図示されるように、三つの原料供給用マイクロチャネル１２，１３，１４は一つのポイントＰで反応用マイクロチャネル１８に連通するように形成されている。また、原料供給用マイクロチャネル１２，１３，１４の上流側には原料流体（液体）を一時的に貯留し得る貯留部（注入口：inlet）１２Ａ，１３Ａ，１４Ａが形成されており、他方、反応用マイクロチャネル１８の下流側には反応後流体を一時的に貯留し得る貯留部（排出口：outlet）１８Ａが形成されている。これにより基板１０のマイクロリアクターとしての利便性向上が実現される。 As a typical example, FIG. 1 schematically shows a microchip-like substrate (microreactor) 10 suitable for carrying out the method of the present invention. The substrate (microchip) 10 is formed with a total of three raw material supply microchannels 12, 13, and 14 and one reaction microchannel 18. As shown in the figure, the three raw material supply microchannels 12, 13, and 14 are formed to communicate with the reaction microchannel 18 at one point P. In addition, storage portions (inlet) 12A, 13A, and 14A that can temporarily store a raw material fluid (liquid) are formed on the upstream side of the raw material supply microchannels 12, 13, and 14, On the downstream side of the reaction microchannel 18, a storage portion (outlet) 18 </ b> A capable of temporarily storing the post-reaction fluid is formed. As a result, the convenience of the substrate 10 as a microreactor is improved.

各マイクロチャネルの接続ポイントＰの拡大図を図２に示す。この図に示すように、ポイント部分Ｐは、各原料供給用マイクロチャネル１２，１３，１４が隣接するチャネル同士でそれぞれ直交し、且つ、それら原料供給用マイクロチャネル１２，１３，１４と反応用マイクロチャネル１８とが十文字に交差するような状態に形成されている。
かかる連通状態を構成することによって、図２中の矢印で示すように、中央の原料供給用マイクロチャネル１３を流れる流体はそのまま直進して反応用マイクロチャネル１８に供給され、その両サイドの原料供給用マイクロチャネル１２，１４を流れる流体はそれぞれ中央の原料供給用マイクロチャネル１３から供給された流体を両サイドから挟み込む状態で反応用マイクロチャネル１８に供給される。
これにより、図２中の一点鎖線で示すように、反応用マイクロチャネル１８内において各原料供給用マイクロチャネル１２，１３，１４から流動してきた流体間の界面（液液界面）Ｂが形成される。An enlarged view of the connection point P of each microchannel is shown in FIG. As shown in this figure, the point portion P is perpendicular to each other between adjacent raw material supply microchannels 12, 13, and 14, and the raw material supply microchannels 12, 13, and 14 and the reaction microchannels. The channel 18 is formed so as to cross the cross.
By constructing such a communication state, as shown by the arrows in FIG. 2, the fluid flowing in the central raw material supply microchannel 13 goes straight as it is and is supplied to the reaction microchannel 18, and the raw material supply on both sides thereof The fluids flowing through the microchannels 12 and 14 are supplied to the reaction microchannel 18 in a state where the fluid supplied from the central raw material supply microchannel 13 is sandwiched from both sides.
As a result, as shown by the one-dot chain line in FIG. 2, an interface (liquid-liquid interface) B between the fluids flowing from the raw material supply microchannels 12, 13, 14 is formed in the reaction microchannel 18. .

また、図２に示すように、ポイント部分Ｐを構成するマイクロチャネル側壁のコーナー部Ｒ（特に反応用マイクロチャネル１８に隣接する二つの側壁コーナー部Ｒ）は曲面（Ｒ面）に形成されている結果、各原料供給用マイクロチャネル１２，１３，１４から反応用マイクロチャネル１８への流体供給がスムーズに行え、上記界面Ｂを容易に維持することができる。なお、図示していないが、曲面（Ｒ面）に代えてコーナー部ＲをＣ面に形成した場合も同様の効果を奏し得る。 Further, as shown in FIG. 2, the corner portion R of the microchannel side wall constituting the point portion P (particularly, two side wall corner portions R adjacent to the reaction microchannel 18) is formed in a curved surface (R surface). As a result, fluid can be smoothly supplied from the raw material supply microchannels 12, 13, and 14 to the reaction microchannel 18, and the interface B can be easily maintained. Although not shown, the same effect can be obtained when the corner portion R is formed on the C surface instead of the curved surface (R surface).

マイクロチャネルの形状（幅、深さ等）は、上記界面において目的物質（微小カプセルまたは上記複合体のような封入物質）の生成反応が実現できればよく特に制限はないが、マイクロチャネルの幅は１μｍ以上１０００μｍ以下が適当であり１０μｍ以上５００μｍ以下が好ましい。このようなサイズのマイクロチャネルによると、典型的には、直径が１０〜１０００ｎｍ、好ましくは１０〜５００ｎｍ程度（特に５０〜２００ｎｍ程度）の微小カプセルを形成することができる。また、本発明の方法によると、極めて粒度分布の狭い（即ち、粒径がほぼ揃った）微小カプセルを提供することができる。
なお、図２に示す例では原料供給用マイクロチャネル１２，１３，１４と反応用マイクロチャネル１８の幅は同様であるが、相互に異なっていてもよい。例えば、反応用マイクロチャネル１８の幅を原料供給用マイクロチャネル１２，１３，１４の幅よりも拡大しておいてもよい。
また、マイクロチャネルの深さは界面が維持できる限り特に制限はないが１μｍ以上５００μｍ以下が適当であり、５μｍ以上３００μｍ以下が好ましい。例えば、幅が５０〜２００μｍ程度であり、深さが１０〜５０μｍ程度のマイクロチャネルが好ましい。The shape (width, depth, etc.) of the microchannel is not particularly limited as long as the reaction for generating the target substance (encapsulated substance such as the microcapsule or the complex) can be realized at the interface, but the width of the microchannel is 1 μm. The thickness is suitably 1000 μm or less and preferably 10 μm or more and 500 μm or less. According to the microchannel of such a size, typically, a microcapsule having a diameter of 10 to 1000 nm, preferably about 10 to 500 nm (particularly about 50 to 200 nm) can be formed. Further, according to the method of the present invention, it is possible to provide a microcapsule having a very narrow particle size distribution (that is, having a substantially uniform particle size).
In the example shown in FIG. 2, the widths of the raw material supply microchannels 12, 13, and 14 and the reaction microchannel 18 are the same, but they may be different from each other. For example, the width of the reaction microchannel 18 may be larger than the width of the raw material supply microchannels 12, 13, and 14.
The depth of the microchannel is not particularly limited as long as the interface can be maintained, but is preferably 1 μm or more and 500 μm or less, and preferably 5 μm or more and 300 μm or less. For example, a microchannel having a width of about 50 to 200 μm and a depth of about 10 to 50 μm is preferable.

基材上に上述したような形状の反応用マイクロチャネルおよび原料供給用マイクロチャネルを形成するには従来のマイクロチップ（マイクロリアクター）製造において採用されている方法をそのまま採用すればよい。
例えばガラス製基材に上記のようなマイクロチャネル１２，１３，１４，１８および貯留部１２Ａ，１３Ａ，１４Ａ，１８Ａを形成する方法として、従来から行われているフォトレジストとエッチングを利用する方法が挙げられる。例えば基材上にシリコン膜を形成し、その上にコーティングしたフォトレジストをパターニングした後、適当な薬剤でエッチングを行うことによって基材上に所定のパターン／サイズのマイクロチャネルおよび貯留槽を形成することができる。また、樹脂製基材の場合には射出成形法を採用することができる。このような基材（マイクロチップ等）にマイクロチャネルを形成する方法自体は従来からよく行われており本発明を特徴づけるものでないため、これ以上の詳細な説明は省略する。In order to form the reaction microchannel and the raw material supply microchannel having the above-described shape on the substrate, the method employed in the conventional microchip (microreactor) manufacturing may be employed as it is.
For example, as a method of forming the microchannels 12, 13, 14, 18 and the storage portions 12A, 13A, 14A, 18A as described above on a glass substrate, a conventionally used method using photoresist and etching is used. Can be mentioned. For example, after forming a silicon film on a substrate, patterning a photoresist coated thereon, and etching with an appropriate agent, a microchannel and a storage tank having a predetermined pattern / size are formed on the substrate. be able to. In the case of a resin base material, an injection molding method can be employed. Since the method itself for forming a microchannel on such a base material (microchip or the like) has been conventionally performed and does not characterize the present invention, further detailed description is omitted.

また、マイクロチャネル内において生成された微小カプセルまたは原料物質がチャネルの壁面に吸着されることを防止するために、適当なコーティング物質によってチャネルの壁面をコーティングすることが好ましい。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、シリコーン樹脂等のポリマーをチャネルの内壁面にコーティングすることにより、ポリヌクレオチド、タンパク質等のチャネル壁面への吸着を抑制することができる。 Further, in order to prevent the microcapsules or the raw material produced in the microchannel from being adsorbed on the wall surface of the channel, it is preferable to coat the wall surface of the channel with an appropriate coating material. For example, by coating the inner wall surface of the channel with a polymer such as polyethylene glycol (PEG) or silicone resin, adsorption of the polynucleotide, protein, or the like on the channel wall surface can be suppressed.

