JP5634272B2 - ヒト細胞発現系を用いる真正ヒトタンパク質の組換え生産 - Google Patents
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Description
本国際PCT出願は、2009年1月27日に出願された米国特許仮出願第61/147,627号および2008年3月14日に出願された同第61/036,667号(両方とも参照により本明細書に組み入れられるものとする)に対する優先権を主張するものである。
本発明は、真正ヒトタンパク質を組換え生産するためのヒト発現系に関する。
(1)サイトメガロウイルス(CMV)エンハンサーエレメント;
(2)(i)ヒトβ-アクチンプロモーター、(ii)ヒト血清アルブミンプロモーター、および(iii)ヒトフィブリノゲンプロモーターからなる群より選択されるヒトプロモーター配列;
(3)ヒトグロビン遺伝子イントロン;ならびに
(4)免疫グロブリンスーパーファミリー8シグナルペプチドもしくはα-フィブリノゲンシグナルペプチドなどのシグナルペプチド、
を含む前記発現カセットである。
(A)サイトメガロウイルスエンハンサーエレメント配列;
(B)(i)ヒトアクチンプロモーター配列、(ii)ヒト血清アルブミンプロモーター配列、および(iii)ヒトフィブリノゲンプロモーター配列からなる群より選択されるヒトプロモーター配列;
(C)ヒトグロビン遺伝子イントロン配列;ならびに
(D)ヒトシグナルペプチド配列、
を含むカセットを含む発現ベクターである。
サイトカインと本発明
サイトカインは、生物がシグナル伝達分子として用いるタンパク質およびポリペプチド群である。多くのサイトカインは、30 kDa未満のサイズの糖タンパク質であり、特異的な、高親和性細胞表面受容体に結合する。免疫系におけるその中心的な役割に起因して、サイトカインは様々な免疫疾患、炎症性疾患および感染性疾患に関与し、研究、診断および治療において広く用いられている。現在、これらのタンパク質は大腸菌などの非ヒト細胞において主に生産されており、従って、以下に記載のように、関連する糖鎖パターンが存在しないことに起因して、真正性を欠く。さらに、いくつかの重要なサイトカインは、そのような非ヒト細胞発現系において生じる不十分なタンパク質溶解的プロセッシングまたは他の翻訳後修飾のため、商業的に利用可能ではない。表1を参照されたい。この点での真正とは、本発明の安定なヒト細胞発現方法に従って発現された組換えヒトサイトカインが、in vivoでヒト細胞中で通常発現されるその天然の内因性対応物と一致し、その天然の対応物と関連する特定の特徴を再現することを示している。すなわち、例えば、本発明の安定なヒト細胞方法を用いて発現された組換えヒトIFNαは、天然のヒトIFNαと類似しており、本質的に同じ構造、生物活性、大きさ、分子量、折畳みパターン、および糖鎖付加パターンを有する。かくして、本発明の方法により発現されたヒトタンパク質を、「真正タンパク質」、または「真正サイトカイン」または「組換え真正タンパク質」などと見なすことができる。そのin vivoでの対応物を、天然もしくは内因性サイトカインまたはタンパク質と見なすことができる。本発明の安定なヒト細胞発現系により発現されるタンパク質およびサイトカインのそのような「真正の」特徴を、以下により詳細に開示する。対照的に、大腸菌細胞、または酵母もしくは菌類細胞、または昆虫細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞などの非ヒト哺乳動物細胞から発現されるヒトIFNαタンパク質は、本文脈においては「真正な」ヒトIFNαタンパク質ではないと考えられる。従って、本発明の「真正な」組換え生産されたタンパク質は、限定されるものではないが、同じ構造、生物活性、大きさ、分子量、タンパク質折畳みパターン、ダイマー化特性、ジスルフィド結合特性、および表面結合糖鎖付加パターンなどの、天然型のタンパク質の1個以上の特徴および特性と高度に類似するものである。
それぞれの構成メンバーが他のメンバーと共有する構造的類似性、ならびにその各々の一次アミノ酸配列に基づく他の類似性に基づいて、多くのサイトカインを一緒にグループ化することができる。The Cytokine Handbook, Volumes 1および2、第4版、Thomson & Lotze(編)の第1章(その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)を参照されたい。従って、共通の構造的特徴に従えば、個々のサイトカインの以下の「ファミリー」を、以下のようにグループ化することができる:
(1)IL-2/IL-4:代表的なメンバーとしては、IL-2、IL-4、IL-5、GM-CSFが挙げられる。
それぞれのサイトカインは、それを産生する細胞ならびに遠い標的細胞(エンドクライン)、それらを産生する細胞と近接する標的細胞(パラクライン)またはサイトカインを産生するのと同じ細胞(オートクライン)であってよい、それが作用する標的細胞に応じて複数の機能を有してもよい。
(1)インターフェロン:インターフェロンα(IFNα)は白血球から軟膜層により産生され、様々な悪性腫瘍および免疫障害の治療に用いられている。インターフェロンβ(IFNβ)は線維芽細胞により産生され、多発性硬化症の治療において現在評価中である。インターフェロンγ(IFNγ)は活性化T細胞により産生され、特に、アレルギー疾患において重要な免疫調節分子である。
多くのタンパク質は、その物理的および化学的特性、例えば、MW、pI、折畳み、安定性、および生物活性を変化させ得る翻訳後修飾を受ける。糖鎖付加は、最も一般的な方の翻訳後修飾であり、全ての血漿タンパク質の80%が糖鎖付加され、最も重要な公知のヒト天然インターフェロンα種の大部分が糖タンパク質であると見積もられている。
非ヒト細胞発現系、例えば、細菌、酵母、真菌、昆虫、および非ヒト哺乳動物系は、真正ヒトタンパク質を産生しない。例えば、大腸菌細胞などの一般的な細菌発現系は、組換え哺乳動物タンパク質に糖鎖付加しない。酵母および真菌発現系はヒトDNA配列を発現することができるが、酵母および真菌細胞に由来する得られる糖鎖付加パターンは、ヒト細胞の糖鎖付加プロセッシングとは有意に異なる。例えば、酵母および真菌細胞は、非ヒト高マンノース糖鎖を、組換え発現されたヒトタンパク質に結合させる。このマンノース鎖は免疫原性であり、タンパク質は腎臓系を介して系から非常に素早く消失する。昆虫細胞発現系は酵母および真菌と同様であるが、昆虫により発現されたタンパク質に結合されるようになるマンノース鎖の長さが、典型的には酵母系において結合されたものよりも短い。さらなる詳細については、ZopfおよびVergis, Pharmaceutical Visions, Neose Technologies, Inc (www.neose.com)を参照されたい。
従って、本発明は、in vitroでヒト細胞の安定な培養物から真正ヒトタンパク質を生産するための迅速かつ拡張性のある方法に関する。本発明のヒト細胞発現系を、ヒトタンパク質をコードする新規発現ベクターの導入、ならびにそのタンパク質をコードするポリヌクレオチドのその後の発現を容易にする懸濁媒体にとってより受け入れやすくする。
本発明のヒト細胞および方法を用いて生産されるヒトタンパク質は、特に、タンパク質折畳みならびにタンパク質溶解的切断処理および糖鎖付加などの翻訳後修飾に関して、非ヒト細胞から発現されたものよりも真正の「ヒト様」特性および構造を有し、示す。これらの理由から、本発明の方法および試薬を用いて発現されたヒトタンパク質は、その内因性の天然に発現される天然型により近い生物活性および循環半減期を示す。さらに、組換え発現されたヒトタンパク質は、折畳みおよび通常に利用可能なジスルフィド結合形成残基に関して天然タンパク質とより構造的に同等であり、結果として、その非ヒト細胞により発現された対応物よりも免疫原性が低い。同様に、前記ヒト細胞は好適なヒト酵素を含有するため、非ヒト細胞系と違って、その細胞環境および細胞質器官が、ヒトタンパク質を認識し、操作するために理想的に適合するため、発現された組換えタンパク質をより容易に糖鎖付加することができる。従って、本発明の安定なヒト細胞培養物中で発現された組換えサイトカインの糖鎖付加パターンおよび状態は糖鎖付加されているが、それらはin vivoで内因的に生産されたものである。
(a)ヒト細胞の調製
ヒト細胞を、無血清培地上、単層としてペトリ皿上に塗布する。次いで、無血清培地上で生存する細胞を、血清を含有する培地中に入れて、実用細胞バンクを作製する。無血清培地としては、限定されるものではないが、293 SFM II、CD 293、FreeStyle 293、Hybridoma-SFM(Invitrogen)、およびEx-Cell 293 (JRH Biosciences)が挙げられる。
好適な濃度のプラスミドDNAとトランスフェクタントを、細胞の集密層を含むペトリ皿に添加する。有用なトランスフェクタントとしては、限定されるものではないが、FuGene 6、FuGene HD(Roche社製);Lipofectamin、Lipofectamin 2000、293fectin (Invitrogen)、およびPolyethyleneimineが挙げられる。プラスミドDNAを、好適にトランスフェクトされたヒト細胞の選択を補助するための抗生物質耐性遺伝子を含むように遺伝子操作する。以下の小節を参照されたい。
工程(b)のトランスフェクト細胞を、トリプシン処理(ペトリ皿プレートから細胞を剥離させる)後の遠心分離により収穫した後、ネオマイシン(G418)、ヒグロマイシン、ゼオシン、もしくはブラスチシジンなどの、特定の濃度の抗生物質、例えば、400μg/mlもしくは800μg/mlの抗生物質を含む血清培地中に、一定時間再懸濁する。次いで、生存する細胞コロニーを収穫し、さらに一定時間、別の周回の抗生物質に曝露する。
