JP5633152B2 - Adjuvant - Google Patents
Adjuvant Download PDFInfo
- Publication number
- JP5633152B2 JP5633152B2 JP2010031096A JP2010031096A JP5633152B2 JP 5633152 B2 JP5633152 B2 JP 5633152B2 JP 2010031096 A JP2010031096 A JP 2010031096A JP 2010031096 A JP2010031096 A JP 2010031096A JP 5633152 B2 JP5633152 B2 JP 5633152B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- adjuvant
- antigen
- animal
- antibody
- crystal
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Description
本発明は、新規なアジュバントおよびそれを用いて動物を免疫する方法に関する。特に本発明は、ＤＮＡで動物を免疫するためのアジュバントとして有用である。 The present invention relates to a novel adjuvant and a method for immunizing an animal using the same. In particular, the present invention is useful as an adjuvant for immunizing animals with DNA.
タンパクまたはその部分ペプチドを抗原として免疫する従来の免疫方法の場合、液性免疫の誘導は可能だが細胞性免疫の誘導は困難なことが多い。そのため、細胞性免疫を誘導する必要がある感染症に対しては、微生物やウイルスを弱毒化した生ワクチンが用いられているが、生ワクチンには副作用など安全性の面で解決すべき課題が多い。一方、別の免疫方法として、標的タンパク遺伝子を含む発現ベクターを動物に投与することで、前記標的タンパクに対する液性免疫および細胞性免疫を誘導するＤＮＡ免疫法が知られている（特許文献１、非特許文献１から４）。 In the conventional immunization method in which a protein or a partial peptide thereof is used as an antigen, humoral immunity can be induced but cellular immunity is often difficult to induce. For this reason, live vaccines with attenuated microorganisms and viruses are used for infectious diseases that need to induce cellular immunity. However, live vaccines have problems to be solved in terms of safety such as side effects. Many. On the other hand, as another immunization method, a DNA immunization method for inducing humoral immunity and cellular immunity against the target protein by administering an expression vector containing the target protein gene to an animal is known (Patent Document 1, Non-Patent Documents 1 to 4).
ＤＮＡ免疫法は、液性免疫と細胞性免疫の両方を誘導できることから、細胞性免疫の誘導が困難な感染症に対する安全な免疫手法として臨床応用研究が進められている。また近年、前記液性免疫の誘導能から従来の抗体作製方法（すなわちタンパクまたはその部分ペプチドを抗原として免疫し、得られた抗体産生細胞から抗体を作製する方法）では取得が困難だった、動物種間でアミノ酸配列が高度に保存されている抗原タンパクを特異的に認識する抗体や、生体内に自然状態で存在する構造（いわゆる天然型）の抗原タンパクを特異的に認識する抗体を作製するための手法としても用いられている（特許文献２および３、非特許文献５）。従来の免疫方法では、免疫源であるタンパクまたはペプチドを調製する過程で構造変化する可能性があるため、前記方法を用いて得られた抗体が、天然型の抗原に対して高い特異性や結合力を有さない場合がある。一方、ＤＮＡ免疫法では、免疫された動物の体内で、投与した抗原タンパク遺伝子を含む発現ベクターにより天然型の抗原タンパクが発現するため、天然型抗原に対して高い特異性や結合力を有した抗体の作製が可能である。
Since DNA immunization can induce both humoral immunity and cellular immunity, clinical application research is being promoted as a safe immunization technique for infectious diseases in which induction of cellular immunity is difficult. Further, in recent years, it has been difficult to obtain animals by the conventional antibody production method (ie, the method of producing an antibody from the antibody-producing cells obtained by immunization using a protein or a partial peptide thereof as an antigen) because of the ability to induce humoral immunity. Create antibodies that specifically recognize antigenic proteins whose amino acid sequences are highly conserved among species, and antibodies that specifically recognize antigenic proteins that have a structure that exists naturally in the living body (so-called natural type) (
ＤＮＡ免疫法では、抗原タンパク遺伝子を含む発現ベクターが免疫箇所近傍の細胞中に取り込まれることで前記細胞内で抗原タンパクを発現し、前記抗原タンパクに対する免疫が誘導されるため、前記細胞内に前記発現ベクターを効率よく導入すること、および前記細胞自身の免疫機構を効果的に誘導することが重要である。また、ＤＮＡ免疫法では免疫された動物の体内で発現する抗原タンパク量が、従来の免疫方法で投与する抗原量と比較し著しく少なく、従来の免疫方法と比較し感作効果が低い。そのため、他の方法で感作効果を高める必要がある。 In the DNA immunization method, an expression vector containing an antigen protein gene is taken into a cell in the vicinity of the immunization site to express the antigen protein in the cell, and immunity against the antigen protein is induced. It is important to efficiently introduce an expression vector and to effectively induce the immune mechanism of the cell itself. Further, in the DNA immunization method, the amount of antigen protein expressed in the body of the immunized animal is significantly smaller than the amount of antigen administered by the conventional immunization method, and the sensitizing effect is low as compared with the conventional immunization method. Therefore, it is necessary to enhance the sensitization effect by other methods.
ＤＮＡ免疫法における感作効果を高めることを目的に、免疫する方法や免疫賦活物質（アジュバント）について検討されている。 For the purpose of enhancing the sensitization effect in the DNA immunization method, methods for immunization and immunostimulatory substances (adjuvants) have been studied.
