JP5629940B2 - 関節疾患治療用の組み合わせ製剤 - Google Patents

Description

本発明は、変形性関節症などの関節疾患治療に用いることのできるヒアルロン酸と動物性ムチン型タンパク質の組み合わせ製剤に関する。

疾病や老化、またはその部分の酷使などによって、ヒト及び哺乳類動物の関節に誘起される不具合には、関節液の変性、あるいは軟骨表面に生じる損傷を呈するものが数多くある。これらは、本来持つ関節の機能、すなわち少ない摩擦でスムーズな骨格運動を実現する能力を低下させ、その結果として身体に障害や痛みなどを与える。例えば、変形性関節症（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ：以下「ＯＡ」という）は、６０歳以上の２５％以上が発病すると言われている最も一般的な関節疾患の一つであり、長期間にわたり穏やかに進行する軟骨の変性（退行性変性）によって特徴づけられる。これらは、主に膝関節や股関節といった下肢荷重関節に好発し、発症には年齢と強い相関がある。ゆえに、高齢者における疼痛や関節の機能障害の主な要因の一つである。
高齢者のＡＤＬ（Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｄａｉｌｙ ｌｉｆｅ）を高く維持するためには、骨軟骨の機能維持は重要な要素で、高齢化社会において国民の社会活動や経済活動を促進する社会的要請から産業上の要請でもある。発症に寄与する因子としては、ＯＡの家族歴、外傷または手術による関節に対する以前の損傷、及び関節の年齢（すなわち、関節のアーティキュレイティング（ａｒｔｉｃｕｌａｔｉｎｇ）表面の摩耗及び裂傷）が挙げられる。ＯＡは、上記のように高齢者において非常に一般的であるが、骨折、前十字靱帯損傷、半月板損傷といった外傷後や、血友病などの基礎疾患を有する場合では子供にも同様に発症し得る。現在、ＯＡの薬物治療は、おもに疼痛緩和を目的としており、全身性の鎮痛薬治療、局所の関節内治療から成り立っている。全身性の鎮痛薬治療として、非ステロイド性消炎鎮痛剤（ＮＳＡＩＤｓ）が広く使われている［Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ４３：１９０５−１９１５（２０００）］。しかしながら、病態の進行を加速させる可能性があることを述べている論文も散見される［Ｈｕｓｋｉｓｓｏｎ，Ｅ．Ｃ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ ２２：１９４１−１９４６（１９９５）；Ｒａｓｈａｄ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ２：５１９−５２２（１９８９）；Ｄｏｕｇａｄｏｓ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．５５：３５６−３６２（１９９６）］。一方、局所の関節内治療としてはヒアルロン酸注入療法が広く知られている。
ヒアルロン酸注入療法のように、外部からの薬剤の添加により滑液の粘度を増加させ、関節が物理的に損傷する原因を緩和するという方法は、粘度補充療法（ｖｉｓｃｏｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）と呼ばれている（特許文献１）。粘度補充療法は、上記ＯＡの治療のみならず、老化や疾病で滑液の粘度が低下することで軟骨同士の相互作用が頻繁に起きて表層性欠損が生じていると考えられる場合に広く用いられている。粘度補充療法には、ヒアルロン酸やその誘導体を用いることが多く、関節液の粘度を増加させ、関節軟骨の破壊を抑制する効果が認められている（非特許文献１〜４）。また、ヒアルロン酸の抗炎症作用も疾病の緩和に効果があると言われている（非特許文献５）。しかし、ヒアルロン酸を用いた粘度補充療法は、多くの場合目立った表層性欠損の修復作用を得ることができないので、一時的な緩和治療にとどまっている。また投与されたヒアルロン酸も数週間で代謝消費されてしまうので、効果を維持し、症状を軽減させるためには本治療を繰り返し用いなくてはならない。
一方、関節液の粘度ではなく、滑膜付近の境界潤滑物質を補充する、潤滑補充療法（ｔｒｉｂｏｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）という治療法も提案されており、たとえばムチン型糖タンパク質であるトリボネクチンを直接投与する場合には、この潤滑補充効果を期待しているものである（特許文献１）。また、近年、関節液内と関節表面からトリボネクチンの範囲に含まれるルブリシンと呼ばれるムチン領域を有する糖タンパク質が同定され、これらも関節の潤滑補充に寄与することが報告されている（非特許文献６、７）。ルブリシンは、タンパク質骨格に０結合型糖鎖が接続したムチン型配列領域を挟んで両端に非ムチン型配列を持っていることを特徴としており、この非ムチン型配列が軟骨表面に親和性を持って相互作用し、ルブリシンを軟骨表面に定着させるという説が提唱されている（非特許文献８）。ルブリシンが軟骨表面に定着すると、そのムチン領域は糖鎖を毛ブラシのように外部に出して摩擦を軽減する役割、また、非ムチン領域は軟骨表面への定着を促進するという役割、という分業が行われていると考えられ、その形状からブラッシングモデルと呼ばれている。一方、前記のトリボネクチンについては、そのようなメカニズムは提唱されていないが、トリボネクチンもまた摩擦を軽減するムチン型配列と、非ムチン領域を有していることは共通しており、同様にムチン領域が軟骨組織表面に密に（おそらくフィルム状に）吸着することにより、摩擦を低減する効果が得られているものと考えられる。従って、これらの２種のムチン型糖タンパク質の例にあるように、摩擦軽減のためのムチン型糖鎖部分と軟骨表面に吸着を果たす非ムチン領域が必須といえる（非特許文献８）。
