JP5629423B2 - 野生型及び変異型mt−sp1による、vegf及びvegf受容体の切断 - Google Patents
野生型及び変異型mt−sp1による、vegf及びvegf受容体の切断 Download PDFInfo
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Description
本発明を詳細に説明する前に、本明細書で使用するいくつかの用語を定義する。
治療剤によるヒトの疾患の治療は、大抵の場合、細胞プログラムに特定の改変を加えるために、小分子を使用し、又はインシュリン、EPO等のタンパク質を供給することを含む。開発中の重要な新たなクラスの治療剤は、疾患関連分子を標的化するような新たな基質特異性を有するように設計されたクラスのプロテアーゼである。現在、重要な細胞表面分子を攻撃するように特異性がプログラムされたプロテアーゼの三次元構造を決定する方法がいくつか開発されている。標的様ペプチドと複合体形成する設計型プロテアーゼに関する構造データは、特異性を決定する直接的相互作用及び第2殻側鎖相互作用を理解するための基盤を与える。三次元構造とプロテアーゼの活性及び特異性との相関関係は、学問的に興味深く、また、臨床的にも長期に渡って関心を集めてきた。本発明は、改変された特異性を有するプロテアーゼの活性における第2殻部位の改変の重要性を示し、更に、新規のMT−SP1変異体、及びそれらを使用して疾患を治療する方法を提供する。例えば、Perona、et al.(1995)Biochemistry34(5):1489〜99を参照のこと。
血管内皮成長因子(VEGF)は、特異的細胞表面受容体(VEGFR)と結合し、それを介してシグナル伝達を行い、血管新生を制御するサイトカインである。血管新生は、新しい血管が既存の脈管構造から生じるプロセスである。病的血管新生は、疾患に伴う増大した血管新生のことであり、固形腫瘍の増殖[McMahon、Oncologist.2000;5 Suppl 1:3〜10]、黄斑変性、糖尿病等の事象を含む。癌において、固形腫瘍は、増殖及び転移のために、絶えず増大する血液供給を必要とする。低酸素血症又は腫瘍形成突然変異は、腫瘍及び周囲の間質細胞中のVEGF及びVEGFRのmRNAのレベルを増大させ、既存の血管の伸長、及び新しい血管網の形成を引き起こす。湿潤型黄斑変性では、異常な血管が黄斑の下に増殖形成される。これらの血管は、黄斑に血液及び体液を漏出し、光受容体細胞を損傷する。糖尿病では、眼への血液の欠如が失明を引き起こす可能性もある。眼の周辺の毛細血管の増殖がVEGFで刺激されると、正確に機能しない異常な血管が生じる。
・タンパク質分解を受けやすいアミノ酸の不安定領域
・ヒト、ラット及びマウス種間の高い配列同一性
・切断時のシグナル伝達の下方制御
・リガンドと非生産的に結合可能な可溶性受容体のタンパク質分解による生成
本発明は、所定の基質配列の標的タンパク質を切断するMT−SP1プロテアーゼ、及び特定の変異体を生成させ、スクリーニングする方法、並びに、それらを使用して疾患を治療する方法を提供する。プロテアーゼは、標的タンパク質中のアミノ酸又はアミノ酸基質配列を認識するタンパク質分解酵素である。基質配列を認識することによって、プロテアーゼは標的タンパク質中のペプチド結合の加水分解又は切断を触媒する。標的タンパク質のこのような加水分解は、標的配列の完全長配列の状態で、ペプチド結合の位置に応じて、標的タンパク質を不活性化させることができる。MT−SP1プロテアーゼの特異性は、タンパク質工学によって改変することができる。1つ又は複数のタンパク質中の基質配列を認識するようにプロテアーゼを設計する場合、(i)それは、ペプチド結合の加水分解を触媒して、標的タンパク質を不活性化させることによって、その機能を改変し、また、(ii)標的タンパク質は、特定の1つ又は複数の疾患に関する分子介入地点となり、設計型プロテアーゼは、タンパク質分解媒介型不活性化を通じて治療効果を生じる。特に、MT−SP1プロテアーゼは、膜貫通ドメインとサイトカイン又は成長因子結合ドメインとの間の特定の標的受容体を切断するように設計することが可能である。それによって、タンパク質受容体と細胞の表面又はループ領域とを結合させるように働くストーク領域が、ポリペプチド鎖中の球状ドメインから分離される。
MT−SP1を含むほぼ全ての態様のプロテアーゼは、酵素基質の配列特異性、熱安定性、pHプロファイル、触媒効率、酸化安定性、及び触媒機能を含めて再設計することができる。
セリンプロテアーゼ基質認識部位を、Schecter及びBerger Biochem、Biophys.Res.Commun.27(1967)157〜162の方法に従って標識する。標識番号は、切断性結合のN末端側基質アミノ酸に関してはP1、P2、...Pnと、切断性結合のN末端側基質アミノ酸に関してはP1’、P2’、...Pn’と増大する。酵素上の対応する基質認識ポケットは、Sn...S2、S1、S1’、S2’、...Sn’と標識する。従って、例えば、P2はS2と、P1はS1と、P1’はS1’と相互作用する。