次いで、抗生物質処理を生き残る細胞を、例えば、1%血清、および抗生物質を含む低血清培地中に再懸濁して、液体培養物中での生存能力および増殖を維持するのに十分に安定である細胞を決定する。この「適合化」期間は2〜3週間かかり、この時間の後、細胞を、抗生物質のみを含む無血清培地に移し、再度一定時間、「適合」させるために静置する。
プラスミドDNAは、(d)に記載の大量培養懸濁液中で連続的に増殖している抗生物質耐性ヒト細胞から分泌されるサイトカイン遺伝子またはそれをコードするポリヌクレオチドを発現する。従って、その大量の懸濁液のアリコートを、穏やかに遠心分離して、ヒト細胞を沈降させ、所望のサイトカインを含有するであろう上清を分離することができる。ヒト細胞が増殖している懸濁培地は無血清もしくは無タンパク質であるため、他のタンパク質または細胞デブリなどの夾雑細胞材料は、たとえあったとしても、少ない。従って、分泌されたサイトカインを含む上清は比較的純粋である。
本発明の方法により生産することができるタンパク質の収率は、所望のポリヌクレオチド構築物を発現させるのに用いられるヒト細胞培養物の容量、サイトカインおよびそのサイズ、ならびに培養培地自体の構成要素基剤に依存し得る。培養培地の特定の成分、温度、pHを変化させるか、または糖鎖付加機構を容易にするために混合物中にグリカン前駆体を含有させることにより、収率に影響させることがでできる。従って、本発明のヒト細胞発現系からの発現されたヒトサイトカインの収率は、1〜500 mg/リットル、または500 mg/リットルを超えるものであってよい。従って、本発明は、約1 mg/リットル、約2 mg/リットル、約3 mg/リットル、約4 mg/リットル、約5 mg/リットル、約6 mg/リットル、約7 mg/リットル、約8 mg/リットル、約9 mg/リットル、約10 mg/リットル、約20 mg/リットル、約30 mg/リットル、約40 mg/リットル、約50 mg/リットル、約60 mg/リットル、約70 mg/リットル、約80 mg/リットル、約90 mg/リットル、約100 mg/リットル、約120 mg/リットル、約140 mg/リットル、約160 mg/リットル、約180 mg/リットル、約200 mg/リットル、約220 mg/リットル、約240 mg/リットル、約260 mg/リットル、約280 mg/リットル、約300 mg/リットル、約320 mg/リットル、約340 mg/リットル、約360 mg/リットル、約380 mg/リットル、約400 mg/リットル、約420 mg/リットル、約440 mg/リットル、約460 mg/リットル、約480 mg/リットル、もしくは約500 mg/リットルまたは約500 mg/リットル以上の本発明のヒト細胞発現系からのサイトカインの収率を意図する。本発明はまた、任意のこれらの濃度の間の収率も意図する。
本発明の一態様は、
(1)CMV極初期エンハンサーエレメント(CMV IE)などのサイトメガロウイルスエンハンサーエレメント;
(2)(i)ヒトアクチンプロモーター、(ii)ヒト血清アルブミンプロモーター、および(iii)ヒトフィブリノゲンプロモーターからなる群より選択されるヒトプロモーター配列;
(3)ヒトグロビン遺伝子イントロン;ならびに
(4)免疫グロブリンスーパーファミリー8シグナルペプチドもしくはα-フィブリノゲンシグナルペプチドなどのシグナルペプチド、
を含む新規発現カセットである。
1. (i)hCMV IE、(ii)ヒトβ-アクチンプロモーター、および(iii)ヒトβ-グロビンイントロンの機能し得る形で連結されたヌクレオチド配列を含むpHZhag;
2. (i)hCMVプロモーター、および(ii)ヒトフィブリノゲンサブユニットAシグナルペプチドの機能し得る形で連結されたヌクレオチド配列を含むpHZA;
3. (i)hCMVプロモーター、および(ii)ヒトIgスーパーファミリー8シグナルペプチドの機能し得る形で連結されたヌクレオチド配列を含むpHZI;
4. (i)hCMV IE、(ii)ヒトβ-アクチンプロモーター、(iii)ヒトβ-グロビンイントロン、および(iv)ヒトフィブリノゲンサブユニットAシグナルペプチドの機能し得る形で連結されたヌクレオチド配列を含むpHZhagA;
5. (i)hCMV IE、(ii)ヒトβ-アクチンプロモーター、(iii)ヒトβ-グロビンイントロン、および(iv)ヒトIgスーパーファミリー8シグナルペプチドの機能し得る形で連結されたヌクレオチド配列を含むpHZhagI;
6. (i)hCMV IE、(ii)ヒトβ-アクチンプロモーター、(iii)ヒトβ-グロビンイントロン、および(iv)TGF-β1の機能し得る形で連結されたヌクレオチド配列を含むpHZhag-TGFβ1;ならびに
7. (i)hCMV IE、(ii)ヒトβ-アクチンプロモーター、(iii)ヒトβ-グロビンイントロン、(iv)ヒトIgスーパーファミリー8シグナルペプチド、および(v)TGFβ1の機能し得る形で連結されたヌクレオチド配列を含むpHZhagI-TGFβ1、
が挙げられる。
1. (i)hCMV IE、(ii)ニワトリβ-アクチンプロモーター、および(iii)ウサギβ-グロビンイントロンの機能し得る形で連結されたヌクレオチド配列を含むpCAG;ならびに
2. (i)hCMVプロモーター、および(ii)mIg-κリーダーの機能し得る形で連結されたヌクレオチド配列を含むpHZsec、
が挙げられる。
サイトカインのクローニングを、遺伝子工学の当業者には利用可能な様々な方法により達成することができる。例えば、全RNAまたはポリ-A RNAを、特定のサイトカイン発現(例えば、リンパ球)が豊富なヒト組織サンプルから精製し、遺伝子特異的RT-PCRの鋳型として用いることができる。従って、予め作製されたcDNAライブラリーを、商業的な起源から購入し、PCRを用いてサイトカインcDNAを直接増幅することができる。さらに、合成オリゴヌクレオチドを構築して、その遺伝子受託(アクセッション)番号と共にNational Center for Biotechnology Informationにおいて入手可能な配列情報に基づいて、サイトカインの合成遺伝子を作製することができる。さらに、完全長のcDNAクローンを、例えば、IMAGEクローンコンソーシアム(image.llnl.gov/)またはOpenbiosystems (Huntsville, AL)から取得することができる。完全長サイトカインcDNAクローンを、Openbiosystems (Huntsville, AL)から取得した。クローニングされたサイトカインの遺伝子受託番号を、表3に提示する。
本発明のタンパク質を発現させるのに用いることができるヒト細胞の型としては、ヒト幹細胞、ヒト前駆細胞、ヒト腎臓細胞、ヒト網膜由来PER-C6細胞、ヒト胚性腎細胞系が挙げられる。特に有用なヒト細胞系としては、限定されるものではないが、HEK 293細胞ならびにHEK 293T、HEK 293S、およびHEK 293 EBNAなどのその誘導体が挙げられる。
(a)サイトカイン
本発明の方法に従って、ヒト細胞からのヒトサイトカインの培地規模および大規模生産を行うことができる。本発明の方法は、TGF-βスーパーファミリーの発現させることが難しいタンパク質などの60種の無タグサイトカインを生産するのに成功した。例えば、例としてGM-CSF、IL4およびVEGF165を用いて、高度に真正の糖鎖付加されたサイトカインを発現させ、ヒト細胞から単離し、炎症、癌の治療のその後の開発、幹細胞研究、および抗体の生成のための非常に好ましい試薬として用いることができる。さらに、本発明の技術により生産されるヒトサイトカインはより天然に糖鎖付加されるだけでなく、完全に機能的な複合体を作製するのに必要になることがある好適なジスルフィド結合も無傷である。これは、発現されたモノマー間のジスルフィド結合が可能ではない特定の非ヒト細胞中での状況とは異なる。
本発明の真正に糖鎖付加され、折畳まれ、およびリン酸化されたタンパク質に帰する別の利益は、それらが高度に特異的な抗体を生成させるための優れた試薬であるということである。
また、限定されるものではないが、AKT1、AKT2、AMPK1、ATM、オーロラA、BTK3、CDK6、ERK5、Fyn-1、GRK5、JNK1、LYN、MAPKAPK2、MAPKAPK3、MEKK3、MKK3、MKK4、mTOR、P38-α、P70S6K2、PDK1、PKC-β、PKC-γ、PTEN、SYK、およびZap70などの組換え生産された真正ヒトキナーゼを取得するために、本発明の安定化されたヒト細胞発現系中で上記ヒトキナーゼ遺伝子を発現させるのが非常に望ましい。
本発明は、サイトカインのみ、およびこれらのサイトカインに対して生成した抗体の生産に限定されない。本発明の安定なヒト細胞系を用いて、限定されるものではないが、キナーゼおよび他の酵素などの他のヒトタンパク質を本発明に従って発現させることができる。かくして、本発明はまた、アルブミン、IgG、IgA、IgM、IgD、IgE、α-1-プロテイナーゼインヒビター、血液前凝固タンパク質、血液抗凝固タンパク質、血栓溶解剤、抗血管形成タンパク質、α-2-抗プラスミン、C-1エステラーゼ阻害剤、アポリポタンパク質、HDL、LDL、フィブロネクチン、β-2-糖タンパク質I、フィブリノゲン、プラスミノゲン、プラスミン、プラスミノゲン活性化因子、プラスミノゲン阻害因子、血漿プロテアーゼ阻害剤、抗トロンビンIII、ストレプトキナーゼ、インター-α-トリプシン阻害剤、α-2-マクログロブリン、アミロイドタンパク質、フェリチン、プレアルブミン、GC-グロブリン、ヘモペキシン、C3-補体、トランスフェリン、ウロキナーゼ、α-1-酸-糖タンパク質、凝固因子、抗凝固因子(第II因子、第V因子、第VII因子、第VIII因子、von Willebrand因子、第VIII--von Willebrand因子複合体、第IX因子、第X因子、第XI因子、C1インヒビター、プロテインCおよびプロテインSなど)、細胞外膜タンパク質、または受容体の細胞外ドメインからなる群より選択される真正ヒト血漿タンパク質の組換え生産も包含する。