免疫する方法については、遺伝子銃が最も感作効果が高いとされているが、抗原金粒子の調製工程および専用の免疫機器の使用が必要であること、外皮が厚い大型動物ではその感作効果が著しく減少することなど、臨床応用に向けては解決すべき課題が多い。また、イオンポリマー、リポソーム、ウイルスエンベロープベクターなどで発現ベクターを修飾したり、超音波を活用したソノポレーション法などで発現ベクターの安定性および導入効率を向上させる研究が進められているものの、さらに感作効果が高い方法が求められている。 As for the immunization method, the gene gun is said to have the highest sensitization effect, but it requires the preparation of antigen gold particles and the use of a dedicated immunity device. There are many problems to be solved for clinical application, such as a marked decrease in In addition, although research is underway to improve the expression vector stability and introduction efficiency by modifying the expression vector with ion polymers, liposomes, viral envelope vectors, etc., and sonoporation using ultrasound, etc. A method with a high sensitizing effect is required.
一方、アジュバントについては、
（１）炎症などによる免疫対象細胞自体の免疫機構の誘導、
（２）抗原の免疫対象細胞への取り込み促進、
（３）抗原の持続的な放出（いわゆる徐放作用）、
などを目的としたものが検討されており、Ｒｉｂｉアジュバント（Ｃｏｒｉｘａ社製）、Ｔｉｔｅｒｍａｘ（Ｔｉｔｅｒｍａｘ社製）などの油含有アジュバント、α抗原、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、リピドＡ、リポ多糖類（ＬＰＳ）などの細菌由来のアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、リン酸化カルシウムなどの無機化合物、リポソーム、膜タンパク質抗原（免疫刺激複合体）に複合されたサポニン、スペルミジンなどのポリアミン、種々のサイトカイン遺伝子またはサイトカインタンパクなどを単独または併用して用いられている（特許文献４および５）。しかしながら、前記例示したアジュバントによる感作効果の向上は必ずしも十分なものではない。
On the other hand, for adjuvants,
(1) Induction of the immune mechanism of the immunized cell itself due to inflammation, etc.
(2) Promotion of antigen uptake into immunized cells,
(3) Sustained release of antigen (so-called sustained release action),
For example, Ribi adjuvant (manufactured by Corixa), oil-containing adjuvant such as Titermax (manufactured by Titermax), α antigen, muramyl dipeptide (MDP), lipid A, lipopolysaccharide (LPS) ) And other bacterial-derived adjuvants, inorganic compounds such as aluminum phosphate, aluminum hydroxide and calcium phosphate, liposomes, saponins complexed with membrane protein antigens (immunostimulatory complexes), polyamines such as spermidine, various cytokine genes Alternatively, cytokine proteins are used alone or in combination (Patent Documents 4 and 5). However, the improvement of the sensitization effect by the exemplified adjuvant is not always sufficient.
本発明は、特にＤＮＡ免疫法において感作効果を高めることが可能な新規なアジュバント、および前記アジュバントを用いて動物を免疫する方法を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a novel adjuvant capable of enhancing the sensitizing effect particularly in DNA immunization, and a method for immunizing an animal using the adjuvant.
前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、無機化合物の針状結晶体が、物理的に細胞を傷つけることで抗原免疫箇所近傍細胞への取り込みを促進し、また前記細胞の炎症を惹起することで、十分な感作効果が得られることを見出した。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the needle-like crystal of the inorganic compound promotes the uptake of cells in the vicinity of the antigen immunity site by physically damaging the cells, and also causes inflammation of the cells. And found that a sufficient sensitizing effect can be obtained.
すなわち第一の発明は、無機化合物の針状結晶体を含む、アジュバントである。 That is, the first invention is an adjuvant containing a needle crystal of an inorganic compound.
また第二の発明は、針状結晶体が針状単結晶を含む結晶体である、第一の発明に記載のアジュバントである。 Moreover, 2nd invention is an adjuvant as described in 1st invention whose acicular crystal | crystallization is a crystal body containing an acicular single crystal.
また第三の発明は、無機化合物が酸化亜鉛であり、針状結晶体が核部と前記核部から異なる４軸方向に伸びた針状単結晶部からなる結晶体である、第一の発明に記載のアジュバントである。 The third invention is the first invention, wherein the inorganic compound is zinc oxide, and the acicular crystal is a crystal composed of a core and a needle-like single crystal extending from the core in different four-axis directions. The adjuvant described in 1. above.
また第四の発明は、第一から第三の発明のいずれかに記載のアジュバントと抗原との混合物を動物に投与する工程を含む、動物を免疫する方法である。 The fourth invention is a method for immunizing an animal, comprising a step of administering to the animal a mixture of the adjuvant and antigen according to any one of the first to third inventions.
また第五の発明は、抗原がタンパク遺伝子を含む発現ベクターである、第四の発明に記載の方法である。 The fifth invention is the method according to the fourth invention, wherein the antigen is an expression vector containing a protein gene.
また第六の発明は、第四または第五の発明に記載の方法により得られた抗体産生細胞を用いて、抗体を製造する方法である。 The sixth invention is a method for producing an antibody using the antibody-producing cells obtained by the method described in the fourth or fifth invention.