このように、ムチン型糖タンパク質は、潤滑補充を目的として関節組織に注入して関節疾患の治療への利用が期待されるところである。しかしながら、ムチン型糖タンパク質を製造するにあたり、その骨格ペプチド質部分は合成できても、Ｏ−グリコシド結合により糖鎖を結合させる（Ｏ−グリコシレーションする）ことは生体内でも翻訳後修飾反応によって行われている合成経路であり、容易に制御することのできない生体反応であるため、糖鎖部分を結合させて全く同じ糖タンパク質を人工的に作成することは非常に困難である。特殊な細胞系による発現や、酵素反応、精密な有機化学反応において、Ｏ−グリコシド結合を有した糖鎖を結合させることは不可能ではないものの、十分な密度や変換率で糖鎖を導入することなどは不可能で、もし実現できたとしても莫大なコストがかかると考えられる。従ってムチン型糖タンパク質はその供給が十分確保できないため、それを用いた上記の治療法は実際上利用することができず、かつ普及浸透することも難しい。
これに対し、最近、ムチン型糖タンパク質を、簡略化した化合物を人工的に合成する試みが行われており、例えば、ルブリシンのムチン配列部分を短くしたムチン型糖タンパク質を合成し、関節表面に定着したという事実が報告されているが、治療効果が確認されたわけではない（非特許文献９、１０）。
ムチン型糖タンパク質は粘液の成分として動植物全般に広く分布する。植物性ムチン型糖タンパク質は長い糖鎖に短いペプチドが結合している構造を有しているものが多いのに対し、動物性ムチン型糖タンパク質はペプチド鎖が長大であるという特徴があり、動物の種類によって、コアペプチドの配列、糖鎖の構造、非ムチン型ドメインなどは様々である。これまで種々の動物性ムチン型糖タンパク質（動物性ムチン）が知られており、主にはウシなどの家畜の消化液や唾液由来のムチンであるが、カタツムリ、ヒトデ、イカにもその存在が報告されている。しかしながら、これらの動物性ムチンはいずれも生産量が限られているために大量に供給することができない、純度が低いために安全性に乏しい、また構造解析（ペプチド鎖の配列、糖鎖の配列解析）が十分に行われていない、などの種々の問題がある。これに対し、近年クラゲから採取したムチン（クニウムチン）は、構造が簡単で、ほぼ純粋にムチン配列領域から構成されていること、安価で大量生産が可能であることを特徴とするものであり、その有効利用が期待される（非特許文献１１、特許文献２）。
上記のヒアルロン酸、ムチン以外にも、組織の成長因子を投与するという手法も提案されている（特許文献３、特許文献４、非特許文献１２）。しかしながら、いずれも従来の療法と同様に、損傷の進行を抑止したり、痛みを軽減するような効果はあるものの、損傷の自己修復作用を促進するような効果は得られていない。
特表２００３−５０００２２ ＷＯ ２００７／０２０８８９ 特開２００４−２３０１８４ 特開２００５−１４４１３１ Ｒｅｉｊｍａｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ５２：３１３７−３１４２（２００５） Ｐｅｔｒｅｌｌａ，Ｒ．Ｊ．，ＤｉＳｉｌｖｅｓｔｒｏ，Ｍ．Ｄ．，Ａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．１６２：２９２−２９８（２００２） Ｄｏｕｇａｄｏｓ，Ｍ．ｅｔ ａｌ，Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ １：９７−１０３（１９９３） Ｓａｌｋ，Ｒ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ．Ａｍ．８８：２９５−３０２（２００６） Ｇｏｔｏ Ｍ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１９：３２７−３８３（２００１） Ｒｈｅｅ Ｄ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１５：６２２−６３１（２００５） Ｊａｙ，Ｇ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０４：６１９４−６１９９（２００７） Ｃｈａｎｇ Ｄ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２４：１１８３−１１９３（２００８） Ｆｌａｎｎｅｒｙ，Ｃ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ，１５，Ｓ１９（２００８） Ｒｉｖｅｒｓ−Ｂｅｒｍｕｄｅｚ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ，１５，Ｓ４３（２００８） Ｍａｓｕｄａ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．