所定のサブサイト(S1〜S4)の、所定のアミノ酸に対する基質選好性を改変するために、結合ポケットの内側に位置する構造決定因子を個別に、又は組み合わせて変異させる。異なる各メンバーが、互いに異なる特異性、及び1つ又は複数の互いに異なる変異を有する、得られるプロテアーゼ変異体のセット、並びにコード配列及びそれを生成する発現ベクターは、本発明の重要な態様を構成する。本発明の一実施形態では、ポケットの内側に位置する残基を、20個の候補アミノ酸の各々に変異させる飽和突然変異誘発技術を用いる。Kunkleの方法(In:Current Protocols in Molecular Biology、Ausubel et al.(eds.)John Wiley and Sons、Inc.、Media Pa.)を用いて、これを実施することができる。簡潔には、所望のコドンで無作為化NNS又はNNKを含む突然変異誘発オリゴヌクレオチドプライマーを合成する。プライマーを一本鎖DNA鋳型にアニーリングさせ、DNAポリメラーゼを加えて、鋳型の相補系を合成する。連結後、二本鎖DNA鋳型を大腸菌に導入して増幅する。或いは、市販の標準的な部位特定的変異導入キット(QuikChange(Stratagene)等)を使用して、1アミノ酸置換を施す。他の一実施形態では、MT−SP1の部位特異的アミノ酸変異の方法として当分野で一般に知られている任意の方法を用いて、VEGF、VEGFR、又は他の標的タンパク質を切断する変異体を同定するためにスクリーニングすることができる、本発明のMT−SP1変異体のセットを調製することができる。
一実施形態では、活性形でプロテアーゼを発現させる。他の実施形態では、不活性、酵素原形でプロテアーゼを発現させる。一実施形態では、大腸菌、Pichia pastoris、S.cerevisiae、バキュロウイルス発現系等の異種発現系によって、プロテアーゼを発現させる。好ましい実施形態では、哺乳動物の細胞培養物発現系において、プロテアーゼを発現させる。哺乳動物の細胞培養物としては、ラット、マウス、又は、好ましくはヒト細胞に由来するものが挙げられる。タンパク質は細胞内環境で発現させることができ、また、培地中に排出(分泌)することができる。プロテアーゼは、in vitro発現系で発現させることもできる。
多くの方法を用いて、本発明のペプチド及びライブラリーを調製することができることを、当業者は理解しているであろう。適切な実施形態を実施例3に更に示す。
本発明の方法を用いて生成するMT−SP1変異体中の必須アミノ酸は、当分野で知られている方法、例えば、活性部位残基の部位特定的変異導入若しくは飽和突然変異誘発、又は本明細書に開示する方法、に従って同定する。一方法では、特異性の重要な決定因子であることが示されているS1〜S4ポケットを形成する残基を、単独で、又は組み合わせて候補アミノ酸に変異させる。例えば、Legendre、et al.、JMB(2000)296:87〜102を参照のこと。得られる変異体の基質特異性は、ACCポジショナルスキャニングライブラリーを使用して、また、1基質動態アッセイによって決定する。例えば、Harris、et al.PNAS、2000、97:7754〜7759を参照のこと。
S1’:146、151
S1:189、190、226、191、195
S2:99、41、57、58、59、60、61、62、63、97、98、100、102
S3:192、218、146
S4:171、174、179、180、215、99、172、175、97、98、169、170、171A、173、176、177、178、181、224、217
本発明のプロテアーゼ変異体及びプロテアーゼライブラリーは、本明細書に記載の1つ又は複数のプロテアーゼのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。本発明は、そのプロテアーゼ活性及び生理機能を依然として保持しながら、MT−SP1と比較して、MT−SP1の対応する残基と異なる残基を有する変異型プロテアーゼ、及びそれらの機能断片も提供する。好ましい実施形態では、本発明のMT−SP1変異体の変異は、本明細書で詳細に説明するプロテアーゼのS1〜S4領域内で起こる。
2個のアミノ酸配列又は2個の核酸の相同率を決定するために、配列を、それらの重なりが最適化されるようにアラインメントする(例えば、第2のアミノ酸又は核酸配列との最適アラインメントのために、第1のアミノ酸又は核酸配列の配列中にギャップを導入することができる)。次いで、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置のアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第1配列中の位置が第2配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占められているとき、それらの分子はその位置において相同的である(すなわち、本明細書において、アミノ酸又は核酸の「相同性」は、アミノ酸又は核酸の「同一性」に等しい)。