以下、本発明をさらに詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
本発明は、鋭利かつ強度の高い無機化合物の針状結晶体をアジュバントとして用いることを特徴としており、前記針状結晶体が細胞の物理的傷害および炎症を惹起することで、動物を免疫する際、アジュバントとともに投与する抗原の感作効果を高め、液性免疫を誘導させることができる。本発明のアジュバントで用いる無機化合物の針状結晶体は鋭利かつ強度の高い針状結晶を含んでいれば、多結晶からなる針状結晶であってもよいし、単結晶からなる針状結晶（いわゆるウィスカー）であってもよいが、結晶粒界などの構造的な欠陥が少なく、不純物をほとんど含まないため強度が高い、単結晶からなる針状結晶を含んだ針状結晶体が好ましい。前記好ましい無機化合物の針状結晶体の例としては、グラファイトウィスカー、チタン酸カリウムウィスカー、アルミナウィスカー、炭化ケイ素ウィスカー、窒化ケイ素ウィスカー、ムライトウィスカー、マグネシアウィスカー、ホウ酸マグネシウムウィスカー、酸化亜鉛ウィスカー、ホウ化チタンウィスカーといった、樹脂、金属、セラミックスなどの強度を高めるための添加剤として用いられるウィスカーをあげることができる。 The present invention is characterized in that a sharp and strong inorganic acicular crystal is used as an adjuvant, and the acicular crystal induces physical injury and inflammation of cells, thereby immunizing an animal. The sensitization effect of an antigen administered together with an adjuvant can be enhanced and humoral immunity can be induced. As long as the needle-like crystal of the inorganic compound used in the adjuvant of the present invention contains a sharp and strong needle-like crystal, it may be a needle-like crystal made of a polycrystal or a needle-like crystal made of a single crystal ( A so-called whisker) may be used, but a needle-like crystal including a needle-like crystal made of a single crystal, which has few structural defects such as crystal grain boundaries and has almost no impurities and high strength, is preferable. Examples of the preferred inorganic crystalline needle crystals include graphite whiskers, potassium titanate whiskers, alumina whiskers, silicon carbide whiskers, silicon nitride whiskers, mullite whiskers, magnesia whiskers, magnesium borate whiskers, zinc oxide whiskers, and boride. The whisker used as an additive for increasing the strength of resin, metal, ceramics, etc., such as titanium whisker, can be mentioned.
本発明のアジュバントに含まれる好ましい無機化合物の針状結晶体の一例として、核部と前記核部から異なる４軸方向に伸びた針状単結晶部からなる三次元形状を有した酸化亜鉛ウィスカー（特許文献６）があげられ、例えば、樹脂の精密成形性、摺動、耐摩耗性、帯電防止性、導電性を向上させるための添加剤として市販されているパナテトラ（アムテック社製）を前記酸化亜鉛ウィスカーとして用いることができる。 As an example of a preferable needle-like crystal of an inorganic compound contained in the adjuvant of the present invention, a zinc oxide whisker having a three-dimensional shape consisting of a core and a needle-like single crystal extending from the core in different four axial directions ( For example, Panatetra (manufactured by Amtec), which is commercially available as an additive for improving the precision moldability, sliding, abrasion resistance, antistatic property, and conductivity of a resin, is described above. It can be used as a zinc whisker.
本発明のアジュバントは無機化合物の針状結晶体を含んでいればよく、無機化合物の針状結晶体単独であってもよいし、アジュバントとして用いられている公知の物質（例えばスペルミジンなどのポリアミンや尿酸結晶）と混合したものであってもよい。 The adjuvant of the present invention only needs to contain an acicular crystal of an inorganic compound, may be an acicular crystal of an inorganic compound, or a known substance used as an adjuvant (for example, polyamines such as spermidine, It may be mixed with uric acid crystals.
本発明のアジュバントと抗原とを動物に投与して動物を免疫する際に使用するアジュバントの量は、免疫する動物の大きさや、本発明のアジュバントに含まれる無機化合物の針状結晶体における無機化合物の物性、針状結晶体（針状単結晶部）の長さ、などを考慮し適宜決定すればよく、マウスやラットといった通常免疫に用いられる動物に対しては、１回の免疫で１個体あたり５０から５０００μｇの無機化合物の針状結晶体を含む本発明のアジュバントを抗原とともに投与すればよい。例えば、免疫する動物がマウスであり、本発明のアジュバントが核部と前記核部から異なる４軸方向に伸びた針状単結晶部からなる三次元形状を有した酸化亜鉛ウィスカー（特許文献６）を含む場合は、１回の免疫で１匹のマウスに対して、前記酸化亜鉛ウィスカーを８００から１０００μｇ（例えば９００μｇ）含む本発明のアジュバントを、抗原とともに投与すればよい。 The amount of adjuvant used when immunizing an animal by administering the adjuvant of the present invention and an antigen to the animal depends on the size of the animal to be immunized and the inorganic compound in the needle crystal of the inorganic compound contained in the adjuvant of the present invention. And the length of the acicular crystal (needle-shaped single crystal part), etc., may be appropriately determined. For animals that are normally used for immunization, such as mice and rats, one individual in one immunization The adjuvant of the present invention containing about 50 to 5000 μg of an inorganic compound needle-like crystal may be administered together with the antigen. For example, the animal to be immunized is a mouse, and the zinc oxide whisker having a three-dimensional shape consisting of a nucleus and an acicular single crystal portion extending in different four-axis directions from the nucleus (Patent Document 6). In this case, the adjuvant of the present invention containing 800 to 1000 μg (for example, 900 μg) of the zinc oxide whisker may be administered together with the antigen to one mouse in one immunization.