真正様組換え体の精製を、大腸菌培養物中で標的インターフェロンの必要量を拡張させた後、細胞、およびHEK細胞などのヒト細胞、ならびに他の関連するヒト細胞の発現のために仕立てる。特定のインターフェロンに用いられる細胞を選択し、正確なヒト成分に由来するベクターを選択した特定のベクターのために仕立てる。個々のインターフェロンのために選択された特定のヒト細胞は、最適なヒト細胞系の選択を必要とする。細胞が細胞懸濁培養無血清培地に適合されるという事実に起因して、収穫された培地に適用される精製方法は、細胞培養培地を含有する血清と比較した場合、設計が容易である。
(i)サイトカイン純度レベル
最大3回のクロマトグラフィー工程の後、サイトカインは、SDS-PAGEゲル上でのクマシー染色(図7)および利用可能な抗体を用いるウェスタンブロット(図8)により判定したところ、95%を超えて純粋であった。次いで、純粋なサイトカインを、当業者には利用可能な公知の方法(例えば、Bradfordアッセイ、ゲル上でのクマシー染色、およびOD280 nm)を用いて定量した。定量の後、サイトカインを、製造業者のマニュアルに従ってLonza (Allendale, NJ)社製の内毒素検出キットにより内毒素レベルを分析し、必要量に基づいて分注し、商業化のために凍結乾燥した。
内毒素は、細菌および他の発現系から調製されたサイトカインにおける主要な夾雑物である。低レベルの内毒素でも、細胞または生物にとって毒性である可能性があり、除去しなければならない。商業的に供給されるサイトカインに関する工業的に標準的な報告値は、1.0 EU/μg未満である。本発明の方法は、超低レベルの内毒素夾雑物を含む、様々なヒトサイトカインなどのタンパク質を生産することができる。以下に開示されるように、標準的な商業用調製物で報告されたレベルよりも10倍〜1000倍少ない内毒素を含むサイトカインが本発明に従って調製された。
サイトカインの「純度」、「活性」を確認し、サイトカインの濃度を定量するか、またはサイトカインを発現する細胞を検出するための多くの異なるアッセイ系が利用可能である。サイトカイン生物アッセイは、例えば、(i)サイトカインにより誘導される細胞増殖、(ii)走化性、(iii)細胞傷害性、(iv)コロニー形成を誘導する能力、(v)細胞脱顆粒化、または(vi)さらなるサイトカインもしくは他の化合物の分泌の誘導を測定する。
上記のように、サイトカイン活性を決定するための標準的なアッセイは、(a)指示細胞系のサイトカインにより誘導される増殖;(b)サイトカインにより誘導されるアポトーシス;(c)ウイルス感染に対するサイトカインにより誘導される防御;および(4)サイトカインにより誘導されるサイトカインの産生を含む。それぞれの特定の方法に関する詳細は当業者にはよく知られており、参照により本明細書に組み入れられるものとする「Cytokine Bioassays」(www.ebioscience.com/ebioscience/appls/BAC.htm)に見出すことができる。
また、2つのタンパク質産物間の純度および糖鎖付加状態の差異を証明するための、本発明の系により発現されたサイトカインと、非ヒト細胞中で発現された同じサイトカインとの対照比較も提供する。図7および8を参照されたい。
上記の節で詳述された通り、本発明の安定なヒト細胞発現系から発現されたサイトカインは、より「ヒトに近い」もしくはより「真正な」折畳み、糖鎖付加、リン酸化状態、エピトープ提示、および天然のダイマー化特性などの、他の細胞系において産生されるサイトカインに対するいくつかの利点および利益を有する。従って、本発明の方法に従って生産される実際のタンパク質構造は、その天然の内因性対応物により類似している。これは、これらの真正組換えサイトカインに関する治療的使用の文脈における有意な利点と言い換えることができる。また、様々なサイトカインと機能の相関については、以下の表2も参照されたい。当業者であれば、特定の障害および疾患と、異常な、もしくは機能不全であるサイトカイン活性とを相関させることによって、以下により詳細に考察されるように、その異常性を相殺するか、または修正するための療法を考案することができる。
(1)多発性硬化症、免疫介在疾患、癌、自己免疫疾患(狼瘡、喘息、およびクローン病)、ならびにウイルス性肝炎を治療するための組換え生産された真正インターフェロン;
(2)自己免疫、癌を治療するための組換え生産された真正インターロイキン;キャッスル万病を治療するためのIL-6(Tocilizumab);免疫細胞調節を治療するためのIL-10、IL-11、IL-12、およびIL-13;マウスにおける癌モデルを調製するためのIL-21およびその受容体;自己免疫疾患(慢性関節リウマチおよび乾癬など)を治療するためのIL-1;喘息を治療するためのIL-4受容体およびIL-5;乾癬を治療するためのIL-8;ならびにTH1媒介性自己免疫を治療するためのIL-12、IL-13、IL-17およびIL-18;
(3)FDAに認可され、後続の薬剤における組換え生産された真正TNF-αおよびその阻害剤、例えば、限定されるものではないが、Enbrel(Etanercept)、Remicade (Infliximab)、Golimumab (CNTO 148)、Humira (Adalimumab)、Cimzia (Certolizumab Pegol)、自己免疫および炎症におけるさらなるTNF-α抗体阻害剤;ならびに癌および感染を治療するための腫瘍壊死因子-α;
(4)自己免疫疾患、癌を治療するための組換え生産された真正ケモカイン;抗炎症剤としての使用のためのCCR2;
(5)増殖因子およびコロニー刺激因子に関する障害のための治療剤の開発のための組換え生産された真正タンパク質、例えば、限定されるものではないが、血管形成、血管形成抗体を治療するためのVEGF(AvastinおよびLucentis)、VEGFアンタゴニストMacugen、マルチキナーゼ阻害剤SutentおよびNexavar、VEGFモノクローナルおよび阻害剤、VEGF遺伝子療法;肝細胞増殖因子;血小板由来増殖因子;Gleevecおよび他のタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤;線維芽細胞増殖因子;TGF結合タンパク質、およびTGFβシグナリングの阻害剤;インスリン様増殖因子;ケラチノサイト増殖因子;口腔粘膜炎を治療するためのrhKGF;結合組織増殖因子(CTGF);コロニー刺激因子(CSF);エリスロポエチン;トロンボポエチン;アンギオポエチン;骨形態形成タンパク質および増殖分化因子;rhBMP、ミオスタチンの阻害剤;ならびに発達障害を治療するための神経栄養因子、
の使用を包含する。
特定のサイトカインの過剰発現は、特定の疾患および異常な病理学的状態と関連することが知られている。例えば、多すぎるTNFαは炎症および関節炎と関連する。従って、TNFα活性ならびにリガンドおよび受容体への結合を遮断する抗体は、炎症および関節炎に関連する問題を軽減するのに役立つ。同様に、特異的抗体結合によるVEGFサイトカイン活性の遮断は、血管形成を減少させることにより癌および望ましくない細胞増殖を治療するための有効な機構である。
また、当業者であれば、本発明の真正タンパク質が診断環境においても、また特定の真正ヒトタンパク質への曝露を用いて、および用いずに候補薬剤および物質を試験するためのスクリーニングアッセイにおいて有用であり得ることを知っているであろう。本発明の組換え生産された真正ヒトタンパク質に対して生成した抗体は、本発明の組換え生産された真正ヒトタンパク質に対して生成しなかった抗体よりも高い感受性および特異性を有する。1つのそのような診断道具は、サイトカインビーズアレイである。Lambeckら、Clinical Cancer Research 13, 2385(2007年4月15日)(参照により本明細書に組み入れられるものとする)を参照されたい。その方法は、LINCOplexキットおよび関連するプロトコル(Linco research, St. Charles, MO)を用いることなどにより、少量の血清中で複数のサイトカインを同時に測定することができるものである。
(1)以下の機能し得る形で連結された発現エレメント:
(A)サイトメガロウイルスエンハンサーエレメント配列;
(B)(i)ヒトアクチンプロモーター配列、(ii)ヒト血清アルブミンプロモーター配列、および(iii)ヒトフィブリノゲンプロモーター配列からなる群より選択されるヒトプロモーター配列;
(C)ヒトグロビン遺伝子イントロン配列;ならびに
(D)ヒトシグナルペプチド配列、
を含むカセットを含む発現ベクター。
(2)シグナルペプチド配列の下流に位置し、(1)に記載のエレメント(A)、(B)、(C)、および(D)に機能し得る形で連結された所望のポリヌクレオチドをさらに含む、(1)に記載の発現ベクター。
(3)(i)所望のポリヌクレオチドが、ヒトシグナルペプチド配列の下流の発現ベクター中に位置する終結シグナル配列に機能し得る形で連結されるか、または(ii)所望のポリヌクレオチド自身が終結シグナル配列を含む、(2)に記載の発現ベクター。
(4)ヒトプロモーター配列が機能的なヒトβ-アクチンプロモーター配列である、(1)に記載の発現ベクター。
(5)CMVエンハンサーエレメントがCMV極初期エンハンサー配列である、(1)に記載の発現ベクター。
(6)シグナルペプチド配列が免疫グロブリンスーパーファミリー8シグナルペプチド、またはα-フィブリノゲンシグナルペプチドである、(1)に記載の発現ベクター。