７０（７）：１０８９−１０９２（２００７） Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｅ．Ｎ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｔｈｅｒａｐｙ９：Ｒ１０２（２００７）

上記のとおり、変形性関節症などの関節疾患の治療または症状緩和を目的として種々の方法が提案されているものの、粘度補充療法は、それ単独では関節軟骨の修復効果を持たず、また、潤滑補充療法は、それに用いることのできる構造を有したムチン型糖タンパク質を人工的に大量生産することが現時点では困難であるので、実際の治療に用いることができない。
従って、本発明の課題は、従来の治療法では達成できなかった関節軟骨の修復及び再生を可能にし、変形性関節症などの関節疾患の治療に有効な安全かつ安価な薬剤を提供することにある。
発明者らは、上記課題を解決すべき鋭意研究を重ねた結果、従来から関節の粘度補充療法に用いられてきたヒアルロン酸に加えて、動物性ムチン型糖タンパク質を併用すると、これまでの治療法では得られなかった関節軟骨の修復及び再生効果が相乗的に誘起されることを見出し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１） 関節疾患の治療においてヒアルロン酸と動物性ムチン型糖タンパク質を同時に、別々に、又は順次に投与するための組み合わせ製剤。
（２） 動物性ムチン型糖タンパク質が、その全長アミノ酸配列の９５％以上がムチン領域で構成されている、（１）に記載の組み合わせ製剤。
（３） 動物性ムチン型糖タンパク質が、下記式（Ｉ）：
Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ （Ｉ）
（式中、ＸａａはＶａｌ又はＩｌｅである。）
で示されるアミノ酸配列からなる繰り返し単位を３〜２０００回含む繰り返し構造を有し、該繰り返し構造中の全Ｔｈｒ残基のうち５０％以上のＴｈｒ残基に対して糖鎖が結合していることを特徴とする、（１）に記載の組み合わせ製剤。
（４） 動物性ムチン型糖タンパク質がクラゲからの抽出物である、（１）に記載の組み合わせ製剤。
（５） ヒアルロン酸と動物性ムチン型糖タンパク質が異なるまたは同一の製剤に含まれていることを特徴とする、（１）〜（４）のいずれかに記載の組み合わせ製剤。
（６） 注射剤である、（１）〜（５）のいずれかに記載の組み合わせ製剤。
（７） 関節疾患の治療が、関節軟骨欠損の修復及び再生である、（１）〜（６）のいずれかに記載の組み合わせ製剤。
（８） ヒアルロン酸と動物性ムチン型糖タンパク質とを組み合わせて投与することを特徴とする、関節疾患の治療方法。
（９） 動物性ムチン型糖タンパク質が、その全長アミノ酸配列の９５％以上がムチン領域で構成されている、（８）に記載の方法。
（１０） 動物性ムチン型糖タンパク質が、下記式（Ｉ）：
Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ （Ｉ）
（式中、ＸａａはＶａｌ又はＩｌｅである。）
で示されるアミノ酸配列からなる繰り返し単位を３〜２０００回含む繰り返し構造を有し、該繰り返し構造中の全Ｔｈｒ残基のうち５０％以上のＴｈｒ残基に対して糖鎖が結合していることを特徴とする、（８）に記載の方法。
（１１） 動物性ムチン型糖タンパク質がクラゲからの抽出物である、（８）に記載の方法。
（１２） 関節疾患の治療が、関節軟骨欠損の修復及び再生である、（８）〜（１１）のいずれかに記載の方法。
発明の効果
本発明のヒアルロン酸と動物性ムチン型糖タンパク質からなる組み合わせ製剤によれば、自己治癒能力に乏しく、一度損傷すると修復及び再生の可能性はほとんどないとされていた関節軟骨の修復及び再生が可能となり、粘度補充や潤滑補充を目的とした従来の関節症治療剤とは異なった新たなかつ相乗的な治療効果が得られる。また、本発明の組み合わせ製剤に含まれる動物性ムチン型糖タンパク質は、糖鎖が短く構成糖の種類も少なくシアル酸を殆ど含まないこと、ルブリシンやトリボネクチンに見られるような非ムチン領域を持たないことから、免疫やアレルギーなどの生体反応が比較的穏やかであるため、安全性に優れる。

図１は、ムチン型糖タンパク質を投与した正常な膝関節の軟骨組織の肉眼的所見を示す。
図２は、ムチン型糖タンパク質を投与した正常な膝関節の軟骨組織のＨ−Ｅ染色像及びトルイジンブルー（Ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ−Ｂｌｕｅ）染色像を示す。
図３は、前十字靭帯損傷ＯＡモデルへの薬剤投与スケジュールを示す。