本発明のアジュバントに含まれる無機化合物の針状結晶体は、細胞の物理的傷害および炎症を惹起することで、感作効果を高めている。そのため、本発明のアジュバントを用いて動物を免疫する方法において、アジュバントとともに投与する抗原は、タンパクまたはその部分ペプチドであってもよいし、タンパク遺伝子を含む発現ベクターであってもよいが、これまで検討された方法では感作効果の低かった、タンパク遺伝子を含む発現ベクターを抗原とした場合に、本発明による効果が大きい。 The needle-like crystal of an inorganic compound contained in the adjuvant of the present invention enhances the sensitizing effect by inducing physical damage and inflammation of cells. Therefore, in the method of immunizing an animal using the adjuvant of the present invention, the antigen administered together with the adjuvant may be a protein or a partial peptide thereof or an expression vector containing a protein gene. The effect of the present invention is great when an expression vector containing a protein gene is used as an antigen.
本発明のアジュバントを用いて動物を免疫する方法で得られた免疫動物が抗体を産生しているかを確認するには、当業者が通常用いるイムノアッセイを用いればよく、例として、液相または固相化抗原を用いたＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ウェスタンブロッティング、抗原遺伝子を導入した一過性発現細胞株を用いたフローサイトメトリーまたは細胞ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）などがあげられる。 In order to confirm whether the immunized animal obtained by the method of immunizing an animal using the adjuvant of the present invention produces an antibody, an immunoassay commonly used by those skilled in the art may be used. For example, liquid phase or solid phase EIA (enzyme immunoassay) using activated antigen, Western blotting, flow cytometry using a transient expression cell line into which an antigen gene has been introduced, or cell ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay).
本発明のアジュバントを用いた動物を免疫する方法は、ヒトなどの動物への疾病治療や疾病防御を目的としたワクチンへの適用に限られるものではなく、投与した抗原に対する免疫した動物のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の製造への適用も可能である。前記抗体を製造するには、本発明のアジュバントと抗原との混合物を投与することで動物を免疫し、免疫された動物から脾臓、リンパ節、抹消血などを採取し抗体産生Ｂ細胞を取得後、前記Ｂ細胞を当業者に知られた方法でミエローマなどの適切な不死化細胞と融合させてハイブリドーマを作製することで、投与した抗原に対して特異的な抗体を製造することができる。 The method of immunizing an animal using the adjuvant of the present invention is not limited to application to a vaccine for the purpose of disease treatment or disease protection in animals such as humans, but a polyclonal antibody of the immunized animal against the administered antigen. Alternatively, it can be applied to the production of monoclonal antibodies. In order to produce the antibody, an animal is immunized by administering a mixture of the adjuvant of the present invention and an antigen, and spleen, lymph nodes, peripheral blood, etc. are collected from the immunized animal and antibody-producing B cells are obtained. An antibody specific to the administered antigen can be produced by fusing the B cell with an appropriate immortal cell such as myeloma by a method known to those skilled in the art to produce a hybridoma.
本発明は無機化合物の針状結晶体をアジュバントとして用いることに特徴があり、前記針状結晶体が、免疫箇所周辺部の細胞を物理的に傷害することで前記細胞への抗原の取り込みが促進され、また、免疫箇所周辺部にて強い炎症作用を惹起することで免疫対象物自身の免疫応答反応が活性化されることで効果的に液性免疫を誘導することできる。 The present invention is characterized in that an acicular crystal of an inorganic compound is used as an adjuvant, and the acicular crystal accelerates the uptake of antigen into the cell by physically damaging the cells around the immune site. Moreover, humoral immunity can be effectively induced by activating the immune response reaction of the immunized object itself by inducing a strong inflammatory action in the periphery of the immunized site.
なお、本発明のアジュバントは、抗原タンパク遺伝子を含んだ発現ベクターとともに動物に投与して動物を免疫させるＤＮＡ免疫法で、免疫動物における、発現した抗原タンパクに対する感作効果を高めることができる。よって、従来の免疫方法（タンパクまたはその部分ペプチドを投与して動物を免疫する方法）では困難であった、動物種間でアミノ酸配列が高度に保存されている抗原タンパクや、天然型の抗原タンパクに対する免疫を容易に動物に付与することができる。 The adjuvant of the present invention is a DNA immunization method in which an animal is immunized with an expression vector containing an antigen protein gene to immunize the animal, and can enhance the sensitizing effect on the expressed antigen protein in the immunized animal. Therefore, antigen proteins with highly conserved amino acid sequences between animal species and natural antigen proteins, which were difficult with conventional immunization methods (methods of immunizing animals by administering proteins or partial peptides thereof) Immunity to can be easily given to animals.
本発明のアジュバントを用いた動物を免疫する方法は、単に本発明のアジュバントとともに投与した抗原に対する免疫を動物に付与するだけにとどまらず、前記免疫された動物から抗体産生細胞を取得し適切な不死化細胞と融合させてハイブリドーマを作製することで、投与した抗原に対して特異的な抗体を製造することができる。 The method for immunizing an animal using the adjuvant of the present invention is not limited to merely immunizing an animal with an antigen administered together with the adjuvant of the present invention, and an antibody-producing cell is obtained from the immunized animal and appropriately immortalized. An antibody specific to the administered antigen can be produced by producing a hybridoma by fusing with a modified cell.
以下に本発明を更に詳細に説明するために実施例を示すが、これら実施例は本発明の一例を示すものであり、本発明は実施例に限定されるものではない。 Examples will be shown below to describe the present invention in more detail. However, these examples are only examples of the present invention, and the present invention is not limited to the examples.