図１に示すような基材１０は、マイクロリアクター（反応器）として好適に使用することができる。マイクロリアクターの簡単な構成を図３に示す。
この図に示すように、基材１０に形成された各原料供給用マイクロチャネル１２，１３，１４の貯留部（注入口：inlet）１２Ａ，１３Ａ，１４Ａに対し、それぞれ独立にシリンジポンプを備える送液管２を接続する。これにより、各原料供給用マイクロチャネル１２，１３，１４に異なる組成の流体（溶液、分散液等の種々の液状材料）を適当な流量（例えば０．０５〜１００μＬ／min、好ましくは０．５〜２０μＬ／min）で供給することができる。また、基材１０に形成された反応用マイクロチャネル１８の貯留部（排出口：outlet）１８Ａに回収管６を接続することにより、反応が終了した流体（即ち微小カプセルを含む流体）を回収することができる。なお、図３は本発明の説明のために構成を非常に単純化したものであり、実際のマイクロリアクターでは用途に応じて、この図に示していない数多くの付属装置を備えることができる。例えば、上記シリンジポンプの動作を制御して各原料供給用マイクロチャネルに供給される原料流体の流量（流速）を制御するための制御装置（典型的にはコンピュータ（ＰＣ））や各種モニタリング装置、センサ等を備えることができる。A substrate 10 as shown in FIG. 1 can be suitably used as a microreactor (reactor). A simple configuration of the microreactor is shown in FIG.
As shown in this figure, each of the raw material supply microchannels 12, 13, and 14 formed in the base material 10 is supplied with a syringe pump independently to the reservoirs (inlet) 12A, 13A, and 14A. Connect the liquid pipe 2. Thereby, fluids (various liquid materials such as solutions and dispersions) having different compositions are supplied to the raw material supply microchannels 12, 13, and 14 at appropriate flow rates (for example, 0.05 to 100 μL / min, preferably 0.5). ˜20 μL / min). Further, the recovery pipe 6 is connected to a reservoir (outlet) 18 </ b> A of the reaction microchannel 18 formed on the base material 10, thereby recovering a fluid (that is, a fluid containing microcapsules) that has finished the reaction. be able to. Note that FIG. 3 shows a very simplified configuration for explaining the present invention, and an actual microreactor can be provided with a number of accessory devices not shown in this figure depending on the application. For example, a control device (typically a computer (PC)) or various monitoring devices for controlling the flow rate (flow velocity) of the raw material fluid supplied to each raw material supply microchannel by controlling the operation of the syringe pump, A sensor or the like can be provided.

以上に説明したような原料供給用マイクロチャネル及び反応用マイクロチャネルを備える基材を使用することによって、微細な界面での反応により効率よく所望する性状の微小カプセルを製造することができる。
微小カプセルを構成するエンベロープを形成する流体（即ち液状材料）は、典型的には適当な溶媒中にエンベロープを構成する物質を含ませることによって調製される流体である。エンベロープを構成する物質としては種々のものが使用され得るが、特に有機溶媒又は水性溶媒中で安定的な膜（エンベロープ）を形成可能な両親媒性物質が好ましく、典型的には脂質が利用される。即ち、本発明の実施に特に好ましいエンベロープは従来のリポソームを構成するような脂質から成る膜（特に脂質二重層から成る膜）である。上述したＭＥＮＤのエンベロープも典型的には脂質二重層から成る脂質膜によって構成される。By using the base material provided with the raw material supply microchannel and the reaction microchannel as described above, microcapsules having desired properties can be efficiently produced by reaction at a fine interface.
The fluid that forms the envelope constituting the microcapsule (ie, the liquid material) is typically a fluid that is prepared by including a substance that constitutes the envelope in a suitable solvent. Various substances can be used as the substance constituting the envelope, but in particular, an amphiphilic substance capable of forming a stable membrane (envelope) in an organic solvent or an aqueous solvent is preferable, and a lipid is typically used. The That is, a particularly preferred envelope for the practice of the present invention is a membrane composed of lipids (particularly a membrane composed of lipid bilayers) that constitutes a conventional liposome. The aforementioned MEND envelope is also typically constituted by a lipid membrane composed of a lipid bilayer.

エンベロープを構成する脂質として好ましいものに、リン脂質、糖脂質、ステロール、飽和又は不飽和の脂肪酸等が挙げられる。
リン脂質の例示として、ホスファチジルコリン（例えばジオレオイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン）、ホスファチジルグリセロール（例えばジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジグリセロール）、ホスファチジルエタノールアミン（例えばジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジエタノールアミン）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、これらの水素添加物等が挙げられる。
また、糖脂質の例示として、グリセロ糖脂質（例えばスルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリド）、スフィンゴ糖脂質（例えばガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシド）が挙げられる。
また、ステロール類の例示として、動物由来のステロール（例えばコレステロール、コレステロールコハク酸、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロール）、植物由来のステロール（例えばスチグマステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロール）、微生物由来のステロール（例えばチモステロール、エルゴステロール）が挙げられる。
また、飽和又は不飽和の脂肪酸としては、例えば、パルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸等の炭素数１２〜２０の飽和又は不飽和の脂肪酸が挙げられる。Preferable lipids constituting the envelope include phospholipids, glycolipids, sterols, saturated or unsaturated fatty acids, and the like.
Examples of phospholipids include phosphatidylcholines (eg dioleoylphosphatidylcholine, dilauroylphosphatidylcholine, dimyristoylphosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine, distearoylphosphatidylcholine), phosphatidylglycerols (eg dioleoylphosphatidylglycerol, dilauroylphosphatidylglycerol, dimyristoylphosphine) , Dipalmitoyl phosphatidylglycerol, distearoyl phosphatidylglycerol), phosphatidylethanolamine (eg dioleoyl phosphatidylethanolamine, dilauroyl phosphatidylethanolamine, dimyristoyl phosphatidylethanolamine, dipalmitoyl phosphatid Ethanolamine, distearoyl phosphatidyl diethanolamine), phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidic acid, cardiolipin, sphingomyelin, egg yolk lecithin, soybean lecithin, etc. These hydrogenated products thereof.
Examples of glycolipids include glyceroglycolipids (for example, sulfoxyribosyl glyceride, diglycosyl diglyceride, digalactosyl diglyceride, galactosyl diglyceride, glycosyl diglyceride), and sphingoglycolipids (for example, galactosyl cerebroside, lactosyl cerebroside, ganglioside). .
Examples of sterols include animal-derived sterols (eg, cholesterol, cholesterol succinic acid, lanosterol, dihydrolanosterol, desmosterol, dihydrocholesterol), plant-derived sterols (eg, stigmasterol, sitosterol, campesterol, brassicasterol) And sterols derived from microorganisms (eg, timosterol, ergosterol).
Examples of the saturated or unsaturated fatty acid include saturated or unsaturated fatty acids having 12 to 20 carbon atoms such as palmitic acid, oleic acid, stearic acid, arachidonic acid, and myristic acid.

特に上述のＭＥＮＤのように遺伝子ベクターとして使用する微小カプセルを製造する場合、エンベロープ形成材料として使用する脂質としては、膜融合性が高い脂質の採用が好ましい。膜融合性が高い脂質を用いることにより、遺伝子ベクター（微小カプセル）が細胞に取り込まれたときにエンドソームからの脱出効率を向上させることができる。膜融合性が高い脂質としては、例えばジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、カルジオリピン、コレステロールコハク酸が挙げられる。 In particular, when producing a microcapsule used as a gene vector like the above-mentioned MEND, it is preferable to employ a lipid having high membrane fusion property as a lipid used as an envelope forming material. By using lipids with high membrane fusion properties, the efficiency of escape from endosomes can be improved when a gene vector (microcapsule) is taken into cells. Examples of lipids having high membrane fusion properties include dioleoylphosphatidylethanolamine, cardiolipin, and cholesterol succinic acid.