図４は、所定の薬剤投与を行った前十字靭帯損傷ＯＡモデル（術後１０週目）における膝関節部大腿骨の肉眼的所見を示す（Ａ群：生理食塩水（対照）群、Ｂ群：ヒアルロン酸単独投与群、Ｃ１群：エチゼンクラゲ由来ムチン抽出物の単独投与群、Ｃ２群：ミズクラゲ由来ムチン抽出物の単独投与群、Ｄ１群：エチゼンクラゲ由来ムチン抽出物＋ヒアルロン酸の併用投与群、Ｄ２群：ミズクラゲ由来ムチン抽出物＋ヒアルロン酸の併用投与群）。
図５は、所定の薬剤投与を行った前十字靭帯損傷ＯＡモデル（術後１０週目）における膝関節部大腿骨のｓａｆｒａｎｉｎ−Ｏ染色像を示す（Ａ群：生理食塩水（対照）群、Ｂ群：ヒアルロン酸単独投与群、Ｃ群：クラゲ由来ムチン抽出物の単独投与群、Ｄ群：クラゲ由来ムチン抽出物＋ヒアルロン酸の併用投与群）。
図６は、所定の薬剤投与を行った前十字靭帯損傷ＯＡモデル（術後１０週目）における軟骨変性の程度をＯＡスコアで評価した結果を示す（Ａ群：生理食塩水（対照）群、Ｂ群：ヒアルロン酸単独投与群、Ｃ１群：エチゼンクラゲ由来ムチン抽出物の単独投与群、Ｃ２群：ミズクラゲ由来ムチン抽出物の単独投与群、Ｄ１群：エチゼンクラゲ由来ムチン抽出物＋ヒアルロン酸の併用投与群、Ｄ２群：ミズクラゲ由来ムチン抽出物＋ヒアルロン酸の併用投与群。コラムと縦線：各群の平均値と標準偏差）。
本願は、２００９年１月２９日に出願された日本国特許出願２００９−０１８７１９号の優先権を主張するものであり、該特許出願の明細書に記載される内容を包含する。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、関節疾患の治療においてヒアルロン酸と動物性ムチン型糖タンパク質を同時に、別々に、又は順次に投与するための組み合わせ製剤に関する。
本発明に用いるヒアルロン酸は、通常の関節内粘度補充療法に用いられるヒアルロン酸であればその起源や製法は問わないが、分子量は、約５０万〜２０００万の範囲内のものが好ましく、約８０万〜２００万の範囲内のものがより好ましい。また、本発明にいうヒアルロン酸は、そのアルカリ金属塩、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウムの塩をも包含する。
本発明においてヒアルロン酸と組み合わせて用いる動物性ムチン型糖タンパク質は、実質的にムチン領域で構成されており、ルブルシン、トリボネクチンに見られるような非ムチン領域を持たないか、或いは非ムチン領域がごくわずかであるものが好ましい。
上記の「実質的にムチン領域で構成されている」とは、具体的には、その全長アミノ酸配列の９５％以上、好ましくは９８％以上、より好ましくは１００％がムチン領域で構成されていることをいう。ここで、「ムチン型糖タンパク質」（ムチン）とは、粘液（Ｍｕｃｕｓ）の主成分である糖タンパク質で、アミノ酸のつながったタンパク質（ペプチド鎖）のトレオニン（Ｔｈｒ）及び／又はセリン（Ｓｅｒ）にＯ−グリコシド結合で糖鎖（ムチン型糖鎖）が枝状に結合した高分子化合物をいう。また、上記の「ムチン領域」とは、ムチン型糖鎖が密に存在する領域であり、ムチン型糖鎖が結合したアミノ酸残基を含む数個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列の繰り返し構造（ムチン型配列）を有する領域をいう。例えば、下記に示すような１０残基程度のアミノ酸配列の連続した繰り返し配列を有するムチン型糖タンパク質の場合、該ムチン型糖タンパク質を構成する全アミノ酸配列中からランダムに１０残基程度からなるアミノ酸配列を選択した際に、該１０残基程度のアミノ酸残基中、少なくとも１つのアミノ酸残基にムチン型糖鎖が結合していることを確認することにより、該領域はムチン領域であると判断することができる。また、上記の「非ムチン領域」とは「ムチン領域」以外の領域、すなわちムチン型糖鎖がないか或いは極端に少ない領域であり、ムチン型糖鎖が結合していないアミノ酸残基からなるアミノ酸配列（非ムチン型配列）を有する領域をいう。例えば、下記に示すような１０残基程度のアミノ酸配列の連続した繰り返し配列を有するムチン型糖タンパク質の場合、該ムチン型糖タンパク質を構成する全アミノ酸配列中からランダムに１０残基程度からなるアミノ酸配列を選択した際に、該１０残基程度のアミノ酸配列中の、いずれのアミノ酸残基にもムチン型糖鎖が結合していないことを確認することにより、該領域は非ムチン領域であると判断することができる。
本発明における動物性ムチン型糖タンパク質において、アミノ酸残基に結合するムチン型糖鎖の糖鎖構造及び構成については特に限定はないが、糖鎖が短く（１糖もしくは２糖からなる短い糖鎖）、構成糖の種類が少ないことが好ましい。また、糖鎖が結合するアミノ酸残基の種類としても特に限定されるものではないが、トレオニン残基（Ｔｈｒ）及び／又はセリン残基（Ｓｅｒ）に糖鎖が結合していることが好ましい。
このような動物性ムチン型糖タンパク質として、タンデムリピートと呼ばれる１０残基程度のアミノ酸配列の連続した繰り返し配列を有するムチン型糖タンパク質、好適には、ＷＯ ２００７／０２０８８９に記載の下記式（Ｉ）（配列番号１）：
Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ （Ｉ）