実施例１ 発現ベクターの構築
ＤＮＡ免疫にて液性免疫を効果的に誘導するためには、膜結合型タンパクとして対象抗原タンパクを細胞表面上に局在させることが望ましい。今回、対象抗原タンパクとして細胞内タンパクであるＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １（以下、ＳＮＤ１とする）を選択したため、ＳＮＤ１にＧＰＩアンカーを付加したタンパクを発現可能なプラスミドベクターを構築することにした。
（１）常法に従ってＳＮＤ１ ｃＤＮＡの開始コドンおよび終止コドンを除いた全長（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０１４３９０の２３０から２９５６番目の領域）またはＲｅｇｉｏｎ ３（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿０１４３９０の１７９３から２９５６番目の領域）の遺伝子断片をＲＴ−ＰＣＲ法により増幅後、ｐＶＡＣ１（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社製）のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ部位に挿入した。増幅に使用したプライマーの組み合わせを以下に示す。
（ａ）ＳＮＤ１全長増幅用プライマー
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ｇｇａｔｃｃａｇｇｃｇｔｃｃｔｃｃｇｃｇｃａｇａｇｃｇｇ−３’（配列番号１、５’末端側６塩基はＢａｍＨＩ認識配列、３’末端側２０塩基はＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿０１４３９０の２３０から２４９番目の配列に相当）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ｇａａｔｔｃｇｃｇｇｃｔｇｔａｇｃｃａａａｔｔｃｇｔ−３’（配列番号３、５’末端側６塩基はＥｃｏＲＩ認識配列、３’末端側２０塩基はＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿０１４３９０の２９３７から２９５６番目の配列に相当）
（ｂ）ＳＮＤ１ Ｒｅｇｉｏｎ ３増幅用プライマー
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ｇｇａｔｃｃａｇｃｇｇｇｃａｇｇｔｃｇｔｔｃｔｇａａｇｃ−３’（配列番号２、５’末端側６塩基はＢａｍＨＩ認識配列、３’末端側２０塩基はＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿０１４３９０の１７９３から１８１２番目の配列に相当）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ｇａａｔｔｃｇｃｇｇｃｔｇｔａｇｃｃａａａｔｔｃｇｔ−３’（配列番号３）
（２）ＳＮＤ１全長またはＲｅｇｉｏｎ ３とｐＶＡＣ１由来Ｐｌａｃｅｎｔａｌ Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅのＧＰＩアンカー領域を含む各遺伝子断片をＰＣＲ法により増幅後、ＳＮＤ１全長とＧＰＩアンカーを含む遺伝子断片はｐＦＬＡＧ−Ｍｙｃ−ＣＭＶ−２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部位に、ＳＮＤ１ Ｒｅｇｉｏｎ ３とＧＰＩアンカーを含む遺伝子断片はｐＦＬＡＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部位に、それぞれ挿入した。増幅に使用したプライマーの組み合わせを以下に示す。
（ｃ）（ＳＮＤ１全長＋ＧＰＩアンカー）増幅用プライマー
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ａａｇｃｔｔｇｃｇｔｃｃｔｃｃｇｃｇｃａｇａｇｃｇｇ−３’（配列番号４、５’末端側６塩基はＨｉｎｄＩＩＩ認識配列、３’末端側２０塩基はＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿０１４３９０の２３０から２４９番目の配列に相当）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ｇｇａｔｃｃｔｃａｇｇｔｔｔａｇｇｇａｇｃａｇｔｇｇ−３’（配列番号６、５’末端側６塩基はＥｃｏＲＩ認識配列）
（ｄ）（ＳＮＤ１ Ｒｅｇｉｏｎ ３＋ＧＰＩアンカー）増幅用プライマー
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ａａｇｃｔｔｃｇｇｇｃａｇｇｔｃｇｔｔｃｔｇａａｇｃ−３’（配列番号５、５’末端側６塩基はＨｉｎｄＩＩＩ認識配列、３’末端側２０塩基はＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿０１４３９０の１７９３から１８１２番目の配列に相当）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ｇｇａｔｃｃｔｃａｇｇｔｔｔａｇｇｇａｇｃａｇｔｇｇ−３’（配列番号６）
（３）各プラスミドベクターに挿入した遺伝子により発現したタンパクが想定した通りに細胞表面に局在していることを確認するために、チャイニーズハムスター卵巣由来哺乳細胞（ＣＨＯ−Ｋ１細胞株）を用いて検証した。
（３−１）（２）で構築したプラスミドベクターを常法に従いＣＨＯ−Ｋ１細胞株へ導入し一過性発現させた。
（３−２）前記導入したＣＨＯ−Ｋ１細胞株を、５％ＣＯ２インキュベータにて、１０％ＦＣＳ添加Ｈａｍｓ Ｆ１２培地（和光純薬社製）を用いて、２４時間・３７℃で培養した。
（３−３）（３−２）の培養液に、前記導入したプラスミドベクターに挿入されているＦＬＡＧタグに対するマウス抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（ＳＩＧＭＡ社製）を添加して３０分静置後、蛍光標識した抗マウスＩｇＧ抗体（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社製）を添加し３０分間静置後、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ）解析を行なった。なお、対象区として遺伝子導入をしていないＣＨＯ−Ｋ１細胞株培養液を用いて同様な解析を行なった。
Example 1 Construction of Expression Vector In order to effectively induce humoral immunity by DNA immunization, it is desirable to localize the target antigen protein as a membrane-bound protein on the cell surface. In this study, Homo sapiens Staphylococcal Nuclease Domain Containing 1 (hereinafter referred to as SND1), which is an intracellular protein, was selected as a target antigen protein, so that a plasmid vector capable of expressing a protein having a GPI anchor added to SND1 was constructed.