(7)所望のポリヌクレオチドが、CMV極初期エンハンサー、β-アクチンプロモーター配列、ヒトグロビン遺伝子イントロン配列、および免疫グロブリンスーパーファミリー8シグナルペプチドに機能し得る形で連結された、(2)に記載の発現ベクター。
(8)所望のポリヌクレオチドが、CMV極初期エンハンサー、β-アクチンプロモーター配列、ヒトグロビン遺伝子イントロン配列、およびα-フィブリノゲンシグナルペプチドに機能し得る形で連結された、(2)に記載の発現ベクター。
(9)所望のポリヌクレオチドがサイトカインをコードする、(2)に記載の発現ベクター。
(10)コードされるサイトカインが、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンA/2xINHbA、アクチビンB/2xINHbB、AMH/MIS、アルテミン、BDNF、BMP2、BMP15/GDF9B、BMP2/BMP2A、BMP3/オステオゲニン、BMP4、BMP4/BMP2B、BMP5、BMP7/OP-1、BMP1、BMP10、BMP15/GDF9B、β-NGF、シスタチンC、デルタ1、EGF、エリスロポエチン(EPO)、酸性FGF、塩基性FGF、FGF10、FGF5、FGF7、FGF8b、FLT3リガンド、G-CSF、GDF15、GDF2/BMP9、GDF3、GDF5/BMP14、GDF8/ミオスタチン、GDF9、GDNF、GM-CSF、HGF、HGH、IFN-α2A、IFN-α2B、IFN-γ、IFN-β1、IGF I、IGF II、IGF IIv1、IGF IIv2、IL10、IL11、IL12、IL15、IL17/IL17A、IL17F、IL1β、IL2、IL23、IL27、IL28A/IFN-λ-2、IL28B/IFN-λ-3、IL29/IFN-λ-1、IL1β、IL2 IL3、IL32、IL35、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、インヒビンA/INHa&INHbA、インヒビンB/INHa&INHbB、インヒビンC/INHa&INHbC、インヒビンE/INHa&INHbE、LEFTYB、LEFTY1/LeftyB、M-CSF、マウスCSF、マウスSCF、NODAL、Noggin、NT3 (ニューロトロフィン3)、オンコスタチンM、PDGFα、PDGFβ、ペルセフィン、SCF、SDF1α、SHH、ソマトトロピン、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TGFβ4/LEFTY2/LeftyA、TNFα、TPOα、VEGF121aa、VEGF165aa、WIF1、WNT1、Wnt10A、Wnt10B/12、Wnt11、Wnt16、Wnt2、Wnt2B/13、Wnt3、Wnt3A、Wnt4、Wnt5A、Wnt5B、Wnt6、Wnt7A、Wnt7B、Wnt8B、およびWnt9A/14からなる群より選択される、(9)に記載の発現ベクター。
(11)コードされるサイトカインが、EPO、G-CSF、GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-6、M-CSF、Noggin、SCF、ソマトトロピン、TGFβ1、TNFα、およびVEGF-165からなる群より選択される、(10)に記載の発現ベクター。
(12)(2)、(7)、または(8)に記載の発現ベクターをヒト細胞中に導入することを含み、所望のポリヌクレオチドがヒトタンパク質をコードし、ヒト細胞中での所望のポリヌクレオチドの発現が真正ヒトタンパク質を産生する、真正ヒトタンパク質を生産するための組換え方法。
(13)真正ヒトタンパク質が、天然型の同じヒトタンパク質のものと同様のサイズ、構造、分子量、糖鎖付加パターン、および転写後修飾を有する、(12)に記載の組換え方法。
(14)所望のポリヌクレオチドが、サイトカイン、アルブミン、IgG、IgA、IgM、IgD、IgE、α-1-プロテイナーゼ阻害剤、血液前凝固タンパク質、血液抗凝固タンパク質、血栓溶解剤、抗血管形成タンパク質、α-2-抗プラスミン、C-1エステラーゼ阻害剤、アポリポタンパク質、HDL、LDL、フィブロネクチン、β-2-糖タンパク質I、プラスミノゲン、プラスミン、プラスミノゲン活性化因子、プラスミノゲン阻害因子、血漿プロテアーゼ阻害剤、抗トロンビンIII、ストレプトキナーゼ、インター-α-トリプシン阻害剤、α-2-マクログロブリン、アミロイドタンパク質、フェリチン、プレアルブミン、GC-グロブリン、ヘモペキシン、C3-補体、トランスフェリン、ウロキナーゼ、およびα-1-酸-糖タンパク質からなる群より選択されるタンパク質をコードする、(12)に記載の組換え方法。
(15)所望のポリヌクレオチドがサイトカインをコードする、(12)に記載の組換え方法。
(16)コードされるサイトカインが、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンA/2xINHbA、アクチビンB/2xINHbB、AMH/MIS、アルテミン、BDNF、BMP2、BMP15/GDF9B、BMP2/BMP2A、BMP3/オステオゲニン、BMP4、BMP4/BMP2B、BMP5、BMP7/OP-1、BMP1、BMP10、BMP15/GDF9B、β-NGF、シスタチンC、デルタ1、EGF、エリスロポエチン(EPO)、酸性FGF、塩基性FGF、FGF10、FGF5、FGF7、FGF8b、FLT3リガンド、G-CSF、GDF15、GDF2/BMP9、GDF3、GDF5/BMP14、GDF8/ミオスタチン、GDF9、GDNF、GM-CSF、HGF、HGH、IFN-α2A、IFN-α2B、IFN-γ、IFN-β1、IGF I、IGF II、IGF IIv1、IGF IIv2、IL10、IL11、IL12、IL15、IL17/IL17A、IL17F、IL1β、IL2、IL23、IL27、IL28A/IFN-λ-2、IL28B/IFN-λ-3、IL29/IFN-λ-1、IL1β、IL2 IL3、IL32、IL35、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、インヒビンA/INHa&INHbA、インヒビンB/INHa&INHbB、インヒビンC/INHa&INHbC、インヒビンE/INHa&INHbE、LEFTYB、LEFTY1/LeftyB、M-CSF、マウスCSF、マウスSCF、NODAL、Noggin、NT3 (ニューロトロフィン3)、オンコスタチンM、PDGFα、PDGFβ、ペルセフィン、SCF、SDF1α、SHH、ソマトトロピン、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TGFβ4/LEFTY2/LeftyA、TNFα、TPOα、VEGF121aa、VEGF165aa、WIF1、WNT1、Wnt10A、Wnt10B/12、Wnt11、Wnt16、Wnt2、Wnt2B/13、Wnt3、Wnt3A、Wnt4、Wnt5A、Wnt5B、Wnt6、Wnt7A、Wnt7B、Wnt8B、およびWnt9A/14からなる群より選択される、(15)に記載の組換え方法。
(17)コードされるサイトカインが、EPO、G-CSF、GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-6、M-CSF、Noggin、SCF、ソマトトロピン、TGFβ1、TNFα、およびVEGF-165からなる群より選択される、(16)に記載の組換え方法。
(18)ヒト細胞が 付けでATCC生物寄託受託番号 の下で寄託され、且つ該受託番号を有するHZ-293TSである、(12)に記載の組換え方法。
(19)ヒト細胞から真正ヒトタンパク質を単離することをさらに含む、(12)に記載の組換え方法。
(20)固定化金属アフィニティクロマトグラフィー(IMAC)カラムを通してヒト細胞の抽出物を流し、真正ヒトタンパク質を単離することをさらに含む、(19)に記載の組換え方法。
(21)所望のポリヌクレオチドがHIS-タグ非含有ポリペプチドまたはタンパク質をコードする、(12)に記載の組換え方法。
(22)IMACカラムを通してヒト細胞の抽出物を流し、真正ヒトタンパク質を単離することをさらに含む、(21)に記載の組換え方法。
(23)(2)、(7)、または(8)に記載の発現ベクター中の所望のポリヌクレオチドを発現するヒト細胞により産生された組換え生産された真正ヒトタンパク質であって、所望のポリヌクレオチドがヒトタンパク質をコードし、所望のポリヌクレオチドの発現が真正ヒトタンパク質を産生する、前記真正ヒトタンパク質。
(24)所望のポリヌクレオチドが、サイトカイン、アルブミン、IgG、IgA、IgM、IgD、IgE、α-1-プロテイナーゼ阻害剤、血液前凝固タンパク質、血液抗凝固タンパク質、血栓溶解剤、抗血管形成タンパク質、α-2-抗プラスミン、C-1エステラーゼ阻害剤、アポリポタンパク質、HDL、LDL、フィブロネクチン、β-2-糖タンパク質I、フィブリノゲン、プラスミノゲン、プラスミン、プラスミノゲン活性化因子、プラスミノゲン阻害因子、血漿プロテアーゼ阻害剤、抗トロンビンIII、ストレプトキナーゼ、インター-α-トリプシン阻害剤、α-2-マクログロブリン、アミロイドタンパク質、フェリチン、プレアルブミン、GC-グロブリン、ヘモペキシン、C3-補体、トランスフェリン、ウロキナーゼ、およびα-1-酸-糖タンパク質からなる群より選択されるヒトタンパク質をコードする、(23)に記載の組換え生産された真正タンパク質。
(25)真正ヒトタンパク質がヒトサイトカインである、(24)に記載の組換え生産された真正ヒトタンパク質。