（式中、ＸａａはＶａｌ又はＩｌｅである。）
で示されるアミノ酸配列からなる繰り返し単位を３回以上含む繰り返し構造を有するムチン型糖タンパク質が挙げられる。上記単位の繰り返し回数は、３〜２０００回、好ましくは３〜７００回である。当該ムチン型糖タンパク質の分子量は１０〜１００ｋＤａ程度にピークを持つ広い分布をしているが、本発明においてはいずれの分子量のものを用いてもよい。
上記の繰り返し単位は、直接結合してもよいし、又はリンカーを介して結合してもよい。リンカーは、限定されるものではないが、例えばシステインを用いたＳ−Ｓ結合などが挙げられる。
また、上記式（Ｉ）の繰り返し単位を含む繰り返し構造を有する当該動物性ムチン型糖タンパク質において、糖鎖が結合しているＴｈｒ残基としては、前記繰り返し構造中の全Ｔｈｒ残基の５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上である。
なお、本発明における動物性ムチン型糖タンパク質において、糖鎖を構成する単糖は、一般的なムチン型糖タンパク質において見出されている単糖であれば特に限定されるものではなく、例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、シアル酸、アラビノース、フコースなどが挙げられる。特に、Ｎ−アセチルガラクトサミン及び／又はガラクトースから構成される糖鎖であることが好ましい。具体的には、上記の繰り返し単位におけるトレオニン残基（Ｔｈｒ）に、Ｎ−アセチルガラクトサミン及びガラクトースが結合してＴｈｒ−ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌの構造をとるか、Ｎ−アセチルガラクトサミンのみが結合してＴｈｒ−ＧａｌＮＡｃの構造をとることが好ましい。
また、本発明における動物性ムチン型糖タンパク質として、クラゲからの抽出物を用いてもよい。クラゲとしては、ヒトや動物に対する安全性が確認されているクラゲであることが好ましく、例えば、ミズクラゲ、エチゼンクラゲ、ビゼンクラゲなどが挙げられる。また、当該ムチン型糖タンパク質が抽出されるクラゲの部位は特に限定されるものではなく、例えば、表皮、口腕、胃体部、体液など、また凍結保存や常温による保存において生じた液体成分を用いることができる。これらのクラゲの部位を材料として当該ムチン型糖タンパク質を含む抽出物を得る方法、ならびに得られた抽出物を液体クロマトグラフィーなどのタンパク質の精製に通常用いられる手段によって精製する方法は、ＷＯ ２００７／０２０８８９の記載に従えばよい。
本発明において用いるクラゲ抽出物は、上記の動物性ムチン型糖タンパク質を９０％以上含むように高度に精製されたものが好ましいが、コスト低減と効率性の観点から、５０％程度含む粗精製物（粗精製ムチン）であってもよい。かかる粗精製物としては、例えば、上記公報に記載の方法に従って得られる精製処理直前のクラゲ抽出物を用いることができる。
本発明の組み合わせ製剤への使用に際し、上記の動物性ムチン型糖タンパク質及びこれを含むクラゲ抽出物（以下、これらを「ムチン成分」という）は、あらかじめエンドトキシンを含む病原性成分、抗原性成分、アレルギー源性成分を除去あるいは低減する処理をしておくことが必要である。
本発明の組み合わせ製剤は、ヒアルロン酸を含む製剤とムチン成分を含む製剤の別個の製剤から構成されていてもよく、ヒアルロン酸とムチン成分を混合して含む単一の製剤から構成されていてもよい。組み合わせ製剤の剤型としては、患部、例えば関節軟骨欠損部分に直接注入可能な注射剤であることが好ましい。この場合、ヒアルロン酸とムチン成分をそれぞれ適当な溶媒に溶解した別個の注射剤としてもよく、また両者を適当な溶媒に混合溶解した単一の注射剤としてもよい。注射剤の種類は、水性注射剤、水性懸濁注射剤が好ましい。ここで用いる溶媒としては、通常注射剤に使用される生理食塩水、緩衝液、注射用水のいずれであってもよい。水性注射剤、水性懸濁注射剤の調製は、ヒアルロン酸またはムチン成分、それらの両方を上記溶媒に必要に応じて加熱しながら溶解または懸濁させ、滅菌して注射剤容器に充填密封することにより行う。また、注射剤には、必要に応じて懸濁化剤、安定剤、緩衝剤、保存剤、防腐剤、増粘剤、等張化剤、水溶性または水膨潤性高分子、ｐＨ調整剤などを添加することもできる。
ヒアルロン酸を上記の溶媒に溶解してヒアルロン酸を含む製剤を調製する場合、ヒアルロン酸の濃度は、臨床応用でのハンドリングの容易な濃度を選択すればよく、例えば、０．１〜５重量パーセント、好ましくは０．２〜２重量パーセントとする。
また、ムチン成分を上記の溶媒に溶解してムチン成分を含む製剤を調製する場合、ムチン成分の濃度は、同様に臨床応用でのハンドリングの容易な濃度を選択すればよく、例えば、ムチン量として０．００１〜２０重量パーセント、好ましくは０．０１〜１重量パーセントとする。
ヒアルロン酸とムチン成分を混合して含む単一の製剤を調製する場合は、ヒアルロン酸とムチン成分をそれぞれ上記の溶媒に溶解した液を、適当な量比（例えば１：１）で混和することによって調製する。従って、最終的に調製される組み合わせ製剤中のヒアルロン酸の含量は０．１〜１重量パーセント、ムチン成分の含量は０．００５〜１重量パーセントとなる。混和は、数時間から十数時間程度ゆるやかに攪拌することによって行うことが好ましい。