(1) Gene of full length (genbank accession No. NM — 014390 region 230 to 2956) or region 3 (GenBank No. NM — 014390 region 1793 to 2956) excluding the start and stop codons of SND1 cDNA according to a conventional method The fragment was amplified by the RT-PCR method and then inserted into the BamHI-EcoRI site of pVAC1 (Invivogen). The primer combinations used for amplification are shown below.
(A) Primer for full-length amplification of SND1 Forward: 5′-gcatccaggggtcctccgcgcagagggg-3 ′ (SEQ ID NO: 1, 6 ′ base on the 5 ′ terminal side is BamHI recognition sequence, 3 bases on the 20 ′ terminal side are GenBank No. Equivalent to an array)
Reverse: 5'-gaattcgcggctgtcccaaaattcgt-3 '(SEQ ID NO: 3, 5' terminal 6 bases are EcoRI recognition sequences, 3 'terminal 20 bases correspond to GenBank No. NM_014390 from 2937 to 2956)
(B)
Reverse: 5′-gaattcgcggctgtcccaaaattcgt-3 ′ (SEQ ID NO: 3)
(2) After amplification of each gene fragment containing the full length of SND1 or the GPI anchor region of
(C) (SND1 full length + GPI anchor) Amplification primer Forward: 5′-aagctttgcgtcctccgcgcaggcgg-3 ′ (SEQ ID NO: 4, 5 ′ terminal side 6 base is HindIII recognition sequence, 3 ′ terminal side 20 base is GenBank No. NM — 014390 230 To the 249th sequence from
Reverse: 5'-ggaccctcaggtttaggggagcagggg-3 '(SEQ ID NO: 6, 5' terminal 6 bases are EcoRI recognition sequences)
(D) Primer for amplification (
Reverse: 5′-ggatcctcaggtttagggggaggtgg-3 ′ (SEQ ID NO: 6)
(3) In order to confirm that the protein expressed by the gene inserted into each plasmid vector is localized on the cell surface as expected, using Chinese hamster ovary-derived mammalian cells (CHO-K1 cell line) Verified.
(3-1) The plasmid vector constructed in (2) was introduced into the CHO-K1 cell line according to a conventional method and transiently expressed.
(3-2) The introduced CHO-K1 cell line was cultured at 37 ° C. for 24 hours using a 10% FCS-added Hams F12 medium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in a 5% CO 2 incubator.
(3-3) A mouse anti-FLAG M2 antibody (manufactured by SIGMA) against the FLAG tag inserted in the introduced plasmid vector is added to the culture solution of (3-2) and left for 30 minutes, and then fluorescently labeled The anti-mouse IgG antibody (manufactured by BECKMAN COULTER) was added and allowed to stand for 30 minutes, and then FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) analysis was performed. In addition, the same analysis was performed using the CHO-K1 cell line culture solution which has not carried out gene transfer as a target section.
ＦＡＣＳ解析の結果を図１に示す。解析の結果、対照区では全く反応が認められないが、ＳＮＤ１全長遺伝子（ＳＮＤ１全長区）またはＳＮＤ１ Ｒｅｇｉｏｎ ３遺伝子（Ｒｅｇｉｏｎ ３区）を導入した細胞はいずれも反応が認められた。本結果より発現したＳＮＤ１ 全長タンパクまたはＳＮＤ１ Ｒｅｇｉｏｎ ３タンパクは細胞表面上に局在していることが示された。なお、ＳＮＤ１全長区と比較してＲｅｇｉｏｎ ３区の方がよりＦＬＡＧ抗体の反応性が高いことから、全長を断片化することで細胞表面上への発現量が増えていることが推察される。
The result of FACS analysis is shown in FIG. As a result of the analysis, no response was observed in the control group, but any of the cells into which the SND1 full-length gene (SND1 full-length group) or the
実施例２ 免疫および採血
（１）ＳＮＤ１ Ｒｅｇｉｏｎ ３遺伝子を挿入したプラスミドベクターをＤＮＡ量として４０μｇ含むように１００μＬの５％スクロース溶液にて調製し、それをＡ／Ｊマウスに投与することで、Ａ／Ｊマウスを免疫した。なお免疫群として、対照群（プラスミドベクター４０μｇのみを投与）、酸化亜鉛ウィスカー群（プラスミドベクター４０μｇと酸化亜鉛ウィスカー（商品名：パナテトラ、アムテック社製）９００μｇを投与）、尿酸結晶群（プラスミド４０μｇと尿酸結晶飽和溶液１００μＬを投与、なお尿酸結晶は非特許文献６に記載の方法で調製）を設け、各免疫群に対して４匹のＡ／Ｊマウスを使用した。
（２）初回の免疫から３日後、５日後、７日後、９日後、１２日後、１４日後、２１日後、２８日後、３５日後に追加免疫し、初回の免疫開始後４２日目に採血を行ない抗血清を採取した。なお、酸化亜鉛ウィスカー群においてのみ、免疫開始７日後から免疫箇所周辺部に鬱血を伴う強い炎症反応が認められた。
Example 2 Immunization and Blood Collection (1) A plasmid vector into which
(2) 3 days, 5 days, 7 days, 9 days, 12 days, 14 days, 21 days, 28 days, and 35 days after the first immunization, additional immunization is performed, and blood is collected on the 42nd day after the start of the first immunization. Antiserum was collected. Only in the zinc oxide whisker group, a strong inflammatory reaction accompanied by congestion was observed around the immunized site 7 days after the start of immunization.