(26)ヒトサイトカインが、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンA/2xINHbA、アクチビンB/2xINHbB、AMH/MIS、アルテミン、BDNF、BMP2、BMP15/GDF9B、BMP2/BMP2A、BMP3/オステオゲニン、BMP4、BMP4/BMP2B、BMP5、BMP7/OP-1、BMP1、BMP10、BMP15/GDF9B、β-NGF、シスタチンC、デルタ1、EGF、エリスロポエチン(EPO)、酸性FGF、塩基性FGF、FGF10、FGF5、FGF7、FGF8b、FLT3リガンド、G-CSF、GDF15、GDF2/BMP9、GDF3、GDF5/BMP14、GDF8/ミオスタチン、GDF9、GDNF、GM-CSF、HGF、HGH、IFN-α2A、IFN-α2B、IFN-γ、IFN-β1、IGF I、IGF II、IGF IIv1、IGF IIv2、IL10、IL11、IL12、IL15、IL17/IL17A、IL17F、IL1β、IL2、IL23、IL27、IL28A/IFN-λ-2、IL28B/IFN-λ-3、IL29/IFN-λ-1、IL1β、IL2 IL3、IL32、IL35、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、インヒビンA/INHa&INHbA、インヒビンB/INHa&INHbB、インヒビンC/INHa&INHbC、インヒビンE/INHa&INHbE、LEFTYB、LEFTY1/LeftyB、M-CSF、マウスCSF、マウスSCF、NODAL、Noggin、NT3 (ニューロトロフィン3)、オンコスタチンM、PDGFα、PDGFβ、ペルセフィン、SCF、SDF1α、SHH、ソマトトロピン、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TGFβ4/LEFTY2/LeftyA、TNFα、TPOα、VEGF121aa、VEGF165aa、WIF1、WNT1、Wnt10A、Wnt10B/12、Wnt11、Wnt16、Wnt2、Wnt2B/13、Wnt3、Wnt3A、Wnt4、Wnt5A、Wnt5B、Wnt6、Wnt7A、Wnt7B、Wnt8B、およびWnt9A/14からなる群より選択される、(25)に記載の組換え生産された真正ヒトタンパク質。
(27)ヒトサイトカインが、EPO、G-CSF、GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-6、M-CSF、Noggin、SCF、ソマトトロピン、TGFβ1、TNFα、およびVEGF-165からなる群より選択される、(26)に記載の組換え生産された真正ヒトタンパク質。
(28)ヒト細胞が 付けでATCC生物寄託受託番号 の下で寄託され、且つ該受託番号を有するHZ-293TSである、(24)に記載の組換え生産された真正ヒトタンパク質。
(29)真正ヒトタンパク質の糖鎖付加パターンが、天然の内因型のそのヒトタンパク質と類似する、(24)に記載の組換え生産された真正ヒトタンパク質。
(30)真正ヒトタンパク質のサイズ、構造、および分子量が、天然の内因型のそのヒトタンパク質のサイズおよび分子量と類似する、(24)に記載の組換え生産された真正ヒトタンパク質。
(31)真正ヒトタンパク質がTGFβである、(24)に記載の組換え生産された真正ヒトタンパク質。
(32)所望のポリヌクレオチドがnogginタンパク質をコードし、所望のポリヌクレオチドの発現が細胞中でジスルフィド結合したnogginダイマーを産生する、(24)に記載の組換え生産された真正ヒトタンパク質。
(33)(24)に記載の真正ヒトタンパク質のエピトープに対する抗体。
(34)(26)に記載の真正ヒトタンパク質のエピトープに対する抗体。
(35)前記抗体がポリクローナルまたはモノクローナル抗体である、(33)に記載の抗体。
(36)前記抗体がポリクローナルまたはモノクローナル抗体である、(34)に記載の抗体。
(37) 付けでATCC生物寄託受託番号 の下で寄託され、且つ該受託番号を有するHZ-293TSと呼ばれる安定なヒト細胞系。
(38)(2)、(7)、または(8)に記載の発現ベクターを発現するヒト細胞。
(39)ヒト細胞が 付けでATCC生物寄託受託番号 の下で寄託され、且つ該受託番号を有するHZ-293TSである、(38)に記載のヒト細胞。
(40)細胞成長、細胞増殖、細胞分化、または炎症に関連する症状を治療するための方法であって、(A)(23)に記載の組換え生産された真正ヒトタンパク質、または(B)(23)に記載の組換え生産された真正ヒトタンパク質に対する抗体を、細胞成長、増殖、分化、または炎症に関連する症状を有する個体に投与することを含む、前記方法。
(41)組換え生産された真正ヒトタンパク質が、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンA/2xINHbA、アクチビンB/2xINHbB、AMH/MIS、アルテミン、BDNF、BMP2、BMP15/GDF9B、BMP2/BMP2A、BMP3/オステオゲニン、BMP4、BMP4/BMP2B、BMP5、BMP7/OP-1、BMP1、BMP10、BMP15/GDF9B、β-NGF、シスタチンC、デルタ1、EGF、エリスロポエチン(EPO)、酸性FGF、塩基性FGF、FGF10、FGF5、FGF7、FGF8b、FLT3リガンド、G-CSF、GDF15、GDF2/BMP9、GDF3、GDF5/BMP14、GDF8/ミオスタチン、GDF9、GDNF、GM-CSF、HGF、HGH、IFN-α2A、IFN-α2B、IFN-γ、IFN-β1、IGF I、IGF II、IGF IIv1、IGF IIv2、IL10、IL11、IL12、IL15、IL17/IL17A、IL17F、IL1β、IL2、IL23、IL27、IL28A/IFN-λ-2、IL28B/IFN-λ-3、IL29/IFN-λ-1、IL1β、IL2 IL3、IL32、IL35、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、インヒビンA/INHa&INHbA、インヒビンB/INHa&INHbB、インヒビンC/INHa&INHbC、インヒビンE/INHa&INHbE、LEFTYB、LEFTY1/LeftyB、M-CSF、マウスCSF、マウスSCF、NODAL、Noggin、NT3 (ニューロトロフィン3)、オンコスタチンM、PDGFα、PDGFβ、ペルセフィン、SCF、SDF1α、SHH、ソマトトロピン、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TGFβ4/LEFTY2/LeftyA、TNFα、TPOα、VEGF121aa、VEGF165aa、WIF1、WNT1、Wnt10A、Wnt10B/12、Wnt11、Wnt16、Wnt2、Wnt2B/13、Wnt3、Wnt3A、Wnt4、Wnt5A、Wnt5B、Wnt6、Wnt7A、Wnt7B、Wnt8B、およびWnt9A/14からなる群より選択されるサイトカインである、(40)に記載の方法。
(42)組換え生産された真正ヒトTNFαに対する抗体を、炎症または関節炎に関連する症状を有する個体に投与することを含む、(40)に記載の方法。
(43)組換え生産された真正ヒトVEGFに対する抗体を、癌または細胞増殖に関連する症状を有する個体に投与することを含む、(40)に記載の方法。
(44)サンプルから(24)に記載の真正ヒトタンパク質を検出するための診断剤としての該ヒトタンパク質のエピトープに対する抗体の使用。
(45)前記抗体を、ヒトタンパク質を検出するためのELISAアッセイにおける診断剤として用いる、(44)に記載の使用。
(46)サンプルがヒト組織サンプル、ヒト細胞サンプル、ヒト血液サンプル、またはヒト体液サンプルである、(44)に記載の使用。
(47)ヒトタンパク質がサイトカインである、(44)に記載の使用。
(48)ex vivoでの研究道具としての(24)に記載の組換え生産された真正タンパク質の使用。
(49)組換え生産された真正タンパク質を、そのタンパク質と相互作用する薬剤のためのタンパク質または細胞スクリーニングアッセイにおいて用いる、(48)に記載の使用。
(50)細胞成長、細胞増殖、細胞分化、または炎症に関連する症状を治療する方法であって、タンパク質をコードする所望のポリヌクレオチドを発現するベクターを、細胞成長、増殖、分化、または炎症に関連する症状を有する個体に投与することを含み、該個体の細胞中で発現されたタンパク質が該症状を治療するのに役立つ、前記方法。
(51)前記ベクターがpHZhag、pHZA、pHZA、pHZI、pHZhagA、およびpHZhagIからなる群より選択される、(50)に記載の方法。
(52)pHZhagベクターが、(i)hCMV IE、(ii)ヒトβ-アクチンプロモーター、および(iii)ヒトβ-グロビンイントロンの機能し得る形で連結されたヌクレオチド配列を含む、(51)に記載の方法。
(53)pHZAベクターが、(i)hCMVプロモーター、および(ii)ヒトフィブリノゲンサブユニットAシグナルペプチドの機能し得る形で連結されたヌクレオチド配列を含む、(51)に記載の方法。
(54)pHZIベクターが、(i)hCMVプロモーター、および(ii)ヒトIgスーパーファミリー8シグナルペプチドの機能し得る形で連結されたヌクレオチド配列を含む、(51)に記載の方法。
(55)pHZhagAベクターが、(i)hCMV IE、(ii)ヒトβ-アクチンプロモーター、(iii)ヒトβ-グロビンイントロン、および(iv)ヒトフィブリノゲンサブユニットAシグナルペプチドの機能し得る形で連結されたヌクレオチド配列を含む、(51)に記載の方法。
(56)pHZhagIベクターが、(i)hCMV IE、(ii)ヒトβ-アクチンプロモーター、(iii)ヒトβ-グロビンイントロン、および(iv)ヒトIgスーパーファミリー8シグナルペプチドの機能し得る形で連結されたヌクレオチド配列を含む、(51)に記載の方法。