ところで、脂質は中性脂質、カチオン性脂質及びアニオン性脂質に分類される。中性脂質としては、例えばジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、コレステロール、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、セレブロシドが挙げられる。カチオン性脂質としては、例えばＤＯＤＡＣ（dioctadecyldimethylammonium chloride）、ＤＯＴＭＡ（N-（2,3-dioleyloxy）propyl-N,N,N-trimethylammonium）、ＤＤＡＢ（didodecylammonium bromide）、ＤＯＴＡＰ（1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammonio propane）、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（3β-N-（N',N',-dimethyl-aminoethane）-carbamol cholesterol）、ＤＭＲＩＥ（1,2-dimyristoyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethyl ammonium）、ＤＯＳＰＡ（2,3-dioleyloxy-N-[2（sperminecarboxamido）ethyl]-N,N-dimethyl-1-propanaminum trifluoroacetate）が挙げられる。また、アニオン性脂質としては、例えばカルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン（Ｎ−スクシニルＰＥ）、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエチレングリコール、コレステロールコハク酸が挙げられる。
このような電荷の相違に着目してエンベロープ形成用材料（脂質材料）を選択することによって、形成されるエンベロープの電荷を調整することができる。例えばカチオン性脂質材料を主体に使用することによって全体に正に帯電したエンベロープを形成することができる。また、アニオン性脂質材料を主体に使用することによって全体に負に帯電したエンベロープを形成することができる。By the way, lipids are classified into neutral lipids, cationic lipids and anionic lipids. Examples of neutral lipids include diacylphosphatidylcholine, diacylphosphatidylethanolamine, cholesterol, ceramide, sphingomyelin, cephalin, and cerebroside. Examples of the cationic lipid include DODAC (dioctadecyldimethylammonium chloride), DOTMA (N- (2,3-dioleyloxy) propyl-N, N, N-trimethylammonium), DDAB (didodecylammonium bromide), DOTAP (1,2-dioleoyloxy-3 -trimethylammoniopropane), DC-Chol (3β-N- (N ', N',-dimethyl-aminoethane) -carbamol cholesterol), DMRIE (1,2-dimyristoyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethyl ammonium), DOSPA (2,3- dioleyloxy-N- [2 (sperminecarboxamido) ethyl] -N, N-dimethyl-1-propanaminum trifluoroacetate). Examples of the anionic lipid include cardiolipin, diacylphosphatidylserine, diacylphosphatidic acid, N-succinylphosphatidylethanolamine (N-succinyl PE), phosphatidic acid, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol, phosphatidylethylene glycol, and cholesterol succinic acid. It is done.
By paying attention to such a difference in charge and selecting an envelope forming material (lipid material), the charge of the formed envelope can be adjusted. For example, a positively charged envelope can be formed as a whole by mainly using a cationic lipid material. Moreover, the negatively charged envelope can be formed as a whole by mainly using an anionic lipid material.

また、エンベロープ形成用流体（液状材料）には、脂質以外の種々の成分を含ませることができる。例えば、膜安定化剤としてステロール、グリセリン又はその脂肪酸エステル（例えばトリオレイン、トリオクタノイン）等を添加してもよい。
また、抗酸化剤としてトコフェロール、没食子酸プロピル、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシトルエン等を添加してもよい。
また、主体となる脂質材料の他に、エンベロープの正荷電又は負荷電を調整するための荷電物質を適宜添加してもよい。正荷電を付与する荷電物質としては、例えばステアリルアミン、オレイルアミン等の飽和又は不飽和脂肪族アミン、ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン等の飽和又は不飽和カチオン性合成脂質等が挙げられる。その他、カチオン性界面活性剤を適量添加してもよい。他方、負電荷を付与する荷電物質としては、例えばジセチルホスフェート、コレステリルヘミスクシネート、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸等が挙げられる。その他、アニオン性界面活性剤を適量添加してもよい。
また、膜の構造を維持したり、リポソーム膜に機能性を付与する目的で、種々のペプチド、タンパク質成分を添加してもよい。この種の物質として、例えば膜表在性タンパク質（又はペプチド）、膜内在性タンパク質（又はペプチド）が挙げられる。The envelope forming fluid (liquid material) can contain various components other than lipids. For example, sterol, glycerin or a fatty acid ester thereof (for example, triolein, trioctanoin) or the like may be added as a film stabilizer.
Moreover, you may add tocopherol, a propyl gallate, ascorbyl palmitate, butylated hydroxytoluene, etc. as an antioxidant.
In addition to the main lipid material, a charged substance for adjusting the positive charge or negative charge of the envelope may be appropriately added. Examples of the charged substance imparting positive charge include saturated or unsaturated aliphatic amines such as stearylamine and oleylamine, and saturated or unsaturated cationic synthetic lipids such as dioleoyltrimethylammonium propane. In addition, an appropriate amount of a cationic surfactant may be added. On the other hand, examples of the charged substance imparting a negative charge include dicetyl phosphate, cholesteryl hemisuccinate, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, and phosphatidic acid. In addition, an appropriate amount of an anionic surfactant may be added.
Various peptide and protein components may be added for the purpose of maintaining the membrane structure and imparting functionality to the liposome membrane. Examples of this type of substance include a membrane surface protein (or peptide) and an integral membrane protein (or peptide).

一方、微小カプセルを構成する封入物質としては、種々の高分子化合物及びそれらの複合体が挙げられる。遺伝子治療その他の生化学的用途に利用する場合、封入物質の好適例としてＤＮＡ、ＲＮＡ等のポリヌクレオチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖質等の生体材料あるいは薬剤が挙げられる。例えばＤＮＡと種々の有機ポリマー（例えばポリペプチド）との複合体は、好適な一例である。 On the other hand, examples of the encapsulating substance constituting the microcapsule include various polymer compounds and composites thereof. When used for gene therapy and other biochemical applications, preferred examples of the encapsulated substance include polynucleotides such as DNA and RNA, biomaterials such as oligopeptides, polypeptides, proteins, and carbohydrates, and drugs. For example, a complex of DNA and various organic polymers (for example, polypeptides) is a suitable example.

例えばエンベロープの電荷と封入物質の電荷を正負逆に設定することによって、静電的相互作用によるエンベロープ内への封入物質の取り込み効率を向上させることができる。例えば、両親媒性のリン脂質等によって水性溶媒中に構成されるエンベロープ（脂質二重層膜）では、膜表面は一般に負に帯電する。従って、このような場合に封入物質は正に帯電しているほうが当該負に帯電するエンベロープに取り込まれやすい。
例えば、負に帯電するＤＮＡ等のポリヌクレオチドを正に帯電させる手段として、カチオン性化合物（カチオン性ポリマー）との複合体形成が挙げられる。カチオン性化合物としては、例えばカチオン性脂質（例えばLipofectamine（Invitrogen社製）、ポリリジン、ポリアルギニン、リジンとアルギニンの共重合体等の塩基性アミノ酸の単独重合体若しくは共重合体又はこれらの誘導体（例えばステアリル化誘導体）、ポリエチレンイミン、ポリ（アリルアミン）、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロライド）、グルコサミン等のポリカチオン性ポリマー、硫酸プロタミン等が挙げられる。
例えば、ポリリジン(poly-l-lysine)等の長鎖状カチオン性ポリマーとの複合体形成が好ましい。また、このような複合体形成はＤＮＡその他のポリヌクレオチドのような長鎖状物質の凝集化を可能にすることにもなり、結果、物理的な側面と静電化学的な側面との両方からエンベロープ内への取り込み率を向上させることができる。
また、カチオン性化合物の構成比を調整することによって、当該複合体全体の電荷（即ち全体として僅かに正に帯電させるか或いはまた負に帯電させるか）を調整することができる。
なお、この逆に例えば封入物質がカチオン性化合物（例えば塩基性タンパク質）である場合、アニオン性化合物（例えば遺伝子としては機能しない無作為配列から成るポリヌクレオチド）との複合体形成を行えばよい。このときも上記と同様に、アニオン性化合物の構成比を調整することによって、複合体全体の電荷（即ち全体として僅かに負に帯電させるか或いはまた正に帯電させるか）を調整することができる。アニオン性化合物としては、例えばアニオン性脂質、ポリアスパラギン酸等の酸性アミノ酸の単独重合体若しくは共重合体又はこれらの誘導体、キサンタンガム、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースポリスチレンスルホン酸塩、ポリサッカライド、カラギーナン等のポリアニオン性ポリマーが挙げられる。For example, by setting the charge of the envelope and the charge of the encapsulating substance to be positive and negative, the efficiency of incorporating the encapsulating substance into the envelope by electrostatic interaction can be improved. For example, in an envelope (lipid bilayer membrane) constituted in an aqueous solvent by an amphiphilic phospholipid or the like, the membrane surface is generally negatively charged. Therefore, in such a case, the encapsulated substance is more easily taken into the negatively charged envelope when it is positively charged.
For example, as a means for positively charging a negatively charged polynucleotide such as DNA, a complex with a cationic compound (cationic polymer) can be mentioned. Examples of the cationic compound include cationic lipids (for example, Lipofectamine (manufactured by Invitrogen), polylysine, polyarginine, homopolymers or copolymers of basic amino acids such as copolymers of lysine and arginine, or derivatives thereof (for example, Stearylated derivatives), polyethylenimine, poly (allylamine), poly (diallyldimethylammonium chloride), polycationic polymers such as glucosamine, and protamine sulfate.
For example, it is preferable to form a complex with a long-chain cationic polymer such as poly-l-lysine. Such complex formation also enables the aggregation of long-chain substances such as DNA and other polynucleotides, resulting in both physical and electrostatic aspects. The incorporation rate into the envelope can be improved.
Further, by adjusting the composition ratio of the cationic compound, the charge of the entire complex (that is, whether it is slightly positively charged or negatively charged as a whole) can be adjusted.
Conversely, for example, when the encapsulated substance is a cationic compound (for example, a basic protein), a complex may be formed with an anionic compound (for example, a polynucleotide comprising a random sequence that does not function as a gene). At this time as well, by adjusting the composition ratio of the anionic compound, the charge of the entire complex (that is, whether it is slightly negatively charged or positively charged as a whole) can be adjusted. . Examples of the anionic compound include anionic lipids, homopolymers or copolymers of acidic amino acids such as polyaspartic acid or derivatives thereof, xanthan gum, carboxyvinyl polymer, carboxymethylcellulose polystyrene sulfonate, polysaccharide, carrageenan and the like. Examples include polyanionic polymers.