本発明の組み合わせ製剤の投与量は、臨床上用いられている投与量に準ずればよく、投与対象の年齢、体重、疾患の種類や症状、投与方法、投与期間などにより適宜選択することができる。例えば、変形性関節症の患者（成人、体重約６０ｋｇ）の場合、ヒアルロン酸及びムチン成分として、それぞれ１回約５〜１００ｍｇ、好ましくは約１０〜５０ｍｇを１週間毎に関節内へ連続投与する。また、本発明の組み合わせ製剤中のヒアルロン酸及びムチン成分はともに一定期間内の分解や代謝によりその成分が失われるので、一定期間、例えば１週間から１０日の間隔で数回以上継続して投与することが好ましい。一般的に１週間で患者により１０％〜５０％の成分が代謝消失することが予想されるので、例えば１週間おきに投与することを推奨する。
本発明の組み合わせ製剤の投与の方法は、ヒアルロン酸とムチン成分を実質上同時に投与する方法であればよく、例えば、前記のヒアルロン酸を含む製剤とムチン成分を含む製剤を、投与対象に対して完全に同時に投与してもよいし、短時間（好ましくは数分以内）に連続的に投与してもよい。さらに効果を最大限に高めるためには、ヒアルロン酸とムチン成分をあらかじめよく混和した製剤を投与することが好ましい。従って、本発明の組み合わせ製剤の投与形態には、例えば、（ａ）ヒアルロン酸とムチン成分とを同時に製剤化して得られる単一の製剤の投与、（ｂ）ヒアルロン酸とムチン成分とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の同一投与経路での同時投与、（ｃ）ヒアルロン酸とムチン成分とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の同一投与経路での時間差をおいての投与（例えば、ヒアルロン酸とムチン成分の順序での投与、あるいは逆の順序での投与）、（ｄ）ヒアルロン酸とムチン成分とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での同時投与、（ｅ）ヒアルロン酸とムチン成分とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での時間差をおいての投与態様が含まれる。
本発明の組み合わせ製剤による治療は、注入治療と切開手術等開放系での治療の両方を含む。投与は、局所投与が好ましく、例えば、損傷が起こっていると思われる膝関節、股関節、足関節、肘関節、顎関節、肩関節（肩関節腔、肩峰下滑液包、上腕二頭筋腱腱鞘）などの関節腔内また関節液内に注入する。
本発明の組み合わせ製剤により投与されたヒアルロン酸とムチン成分は、協同して軟骨生成促進作用、軟骨細胞増殖促進作用、軟骨細胞分化促進作用、軟骨基質産生促進作用、軟骨保護作用を発揮する。従って、本発明の組み合わせ製剤を哺乳動物（例、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、サル等）に対して投与することにより、上記作用に基づいて、関節疾患によって障害または欠損を受けた軟骨組織を機能的かつ生理学的に、適切な組織に修復及び再生することができる。本発明の組み合わせ製剤は、関節疾患、特には、関節軟骨の退化、変性、変形その他の異常に関連する疾患、例えば、変形性関節症、関節リウマチ、肩関節周囲炎、顎関節症などの治療、あるいは軟骨細胞移植等の再生医療実施時に用いることができる。
以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものでない。
（参考例）クラゲ由来の粗精製ムチンの調製
後記実施例で用いるクラゲ（ミズクラゲ、エチゼンクラゲ）由来の抽出物は以下の方法で調製した。冷凍状態にあるクラゲ個体を解凍後、水洗し、固形物と液体を遠心分離器で分離した。液体を除去して、残った固形部分をミキサーで５ｍｍ〜１ｃｍ四方程度の断片に切断し、水を加えて４℃で振とう抽出を行った。次いで４℃のまま１００００ｇで１５分間遠心分離した後、上澄みの抽出液を採取し、固形分を除去した。抽出液を攪拌しながら３倍容のエタノールを投入した後、冷蔵庫内に静置した。一晩静置した後、４℃のまま１００００ｇで、１５分間遠心分離を行い、生じたゲル状の沈殿物を採取し、上澄みを除去した。さらに、採取した沈殿物を少量の水に溶解し、４℃のまま１００００ｇで、１５分間遠心分離を行った。遠心分離後の上澄みを分離し、透析処理により精製し、凍結乾燥したものを粗精製ムチンとして得た。

正常な膝関節内への動物性ムチン型糖タンパク質投与による関節軟骨の変化、炎症の有無の確認
実験動物（ＪＷウサギ３ｋｇ）の正常な膝関節内に、動物性ムチン型糖タンパク質を投与した。動物性ムチン型糖タンパク質として、上記参考例で得られたミズクラゲ由来ムチン（ｑｎｉｕｍｕｃｉｎ）抽出物、エチゼンクラゲ由来ムチン（ｑｎｉｕｍｕｃｉｎ）抽出物を用いた。上記クラゲ由来ムチン抽出物（粗精製ムチン）の生理食塩水溶液（濃度０．１ｍｇ／ｍＬ，０．５ｍｇ／ｍＬ，１．０ｍｇ／ｍＬ）を調製し、これを投与した。短期の影響を調べるために、投与前、投与後１日目、投与後４日目の血液データ（ＷＢＣ，ＣＲＰ）を測定し、外観を観察した。下記表１に示すようにＷＢＣ、ＣＲＰともに大きな変化が見られず、膝関節の外観も異常がなかった。