(57)治療用タンパク質を発現する、遺伝子療法におけるpHZhag、pHZA、pHZA、pHZI、pHZhagAおよびpHZhagIからなる群より選択されるベクターの使用。
(58)前記ベクターが、サイトカイン、アルブミン、IgG、IgA、IgM、IgD、IgE、α-1-プロテイナーゼ阻害剤、血液前凝固タンパク質、血液抗凝固タンパク質、血栓溶解剤、抗血管形成タンパク質、α-2-抗プラスミン、C-1エステラーゼ阻害剤、アポリポタンパク質、HDL、LDL、フィブロネクチン、β-2-糖タンパク質I、フィブリノゲン、プラスミノゲン、プラスミン、プラスミノゲン活性化因子、プラスミノゲン阻害因子、血漿プロテアーゼ阻害剤、抗トロンビンIII、ストレプトキナーゼ、インター-α-トリプシン阻害剤、α-2-マクログロブリン、アミロイドタンパク質、フェリチン、プレアルブミン、GC-グロブリン、ヘモペキシン、C3-補体、トランスフェリン、ウロキナーゼ、およびα-1-酸-糖タンパク質からなる群より選択されるヒトタンパク質をコードする、(57)に記載の使用。
(59)pHZhagベクターが、(i)hCMV IE、(ii)ヒトβ-アクチンプロモーター、および(iii)ヒトβ-グロビンイントロンの機能し得る形で連結されたヌクレオチド配列を含む、(57)に記載の使用。
(60)pHZAベクターが、(i)hCMVプロモーター、および(ii)ヒトフィブリノゲンサブユニットAシグナルペプチドの機能し得る形で連結されたヌクレオチド配列を含む、(57)に記載の使用。
(61)pHZIベクターが、(i)hCMVプロモーター、および(ii)ヒトIgスーパーファミリー8シグナルペプチドの機能し得る形で連結されたヌクレオチド配列を含む、(57)に記載の使用。
(62)pHZhagAベクターが、(i)hCMV IE、(ii)ヒトβ-アクチンプロモーター、(iii)ヒトβ-グロビンイントロン、および(iv)ヒトフィブリノゲンサブユニットAシグナルペプチドの機能し得る形で連結されたヌクレオチド配列を含む、(57)に記載の使用。
(63)pHZhagIベクターが、(i)hCMV IE、(ii)ヒトβ-アクチンプロモーター、(iii)ヒトβ-グロビンイントロン、および(iv)ヒトIgスーパーファミリー8シグナルペプチドの機能し得る形で連結されたヌクレオチド配列を含む、(57)に記載の使用。
(64)治療用タンパク質が、CFTR遺伝子、第VIII因子遺伝子、第IX因子遺伝子、E1A遺伝子、P53遺伝子、AC6遺伝子、およびVEGF遺伝子からなる群より選択されるヒト遺伝子によりコードされる、(57)に記載の使用。
(65)前記ベクターを個体に投与し、それが1個以上の個体の細胞中に進入し、該ベクターが該細胞の内部でコードされた治療用タンパク質を発現する、(57)に記載の使用。
本明細書に開示される各参考文献および引用は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。以下の実施例は単に例示的なものであり、いかなる意味でも本発明の範囲を限定するものではない。
遺伝子工学の当業者にとって利用可能な様々な方法により、サイトカインのクローニングを達成することができる。例えば、特定のサイトカイン発現が豊富なヒト組織サンプル(例えば、リンパ球)から全RNAまたはポリA RNAを精製し、遺伝子特異的RT-PCRのための鋳型として用いることができる。さらに、予め作製したcDNAライブラリーを商業的供給源から購入し、PCRを用いてサイトカインcDNAを直接増幅することができる。さらに、合成オリゴヌクレオチドを構築して、遺伝子受託番号と共に全米バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information)で入手可能な配列情報に基づいて、サイトカインの合成遺伝子を作製することができる。さらに、完全長cDNAクローンを、例えば、IMAGEクローンコンソーシアム(image.llnl.gov/)またはOpenbiosystems (Huntsville, AL)から取得することができる。遺伝子受託番号を表3に提示する。
(A)pHZsec:従来のCMV発現ベクター対照
ヒトサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターに基づくベクターは、典型的には哺乳動物細胞発現系において用いられるベクターの設計に用いられている。例えば、tools.invitrogen.com/content/sfs/productnotes/F_051025_MammalianExpressionVectors-TS-TL-MKT-HL.pdfで入手可能なInvitrogen社の製品ノート「Mammalian Expression Systems」(参照により本明細書に組み入れられるものとする)を参照されたい。
本明細書で設計されるpHZhagベクターは、ヒトβ-アクチンプロモーターとヒトβ-グロビンイントロンからなる。pHZhagベクターは、従来のCMVに基づくベクターよりも非常に高いレベルで所望のポリヌクレオチドまたは遺伝子配列を発現する;そして予想外にも、pHZhagベクターを発現する細胞は、より高い細胞生存能力を有し、精製の間に得られる夾雑バックグラウンドタンパク質がより少ない。
高度に真正なヒトタンパク質を産生する高発現ベクターの設計における次の工程は、CHO細胞中で広く用いられているマウスIgκ鎖リーダーシグナルペプチド配列とヒトタンパク質シグナルペプチドとの置換であった。本明細書に示される結果は、ヒトシグナルペプチド配列の使用により発現レベルが少なくとも2倍改善されることを示している。
ヒトβ-アクチンプロモーター、ヒトイントロン配列、および上記のヒトシグナルペプチドのいずれか一方(hFbgAシグナルペプチドまたはhIg8シグナルペプチド)を含むベクターを本明細書で設計した。
プロモーター比較:pHZ-TGFβ対pHZhag-TGFβ1;
シグナルペプチド比較:pHZ-TGFβ1対pHZI-TGFβ1およびpHZhag-TGFβ1対pHZhagI-TGFβ1またはpHZhagA-TGFβ1;ならびに
プロモーターとシグナルペプチドの組合せ比較:pHZ-TGFβ1対pHZhagI-TGFβ1またはpHZhagA-TGFβ1、
を用いて実施することができる。
ヒト胚性腎細胞を、推奨される培地(典型的には、10%ウシ胎仔血清/2 mM L-グルタミン/10 mM HEPES/1x MEM非必須アミノ酸)を含むDMEM培地)を含む100 mmペトリ皿上に播種した。細胞を3〜4回の継代の間保持して、プレートに付着した集団を選択した。次いで、プレート上に付着した細胞を、様々な無血清培地(293 SFM II、CD 293、FreeStyle 293、Hybridoma-SFM(Invitrogen社製);Ex-Cell 293 (JRH Biosciences))に、プレート中で4日間曝露して、無血清培地中で増殖するか、または生存する細胞を選択した。次いで、これらの細胞を10%血清培地中に戻し入れて、作業用細胞バンクを製造した。
HZ-293TS:HEK293T(または293T)は、HEK293細胞の遺伝的変異体(ATCC CRL-11268)である。この細胞系を、製造業者の試薬(Invitrogen)を用いて無血清かつ化学規定培地に適合させた。懸濁液および完全に無血清かつ化学規定培地へのHEK293T細胞の適合は新規である。HZ-293TSは、懸濁培養物中で少なくとも約500〜600万個の細胞/ml(VCD)に達する(図15b、表)。HZ-293TSと命名されたヒト細胞系は、 付けでATCC生物寄託受託番号 の下で寄託されており、当該受託番号を有する。
懸濁培養物中での維持および単層培養への適合が容易なため、ヒトFGF8bサイトカインをコードするプラスミドを発現させるために、HZ-293TS細胞系を、その組換えタンパク質産生能力についてHEK293Tのものと比較して試験した。両方の細胞系が比較可能な細胞密度および生存能力に達する時、HZ-293TS細胞中でのサイトカイン発現は予想外にも、293Tのものよりも2〜3倍高かった。かくして、HZ-293TSは293Tとは非常に異なる細胞系になり、それがより高い組換えサイトカイン発現の理由であり得る。
トランスフェクションの1日前に、細胞の集密な100 mm皿を5個の皿に移動させた(70〜80%集密度)。100 mm皿のトランスフェクションには、製造業者のマニュアルに従えば、補給物質を含まない500μlのDMEM培地、10μgのプラスミドDNA、および特定量のトランスフェクタント(FuGene 6、FuGene HD(Roche社製);Lipofectamin、Lipofectamin 2000、293fectin (Invitrogen);Polyetheleneimine)が必要である。トランスフェクション材料の混合物を滴下しながら培養皿に添加した。
48時間後、トランスフェクトされた細胞をトリプシン処理後に遠心分離により収穫した。細胞ペレットを5 mlの新鮮な10%血清培地中に再懸濁した。100μlの再懸濁した細胞を、特定の濃度の抗生物質(例えば、400μg/mlもしくは800μg/ml)(ネオマイシン(G418)、ヒグロマイシン、ゼオシン、ブラスチシジン)を含む2 mlの血清培地を含む6穴プレートに添加した。
一度、選択された細胞がプレート中で集密まで増殖したら、細胞をトリプシン処理してプレートから剥離させた。プレート2個分の量の細胞をトリプシン処理後に収穫し、1%の血清および抗生物質を含有する10 mlの無血清培地(例えば、CD293)中に再懸濁した。適合には最大で8週間かかり、細胞の状態に応じて3〜4日毎に培地を交換した。次いで、細胞を無血清培地と抗生物質のみに移した。この適合には最大で4週間かかり、細胞の状態に応じて3〜4日毎に培地を交換した。一度、懸濁液適合されたら、細胞を生産のためにより大規模まで連続的に増殖させ、将来の生産のために10%のDMSOを含む新鮮な培地中で凍結保存した。