本発明は、プロテアーゼキメラ又は融合タンパク質も提供する。本明細書で使用するプロテアーゼ「キメラタンパク質」又は「融合タンパク質」は、非プロテアーゼポリペプチドと作動可能に連結したプロテアーゼポリペプチドを含む。「プロテアーゼポリペプチド」は、本明細書に記載のMT−SP1等のスキャフォールドの1つ、又はMT−SP1スキャフォールドの変異体の1つに対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指し、他方、「非プロテアーゼポリペプチド」は、スキャフォールドの1つと実質的に相同ではないタンパク質、例えば、そのスキャフォールドと異なり、かつ、同種又は異種の生物に由来するタンパク質、に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。プロテアーゼ融合タンパク質内では、プロテアーゼポリペプチドは、親の、又はスキャフォールドプロテアーゼタンパク質全体又はその一部分に対応する可能性がある。一実施形態では、プロテアーゼ融合タンパク質は、プロテアーゼタンパク質の少なくとも1つの生物学的に活性な一部分を含む。他の実施形態では、プロテアーゼ融合タンパク質は、プロテアーゼタンパク質の少なくとも2つの生物学的に活性な一部分を含む。更に他の実施形態では、プロテアーゼ融合タンパク質は、プロテアーゼタンパク質の少なくとも3つの生物学的に活性な一部分を含む。融合タンパク質内では、用語「作動可能に連結した」は、プロテアーゼポリペプチド及び非プロテアーゼポリペプチドが互いにインフレームで融合することを示すことを指す。非プロテアーゼポリペプチドは、プロテアーゼポリペプチドのN末端又はC末端と融合させることができる。
本発明は更に、プロテアーゼアゴニスト(すなわち、模倣体)又はプロテアーゼアンタゴニストとして機能する、プロテアーゼタンパク質の変異体に関する。プロテアーゼタンパク質の変異体は、突然変異誘発(例えば、プロテアーゼタンパク質の離散的な点変異又は切断)によって生成させることができる。プロテアーゼタンパク質のアゴニストは、天然に存在する形のプロテアーゼタンパク質の生物学的活性とほぼ同じ活性、又はその一部を有する。例えば、アゴニストプロテアーゼは、タンパク質内の基質配列を切断することによって、標的タンパク質(例えば、細胞表面受容体)を活性化させる。プロテアーゼタンパク質のアンタゴニストは、例えば、プロテアーゼタンパク質と同じ標的タンパク質を切断することによって、天然に存在する形のプロテアーゼタンパク質の1つ又は複数の活性を阻害することができる。従って、限られた機能の変異体で処理することによって、特異的な生物学的効果を誘導することができる。一実施形態では、天然に存在する形のタンパク質の生物学的活性の一部を有する変異体を用いた個体の治療は、天然に存在する形のプロテアーゼタンパク質を用いた治療と比較して、個体における副作用が少ない。
血管内皮成長因子(VEGF)及びその受容体によるシグナルは、癌における病的血管新生及び腫瘍脈管構造の急速な発達に関与する。このシグナル経路を遮断する薬剤は腫瘍血液供給の増大及び維持を妨げ、全身的な腫瘍の死を引き起こす。転移性大腸癌を有する患者における抗VEGF抗体AVASTIN(商標)の近年の成功により、VEGFが、癌の抗血管新生療法における標的となることが確認されている。これらの有望な結果にも関わらず、依然として、腫瘍の進行が抗VEGF治療において発生している。VEGF機能に影響を与える抗体の機構、及び抗体がどのようにして腫瘍増殖を妨げるかの機構は知られていない。ノックダウンの実験は、VEGF機能を阻害すると、血管新生が阻害されることを示す。従って、VEGFR−2を介した血管新生シグナルの阻害は、新規の標的性を有する設計型プロテアーゼを開発する上で理想的な開発途上の治療分野である。
プロテアーゼと組み合わせた各治療用MT−SP1又は他の治療剤の、逐次的或いはほぼ同時の投与は、経口経路、静脈内経路、筋肉内経路、及び粘膜組織を介した直接的な吸収だけには限られないが、これらを含む任意の適切な経路によって影響を受ける可能性がある。MT−SP1等の治療剤は同じ経路によって、或いは異なる経路によって投与することができる。
本発明の化合物は個別に投与するか、或いは適切な同時配合剤形で同時配合する。併用療法で使用する化合物を含む化合物を、薬剤として許容可能な塩又は医薬組成物の形で患者に投与する。医薬組成物の形で投与する化合物は、治療有効量が組成物中に存在するように、適切な担体又は賦形剤と混合させる。用語「治療有効量」は、所望の終点(例えば、癌に伴う症状の低下)を得るのに必要とされる化合物の量を指す。
セリンプロテアーゼMT−SP1を、VEGF及びVEGFRの特異的タンパク質分解に対する突然変異誘発用のスキャフォールドプロテアーゼとして選択した、これは部分的には、セリンプロテアーゼMT−SP1が生化学的及び構造技術[Harris、Recent Results Cancer Res.1998;152:341〜52]を用いて十分に特徴付けされているためである。
表11に示すように、変異型MT−SP1ポリペプチド(「変異体」)は、ポリペプチド当たり1個の変異を含む可能性があり、或いは任意の組合せで2個以上の変異残基を含む可能性がある。
(固定P1アミノ酸法)