ここで開示される方法によると図１に示すような基材１０を使用することによって、微小カプセルを製造するプロセスの前段階として、上記複合体の生産工程を行うことができる。例えば、図１に示すような基材上の少なくとも一つの原料供給用マイクロチャネルに目的の封入物質（例えばポリヌクレオチド）を含む流体（液状材料）を供給し、基材上の他の少なくとも一つの原料供給用マイクロチャネルには該封入物質とは反対の電荷を持つ物質（例えばカチオン性化合物）を含む流体（液状材料）を供給し、反応用マイクロチャネルにおいて流体間の界面が維持され得る適当な流量（例えば０．０５〜１００μＬ／min、好ましくは０．５〜２０μＬ／min）で原料供給用マイクロチャネルから反応用マイクロチャネルにこれら流体を流動させる。これにより、小スケールで効率よく目的とする電荷の複合体を得ることができる。 According to the method disclosed here, by using the substrate 10 as shown in FIG. 1, the production process of the composite can be performed as a pre-stage of the process of manufacturing the microcapsules. For example, a fluid (liquid material) containing a target encapsulating substance (for example, polynucleotide) is supplied to at least one raw material supply microchannel on the substrate as shown in FIG. A fluid (liquid material) containing a substance (for example, a cationic compound) having a charge opposite to that of the encapsulated substance is supplied to the raw material supply microchannel, and the interface between the fluids can be maintained in the reaction microchannel. These fluids are caused to flow from the raw material supply microchannel to the reaction microchannel at a flow rate (for example, 0.05 to 100 μL / min, preferably 0.5 to 20 μL / min). Thereby, the target charge complex can be obtained efficiently on a small scale.

次いで得られた複合体を含む流体を少なくとも一つの原料供給用マイクロチャネルに供給するとともにエンベロープ形成用流体（例えば脂質と他の添加成分を含む液材）を他の少なくとも一つの原料供給用マイクロチャネルに供給し、所定の条件で液液界面反応によって所望する性状の微小カプセルを製造することができる。 Subsequently, the fluid containing the obtained complex is supplied to at least one raw material supply microchannel, and the envelope forming fluid (for example, a liquid material containing lipid and other additive components) is supplied to at least one other raw material supply microchannel. The microcapsules having a desired property can be produced by a liquid-liquid interface reaction under predetermined conditions.

以下の実施例によって、本発明の微小カプセル製造方法を上述のＭＥＮＤとして使用し得るようなリポソームの製造に適用した場合を詳細に説明するが、本発明の微小カプセル製造方法をかかる実施例に限定することを意図したものではない。 The case where the microcapsule production method of the present invention is applied to the production of liposomes that can be used as the above-mentioned MEND will be described in detail by the following examples. However, the microcapsule production method of the present invention is limited to such examples. It is not intended to be.

＜試験例１＞
本例では、図４に示すように、カチオン性ポリマー（ポリカチオン）として市販（SIGMA社製品「O-9882」）のポリリジン（poly-l-lysine；ＰＬＬ）を採用し、ポリヌクレオチド材料として市販のプラスミドＤＮＡ（plasmid DNA）を採用し、先ず前段階としてＤＮＡとポリリジンの複合体（DNA/Polycation complex；ＤＰＣ）を作製した。
次いで、得られたＤＰＣを含有する流体（液材）とエンベロープ形成用流体（液材）を用いてリポソームを製造した。本例では、ＰＥＧ修飾された脂質等を含む脂質膜形成用材料（液材）を使用した。<Test Example 1>
In this example, as shown in FIG. 4, a commercially available (poly-l-lysine; PLL) (SIGMA product “O-9882”) is used as a cationic polymer (polycation), and is commercially available as a polynucleotide material. First, a DNA / polylysine complex (DNA / Polycation complex; DPC) was prepared as a previous step.
Next, liposomes were produced using the obtained fluid (liquid material) containing DPC and an envelope forming fluid (liquid material). In this example, a lipid film-forming material (liquid material) containing PEG-modified lipid or the like was used.

具体的には、図１に示す形状の石英ガラス製基材（３５ｍｍ×７５ｍｍのマイクロチップ、マイクロチャネルの幅１００μｍ及び深さ３０μｍ）を使用し、ＤＰＣを生産した。即ち、プラスミドＤＮＡ（pcDNA3.1(+)luc）とＰＬＬをそれぞれ蒸留水に溶解し、それらの濃度を０．０１〜１ｍｇ／ｍＬ（ここでは０．１ｍｇ／ｍＬ）に調整した。そして図５に示すように、三つの原料供給用マイクロチャネルのうちの中央のチャネルに蒸留水を供給した。同時に、隣接する一方の原料供給用マイクロチャネルには上記プラスミドＤＮＡ溶液を供給し、隣接する他方の原料供給用マイクロチャネルには上記ＰＬＬ溶液を供給した。 Specifically, a DPC was produced using a quartz glass substrate (35 mm × 75 mm microchip, microchannel width 100 μm and depth 30 μm) having the shape shown in FIG. That is, plasmid DNA (pcDNA3.1 (+) luc) and PLL were each dissolved in distilled water, and their concentrations were adjusted to 0.01 to 1 mg / mL (here 0.1 mg / mL). And as shown in FIG. 5, distilled water was supplied to the center channel among the three raw material supply microchannels. At the same time, the plasmid DNA solution was supplied to one adjacent raw material supply microchannel, and the PLL solution was supplied to the other adjacent raw material supply microchannel.

このように、原料供給用マイクロチャネルのうちの一つにポリヌクレオチドとカチオン性化合物のいずれも含まない材料非含有流体（ここでは蒸留水）を供給し、反応用マイクロチャネルの一部の領域を流動する材料非含有流体の一方の側面をポリヌクレオチド（ここでは負の電荷のプラスミドＤＮＡ）含有流体が該材料非含有流体との界面を維持しつつ流動させ、且つ、反応用マイクロチャネルの一部の領域を流動する材料非含有流体の他方の側面をカチオン性化合物（ここでは正の電荷のＰＬＬ）含有流体が該材料非含有流体との界面を維持しつつ流動させることにより、特に効率よく凝集化した複合体（ここではＤＰＣ）を得ることができる。
本例ではシリンジポンプ（アズワン（株）製品）によって各原料供給用マイクロチャネル及び反応用マイクロチャネルを流動する流体の流速を１０μＬ／minに設定した。In this way, a material-free fluid (in this case, distilled water) that does not contain either a polynucleotide or a cationic compound is supplied to one of the raw material supply microchannels, and a partial region of the reaction microchannel is formed. One side surface of the fluid containing no material is allowed to flow while the fluid containing the polynucleotide (here, negatively charged plasmid DNA) flows while maintaining the interface with the material-free fluid, and a part of the reaction microchannel The other side of the non-material-containing fluid flowing in the region of the material is aggregated particularly efficiently by allowing the fluid containing the cationic compound (here, positively charged PLL) to flow while maintaining the interface with the non-material-containing fluid. A complex (in this case, DPC) can be obtained.
In this example, the flow rate of the fluid flowing through each raw material supply microchannel and reaction microchannel was set to 10 μL / min by a syringe pump (product of ASONE Co., Ltd.).

而して、反応用マイクロチャネルを流動してきた液材を回収した。そして、市販の光散乱方式粒度分布・ゼータ電位測定装置（Particle Sizing Systems Co.社製品）を用いて、得られたＤＰＣ凝集体（ＤＮＡ condensates）の粒度分布を測定した。結果（粒度分布）を図６に示す。図６のグラフから明らかなように、得られたＤＰＣ凝集体の粒径は５０〜１００ｎｍの範囲に集中しており、粒度分布の幅は狭かった。また、粒度分布のピーク値（即ちモード径）は約７０ｎｍであった（図６参照）。 Thus, the liquid material flowing through the reaction microchannel was recovered. And the particle size distribution of the obtained DPC aggregate (DNA condensates) was measured using the commercially available light-scattering type particle size distribution and zeta potential measuring device (product of Particle Sizing Systems Co.). The results (particle size distribution) are shown in FIG. As apparent from the graph of FIG. 6, the particle diameters of the obtained DPC aggregates were concentrated in the range of 50 to 100 nm, and the width of the particle size distribution was narrow. The peak value (namely, mode diameter) of the particle size distribution was about 70 nm (see FIG. 6).