また、長期の効果を調べるために４週間後に外観と関節内を肉眼的に観察したところ、外観には変化がなく、関節内も関節液の貯留は認められず、関節軟骨は正常に保たれていた。また明らかな滑膜の増生も認められなかった（図１）。関節軟骨をＨ−Ｅ染色及びトルイジンブルー（Ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ−Ｂｌｕｅ）染色によって組織学的に観察したところ、軟骨組織に変化は見られなかった（図２）。

人工的に損傷を起こした膝関節内への動物性ムチン型糖タンパク質とヒアルロン酸の併用投与による効果の確認
１．実験材料と方法
（１）試薬
動物性ムチン型糖タンパク質として、参考例で得られたミズクラゲ由来ムチン（ｑｎｉｕｍｕｃｉｎ）抽出物、エチゼンクラゲ由来ムチン（ｑｎｉｕｍｕｃｉｎ）抽出物を濃度１ｍｇ／１ｍＬで生理食塩水に溶解したものを用いた。なお、用いたクラゲ由来ムチン抽出物（粗精製ムチン）のエンドトキシン量は１０ＥＵ／ｍｌ以下であることをＥｎｄｏｓａｆｅ−ＰＴＳ（エンドセーフ社製、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｊａｐａｎ Ｉｎｃ．Ｋａｎａｇａｗａ，Ｊａｐａｎ）による簡易測定で事前に確認した。また、ヒアルロン酸として、治療用ヒアルロン酸水溶液（科研製薬 Ｋａｋｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．Ｌｔｄ．製品名アルツ１ｗｔ％，ヒアルロン酸の平均分子量は約８０万、濃度は２５ｍｇ／２５ｍＬ）を用いた。
（２）動物
日本白色家兎は、体重３ｋｇの雌を東京実験動物より購入した。家兎はＦＲＰ製ゲージ（Ｗ４５０×Ｈ４５０×Ｄ９００ｍｍ）に個別に収容して飼育した。
（３）変形性関節症（Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｅｓ：ＯＡ）モデル
ＯＡモデルとして、膝前十字靱帯損傷（ＡＣＬ−Ｔ）モデル［Ｍｏｓｋｏｗｉｔｚ Ｒ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ １６，ｐｐ．３９７−４０５（１９７３）；Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｆ．Ｇｌｉｍｃｈｅｒ，Ｍ．Ｊ．，Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．１４７，ｐｐ．２８７−９５（１９８０）；Ｋｏｒｋａｌａ Ｏ．ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｏｒｔｈｏｐ Ｓｃａｎｄ ５５，ｐｐ．２７３−２７７（１９８４）；Ｍｅｓｓｎｅｒ，Ｋ．，Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｍｅｃｈ ９，ｐｐ．３７−４３（１９９４）］を作製した。イソフルラン（フォーレン、ＡＢＢＯＴＴ ＪＡＰＡＮ Ｃｏ．，ＬＴＤ．Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）の吸入麻酔下で、無菌的にウサギの両側膝蓋骨内側に約３ｃｍの切開を加え、膝蓋骨と膝蓋腱を露出させた後、これらの内側から関節包を切開した。さらに、膝関節伸展位で膝蓋骨を外側に脱臼させ、膝関節を屈曲し前十字靱帯を直視下に切離した。その後、膝蓋骨を整復し、皮下筋層と皮膚をそれぞれナイロン糸で縫合した。
両側膝関節に前十字靱帯切除術を受けたウサギを、無作為に６つの群に分けた（下記表２）。対照群（Ａ群）には、生理食塩水を関節内投与した。ヒアルロン酸単独投与群（Ｂ群）には、ヒアルロン酸のみを関節内投与した。エチゼンクラゲ由来ムチン抽出物の単独投与群（Ｃ１群）には、エチゼンクラゲ由来ムチン抽出物と生理食塩水との混合液を関節内投与した。ミズクラゲ由来ムチン抽出物の単独投与群（Ｃ２群）には、ミズクラゲ由来ムチン抽出物と生理食塩水との混合液を関節内投与した。エチゼンクラゲ由来ムチン抽出物＋ヒアルロン酸の併用投与群（Ｄ１群）には、エチゼンクラゲ由来ムチン抽出物とヒアルロン酸との混合液を関節内投与した。ミズクラゲ由来ムチン抽出物＋ヒアルロン酸の併用投与群（Ｄ２群）には、ミズクラゲ由来ムチン抽出物とヒアルロン酸との混合液を関節内投与した。投与量は１回あたり計１ｍｌとした。Ａ群には、生理食塩水１ｍｌを投与した。Ｂ群には、ヒアルロン酸０．５ｍｌと生理食塩水０．５ｍｌとの混合液を投与した。Ｃ１，２群には、各クラゲ由来ムチン抽出物０．５ｍｌと生理食塩水０．５ｍｌとの混合液を投与した。Ｄ１，２群には、各クラゲ由来ムチン抽出物０．５ｍｌとヒアルロン酸０．５ｍｌとの混合液を投与した。