個々のP1置換Fmoc−アミノ酸ACC−樹脂(約25mg、0.013mmol)を、Multi−Chem96ウエル反応装置のウエルに加えた。樹脂含有ウエルはDMF(0.5mL)を用いて溶媒化した。20%ピペリジンを溶かしたDMF溶液(0.5mL)を加え、次に30分間撹拌した。反応ブロックのウエルを濾過し、DMF(3×0.5mL)で洗浄した。無作為のP2位を導入するために、Fmoc−アミノ酸(4.8mmol、10当量/ウエル;Fmoc−アミノ酸、mol%:Fmoc−Ala−OH、3.4;Fmoc−Arg(Pbf)−OH,6.5;Fmoc−Asn(Trt)−OH、5.3;Fmoc−Asp(O−t−Bu)−OH、3.5;Fmoc−Glu(O−t−Bu)−OH、3.6;Fmoc−Gln(Trt)−OH、5.3;Fmoc−Gly−OH、2.9;Fmoc−His(Trt)−OH、3.5;Fmoc−Ile−OH、17.4;Fmoc−Leu−OH、4.9;Fmoc−Lys(Boc)−OH、6.2;Fmoc−Nle−OH、3.8;Fmoc−Phe−OH、2.5;Fmoc−Pro−OH、4,3;Fmoc−Ser(O−t−Bu)−OH、2.8;Fmoc−Thr(O−t−Bu)−OH、4.8;Fmoc−Trp(Boc)−OH、3.8;Fmoc−Tyr(O−t−Bu)−OH、4.1;Fmoc−Val−OH、11.3)の等張性混合物(Ostresh、J.M.、et al.、(1994)Biopolymers34:1681〜9)を、DICI(390μL、2.5mmol)、及びHOBt(340mg、2.5mmol)をDMF(10mL)に溶かしたものを用いて事前に活性化させた。溶液(0.5mL)を各ウエルに加えた。反応ブロックは3時間撹拌し、濾過し、DMF(3×0.5mL)で洗浄した。無作為のP3及びP4位を同じ方法で導入した。P4アミノ酸のFmocを除去し、DMF(3×0.5mL)で樹脂を洗浄し、AcOH(150μL、2.5mmol)の0.5mLキャッピング溶液、HOBt(340mg、2.5mmol)及びDICI(390μL、2.5mmol)をDMF(10mL)に溶かしたもので処理した。4時間の撹拌後、樹脂をDMF(3×0.5mL)、CH2Cl2(3×0.5mL)で洗浄し、95:2.5:2.5のTFA/TIS/H2Oの溶液で処理した。1時間のインキュベートの後、反応ブロックを開き、96ディープウエルのタイタープレートに置き、ウエルは他の切断溶液(2×0.5mL)で洗浄した。回収プレートを濃縮させ、基質含有ウエルはEtOH(0.5mL)で希釈し、2回濃縮した。個々のウエルの含有物は、CH3CN:H2O混合物から凍結乾燥させた。各ウエル中の基質の合計量は、1種の基質の収率に基づいて0.0063mmol(50%)であると見積もって推定した。
Fmoc−Clで7−アミノクマリン−4−酢酸を処理することによって、7−アミノクマリン−4−酢酸を調製した。7−アミノクマリン−4−酢酸(10.0g、45.6mmol)とH2O(228ml)を混合させた。NaHCO3(3.92g、45.6mmol)を少量加え、次にアセトン(228ml)を加えた。溶液は氷浴で冷却し、Fmoc−Cl(10.7g、41.5mmol)を1時間の行程で撹拌しながら加えた。氷浴を除去し、溶液は一晩撹拌した。アセトンは回転蒸発によって除去し、生成したゴム状の固体は濾過によって回収し、ある程度の量のヘキサンで洗浄した。リンクアミドAM樹脂と7−Fmoc−アミノクマリン−4−酢酸の縮合によって、ACC−樹脂を調製した。リンクアミドAM樹脂(21g、17mmol)はDMF(200ml)を用いて溶媒化した。混合物は30分間撹拌させ、濾過用カニューレを用いて濾過し、20%ピペリジンを溶かしたDMF(200ml)を加えた。25分間撹拌した後、樹脂を濾過しDMF(3回、各々200ml)で洗浄した。7−Fmoc−アミノクマリン−4−酢酸(15g、34mmol)、HOBt(4.6g、34mnol)、及びDMF(150ml)を加え、次にジイソプロピルカルボジイミド(DICI)(5.3ml、34mmol)を加えた。混合物は一晩撹拌し、濾過し、洗浄し(DMF、3回、200ml;テトラヒドロフラン、3回、200ml;MeOH、3回、200ml)、P2O5で乾燥させた。Fmoc分析により測定して、樹脂の置換レベルは0.58mmol/g(>95%)であった。
個々のP1置換Fmoc−アミノ酸ACC−樹脂(〜25mg、0.013mmol)を、MultiChem96ウエル反応装置のウエルに加えた。樹脂含有ウエルはDMF(0.5mL)を用いて溶媒化した。濾過後、20%ピペリジンを溶かしたDMF溶液(0.5mL)を加え、次に30分間撹拌した。反応ブロックのウエルを濾過し、DMFで洗浄した(0.5mLで3回)。無作為のP2位を導入するために、Fmoc−アミノ酸[4.8mmol、10当量/ウエル;Fmoc−アミノ酸、mol%:Fmoc−Ala−OH、3.4;Fmoc−Arg(Pbf)−OH,6.5;Fmoc−Asn(Trt)−OH、5.3;Fmoc−Asp(O−t−Bu)−OH、3.5;Fmoc−Glu(O−t−Bu)−OH、3.6;Fmoc−Gln(Trt)−OH、5.3;Fmoc−Gly−OH、2.9;Fmoc−His(Trt)−OH、3.5;Fmoc−Ile−OH、17.4;Fmoc−Leu−OH、4.9;Fmoc−Lys(Boc)−OH、6.2;Fmoc−Nle−OH、3.8;Fmoc−Phe−OH、2.5;Fmoc−Pro−OH、4,3;Fmoc−Ser(O−t−Bu)−OH、2.8;Fmoc−Thr(O−t−Bu)−OH、4.8;Fmoc−Trp(Boc)−OH、3.8;Fmoc−Tyr(O−t−Bu)−OH、4.1;Fmoc−Val−OH、11.3]の等張性混合物を、DICI(390μL、2.5mmol)、及びHOBt(340mg、2.5mmol)をDMF(10ml)に溶かしたものを用いて事前に活性化させた。