実施例３ ＳＮＤ１全長タンパク発現細胞の作製
抗血清評価用としてＳＮＤ１全長タンパクを恒常的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞株を作製した。
（１）ＳＮＤ１全長遺伝子を挿入したプラスミドを常法に従いＣＨＯ−Ｋ１細胞株へ遺伝子導入後、５％ＣＯ２インキュベータにて、１０％ＦＣＳ添加Ｈａｍｓ Ｆ１２培地（和光純薬社製）を用いて、２４時間・３７℃で培養した。
（２）培養後、抗生物質Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を２５０μｇ／ｍＬとなるよう添加し、３週間培養した。
（３）抗ＦＬＡＧ抗体を用いてセルソーターによりＳＮＤ１全長タンパクを恒常的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を分取した。
Example 3 Production of SND1 full-length protein-expressing cells A CHO-K1 cell line that constantly expresses SND1 full-length protein was prepared for antiserum evaluation.
(1) After introducing the plasmid having the full-length SND1 gene into a CHO-K1 cell line according to a conventional method, using a Hams F12 medium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) with 10% FCS in a 5% CO 2 incubator, The cells were cultured for 24 hours at 37 ° C.
(2) After culturing, an antibiotic Geneticin solution (manufactured by Invitrogen) was added to a concentration of 250 μg / mL and cultured for 3 weeks.
(3) CHO-K1 cells that constantly express the full-length SND1 protein were collected using a cell sorter using an anti-FLAG antibody.
実施例４ マウス抗血清の評価
実施例３で調製したＳＮＤ１全長タンパク発現細胞を用いて、細胞酵素免疫測定法（ＣＥＬＩＳＡ）およびＦＡＣＳにより、実施例２で調製した各マウス抗血清を解析した。なお、前記抗血清は３％ウシ胎児血清を含むＰＢＳにて１０００倍希釈したものを用いた。
（１）ＣＥＬＩＳＡ解析
（１−１）実施例３で調製したＳＮＤ１全長タンパク発現細胞を９６ウェルプレートに１ｗｅｌｌあたり５×１０４細胞をコートし、５％ＣＯ２インキュベータにて、１０％ＦＣＳ添加Ｈａｍｓ Ｆ１２培地（和光純薬社製）を用いて、２４時間・３７℃で培養した。
（１−２）１０００倍希釈した抗血清を第一抗体として室温にて１時間反応後、プレートを洗浄して西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスイムノグロブリンＧ−Ｆｃ抗体（ＳＩＧＭＡ社製）を２次抗体として反応させた。
（１−３）室温にて１時間反応後、プレートを洗浄しＡｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加し、蛍光測定プレートリーダーにて蛍光強度を算出した。
（２）ＦＡＣＳ解析
実施例１と同様に実施し、蛍光強度を算出した。
Example 4 Evaluation of Mouse Antisera Each mouse antiserum prepared in Example 2 was analyzed by cell enzyme immunoassay (CELISA) and FACS using the SND1 full-length protein-expressing cells prepared in Example 3. The antiserum used was diluted 1000-fold with PBS containing 3% fetal bovine serum.
(1) CELISA analysis (1-1) SND1 full-length protein-expressing cells prepared in Example 3 were coated on a 96-well plate at 5 × 10 4 cells per well, and 10% FCS-added Hams in a 5% CO 2 incubator. The cells were cultured at 37 ° C. for 24 hours using F12 medium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
(1-2) After reacting for 1 hour at room temperature with antiserum diluted 1000 times as the first antibody, the plate was washed and horseradish peroxidase (HRP) -labeled anti-mouse immunoglobulin G-Fc antibody (manufactured by SIGMA) was Reaction was performed as a secondary antibody.
(1-3) After reaction at room temperature for 1 hour, the plate was washed, an Amplex Red solution (manufactured by Invitrogen) was added, and the fluorescence intensity was calculated with a fluorescence measurement plate reader.
(2) FACS analysis The fluorescence intensity was calculated in the same manner as in Example 1.
ＣＥＬＩＳＡ解析の結果を図２に、ＦＡＣＳ解析の結果を図３にそれぞれ示す。いずれの解析でも、対照群や尿酸結晶群と比較し、酸化亜鉛ウィスカー群が高値を示した。ＣＥＬＩＳＡ解析およびＦＡＣＳ解析にて算出した、各免疫群における蛍光強度の平均値および対照群と酸化亜鉛ウィスカー群間のウェルチＴ検定による統計処理結果を図４に示す。対象群と酸化亜鉛ウィスカー群間ではＣＥＬＩＳＡ解析（ｐ＝０．００３６）、ＦＡＣＳ解析（ｐ＝０．００２４）ともに統計的な有意差を示したことから、酸化亜鉛ウィスカーにより液性免疫が誘導され抗体価が上昇したことが示された。一方、針状結晶体でも尿酸結晶を投与した群（尿酸結晶群）では対照群と比較して抗体価の上昇は認められなかった。以上より、針状単結晶部を有した無機化合物である酸化亜鉛ウィスカーがアジュバント効果（液性免疫を増強する効果）を有していることが示された。 The result of CELISA analysis is shown in FIG. 2, and the result of FACS analysis is shown in FIG. In any analysis, the zinc oxide whisker group showed higher values than the control group and the uric acid crystal group. FIG. 4 shows the mean value of the fluorescence intensity in each immunization group and the statistical processing result by Welch T test between the control group and the zinc oxide whisker group, calculated by CELISA analysis and FACS analysis. Since the CELISA analysis (p = 0.0036) and the FACS analysis (p = 0.024) showed a statistically significant difference between the subject group and the zinc oxide whisker group, humoral immunity was induced by the zinc oxide whisker. It was shown that the antibody titer increased. On the other hand, no increase in antibody titer was observed in the group (uric acid crystal group) administered with uric acid crystals as compared with the control group even in the acicular crystals. From the above, it was shown that zinc oxide whiskers, which are inorganic compounds having a needle-like single crystal part, have an adjuvant effect (an effect of enhancing liquid immunity).