続いて、図５に示すように、同形状の基材を使用し、三つの原料供給用マイクロチャネルのうちの中央のチャネルに上記得られたＤＰＣ含有流体（溶液）を供給した。同時に、隣接する二つの原料供給用マイクロチャネルには脂質膜形成用流体（溶液）を供給した。
なお、本試験例に限られず、この種の微小カプセル（リポソーム）を製造する場合の脂質濃度は特に限定されないが、０．０１〜２００ｍｇ／ｍＬ程度が適当であり、０．１〜１００ｍｇ／ｍＬ程度が好ましい。溶媒としては、水性溶媒および有機溶媒のいずれでもよいが適当なｐＨ（６．５〜７．５、より好ましくは７．０〜７．５）のバッファーが好ましい。本試験例では、
（１）．２０ｍｇ／ｍＬのＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、０．２ＭのＯＧＰ（n-Octyl-β-D-glucopyranoside）及び５ｍＭのＨＥＰＥＳの混合溶液２６０μＬと、
（２）．４０ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ（1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-[Methoxy(Polyethylene glycol)-2000]：Avanti（登録商標）Polar Lipids, inc.社製品、No.880120P）、０．２ＭのＯＧＰ及び５ｍＭのＨＥＰＥＳの混合液６０μＬと、
（３）．１ｍｇ／ｍＬのＤＣＰ（ジセチルホスフェート）、０．４ＭのＯＧＰ及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳの混合溶液４００μＬと、
（４）．脱イオン蒸留水４００μＬと、
（５）．０．２ＭのＯＧＰ及び５ｍＭのＨＥＰＥＳの混合溶液４００μＬと、
を混合して脂質溶液（即ち本試験例に係るエンベロープ形成用流体）を調製し、かかる脂質溶液を上記のとおり二つの原料供給用マイクロチャネルに供給した。
本試験例ではシリンジポンプ（アズワン（株）製品）によって各原料供給用マイクロチャネル及び反応用マイクロチャネルを流動する流体の流速を１０μＬ／minに設定し、室温条件（２０〜３５℃、好ましくは２５〜３０℃）で流動を実施した。Subsequently, as shown in FIG. 5, the substrate having the same shape was used, and the obtained DPC-containing fluid (solution) was supplied to the central channel among the three raw material supply microchannels. At the same time, lipid membrane forming fluid (solution) was supplied to two adjacent microchannels for supplying raw material.
In addition, it is not restricted to this test example, The lipid density | concentration in the case of manufacturing this kind of microcapsule (liposome) is not specifically limited, About 0.01-200 mg / mL is suitable, 0.1-100 mg / mL The degree is preferred. The solvent may be either an aqueous solvent or an organic solvent, but a buffer having an appropriate pH (6.5 to 7.5, more preferably 7.0 to 7.5) is preferable. In this test example,
(1). 260 μL of a mixed solution of 20 mg / mL DOPE (dioleoylphosphatidylethanolamine), 0.2 M OGP (n-Octyl-β-D-glucopyranoside) and 5 mM HEPES,
(2). 40 mg / mL PEG (1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N- [Methoxy (Polyethylene glycol) -2000]: Avanti (registered trademark) Polar Lipids, Inc. product, No. 880120P), 60 μL of a mixture of 0.2 M OGP and 5 mM HEPES,
(3). 400 μL of a mixed solution of 1 mg / mL DCP (dicetyl phosphate), 0.4 M OGP and 10 mM HEPES,
(4). 400 μL of deionized distilled water,
(5). 400 μL of a mixed solution of 0.2 M OGP and 5 mM HEPES,
Were mixed to prepare a lipid solution (that is, an envelope forming fluid according to this test example), and the lipid solution was supplied to the two raw material supply microchannels as described above.
In this test example, the flow rate of the fluid flowing through each raw material supply microchannel and reaction microchannel is set to 10 μL / min by a syringe pump (product of ASONE Co., Ltd.), and room temperature conditions (20 to 35 ° C., preferably 25 Flow was carried out at ˜30 ° C.).

而して、反応用マイクロチャネル8を流動してきた液材を回収した。そして、市販の光散乱方式粒度分布・ゼータ電位測定装置（Particle Sizing Systems Co.社製品）を用いて、得られたリポソーム（ＭＥＮＤ）の粒度分布を測定した。結果（粒度分布）を図７に示す。図７のグラフから明らかなように、得られたリポソーム（ＭＥＮＤ）の粒径は１００〜２００ｎｍの範囲に集中しており、粒度分布の幅は狭かった。また、粒度分布のピーク値は約１５０ｎｍであった（図７参照）。
以上の結果から、本発明の方法によって、基材上で微小カプセルを効率よく製造し得ることが確認された。Thus, the liquid material flowing through the reaction microchannel 8 was recovered. And the particle size distribution of the obtained liposome (MEND) was measured using the commercially available light-scattering type particle size distribution and zeta potential measuring device (product of Particle Sizing Systems Co.). The results (particle size distribution) are shown in FIG. As apparent from the graph of FIG. 7, the particle size of the obtained liposome (MEND) was concentrated in the range of 100 to 200 nm, and the width of the particle size distribution was narrow. The peak value of the particle size distribution was about 150 nm (see FIG. 7).
From the above results, it was confirmed that microcapsules can be efficiently produced on a substrate by the method of the present invention.

＜試験例２＞
次に、ＦＩＴＣでラベルしたポリリジンを用いて上記と同様の方法によってＦＩＴＣラベル化ＤＰＣ（ＤＮＡ condensates）溶液を作製した。またローダミンでラベルしたＤＯＰＥをマイクロチューブ内で風乾させ、それを上記脂質溶液に再溶解することによってローダミンラベル化脂質溶液を作製した。次いで、上記と同様の微小カプセル製造プロセスを行い、ラベル化微小カプセル（ＭＥＮＤ）を製造した。得られたＭＥＮＤをレーザー走査型共焦点顕微鏡（Carl Zeiss社製品）により観察したところ、内部に所望する封入物質（ここではＦＩＴＣラベル化ＤＰＣ）が配置されていることが確認された。<Test Example 2>
Next, a FITC-labeled DPC (DNA condensates) solution was prepared by the same method as described above using FITC-labeled polylysine. Also, rhodamine-labeled lipid solution was prepared by air-drying rhodamine-labeled DOPE in a microtube and re-dissolving it in the lipid solution. Subsequently, the same microcapsule manufacturing process as described above was performed to manufacture labeled microcapsules (MEND). When the obtained MEND was observed with a laser scanning confocal microscope (product of Carl Zeiss), it was confirmed that a desired encapsulated substance (here, FITC-labeled DPC) was disposed.

＜試験例３＞
本例では、図８に示すようなＹ字（二股）形状に二つの原料供給用マイクロチャネル３２，３４を有する石英ガラス製基材（３５ｍｍ×７５ｍｍのマイクロリアクター、マイクロチャネルの幅１００μｍ及び深さ４０μｍ）３０を使用し、ＤＰＣを作製した。
即ち、プラスミドＤＮＡ（pcDNA3.1(+)luc）とＰＬＬをそれぞれ蒸留水に溶解し、濃度が０．１ｍｇ／ｍＬのプラスミドＤＮＡ溶液と、濃度が０．００５ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０２ｍｇ／ｍＬ、０．０３ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．０６ｍｇ／ｍＬ、０．０８ｍｇ／ｍＬ及び０．１ｍｇ／ｍＬである計８種類のＰＬＬ溶液を調製した。そして、一方の原料供給用マイクロチャネル３２の貯留部（注入口：inlet）３２Ａに上記プラスミドＤＮＡ溶液を供給し、他方の原料供給用マイクロチャネル３４の貯留部（注入口：inlet）３４Ａには上記いずれかの濃度のＰＬＬ溶液を供給した。なお、本例ではシリンジポンプ（アズワン（株）製品）によって各原料供給用マイクロチャネル３２，３４への原料溶液導入速度を１０μＬ／minに設定した。一回のＤＰＣ作製継続時間（即ち原料溶液導入継続時間）は１０分とした。<Test Example 3>
In this example, a quartz glass substrate (35 mm × 75 mm microreactor, microchannel width 100 μm and depth) having Y-shaped (bifurcated) shapes as shown in FIG. 40 μm) 30 was used to make a DPC.
Specifically, plasmid DNA (pcDNA3.1 (+) luc) and PLL were dissolved in distilled water, respectively, and a plasmid DNA solution having a concentration of 0.1 mg / mL, and concentrations of 0.005 mg / mL, 0.01 mg / mL, Eight types of PLL solutions, 0.02 mg / mL, 0.03 mg / mL, 0.05 mg / mL, 0.06 mg / mL, 0.08 mg / mL and 0.1 mg / mL, were prepared. Then, the plasmid DNA solution is supplied to the storage portion (inlet) 32A of one raw material supply microchannel 32, and the storage portion (injection) 34A of the other raw material supply microchannel 34 is supplied to the storage portion (inlet) 34A. Either concentration of PLL solution was supplied. In this example, the rate of introduction of the raw material solution into each of the raw material supply microchannels 32 and 34 was set to 10 μL / min by a syringe pump (manufactured by ASONE Corporation). The duration of DPC production once (that is, the raw material solution introduction duration) was 10 minutes.

上記原料溶液の供給開始から１０分後、反応用マイクロチャネル３８を流動してきた液材を貯留部（排出口：outlet）３８Ａから回収した。そして、試験例１と同様、市販の光散乱方式粒度分布・ゼータ電位測定装置（Particle Sizing Systems Co.社製品）を用いて、得られたＤＰＣ凝集体（ＤＮＡ condensates）の粒度分布とピーク粒径を測定した。結果（粒度分布のピーク粒径）を図９に示す。なお、図中の各プロットは３回の測定結果の平均値を示している。 Ten minutes after the start of the supply of the raw material solution, the liquid material that had flowed through the reaction microchannel 38 was collected from the storage portion (discharge port: outlet) 38A. As in Test Example 1, the particle size distribution and peak particle size of the obtained DPC aggregates (DNA condensates) were obtained using a commercially available light scattering particle size distribution / zeta potential measurement device (product of Particle Sizing Systems Co.). Was measured. The results (peak particle size of particle size distribution) are shown in FIG. Each plot in the figure shows the average value of the three measurement results.