溶液(0.5ml)を各ウエルに加えた。反応ブロックは3時間撹拌し、濾過し、DMFで洗浄した(0.5mlで3回)。無作為のP3及びP4位を同じ方法で導入した。P4アミノ酸のFmocを除去し、DMFで樹脂を洗浄し(3×0.5mL)、AcOH(150μL、2.5mmol)の0.5mLキャッピング溶液、HOBt(340mg、2.5mmol)、及びDICI(390μL、2.5mmol)をDMF(10ml)に溶かしたもので処理した。4時間の撹拌後、樹脂をDMF(0.5mlで3回)、CH2Cl2(0.5mlで3回)で洗浄し、95:2.5:2.5のTFA/TIS/H2Oの溶液で処理した。1時間のインキュベートの後、反応ブロックを開き、96ディープウエルのタイタープレートに置き、ウエルは他の切断溶液で洗浄した(0.5mlで2回)。回収プレートを濃縮させ、基質含有ウエル中の物質はEtOH(0.5ml)で希釈し、2回濃縮した。個々のウエルの含有物は、CH3CN/H2O混合物から凍結乾燥させた。各ウエル中の基質の合計量は、1種の基質の収率に基づいて0.0063mmol(50%)であると見積もって推定した。
ミリグラム量のP1置換ACC樹脂は、記載する方法によって合成することができる。Fmoc−アミノ酸置換ACC樹脂は96ウエルの反応ブロックの57ウエル中に置き:サブライブラリーは19アミノ酸の第2の固定位置(P4、P3、P2)によって示した(システインは削除し、ノルロイシンはメチオニンで置換した)。基質の合成、キャッピング、及び切断は、P2、P3及びP4サブライブラリーに関するもの以外、前項に記載のものと同じであり、等張性混合物ではなく、個々のアミノ酸(5当量のFmoc−アミノ酸モノマー、5当量のDICI、及び5当量のHOBtをDMFに溶かしたもの)を、空間的に示すP2、P3又はP4位に導入した。
P1別種ライブラリー:
A(i).合成:
前に示したのと同様のP1別種ライブラリーを合成した。種々のMT−SP1変異体の特異性を、野生型MT−SP1と比較して特徴付けた。
タンパク質分解酵素の濃度を、280nmにおいて測定した吸光度によって決定した(Gill、S.C.、et at.、(1989)Anal Biochem 182:319〜26)。触媒活性を有するトロンビン、プラスミン、トリプシン、uPA、tPA、及びキモトリプシンの割合を、MUGB又はMUTMACを用いた活性部位の滴定により定量化した(Jameson、G.W.、et al.、(1973)Biochemical Journal 131:107〜117)。
全アミノ酸が基質配列中のP1部位に結合する可能性を試験するために、P1別種テトラペプチドライブラリーを作製した。P1別種ライブラリーは、システインが除かれ、ノルロイシンが含まれる全アミノ酸として、P1位のみが系統的に一定に保たれている20ウエルからなる。P2、P3及びP4位は、ウエル当たり合計6,859基質配列の全アミノ酸の等モル混合物からなる。いくつかのセリン及びシステインプロテアーゼをプロファイリングして、最適P1アミノ酸の同定における、このライブラリーの適用可能性を試験した。キモトリプシンは、大きな疎水性アミノ酸に対する予想された特異性を示した。トリプシン及びトロンビンは、P1塩基性アミノ酸(Arg>Lys)に対する選好性を示した。プラスミンも、塩基性アミノ酸(Lys>Arg)に対する選好性を示した。P1−Asp特異性を有する唯一の知られている哺乳動物セリンプロテアーゼであるグランザイムBは、他の酸性アミノ酸、Gluを含む全ての他のアミノ酸中のアスパラギン酸に対して異なる選好性を示した。ヒト好中球エラスターゼに関するP1プロファイルは、アラニン及びバリンに対する標準的な選好性を有する。システインプロテアーゼ、パパイン及びクルザインは、これらの酵素に関して知られている広範囲のP1基質配列特異性を示したが、アルギニンに対する適度な選好性が存在する。MT−SP1野生型プロテアーゼは、Arg又はLysを好んだ。
P1一定テトラペプチドライブラリーを、前に開示したのと同様に作製する。P1一定ライブラリーは、システインが除かれ、ノルロイシンが含まれる全アミノ酸として、P1位のみが系統的に一定に保たれている20ウエルからなる。P2、P3及びP4位は、ウエル当たり合計6,859基質配列の全アミノ酸の等モル混合物からなる。いくつかのセリン及びシステインプロテアーゼをプロファイリングして、最適P1アミノ酸の同定における、このライブラリーの適用可能性を試験した。MT−SP1は、P1におけるアミノ酸Arg及びLysを好む。
P1−Arg固定PSSCLライブラリーをDMSO中に再懸濁させ、ウエル当たり5〜10ナノモルの濃度で不透明黒色の96ウエルプレート中に配列させる。変異型プロテアーゼは、5nM〜5μMの濃度で50mMのトリスpH8、50mMのNaCl、及び0.01%のTween20(MTSP活性化バッファー)中に希釈する。100マイクロリットルのプロテアーゼ溶液を各ウエルに加え、Spectramax蛍光プレートリーダー(Molecular Devices)を使用して、ACC脱離基の蛍光を380nmでの励起及び460nmでの発光によって測定する。P4〜P2伸長サブサイトの各々における変異型プロテアーゼの特異性は、P4〜P2PSSCライブラリー中の各配列アミノ酸の蛍光性によって測定する。