無機化合物の針状結晶体を動物を免疫する際のアジュバントとして用いることで、免疫した動物の液性免疫を増強することが可能となる。また、本発明のアジュバントと抗原を投与して動物を免疫することで得られる抗体産生細胞から、投与した抗原に対する特異的の高い抗体を製造することができる。 By using an acicular crystal of an inorganic compound as an adjuvant when immunizing an animal, it is possible to enhance the humoral immunity of the immunized animal. In addition, an antibody with high specificity for the administered antigen can be produced from antibody-producing cells obtained by immunizing an animal by administering the adjuvant of the present invention and the antigen.
Claims (4)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010031096A JP5633152B2 (en) | 2010-02-16 | 2010-02-16 | Adjuvant |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010031096A JP5633152B2 (en) | 2010-02-16 | 2010-02-16 | Adjuvant |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2011168500A JP2011168500A (en) | 2011-09-01 |
| JP5633152B2 true JP5633152B2 (en) | 2014-12-03 |
Family
ID=44683003
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2010031096A Active JP5633152B2 (en) | 2010-02-16 | 2010-02-16 | Adjuvant |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP5633152B2 (en) |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2600761B2 (en) * | 1987-12-29 | 1997-04-16 | 松下電器産業株式会社 | Zinc oxide whisker |
| US8333996B2 (en) * | 1995-05-19 | 2012-12-18 | Etex Corporation | Calcium phosphate delivery vehicle and adjuvant |
| AU756828B2 (en) * | 1997-12-02 | 2003-01-23 | Powderject Vaccines, Inc. | Transdermal delivery of particulate vaccine compositions |
-
2010
- 2010-02-16 JP JP2010031096A patent/JP5633152B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2011168500A (en) | 2011-09-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Tan et al. | Immunogenicity of prime-boost protein subunit vaccine strategies against SARS-CoV-2 in mice and macaques | |
| JP2021138721A (en) | Hiv pre-immunization and immunotherapy | |
| WO2010108215A1 (en) | Compounds and methods for modulating an immune response | |
| WO2019166413A1 (en) | Inhibitors of pla2-g1b cofactors for treating cancer | |
| CN111763256A (en) | Cloning of chicken CR2 gene, expression and purification of protein and preparation of polyclonal antibody thereof | |
| KR100801810B1 (en) | - Super-antigen Fusion Proteins and the Use Thereof | |
| KR20220009960A (en) | Recombinant Classical Swine Fever Virus | |
| JP5561689B2 (en) | Screening method for therapeutic agents for allergic airway inflammation and / or airway hypersensitivity using IL-17RB positive NKT cells | |
| WO2024056097A1 (en) | Use of nkg2d-based cell adapter molecule in removal of aging cells | |
| RU2759227C2 (en) | Dna vaccine against sars-cov-2 virus based on gene therapy dna vector gdtt1.8nas12, method for its preparation, strains carrying gene-therapy dna vectors, method for their preparation, method for production on industrial scale of gene-therapy dna vectors | |
| WO2021042947A1 (en) | Minicircle dna vaccine design and use | |
| AU2009246044B2 (en) | Methods of detecting cells with a disrupted cell membrane, cells infected with a pathogen, dying cells or dead cells | |
| JP5633152B2 (en) | Adjuvant | |
| KR102175885B1 (en) | RECOMBINANT PORCINE AMINOPEPTIDASE N PROTEIN AND METHOD FOR PRODUCING ANTI-pAPN ANTIBODY USING THE SAME | |
| WO2023123696A1 (en) | N protein epitope mutation marker for preparing prrsv genotype ii epitope-deleted vaccine strain and use thereof | |
| Xu et al. | Mucosal and cellular immune responses elicited by nasal and intramuscular inoculation with ASFV candidate immunogens | |
| CN112999341B (en) | Edwardsiella tarda outer membrane protein vaccine and preparation and application thereof | |
| US20060140967A1 (en) | Immunogenic peptides for the treatment of prostate and breast cancer | |
| AU2007217515B2 (en) | Compositions for and methods of identifying antigens | |
| KR20100105974A (en) | Rift valley fever competition elisa using monoclonal antibodies against recombinant n protein | |
| WO2008097812A1 (en) | Toxoplasma gondii oocyst protein | |
| US5882866A (en) | Method of isolating ribotopes and proteotopes | |
| WO2023020615A1 (en) | Efficient expression system of sars-cov-2 receptor binding domain (rbd), methods for purification and use thereof | |
| EP3359559A1 (en) | Glycosylated yghj polypeptides from enterotoxigenic escherichia coli (etec) | |
| JPWO2016158546A1 (en) | Human herpesvirus 6B antigen composition |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20130122 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140304 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140423 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20140916 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20140929 |
|
| R151 | Written notification of patent or utility model registration |
Ref document number: 5633152 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151 |