前十字靱帯切除術後、４週目から関節内投与を、４週目、５週目、６週目、７週目、８週目と計５回行った（図３）。関節内投与は、イソフルランの吸入麻酔下に、ウサギ膝関節の膝蓋骨外側上縁から２６Ｇ針の注射器（ＴＥＲＵＭＯ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ．Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて行った。さらに前十字靱帯切除術後１０週目に、ペントバルビタール塩（ネンブタール、Ｄａｉｎｉｐｐｏｎ Ｓｕｍｉｔｏｍｏ Ｐｈａｒｍａ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を用いて犠牲死した。
（４）関節軟骨の肉眼的評価と組織学的評価
術後１０週目に、ウサギを犠牲死直後に大腿骨膝関節部を確認した。ウサギ犠牲死後、両側膝関節部大腿骨を摘出し、４％中性緩衝ホルマリン液（ｐＨ７．４）にて固定した。固定したサンプルは、１０％エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（ｐＨ７．４）で脱灰し、パラフィンで包埋した。大腿骨顆部の矢状面でパラフィン切片を作製し、ｓａｆｒａｎｉｎ−Ｏ染色を行った。
軟骨変性の病理組織学的評価は、Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ：ｇｒａｄｉｎｇ ａｎｄ ｓｔａｇｉｎｇ［Ｐｒｉｔｚｋｅｒ，Ｋ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ．１４，ｐｐ．１３−２９（２００６）］を用いて行った。評価は、下記式によって算出したＯＡ スコア（ＯＡ ｓｃｏｒｅ）で数値化した。
ＯＡ スコア（１〜２４）＝軟骨変性の最も強い部位（ｇｒａｄｅ１〜６）×変性範囲（ｓｔａｇｅ１〜４）
２．結果
（１）肉眼的所見
Ａ群、Ｂ群、Ｃ１群、Ｃ２群、Ｄ１群、Ｄ２群の肉眼的観察結果を図４に示す。Ａ群では、内外側ともに軟骨下骨に至る高度の軟骨欠損が認められ、欠損は軟骨下骨に至っており、範囲は荷重面全域にわたっていた。Ｂ群では、内外側ともに軟骨表面の不整像が認められ、一部に軟骨下骨に至る軟骨欠損像が認められた。Ｃ１，２群においても、Ａ群同様、内外側に軟骨下骨に至る軟骨欠損が認められ、欠損範囲にも差異は認められなかった。Ｄ群では、内側に軟骨表面の不整像が認められたが、軟骨下骨の露出はなく、範囲もわずかであった。Ｄ群（ヒアルロン酸とムチン併用）をＢ群（ヒアルロン酸単独）と比較すると、Ｄ群ではＢ群に比べ軟骨欠損が軽微であった。クラゲの種類における差異はＣ，Ｄ群ともに認められなかった。
（２）組織学的検討
Ａ群、Ｂ群、Ｃ群、Ｄ群のｓａｆｒａｎｉｎ−Ｏ染色像を図５に示す。Ａ群は軟骨下骨の露出が認められ、軟骨欠損は軟骨下骨に達していた。Ｂ群では、軟骨の亀裂は深層に達し、ｔｉｄｅ ｍａｒｋより上層で染色性の低下が認められた。細胞配列は保たれておらず、細胞の減少も認められた。Ｃ群では、わずかに軟骨層の残存が認められたが、染色性はなく、軟骨細胞は消失していた。Ｄ群では、軟骨層の剥離が認められたが、亀裂はおおむね中間層までで、Ｂ群と比較して明らかに亀裂は浅かった。細胞配列も比較的保たれ、染色性の低下もＢ群に比べ軽度であった。肉眼的所見と同様にクラゲの種類による差異はなかった。
Ａ群、Ｂ群、Ｃ１群、Ｃ２群、Ｄ１群、Ｄ２群について軟骨変性の程度を示すＯＡ スコアの平均値を図６に示す。ＯＡ スコアの平均値は、Ａ群２２．００±４．００、Ｂ群１１．１７±４．６５、Ｃ１群１８．６７±１．１５、Ｃ２群１８．００±０．００、Ｄ１群４．３３±４．１６、Ｄ２群７．００±２．６５であった。Ａ群とＣ群との間に有意差はなく、Ａ群、Ｃ群とＢ群との間、Ｂ群とＤ群との間、Ｃ群とＤ群間に有意差（＊：Ｐ＜０．０５）が認められた。クラゲの種類における差異はＣ，Ｄ群ともに認められなかった。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書に組み入れるものとする。

本発明は、関節疾患の治療及び緩和、関節軟骨再生のための医薬製造分野において利用できる。
［配列表］

Claims (5)

1. 関節疾患の治療においてヒアルロン酸と動物性ムチン型糖タンパク質を同時に、別々に、又は順次に投与するための組み合わせ製剤であって、該動物性ムチン型糖タンパク質が、下記式（Ｉ）：
   Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ （Ｉ）
   （式中、ＸａａはＶａｌ又はＩｌｅである。）
   で示されるアミノ酸配列からなる繰り返し単位を３〜２０００回含む繰り返し構造を有し、該繰り返し構造中の全Ｔｈｒ残基のうち５０％以上のＴｈｒ残基に対して糖鎖が結合していることを特徴とする、上記組み合わせ製剤。
2. 動物性ムチン型糖タンパク質がクラゲからの抽出物である、請求項１に記載の組み合わせ製剤。
3. ヒアルロン酸と動物性ムチン型糖タンパク質が異なるまたは同一の製剤に含まれていることを特徴とする、請求項１または２に記載の組み合わせ製剤。
4. 注射剤である、請求項１〜３のいずれかに記載の組み合わせ製剤。
5. 関節疾患の治療が、関節軟骨の修復及び再生である、請求項１〜４のいずれかに記載の組み合わせ製剤。