ファージミドを、(i)M13ファージの形態形成に必要な全ての遺伝子を有し、(ii)ファージの複製起点と相互作用して、一本鎖DNAの生成を開始させるパッケージシグナルを有し、(iii)破壊されたファージの複製起点を有し、(iv)アンピシリン耐性遺伝子を有する、ように構築する。
VEGF受容体2(VEGF−R2/KDR)のポリペプチド配列を、細胞外(配列番号8)及び細胞内(配列番号9)ドメインの各配列について表12に示す。MT−SP1の天然のP4〜P1基質特異性とほぼ一致する配列は太字で示す。2つの配列、すなわち、箱で囲った配列RVRK、及び二重下線を引いた配列RRVRは、L172D及び野生型MT−SP1の認識プロファイルと合致する。
マウスIgG(3〜10μg)のFcドメインと融合したVEGF−R2の精製細胞外ドメインは、MTSP活性化バッファー(20μL)に再懸濁させる。変異型プロテアーゼは100nM〜1μMの最終濃度に加える。反応混合物を37℃で1〜2時間インキュベートし、更に、SDS−PAGE電気泳動によって分離させる。クマシーブルー染色、銀染色、及び/又はウエスタンブロットによってバンドを目に見える状態にする。
ヒト臍帯血管内皮細胞(HUVEC)をCambrexから購入し、2%のウシ胎児血清(FCS)及び抗真菌薬−抗生物質を含む完全なサプリメントを有するEBM−2(内皮細胞基本培地、Cambrex)中で培養した。生存アッセイ用に、一晩96ウエルプレートで、EBM−2中に2×105細胞/mlの密度で細胞を平板培養した。翌日、24時間でDMEM+10%のFCSと培地を交換することによって、細胞を血清枯渇状態にした。次いで、プロテアーゼを10〜1000nMの種々の濃度で加え、プロテアーゼの存在下で2時間、細胞をインキュベートした。VEGFを20ng/mLの最終濃度で加え、細胞は72時間インキュベートした。その72時間の最後に、製造者のプロトコールに従ってMTTアッセイ(Sigma)によって細胞数を測定した。
急性最大許容量を測定するために、漸増量の精製した野生型及び変異型MTSPを、C57BL/6マウスに静脈内注射した。マウスは毒性及び死の外見的徴候を観察した。
血管新生以外に、VEGFは血管の浸透も誘導し、周辺組織への流体の漏出を引き起こす。VEGF誘導型の血管透過はマイルスアッセイを使用して測定した。簡潔には、ヌード(無胸腺)マウスに、尾部静脈注射によって0.5%のエバンスブルー色素(100uL、PBS中、Sigma)を注射した。色素注射後1時間で、100ngのVEGFを20uLのPBSに溶かしたものを、マウスの背面の2点に皮内注射した。色素の漏出によるVEGF注射部位における青い斑点の出現によって、血管透過を目に見える状態にする。青い斑点の領域を測定することによって半定量的に、血管透過の程度を測定することができる。それらが血管透過を阻害したかどうかを決定するために、野生型MT−SP1及び変異体を、色素注射の直後に種々の用量で腹腔内注射し、血管透過の量は色素漏出の領域を測定することによって決定した。
ネズミルイス肺癌(LLC)細胞を、C57BL/6マウスの背面正中線上、或いはDMEM/10%FCS/ペニシリン/ストレプトマイシン(PNS)/L−グルタミン中に継代する。T241ネズミ線維肉腫はDMEM/10%FCS/PNS/L−グルタミン中で増殖させ、ヒト膵臓BxPc3腺癌はRPMI培地1640/10%FCS/PNS中で増殖させる。腫瘍細胞(106)は、ネズミ腫瘍に関してはC57BL/6マウス(8〜10週齢)の背面正中線、ヒト腫瘍に関しては重症複合免疫不全(SCID)マウスに皮下注射し、100〜200mm3に増殖させて(典型的には10〜14日間)腫瘍摂取を実証し、109pfuのプロテアーゼコードアデノウイルス又は対照アデノウイルスAdFcを静脈内注射によって尾部静脈に投与する。式0.52×長さ(mm)×幅(mm)(長さの短い方を幅とする。)を使用することによって、10〜14日間のカリパス測定によってmm3の腫瘍サイズを計算する。例えば、Kuo et al.、PNAS、2001、98:4605〜4610を参照のこと。一定でない分散をとる両側t検定(マイクロソフトエクセル)を使用することによって、P値を測定した。
図1に示すように、スキャフォールドプロテアーゼ及び変異体を、酵母菌又は細菌発現系において多数のミリグラム量、活性プロテアーゼとして首尾良く発現させた。例えば、Harris1998及びTakeuchi、2000に記載のプロトコールを参照のこと。MT−SP1を設計して、Flk−1/KDRを選択的に切断する変異体を得た。
RRVR標的切断配列に対する増大した選択性を示すPSSCLプロファイルによって、多数の変異体を特徴付けした(図2A〜H)。それらは、どのサブサイト:P2又はP3及びP4プロファイルが変異によって最も影響を受けたかに基づいて、2つのサブクラスに分けた。Ala、Ile、及びValへのPhe99の変異は、Valに対するプロテアーゼのP2選択性を増大させ、基質を含むAlaの特異性を低下させた。この影響は、変異体F99VMT−SP1(CB38)、及びF99I/L172D/Q175DMT−SP1(CB159)において見られる(図2C及びD)。Phe99からTrp、Asn、Asp、Ala、又はArg等の変異は、基質を含むAla、Ser、Trp、Lys及びIleに対するP2選択性を増大させた。P2選択性に影響を与えた他の変異は、Met80からGlu及びAla、並びにTrp215からTyr及びPheであった。