図９のグラフから明らかなように、粒子径（ピーク粒径）が概ね２００ｎｍ〜１０００ｎｍであるＤＰＣ（ここではＤＮＡ／ポリリジン複合体）を得ることができた。得られるＤＰＣの粒径は、ＰＬＬ濃度によって変化した。なお、詳細なデータを示していないが、レーザー走査型共焦点顕微鏡（Carl Zeiss社製品）によって本例において使用したＹ字（二股）形状に原料供給用マイクロチャネル３２，３４を有する基材（マイクロリアクター）３０を観察した結果、各マイクロチャネル３２，３４，３８の接続ポイントＰＰにおいて若干のＤＰＣの集積が確認された。かかる集積の発生が液材の流動（流速）に影響を及ぼし、延いては形成されるＤＰＣの粒子径（ピーク値）を変動させる要因であるとも考えられる。 As is clear from the graph of FIG. 9, DPC (herein, DNA / polylysine complex) having a particle size (peak particle size) of approximately 200 nm to 1000 nm could be obtained. The particle size of the DPC obtained varied with the PLL concentration. Although detailed data is not shown, the substrate (micro-channel) having the microchannels 32 and 34 for supplying the raw material in the Y-shape (bifurcated) shape used in this example by a laser scanning confocal microscope (product of Carl Zeiss) As a result of observing the (reactor) 30, some DPC accumulation was confirmed at the connection point PP of each of the microchannels 32, 34, and 38. It is considered that the occurrence of such accumulation affects the flow (flow velocity) of the liquid material, and in turn causes the particle diameter (peak value) of the formed DPC to fluctuate.

＜試験例４＞
本例では、試験例１と同様の図１に示す形状の三つの原料供給用マイクロチャネルを備える石英ガラス製基材（３５ｍｍ×７５ｍｍのマイクロチップ、マイクロチャネルの幅１００μｍ及び深さ４０μｍ）を使用し、ＤＰＣを生産した。
具体的には、プラスミドＤＮＡ（pcDNA3.1(+)luc）とＰＬＬをそれぞれ蒸留水に溶解し、濃度が０．０１ｍｇ／ｍＬのプラスミドＤＮＡ溶液と、濃度が０．００４ｍｇ／ｍＬ、０．００６ｍｇ／ｍＬ、０．００８ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬ及び０．０２ｍｇ／ｍＬである計５種類のＰＬＬ溶液を調製した。
そして、三つの原料供給用マイクロチャネルのうちの中央のチャネルに蒸留水を供給した。同時に、隣接する一方の原料供給用マイクロチャネルには上記プラスミドＤＮＡ溶液を供給し、隣接する他方の原料供給用マイクロチャネルには上記いずれかの濃度のＰＬＬ溶液を供給した。なお、本例ではシリンジポンプ（アズワン（株）製品）によって各原料供給用マイクロチャネルへの原料溶液導入速度を１０μＬ／minに設定した。一回のＤＰＣ作製継続時間（即ち原料溶液導入継続時間）は１０分とした。<Test Example 4>
In this example, a quartz glass substrate (35 mm × 75 mm microchip, microchannel width of 100 μm and depth of 40 μm) having three raw material supply microchannels having the shape shown in FIG. DPC was produced.
Specifically, plasmid DNA (pcDNA3.1 (+) luc) and PLL are dissolved in distilled water, respectively, and a plasmid DNA solution with a concentration of 0.01 mg / mL and concentrations of 0.004 mg / mL and 0.006 mg are used. A total of five types of PLL solutions were prepared: / mL, 0.008 mg / mL, 0.01 mg / mL, and 0.02 mg / mL.
Then, distilled water was supplied to the central channel among the three raw material supply microchannels. At the same time, the plasmid DNA solution was supplied to one adjacent raw material supply microchannel, and the PLL solution having any of the above concentrations was supplied to the other adjacent raw material supply microchannel. In this example, the raw material solution introduction rate into each raw material supply microchannel was set to 10 μL / min by a syringe pump (product of ASONE Co., Ltd.). The duration of DPC production once (that is, the raw material solution introduction duration) was 10 minutes.

上記原料溶液の供給開始から１０分後、反応用マイクロチャネルを流動してきた液材を貯留部（排出口：outlet）から回収した。そして、試験例３と同様、市販の光散乱方式粒度分布・ゼータ電位測定装置（Particle Sizing Systems Co.社製品）を用いて、得られたＤＰＣ凝集体（ＤＮＡ condensates）の粒度分布とピーク粒径を測定した。結果（粒度分布のピーク粒径）を図１０に示す。なお、図中の各プロットは３回の測定結果の平均値を示している。 Ten minutes after the start of the supply of the raw material solution, the liquid material that had flowed through the reaction microchannel was collected from the reservoir (discharge port: outlet). Then, as in Test Example 3, using a commercially available light scattering particle size distribution / zeta potential measurement device (product of Particle Sizing Systems Co.), the particle size distribution and peak particle size of the obtained DPC aggregate (DNA condensates) Was measured. The results (peak particle size of particle size distribution) are shown in FIG. Each plot in the figure shows the average value of the three measurement results.

図１０のグラフから明らかなように、本例では、使用したＰＬＬの濃度（０．００４〜０．０２ｍｇ／ｍＬ）に拘わらず、粒子径（ピーク粒径）が１００ｎｍ〜２００ｎｍ（より詳細には１３０〜１７０ｎｍ、特に１５０ｎｍ±１０ｎｍ程度）であるＤＰＣ（ここではＤＮＡ／ポリリジン複合体）を安定的に得ることができた。詳細なデータを示していないが、レーザー走査型共焦点顕微鏡（Carl Zeiss社製品）での観察の結果、本例においては各マイクロチャネルの接続ポイント（図１の符号Ｐ参照）にＤＰＣの集積は認められなかった。さらに、各原料溶液の混合部位（即ち各原料供給用マイクロチャネルから流動してきた液液界面：図２の符号Ｂ参照）は、各マイクロチャネルの接続ポイントから反応用マイクロチャネルの貯留部（排出口：outlet）付近まで伸びていた。これらのことが、形成されるＤＰＣの粒子径（ピーク値）の安定化に寄与したと考えられる。 As is apparent from the graph of FIG. 10, in this example, the particle diameter (peak particle diameter) is 100 nm to 200 nm (more specifically, regardless of the concentration of the used PLL (0.004 to 0.02 mg / mL)). DPC (here, DNA / polylysine complex) having a thickness of 130 to 170 nm, particularly about 150 nm ± 10 nm, could be stably obtained. Although detailed data is not shown, as a result of observation with a laser scanning confocal microscope (product of Carl Zeiss), in this example, the integration of DPC at the connection point of each microchannel (see symbol P in FIG. 1) I was not able to admit. Furthermore, the mixing part of each raw material solution (that is, the liquid-liquid interface flowing from each raw material supply microchannel: see B in FIG. 2) is connected to the reaction microchannel reservoir (discharge port) from the connection point of each microchannel. : Outlet). These are considered to have contributed to the stabilization of the particle diameter (peak value) of the formed DPC.

＜試験例５＞
本例では、試験例４と同じ基材（マイクロリアクター）及び材料を使用し、ＤＰＣを生産した。本例では、ＰＬＬ濃度及びプラスミドＤＮＡ濃度をそれぞれ０．０１ｍｇ／ｍＬに固定し、各原料供給用マイクロチャネルへの原料溶液導入速度（流速）を１μＬ／min、２．５μＬ／min、５μＬ／min、７．５μＬ／min及び１０μＬ／minに変化させてＤＰＣ生産を行った。<Test Example 5>
In this example, the same substrate (microreactor) and material as those in Test Example 4 were used to produce DPC. In this example, the PLL concentration and the plasmid DNA concentration are each fixed at 0.01 mg / mL, and the raw material solution introduction speed (flow rate) to each raw material supply microchannel is 1 μL / min, 2.5 μL / min, 5 μL / min. DPC production was carried out at 7.5 μL / min and 10 μL / min.

上記原料溶液の供給開始から１０分後、反応用マイクロチャネルを流動してきた液材を貯留部（排出口：outlet）から回収した。そして、試験例３及び試験例４と同様、市販の光散乱方式粒度分布・ゼータ電位測定装置（Particle Sizing Systems Co.社製品）を用いて、得られたＤＰＣ凝集体（ＤＮＡ condensates）の粒度分布とピーク粒径を測定した。結果（粒度分布のピーク粒径）を図１１に示す。なお、図中の各プロットは３回の測定結果の平均値を示している。 Ten minutes after the start of the supply of the raw material solution, the liquid material that had flowed through the reaction microchannel was collected from the reservoir (discharge port: outlet). Similar to Test Example 3 and Test Example 4, the particle size distribution of the DPC aggregates (DNA condensates) obtained using a commercially available light scattering system particle size distribution / zeta potential measuring device (product of Particle Sizing Systems Co.). And the peak particle size was measured. The results (peak particle size of particle size distribution) are shown in FIG. Each plot in the figure shows the average value of the three measurement results.