製造業者の推奨に従ってトランスフェクタントFuGene 6 (Roche)を用いて、100 mmペトリ皿中、組織内で無血清適合させた293細胞系、またはその誘導体(例えば、HEK 293T、HEK 293S、およびHEK 293 EBNA)中にサイトカイン発現プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、10%BCS、1%MEM非必須アミノ酸、1%ペニシリン-ストレプトマイシンおよび2 mM L-グルタミンを補給したDMEM培地中で増殖させた。48時間後、トランスフェクトされた細胞をトリプシン処理後の遠心分離により収穫した。細胞ペレットを5 mlの新鮮な10%血清培地中に再懸濁した。100μlの再懸濁された細胞を、特定の濃度の抗生物質(例えば、400μg/mlまたは800μg/mlのゼオシン)を含む2 mlの血清培地を含む6穴プレート中に添加した。
ヒトサイトカインは、糖鎖付加、リン酸化、および重合などの複雑な翻訳後分子機構により修飾され、ならびに多数のアミノ酸配列に基づいてその固有の物理化学的特性を改変し、特にタグを用いないその精製を困難にする複雑な切断および転換プロセスにかける。本発明は、最大で3つの工程の従来のクロマトグラフィーを使用し、SDS-PAGE上で95%を超える純度が得られる効率的な精製スキームの開発を包含する。この精製スキームは、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィーを用いる捕捉、次いでイオン交換クロマトグラフィーを用いる精製および研磨からなる。
サイトカインの生物学的活性を、サイトカインの性質に基づいて、用量依存的細胞傷害性(例えば、TNFα)、増殖の刺激(例えば、IL-2)、または有効な細胞に対する他のサイトカインにより誘導される増殖の阻害(例えば、TGF-β1)に関してED50により測定した。図6A-Mを参照されたい。
本発明の方法に従って発現されたサイトカインと、非ヒト細胞中で発現されたものとの間の糖鎖付加の純度および程度を比較するための実験を行った。図7および8は、非還元および還元非ヒト細胞に対して比較した非還元および還元ヒト細胞中での様々なサイトカインのSDS-PAGEゲル分析の対照比較を示す。そのような様式で比較されたサイトカインとしては、EPO、Noggin、G-CSF、SCF、GM-CSF、ソマトトロピン、IL-2、TGFβ1、IL-4、TNFα、IL-6、VEGF-165、およびM-CSFが挙げられる。図8は、本発明のヒト発現系と非ヒト発現系との間のこれらの同じサイトカインのウェスタンブロット分析の比較結果を示す。このデータは、本発明の安定なヒト細胞培養物が、天然のヒトサイトカインと同等の分子量および真正の三次元構造および活性を有し、非ヒト細胞から発現されたサイトカインのサイズおよび構造とは異なるサイトカインを発現したことを示している。さらに、真正サイトカインに対して生じた抗体は、真正のエピトープ表面の提示に起因して、高い親和性結合特性を有する。
VEGF165は、正常な血管形成および病的な血管形成において大きな役割を果たしている。VEGFに特異的なモノクローナル抗体を用いる処理によるVEGF活性の阻害はin vivoで腫瘍増殖を抑制することができることが証明されている。現在、市販のVEGF165タンパク質試薬は大腸菌および昆虫細胞などの非ヒト細胞から生産されている。本明細書に開示される本発明の方法は遺伝子操作されたヒト293細胞からVEGF165を生産するのに用いられた。図9は、大腸菌とヒト細胞との間で発現されたVEGF165の活性の比較を示し、大腸菌により発現されるタンパク質の分子量はモノマーで18 kDである。これは糖鎖付加に起因して28 kDのバンドとして移動する本発明のVEGF165と同等である。ヒトおよび非ヒト細胞系におけるVEGFの比較活性については図9を参照されたい。
トランスフォーミング増殖因子β(TGF-β)は、細胞スイッチとして作用し、免疫機能、増殖および上皮間葉移行を調節する高度に多面的なサイトカインである。これらのタンパク質は前駆体として産生される。フリン様転換酵素はプロタンパク質を加工して、N末端の潜伏関連ペプチド(LAP)およびC末端の成熟TGF-βを生成する。LAPとTGF-βのジスルフィド結合したホモダイマーは分泌後にも非共有結合したままであり、小さい潜伏TGF-β複合体を形成する。LAPの潜伏TGF-β結合タンパク質への共有結合は、細胞外マトリックスと相互作用し得る大きい潜伏複合体を作製する。市販のTGF-βタンパク質は、CHO細胞中で発現される組換えタンパク質として、またはヒト血小板から精製された天然タンパク質として生産されている。複雑なタンパク質溶解後修飾に起因して、TGF-βの収率は低く、製品は経済的なバルク量では入手できない。効率的な本発明のヒト細胞に基づく発現系が、様々なヒトサイトカインの拡張可能な生産のために本明細書で開発されており、遺伝子操作されたヒト293細胞から高度に真正なヒトTGF-β1、β2およびβ3タンパク質を生産している。これらのタンパク質は、25 kDの高度に精製されたジスルフィド結合したダイマーであり、大規模で費用効果的に生産することができる(図18B)。
VEGF165は、システインノット増殖因子スーパーファミリーの一員である。このサイトカインは、内皮細胞の増殖および生存を刺激し、血管形成および血管透過性を促進する。血管化された組織中で発現された場合、VEGF165は正常な血管形成および病的な血管形成において大きな役割を果たす。VEGF165に特異的なモノクローナル抗体を用いる処理によるVEGF165活性の阻害はin vivoで腫瘍増殖を抑制することができることが証明されている。
エリスロポエチン(EPO)は、トロンボポエチンと関連する34 kDの糖タンパク質ホルモンである。このタンパク質は、初期の赤血球前駆体のアポトーシスを防止することにより赤血球形成を促進する。in vivoでの生物学的活性のためにはEPOの糖鎖付加が必要であることが示されている。現在、市販の組換えヒトEPOタンパク質はCHO細胞から生産されている。これらの組換えタンパク質は、SDS-PAGEゲル上で40 kDのより高い見かけの分子量を有し(図20A)、より低い含量の中性グリカンを有する(図20B)ことにより天然のヒトEPOと異なる。組換え生産された真正ヒトEPOは、本明細書では遺伝子操作されたヒト293細胞から生産されたものである。文献(Skibeliら(2001) Blood 98:3626)中の天然ヒトタンパク質と同様、組換え生産された真正ヒトEPOはより低い見かけの分子量および実質的により高い含量の中性グリカンを示す。さらに、組換え生産された真正ヒトEPOは、CHO細胞により産生された型よりも豊富であり多様なグリカンプロフィールを有する。組換え生産された真正ヒトEPO中で最も豊富なグリカンは、テトラ-アンテナ複合体型であるが、CHO EPO中のものは伸長した2アンテナ複合体型である(図20C)。
現在、市販の組換えIL-23サイトカインは、昆虫細胞発現系からヘテロダイマーまたは融合タンパク質として生産されている。組換え生産された真正ヒトIL-23は、本明細書では遺伝子操作されたヒトHEK293細胞の安定な細胞培養物中で生産されている。このタンパク質は、55 kDのジスルフィド結合したヘテロダイマーとして発現され、安定な培養物の拡張性に起因して、費用効果的に生産し、効率的に精製することができる(図18A)。
精製されたヒト末梢血単球を、37℃、5%CO2を含有する加湿された空気中で合計7日間、5 x 105細胞/mlでG4 DC培地(以下に特定されるもの)中で培養した。HZ G4 DCを培地交換せずに5 ng/mlの組換え生産された真正ヒトGM-CSFおよびIL-4で用いたが、EC G4 DCを日常的に用いた(50 ng/mlの大腸菌GM-CSFおよびIL-4を3日目および5日目に50%の培地交換と共に用いた)。6日目に、リポ多糖(LPS)をウェルの半分に添加して、DC成熟を誘導したが、他の半分のウェルを偽処理として用いた。培養の終わりに(7日間)、サイトカイン測定のために上清を収穫したが、得られたDCをフローサイトメトリーによる表面マーカー、FITC-デキストランの食作用による抗原取込み、および同種異系MLRによる抗原提示能力について分析した。
Nogginは、骨形態形成タンパク質(BMP)のアンタゴニストである分泌型ホモダイマー糖タンパク質である。フィーダー層または条件化培地を含まない(しかし、塩基性FGFを添加する)ヒト胚性幹細胞(hES)の培養の間に、Nogginの添加により、幹細胞はその未分化の多能状態を維持することができる。市販のNoggin製品は様々な形態で生産されているが、そのいずれも真正ではない:例えば、大腸菌中で発現された非糖鎖付加タンパク質;NS0中で発現された糖鎖付加されたFc-融合タンパク質。組換え生産された真正ヒトNogginは、本明細書では安定な遺伝子操作されたヒト293細胞発現系中で生産されている。このタンパク質は真正な糖鎖付加されたジスルフィド結合したダイマーとして発現される。組換え生産された真正ヒトホモダイマー性Nogginは、陰性および陽性対照(図24、レーン1および2)と比較して10 pg/ml濃度で処理(図24、レーン3)および20 pg/ml濃度で処理(図24、レーン4)した場合、未分化のhES細胞のマーカーであるOct3/4を効率的かつ一貫して発現する。参照により本明細書に組み入れられるものとするWangら、Biochem. Biophys. Res. Comm., 330:934-942 (2005)およびItsyksonら、Mol. Cell. Neurosci. 30:24-36 (2005)を参照されたい。