基質ライブラリーによって決定した、所望の特異性プロファイルが一致する変異型プロテアーゼを、所望の切断配列に対応する個々のペプチド基質を使用してアッセイして、選択性の変化の程度を決定した。2つの基質:Ac−RRVR−AMC及びAc−RQAR−AMCを表した。基質のプロファイリングによって決定した第2の配列、RQARがMT−SP1の好ましい配列である。それは更に完全長プロテアーゼ中の配列と一致し、プロテアーゼ活性化のために切断されるはずである。
例えば、基質ライブラリーによって決定した、所望の特異性プロファイルが一致する変異型プロテアーゼを、所望の切断配列に対応する個々のペプチド基質を使用してアッセイする。個々の運動定数測定は、Spectra−Max Delta蛍光計(Molecular Devices)を使用して行う。各プロテアーゼは、アッセイバッファー中に50nM〜1μMで希釈する。全てのACC基質はMeSOで5μM〜500μMに希釈し、一方、AMC[DEFINED]基質は20μM〜2000μMに希釈する。各アッセイは、5%未満のMeSOを含む。合計10分間、それぞれ380nm及び460nmの励起波長及び発光波長で、15秒毎に酵素活性を調べる。全てのアッセイは1%のDMSO中で行う。
変異型プロテアーゼをアッセイして、それらは完全長タンパク質の状態で存在すると所望の配列を切断することを確かめ、標的タンパク質の活性をアッセイして、その機能が切断事象によって損なわれたことを確認する。精製完全長タンパク質と変異型プロテアーゼのインキュベーション後に、SDS−PAGEによって切断事象を調べる。タンパク質は標準的なクマシーブルー染色を使用して、放射標識タンパク質を使用するオートラジオグラフィーによって、又は適切な抗体を使用するウエスタンブロットによって目に見える状態にする。或いは、標的タンパク質が細胞表面受容体である場合、その標的タンパク質を発現する細胞を変異型プロテアーゼに曝す。細胞を溶かし、SDS−PAGEによってタンパク質を分離し、更に、ウエスタンブロットによる視覚化によって切断事象を調べる。或いは、タンパク質分解によって放出される可溶性受容体をELISAにより定量化する。
血管内皮成長因子(VEGF)は、胚形成及び成人期中に通常生成される内皮細胞特異的マイトジェンである。VEGFは、腫瘍成長を含む種々の正常及び病的プロセスにおける血管新生の、重要なメディエーターである。3個の高親和性同族VEGF受容体:VEGFR−1/Flt−1、VEGFR−2/KDR、及びVEGFR−3/Flt−4が同定されている。
125I−VEGFR(40,000cpm)は種々の濃度のプロテアーゼと共にインキュベートし、サンプルはSDS−PAGEサンプルバッファー中で煮沸し、12%ポリアクリルアミドゲル上で調べる。ゲルは乾燥させ、−70℃においてx線フィルム(Kodak)に曝す。
125I−VEGFR又はPMNを、前と同様に種々の濃度のプロテアーゼと共にインキュベートする。プロテアーゼに曝した125I−VEGFRと通常のPMNの結合、又は通常の125I−VEGFRとプロテアーゼに曝したPMNの結合は、シンチレーションを使用して定量化する。簡潔には105個の細胞を、プロテアーゼ阻害剤の存在下において96ウエルフィルタープレート(Millipore)中で、種々の濃度の125I−VEGFRと共にインキュベートする。細胞を真空吸引によって3回洗浄し、30μLのシンチレーション流体(Wallac)を各ウエルに加える。(van Kessel et al.、J.Immunol.(1991)147:3862〜3868及びPorteau et al.、JBC(1991)266:18846〜18853から適合させた)Wallac Microbetaシンチレーションカウンターで、シンチレーション数を計数する。
MT−SP1及びトリプシンの活性を、高濃度のウシ胎児血清の存在下においてアッセイした。血清中に存在する高濃度のマクロ分子プロテアーゼ阻害剤は、それをプロテアーゼがin vivoで活性化されるかどうかを試験するための優れたin vitro系にする。MTSP及びトリプシンは、100μLの最終体積中に高血清濃度(0〜10%)で、それぞれ100nM及び80nMでダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)中に再懸濁させた。蛍光ペプチド基質(Leu−Val−Arg−アミノメチルクマリン)を15μMの最終濃度まで加え、380nmの励起波長及び460nmの発光波長で、蛍光プレートリーダー(Molecular Devices)において蛍光を検出した。
特定の実施形態を本明細書で詳細に開示してきたが、これは、単なる例示目的で行ったものであり、添付の特許請求の範囲の限定を目的とするものではない。特に、特許請求の範囲により定義される本発明の精神及び範囲から逸脱せずに、種々の代用、変更及び修飾を本発明に施すことが可能であることは、本発明者が想定するところである。スクリーニング法、プロテアーゼスキャフォールド、又はライブラリー形式の選択は、本明細書に記載の実施形態に関する知識を有する当業者には日常的なことであると考えられる。他の態様、利点、及び変更形態は、特許請求の範囲内にあると考えられる。