図１１のグラフから明らかなように、原料溶液の流速（１〜１０μＬ／min）が減少するに伴い、得られるＤＰＣの粒子径（ピーク粒径）が徐々に大きくなった。具体的には、試験例３と同様の流速１０μＬ／minでは約１５０ｎｍの粒径（粒度分布のピーク粒径）であるＤＰＣを安定的に得ることができた。一方、原料溶液の流速を２．５〜７．５μＬ／min程度に下げることにより、約２００ｎｍの粒径（粒度分布のピーク粒径）であるＤＰＣを安定的に得ることができた。さらに原料溶液の流速を１μＬ／min程度まで下げることにより、２００ｎｍを越える粒径（粒度分布のピーク粒径）のＤＰＣ（典型的には２００〜２５０ｎｍ）を安定的に得ることができた。
なお、詳細なデータは示していないが、ここで得られたＤＰＣを用いて、上述の試験例１と同様の材料及び手法によりリポソーム（ＭＥＮＤ）を製造する工程において、各原料供給用マイクロチャネル及び反応用マイクロチャネルを流動する流体の流速を１〜１０μＬ／minの間で変化させたところ、原料溶液の流速が減少するに伴い、得られるリポソーム（ＭＥＮＤ）の粒径（ピーク粒径）が徐々に大きくなることが確認された。
以上の結果から明らかなように、本発明の製造方法においては、基材上のマイクロチャネルを流動する溶液（液材）の流速を調節することによって、得られるＭＥＮＤ及びＤＰＣの粒径（粒度分布）を制御することができる。特に、上記接続ポイントＰより下流での溶液のスムーズな流動を容易に実現し得る三つの原料供給用マイクロチャネルが一つの反応用マイクロチャネルに連通する三叉路タイプの基材（好適には図１及び図２に示すような各原料供給用マイクロチャネル１２，１３，１４が隣接するチャネル同士でそれぞれ直交する基材）の使用が好ましい。As is clear from the graph of FIG. 11, the particle diameter (peak particle diameter) of the obtained DPC gradually increased as the flow rate of the raw material solution (1 to 10 μL / min) decreased. Specifically, DPC having a particle size of about 150 nm (peak particle size of particle size distribution) was stably obtained at a flow rate of 10 μL / min similar to Test Example 3. On the other hand, by lowering the flow rate of the raw material solution to about 2.5 to 7.5 μL / min, DPC having a particle size of about 200 nm (peak particle size of particle size distribution) could be stably obtained. Furthermore, by lowering the flow rate of the raw material solution to about 1 μL / min, DPC (typically 200 to 250 nm) having a particle size exceeding 200 nm (peak particle size of particle size distribution) could be stably obtained.
Although detailed data is not shown, in the step of producing liposomes (MEND) by the same material and method as in Test Example 1 using the DPC obtained here, each raw material supply microchannel and When the flow rate of the fluid flowing through the reaction microchannel is changed between 1 to 10 μL / min, the particle size (peak particle size) of the obtained liposome (MEND) gradually increases as the flow rate of the raw material solution decreases. It was confirmed that it would become larger.
As is clear from the above results, in the production method of the present invention, the particle size (particle size distribution) of MEND and DPC obtained by adjusting the flow rate of the solution (liquid material) flowing through the microchannel on the substrate. ) Can be controlled. In particular, a three-junction type base material (preferably FIG. 1 and FIG. 1) in which three raw material supply microchannels that can easily realize a smooth flow of a solution downstream from the connection point P communicates with one reaction microchannel. As shown in FIG. 2, it is preferable to use a substrate in which the raw material supply microchannels 12, 13, and 14 are orthogonal to each other in adjacent channels.

上記のようにして得られたリポソーム（ＭＥＮＤ）は、所望する物質（封入物質）を細胞内に送達するベクター（典型的には遺伝子ベクター）として好適に使用することができる。このような微小カプセル（リポソーム）は、分散液の状態で使用することができる。分散溶媒としては、例えば生理食塩水、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液等の緩衝液を使用することができる。分散液には、例えば糖類、多価アルコール、水溶性高分子、非イオン界面活性剤、抗酸化剤、ｐＨ調節剤、水和促進剤等の添加剤を添加して使用することができる。また、このような微小カプセル（リポソーム）は、インビボ(in vivo)及びインビトロ(in vitro)のいずれにおいても使用することができる。インビボで使用する場合の投与経路としては、静脈、腹腔内、皮下、経鼻等の非経口投与が挙げられる。 The liposome (MEND) obtained as described above can be suitably used as a vector (typically a gene vector) for delivering a desired substance (encapsulated substance) into cells. Such microcapsules (liposomes) can be used in the state of a dispersion. As the dispersion solvent, for example, a buffer solution such as physiological saline, phosphate buffer, citrate buffer, and acetate buffer can be used. For example, additives such as sugars, polyhydric alcohols, water-soluble polymers, nonionic surfactants, antioxidants, pH adjusters, hydration accelerators can be added to the dispersion. Such microcapsules (liposomes) can be used both in vivo and in vitro. Examples of the route of administration when used in vivo include parenteral administration such as intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, and nasal administration.

なお、遺伝子ベクター等として使用する場合には、エンベロープ（ここでは脂質膜）の表面に細胞膜結合性物質を導入することが好ましい（図５）。これにより、ベクターとしてのエンドサイトーシス効率を向上させることができる。
細胞膜結合性物質としては、例えば、細胞膜の表面上に存在する受容体又は抗原と結合できる物質、具体的には、トラスフェリン、インシュリン、葉酸、ヒアルロン酸、抗体又はその断片、糖鎖、成長因子、アポリポタンパク質等が挙げられる。
成長因子としては、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）等が挙げられる。アポリポタンパク質としては、例えば、アポＡ−１、アポＢ−４８、アポＢ−１００、アポＥ等が挙げられる。抗体の断片としては、例えば、Fab断片、F（ab）'2断片、単鎖抗体（scFv）等が挙げられる。
細胞膜結合性物質は、例えば、リポソーム表面の親水性ポリマーに結合させることにより、リポソーム表面に導入することができる。例えば、親水性ポリマーが有する官能基（親水性ポリマーに人為的に導入された官能基を含む。）と細胞膜結合性物質が有する官能基（細胞膜結合性物質に人為的に導入された官能基を含む。）を反応させることにより、細胞膜結合性物質を共有結合を介して親水性ポリマーに結合させることができる。共有結合を形成できる官能基の組み合わせとしては、例えば、アミノ基／カルボキシル基、アミノ基／ハロゲン化アシル基、アミノ基／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、アミノ基／ベンゾトリアゾールカーボネート基、アミノ基／アルデヒド基、チオール基／マレイミド基、チオール基／ビニルスルホン基等が挙げられる。In addition, when using as a gene vector etc., it is preferable to introduce | transduce a cell membrane binding substance into the surface of an envelope (here lipid membrane) (FIG. 5). Thereby, the endocytosis efficiency as a vector can be improved.
Examples of the cell membrane-binding substance include a substance capable of binding to a receptor or antigen present on the surface of the cell membrane, specifically, trassferin, insulin, folic acid, hyaluronic acid, antibody or fragment thereof, sugar chain, growth factor And apolipoprotein.
Examples of growth factors include epidermal growth factor (EGF), insulin-like growth factor (IGF), fibroblast growth factor (FGF) and the like. Examples of the apolipoprotein include apo A-1, apo B-48, apo B-100, and apo E. Examples of antibody fragments include Fab fragments, F (ab) ′ 2 fragments, single chain antibodies (scFv), and the like.
The cell membrane-binding substance can be introduced onto the liposome surface, for example, by binding to a hydrophilic polymer on the liposome surface. For example, functional groups possessed by hydrophilic polymers (including functional groups artificially introduced into hydrophilic polymers) and functional groups possessed by cell membrane binding substances (functional groups artificially introduced into cell membrane binding substances) The cell membrane-binding substance can be bound to the hydrophilic polymer via a covalent bond. Examples of combinations of functional groups that can form a covalent bond include amino groups / carboxyl groups, amino groups / acyl halide groups, amino groups / N-hydroxysuccinimide ester groups, amino groups / benzotriazole carbonate groups, amino groups / aldehydes. Group, thiol group / maleimide group, thiol group / vinylsulfone group and the like.

以上のように本発明によると、極めて小さい基材（マイクロチップ）上で、効率よくＭＥＮＤ等の微小カプセルを製造することができる。例えば、従来方法で上記特許文献１に記載のＭＥＮＤを作製する場合には概ね３０時間以上要するが、ここで開示される方法では上記マイクロチャネルを有する基材（マイクロチップ）を用いることによって上記複合体生産工程を含めても約２０分程度（チャネルの長さや流量に依存する）でＭＥＮＤを作製することができる。また、図１，２に示されるパターン以外にも種々のパターンのマイクロチャネルを形成することが可能である。また、微小カプセル製造のための界面反応を全て基材上で行うことにより、コンタミネーションの防止が容易であり、生体材料、例えば遺伝子ベクターを製造する場合に都合がよい。 As described above, according to the present invention, microcapsules such as MEND can be efficiently produced on an extremely small substrate (microchip). For example, when the MEND described in Patent Document 1 described above is manufactured by a conventional method, it takes approximately 30 hours or more. However, in the method disclosed here, the above-mentioned composite is obtained by using a substrate (microchip) having the microchannel. MEND can be produced in about 20 minutes (depending on channel length and flow rate) including the body production process. In addition to the patterns shown in FIGS. 1 and 2, various patterns of microchannels can be formed. In addition, since all the interfacial reactions for producing the microcapsules are carried out on the base material, contamination can be easily prevented, which is convenient when a biomaterial such as a gene vector is produced.