大腸菌中で産生されるサイトカインは糖鎖付加されておらず、秘密の、または通常は隠れたエピトープを露出し得る。同様に、SF9またはCHO細胞中で産生されたサイトカインはヒトに近いものではない翻訳後修飾を有する。これらの因子のため、抗体がヒト細胞により発現されたタンパク質抗原から作製されたか、または非ヒト細胞により発現されたタンパク質抗原から作製されたかに応じて、その抗体は異なる親和性を有し得る。
本発明のヒト発現系は、ヒトサイトカインの発現に限定されるわけではない。ヒトサイトカイン以外のヒトタンパク質を、本発明の安定なヒト細胞発現系中で発現させることができる。例えば、ヒトキナーゼ、およびヒトホスファターゼ、ならびに他のヒトタンパク質および酵素を、本発明のヒト細胞発現系中で真正に発現させて、組換えの真正ヒト様キナーゼ、ホスファターゼ、タンパク質、および酵素を生産することもできる。
Claims (17)
- 以下の機能し得る形で連結された発現エレメント:
(A)ヒトサイトメガロウイルス極初期エンハンサーエレメント;
(B)機能的ヒトβ-アクチンプロモーター;
(C)ヒトグロビン遺伝子イントロン;並びに
(D)免疫グロブリンスーパーファミリー8シグナルペプチド又はα-フィブリノゲンシグナルペプチドから成るヒトシグナルペプチド、
を含むカセットを含む発現ベクター。 - シグナルペプチドの下流に位置し、請求項1に記載のエレメント(A)、(B)、(C)、及び(D)に機能し得る形で連結されたポリヌクレオチドをさらに含む、請求項1に記載の発現ベクター。
- (i)前記ポリヌクレオチドが、ヒトシグナルペプチドの下流の発現ベクター中に位置する転写終結シグナルに機能し得る形で連結されるか、又は(ii)前記ポリヌクレオチド自身が終結シグナルを含む、請求項2に記載の発現ベクター。
- 前記ポリヌクレオチドが、CMV極初期エンハンサー、β-アクチンプロモーター、ヒトグロビン遺伝子イントロン、及び免疫グロブリンスーパーファミリー8シグナルペプチドに機能し得る形で連結された、請求項2に記載の発現ベクター。
- 前記ポリヌクレオチドが、CMV極初期エンハンサー、β-アクチンプロモーター、ヒトグロビン遺伝子イントロン、及びα-フィブリノゲンシグナルペプチドに機能し得る形で連結された、請求項2に記載の発現ベクター。
- 前記ポリヌクレオチドがサイトカインをコードする、請求項2に記載の発現ベクター。
- コードされるサイトカインが、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンA/2xINHbA、アクチビンB/2xINHbB、AMH/MIS、アルテミン、BDNF、BMP2、BMP15/GDF9B、BMP2/BMP2A、BMP3/オステオゲニン、BMP4、BMP4/BMP2B、BMP5、BMP7/OP-1、BMP1、BMP10、BMP15/GDF9B、β-NGF、シスタチンC、デルタ1、EGF、エリスロポエチン(EPO)、酸性FGF、塩基性FGF、FGF10、FGF5、FGF7、FGF8b、FLT3リガンド、G-CSF、GDF15、GDF2/BMP9、GDF3、GDF5/BMP14、GDF8/ミオスタチン、GDF9、GDNF、GM-CSF、HGF、HGH、IFN-α2A、IFN-α2B、IFN-γ、IFN-β1、IGF I、IGF II、IGF IIv1、IGF IIv2、IL10、IL11、IL12、IL15、IL17/IL17A、IL17F、IL1β、IL2、IL23、IL27、IL28A/IFN-λ-2、IL28B/IFN-λ-3、IL29/IFN-λ-1、IL1β、IL2 IL3、IL32、IL35、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、インヒビンA/INHa&INHbA、インヒビンB/INHa&INHbB、インヒビンC/INHa&INHbC、インヒビンE/INHa&INHbE、LEFTYB、LEFTY1/LeftyB、M-CSF、マウスCSF、マウスSCF、NODAL、Noggin、NT3(ニューロトロフィン3)、オンコスタチンM、PDGFα、PDGFβ、ペルセフィン、SCF、SDF1α、SHH、ソマトトロピン、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TGFβ4/LEFTY2/LeftyA、TNFα、TPOα、VEGF121aa、VEGF165aa、WIF1、WNT1、Wnt10A、Wnt10B/12、Wnt11、Wnt16、Wnt2、Wnt2B/13、Wnt3、Wnt3A、Wnt4、Wnt5A、Wnt5B、Wnt6、Wnt7A、Wnt7B、Wnt8B、及びWnt9A/14から成る群より選択される、請求項6に記載の発現ベクター。
- コードされるサイトカインが、EPO、G-CSF、GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-6、M-CSF、Noggin、SCF、ソマトトロピン、TGFβ1、TNFα、及びVEGF-165から成る群より選択される、請求項7に記載の発現ベクター。
- 請求項2〜8のいずれか1項に記載の発現ベクターを単離されたヒト細胞中に導入することを含み、前記ポリヌクレオチドがヒトタンパク質をコードし、該単離されたヒト細胞中での該ポリヌクレオチドの発現が真正ヒトタンパク質を産生する、真正ヒトタンパク質を生産するための組換え方法。
- 真正ヒトタンパク質が、天然型の同じヒトタンパク質のものと同様のサイズ、構造、分子量、糖鎖付加パターン、及び転写後修飾を有する、請求項9に記載の組換え方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、サイトカイン、アルブミン、IgG、IgA、IgM、IgD、IgE、α-1-プロテイナーゼ阻害剤、血液前凝固タンパク質、血液抗凝固タンパク質、血栓溶解剤、抗血管形成タンパク質、α-2-抗プラスミン、C-1エステラーゼ阻害剤、アポリポタンパク質、HDL、LDL、フィブロネクチン、β-2-糖タンパク質I、プラスミノゲン、プラスミン、プラスミノゲン活性化因子、プラスミノゲン阻害因子、血漿プロテアーゼ阻害剤、抗トロンビンIII、ストレプトキナーゼ、インター-α-トリプシン阻害剤、α-2-マクログロブリン、アミロイドタンパク質、フェリチン、プレアルブミン、GC-グロブリン、ヘモペキシン、C3-補体、トランスフェリン、ウロキナーゼ、及びα-1-酸-糖タンパク質から成る群より選択されるタンパク質をコードする、請求項9に記載の組換え方法。
- 前記ポリヌクレオチドがサイトカインをコードする、請求項9に記載の組換え方法。
- コードされるサイトカインが、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンA/2xINHbA、アクチビンB/2xINHbB、AMH/MIS、アルテミン、BDNF、BMP2、BMP15/GDF9B、BMP2/BMP2A、BMP3/オステオゲニン、BMP4、BMP4/BMP2B、BMP5、BMP7/OP-1、BMP1、BMP10、BMP15/GDF9B、β-NGF、シスタチンC、デルタ1、EGF、エリスロポエチン(EPO)、酸性FGF、塩基性FGF、FGF10、FGF5、FGF7、FGF8b、FLT3リガンド、G-CSF、GDF15、GDF2/BMP9、GDF3、GDF5/BMP14、GDF8/ミオスタチン、GDF9、GDNF、GM-CSF、HGF、HGH、IFN-α2A、IFN-α2B、IFN-γ、IFN-β1、IGF I、IGF II、IGF IIv1、IGF IIv2、IL10、IL11、IL12、IL15、IL17/IL17A、IL17F、IL1β、IL2、IL23、IL27、IL28A/IFN-λ-2、IL28B/IFN-λ-3、IL29/IFN-λ-1、IL1β、IL2 IL3、IL32、IL35、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、インヒビンA/INHa&INHbA、インヒビンB/INHa&INHbB、インヒビンC/INHa&INHbC、インヒビンE/INHa&INHbE、LEFTYB、LEFTY1/LeftyB、M-CSF、マウスCSF、マウスSCF、NODAL、Noggin、NT3(ニューロトロフィン3)、オンコスタチンM、PDGFα、PDGFβ、ペルセフィン、SCF、SDF1α、SHH、ソマトトロピン、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TGFβ4/LEFTY2/LeftyA、TNFα、TPOα、VEGF121aa、VEGF165aa、WIF1、WNT1、Wnt10A、Wnt10B/12、Wnt11、Wnt16、Wnt2、Wnt2B/13、Wnt3、Wnt3A、Wnt4、Wnt5A、Wnt5B、Wnt6、Wnt7A、Wnt7B、Wnt8B、及びWnt9A/14から成る群より選択される、請求項12に記載の組換え方法。
- コードされるサイトカインが、EPO、G-CSF、GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-6、M-CSF、Noggin、SCF、ソマトトロピン、TGFβ1、TNFα、及びVEGF-165から成る群より選択される、請求項13に記載の組換え方法。
- ヒト細胞から真正ヒトタンパク質を単離することをさらに含む、請求項9に記載の組換え方法。
- 請求項2〜8のいずれか1項に記載の発現ベクターを発現する単離されたヒト細胞。
- 細胞成長、細胞増殖、細胞分化若しくは炎症により引き起こされる症状、又は細胞成長、細胞増殖、細胞分化若しくは炎症の欠如を生じる症状を治療するための医薬の製造における、請求項2〜8のいずれか1項に記載のベクターを含む組成物の使用。
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