Claims (8)
- スキャフォールド膜型セリンプロテアーゼ−1(MT−SP1)ポリペプチド中に少なくとも1個の変異を有する変異型MT−SP1プロテアーゼであって、
変異型MT−SP1ポリペプチドの基質特異性はスキャフォールドMT−SP1ポリペプチドと比較して改変されており、
改変された基質特異性は、変異型MT−SP1ポリペプチドが配列RQARに比べて配列RRVRにより高い選択性を示し、その結果、血管内皮成長因子受容体(VEGFR)の切断活性が増大する、というものであり、
スキャフォールドMT−SP1ポリペプチドは、野生型MT−SP1又はその触媒活性部分のアミノ酸配列と少なくとも95%又は完全に同一のアミノ酸の配列を含み、ここで、野生型MT−SP1のアミノ酸配列は配列番号1の配列であり、触媒活性部分のアミノ酸配列は配列番号18の配列であり、
変異型MT−SP1は、アミノ酸位置41、58、59、60b、60c、61、62、63、97、98、100、146、151、169、170、172、173、175、176、177、178、179、181及び224から選択される位置に変異を有し、ここで、位置のナンバリングはキモトリプシンのナンバリングに従う、
変異型MT−SP1プロテアーゼ。 - MT−SP1スキャフォールドポリペプチドは野生型MT−SP1であり、ここで、野生型MT−SP1のアミノ酸配列は配列番号1の配列である、請求項1に記載の変異型MT−SP1プロテアーゼ。
- MT−SP1スキャフォールドポリペプチドは野生型MT−SP1の触媒活性部分であり、ここで、触媒活性部分のアミノ酸配列は配列番号18の配列である、請求項1に記載の変異型MT−SP1プロテアーゼ。
- D60bI、D60bF、D60bR、D60bA、R60cI、R60cF、R60cD、R60cA、R60cW、F97N、F97D、F97E、F97A、F97W、F97R、Y146F、Y146N、Y146D、Y146E、Y146A、Y146W、Y146R、L172N、L172D、L172E、L172A、L172V、L172F、L172R、Q175D、Q175E、Q175A、Q175V、Q175F、Q175R、K224A、K224F、K224V及びK224Dから選択される変異を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の変異型MT−SP1プロテアーゼ。
- D60bI、D60bF、D60bR、D60bA、R60cI、R60cF、R60cD、R60cA、R60cW、F97N、F97D、F97E、F97A、F97W、F97R、F99Y、F99W、F99N、F99D、F99E、F99A、F99V、F99R、Y146F、Y146N、Y146D、Y146E、Y146A、Y146W、Y146R、L172N、L172D、L172E、L172A、L172V、L172F、L172R、Q175D、Q175E、Q175A、Q175V、Q175F、Q175R、M180E、M180Y、M180R、M180A、Q192A、Q192V、Q192D、Q192R、Q192F、W215F、W215Y、W215I、W215D、W215R、D217A、D217V、D217F、D217E、D217R、K224A、K224F、K224V及びK224Dから選択される変異を含む、請求項4に記載の変異型MT−SP1プロテアーゼ。
- L172D/Q175D、F99V/L172D、F99V/L172D/Q175D、F99V/K224F、F99V/Y146D、Y146D/K224F、Y146D/L172D/Q175D、F99V/Y146D/L172D/Q175D、F99I/L172D/Q175D、F99L/L172D/Q175D、F99T/L172D/Q175D、F99A/L172D/Q175D、F99I/K224F、F99L/K224F、F99T/K224F、F99V/Y146D/K224F、F99I/Y146D/K224F、F99L/Y146D/K224F及びF99T/Y146D/K224Fから選択される変異を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の変異型MT−SP1プロテアーゼ。
- 野生型膜型セリンプロテアーゼ−1(MT−SP1)又はその触媒活性部分中に変異を有する変異型MT−SP1プロテアーゼであって、
野生型MT−SP1のアミノ酸配列は配列番号1の配列であり、触媒活性部分のアミノ酸配列は配列番号18の配列であり、
変異は、F99Y、F99W、D217A、D217V、D217F、F99N、F99D、F99E、F99A、F99V、F99R、D217E、D217R、W215F、W215Y、W215I、W215D、W215R、Q192A、Q192V、Q192D、Q192R、Q192F、M180E、M180Y、M180R、M180A及びF99V/M180Eから選択され、ここで、位置のナンバリングはキモトリプシンのナンバリングに従い、
変異型MT−SP1プロテアーゼは血管内皮成長因子(VEGF)又はVEGF受容体(VEGFR)を切断する、
変異型MT−SP1プロテアーゼ。 - 請求項1〜7のいずれか一項に記載の変異型MT−SP1プロテアーゼを含む組成物。
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