また、本発明の方法は、上記試験例に限られず、例えばプラスミドＤＮＡ以外のポリヌクレオチド（アンチセンスオリゴＤＮＡ、ＲＮＡ等）、タンパク質（酵素等）、或いは機能性ペプチド、オリゴ糖等の低分子物質を封入物質とする微小カプセルの製造にも好適に適用できる。また、
本方法に使用する基材は従来の方法で使用されるマイクロチップと同様に容易に量産することができる。In addition, the method of the present invention is not limited to the above-described test examples. For example, polynucleotides other than plasmid DNA (antisense oligo DNA, RNA, etc.), proteins (enzymes, etc.), low molecular substances such as functional peptides, oligosaccharides, etc. The present invention can also be suitably applied to the production of microcapsules containing as a sealing substance. Also,
The base material used in this method can be easily mass-produced similarly to the microchip used in the conventional method.

Claims

直径１μｍ以下のエンベロープと該エンベロープ内部に封入された物質とから成る微小カプセルを製造する方法であって、
複数の原料供給用マイクロチャネルと、該複数の原料供給用マイクロチャネルと連通する反応用マイクロチャネルとが形成された基材を用意すること、
前記複数の原料供給用マイクロチャネルのうちの少なくとも一つに前記封入物質を含む流体を供給すること、
前記複数の原料供給用マイクロチャネルのうちの少なくとも他の一つに前記エンベロープを形成するための、リン脂質、糖脂質、ステロール、飽和又は不飽和の脂肪酸からなる群から選択される少なくとも１種の脂質を含むエンベロープ形成用流体を供給すること、
各マイクロチャネルから前記反応用マイクロチャネルに合流した前記エンベロープ形成用流体と前記封入物質含有流体とを、合流時に形成されるそれら流体間の界面が継続的に維持されるようにして該反応用マイクロチャネルを流動させることによって、該反応用マイクロチャネル内において前記エンベロープ内部に前記封入物質が配置された状態の微小カプセルを形成すること、および、
前記反応用マイクロチャネルを流動してきた前記微小カプセルを含有する流体を回収すること、
を包含する微小カプセル製造方法。 A method for producing a microcapsule comprising an envelope having a diameter of 1 μm or less and a substance enclosed inside the envelope,
Preparing a substrate on which a plurality of raw material supply microchannels and a reaction microchannel communicating with the plurality of raw material supply microchannels are formed;
Supplying a fluid containing the encapsulating substance to at least one of the plurality of raw material supply microchannels;
At least one selected from the group consisting of phospholipids, glycolipids, sterols, saturated or unsaturated fatty acids for forming the envelope in at least one other of the plurality of raw material supply microchannels Supplying an envelope-forming fluid containing lipids;
The envelope forming fluid merged from each microchannel into the reaction microchannel and the encapsulated substance-containing fluid are maintained in such a manner that the interface between the fluids formed at the time of merging is continuously maintained. Forming a microcapsule in which the encapsulating substance is disposed inside the envelope in the reaction microchannel by flowing the channel; and
Recovering the fluid containing the microcapsules that have flowed through the reaction microchannels;
A method for producing microcapsules comprising:

前記原料供給用マイクロチャネル及び反応用マイクロチャネルの幅が１０μｍ以上５００μｍ以下である、請求項１に記載の方法。 The method according to claim 1, wherein the raw material supply microchannel and the reaction microchannel have a width of 10 μm or more and 500 μm or less.

前記基材として、前記原料供給用マイクロチャネルを少なくとも三つ備えるとともに該少なくとも三つの原料供給用マイクロチャネルは一つのポイントで前記反応用マイクロチャネルに全て連通するように形成されていることを特徴とする基材を使用し、
該反応用マイクロチャネルの一部の領域を流動する前記封入物質含有流体の両側を、前記エンベロープ形成用流体が前記封入物質含有流体との界面を維持しつつ流動することが実現されるように、前記少なくとも三つの原料供給用マイクロチャネルのうちのいずれか少なくとも二つに前記エンベロープ形成用流体を供給する、請求項２に記載の方法。 The substrate includes at least three raw material supply microchannels, and the at least three raw material supply microchannels are formed so as to communicate with the reaction microchannels at one point. Use the base material to
In order to realize that the envelope-forming fluid flows on both sides of the encapsulating substance-containing fluid flowing in a partial region of the reaction microchannel while maintaining an interface with the encapsulating substance-containing fluid, The method according to claim 2, wherein the envelope forming fluid is supplied to at least two of the at least three raw material supply microchannels.

前記封入物質の一部又は全部がポリヌクレオチドであり、前記エンベロープが脂質から成る膜である、請求項３に記載の方法。 The method according to claim 3, wherein a part or all of the encapsulated material is a polynucleotide, and the envelope is a membrane made of lipid.

前記封入物質としてポリヌクレオチドとカチオン性化合物の複合体を使用し、さらに該複合体の生産工程を予め実施し、
ここで該複合体生産工程は、
複数の原料供給用マイクロチャネルと、該複数の原料供給用マイクロチャネルと連通する反応用マイクロチャネルとが形成された基材を用意すること、
前記複数の原料供給用マイクロチャネルのうちの少なくとも一つに前記ポリヌクレオチドを含む流体を供給すること、
前記複数の原料供給用マイクロチャネルのうちの少なくとも他の一つに前記カチオン性化合物を含む流体を供給すること、
各マイクロチャネルから前記反応用マイクロチャネルに合流した前記ポリヌクレオチド含有流体と前記カチオン性化合物含有流体とを、合流時に形成されるそれら流体間の界面が継続的に維持されるようにして該反応用マイクロチャネルを流動させることによって、該反応用マイクロチャネル内において前記複合体を形成すること、および、
前記反応用マイクロチャネルを流動してきた前記複合体を含有する流体を回収すること、
を包含する、請求項４に記載の方法。 Using a complex of a polynucleotide and a cationic compound as the encapsulating material, and further performing a production process of the complex in advance,
Here, the composite production process includes:
Preparing a substrate on which a plurality of raw material supply microchannels and a reaction microchannel communicating with the plurality of raw material supply microchannels are formed;
Supplying a fluid containing the polynucleotide to at least one of the plurality of raw material supply microchannels;
Supplying a fluid containing the cationic compound to at least another one of the plurality of raw material supply microchannels;
The polynucleotide-containing fluid and the cationic compound-containing fluid that have joined from each microchannel to the reaction microchannel are used for the reaction so that the interface between the fluids formed at the time of joining is continuously maintained. Forming the complex in the reaction microchannel by flowing the microchannel; and
Recovering a fluid containing the complex that has flowed through the reaction microchannel;
The method of claim 4 comprising:

前記ポリヌクレオチドとカチオン性化合物の複合体を生産するための基材として、前記原料供給用マイクロチャネルを少なくとも三つ備えるとともに該少なくとも三つの原料供給用マイクロチャネルは一つのポイントで前記反応用マイクロチャネルに全て連通するように形成されていることを特徴とする基材を使用し、
該原料供給用マイクロチャネルのうちの少なくとも一つには前記ポリヌクレオチドとカチオン性化合物のいずれも含まない材料非含有流体を供給し、
ここで、該反応用マイクロチャネルの一部の領域を流動する前記材料非含有流体の一方の側面を前記ポリヌクレオチド含有流体が該材料非含有流体との界面を維持しつつ流動することが実現され、且つ、前記材料非含有流体の他方の側面を前記カチオン性化合物含有流体が該材料非含有流体との界面を維持しつつ流動することが実現されるように、前記原料供給用マイクロチャネルのうちのいずれか少なくとも一つに前記ポリヌクレオチド含有流体を供給し、前記原料供給用マイクロチャネルのうちの他の少なくとも一つに前記カチオン性化合物含有流体を供給する、請求項５に記載の方法。 As a base material for producing the complex of the polynucleotide and the cationic compound, at least three of the raw material supply microchannels are provided, and the at least three raw material supply microchannels are the reaction microchannels at one point. Using a base material characterized in that it is formed so as to communicate with each other,
At least one of the raw material supply microchannels is supplied with a material-free fluid containing neither the polynucleotide nor the cationic compound,
Here, it is realized that the polynucleotide-containing fluid flows on one side surface of the material-free fluid flowing in a partial region of the reaction microchannel while maintaining an interface with the material-free fluid. And the material-containing microchannel is configured so that the cationic compound-containing fluid flows on the other side surface of the material-free fluid while maintaining the interface with the material-free fluid. 6. The method according to claim 5, wherein the polynucleotide-containing fluid is supplied to at least one of the above, and the cationic compound-containing fluid is supplied to at least one of the raw material supply microchannels.