JP5627569B2 - 新規基質に基づくpet造影剤 - Google Patents
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Description
本出願は、2008年4月30日に出願された米国仮特許出願番号61/049392の利益を主張するものである。
Yは、結合又は連結基であり;
RLは、放射性標識であり;
Subは、ペプチド基質であり;
CPVは、細胞透過性ベクターであり;
Zは、キャッピング基であり;
m、n、p及びsは、独立して、0〜4であり;
tは、0又は1であり;そして
uは、1又は2である。)
本出願の標識化基質において、基質は細胞透過性ベクターに共有結合的に付着しており、基質は、更に、放射性核種を含有する部位とカップリングしている。カップリングプロセスは、アミドに基づく共役化学、オキシムカップリング、又は「クリック化学」結合(即ち、1,4−又は1,5−二置換1,2,3−トリアゾール)によって生じ得る。これらクリック化学由来化合物類は、本明細書に開示の方法を用いて、容易に調製されて放射性標識化される。
Yは、結合又は連結基であり;
RLは、放射性標識であり;
Subは、ペプチド基質であり;
CPVは、細胞透過性ベクターであり;
Zは、キャッピング基であり;
m、n、p及びsは、独立して、0〜4であり;
tは、0又は1であり;そして、
uは、1又は2である。)
本明細書には、細胞透過性ベクター及び放射性標識化タグの両方を含有してなる基質が記載されている(図1)。本明細書に提示される理論に束縛されるものではないが、細胞透過性ベクターは、基質を細胞内に輸送するのを助けると考えられる。一旦、基質が細胞内に入ると、プロテアーゼは、基質と反応して細胞透過性ベクターを切り離す。遊離ベクターは、細胞から自由に拡散する。しかしながら、基質は、放射性標識に結合しており、細胞不透過性となって、細胞内に捕捉されて留まる。
定義:
本明細書において特に断りのない限り、用いられる用語の定義は、有機合成及びペプチド合成並びに薬学の技術分野において用いられる標準的な定義である。
クリック化学によって、化学者らには、候補造影剤のライブラリを迅速に製造する可能性が与えられ、それにより、最適な薬理学的特性と薬物動態学的特性とを備える可能性のあるPET撮像用小分子トレーサを特定することができる。クリック化学は、最も実用的で信頼性のある化学転換のみを利用する、モジュール方式の化学合成法である。クリック化学法は、例えば次の文献に記載されており、これら全体を参照として本明細書に組み込む。
Yは、結合又は連結基であり;
RLは、放射性標識であり;
Subは、ペプチド基質であり;
CPVは、細胞透過性ベクターであり;
Zは、キャッピング基であり;
m、n、p及びsは、独立して、0〜4であり;
tは、0又は1であり;そして、
uは、1又は2である。
Xは、ペプチド基質のN−末端に結合した結合又は連結基であり;
Yは、結合又は連結基であり;
RLは、放射性標識であり;
Subは、ペプチド基質であり;
CPVは、細胞透過性ベクターであり;
Zは、キャッピング基であり;
m、p及びsは、独立して、0〜4であり;
nは、0であり;
tは、1であり;そして、
uは、1である。
Xmは、結合又はX2X3X4であり、ここで、X2は、(C1〜10)アルキレニル基、アリール基又はヘテロアリール基であり、X3は、ヘテロアリール基又は−C=N−O−であり、X4は、(C1〜10)アルキレニル基であり、ここで、(C1〜10)アルキレニル炭素原子のうち一つは、−CO−、−CONR”−、−NR”CO−、−NR”−、−O−又は−S−で置換されていてもよく;
Yは、結合又は連結基であり;
RLは、11C及び18Fからなる群から選択される放射性標識であり;
Subは、−DEVD−、−DEVDD−、−DNLD−、−DQTD、−DMQD−、−YVDA−、−YEVD−、−LEVD−、−LEHD−、−DQMD−、VDQQD−、−VDVDA−、−VEID−、−VQVD−、−YVADGW−、−VDVAD−、−VDVADGW−、−RGVDQQDGKNHW−、−GVDQQDGKNW、−VDQQDGKNW−、−DQQDGKNW−、−QQDGKNW−、−VDQQDGKW−、−VDQQDGW−、−VDQQDW−、−WEHD−、−YVAD−、−AEVD−、−IETD−、−AEVD−、−VEHD−、−XEXDAMC−、−DEVDAMC−、−VEHDAMC−、−VADFMK−、−YEVDGW−、−LEVDGW−、−VDQMDGW−、−VDVADGW−、−VQVDGW−、VDQVDGW−、−DEVDAMC−、−VD−fmk−、−VAD−fmk−、−YVAD−fmk−、−ID−fmk−、LD−fmk、−FD−fmk−、−AD−fmk−、−GD−fmk−、−KD−fmk−、−ED−fmk−及び−DEVDAFC−からなる群から選択されるペプチド基質であり;
CPVは、ポリエチレンイミン、PEG、PEI−PEG、PEG−PEI、Lys4、ポリアミン類、ヒスチジル化ポリ−L−リジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、カチオン性リポソーム及び脂質、糖類誘導体並びにポリリジンからなる群から選択され;
Zは、キャッピング基であり;
pは、0〜4であり;
nは、0であり;そして、
sは、1である。
Xmは、X2X3X4であり、ここで、X2は、−(CH2)2−であり、X3はトリアゾールであり、X4は、−CH2C(O)−であり;
Yは、−AlaNH−であり;
RLは、18Fであり;
Subは、−DEVD−であり;
CPVは、(−CH2CH2O−)4であり;
Zは、−CH2CH2CO2Hであり;
nは、0であり;そして、
sは、1である。
Xは、ペプチド基質のN−末端に結合した結合又は連結基であり;
Yは、結合又は連結基であり;
RLは、放射性標識であり;
Subは、ペプチド基質であり;
CPVは、細胞透過性ベクターであり;
Zは、キャッピング基であり;
m、p及びnは、独立して、0〜4であり;そして、
sは、0である。
Xmは、X2X3X4であり、ここで、X2は、C1〜C6アルキレンであり、X3は、ヘテロアリール基であり、X4は、(C1〜10)アルキレニル基であり、前記(C1〜10)アルキレニル炭素原子のうち一つは、−CO−で置換されていてもよく;
Yは、結合又は連結基であり;
RLは、18Fであり;
Subは、−DEVD−、−DEVDD−、−DNLD−、−DQTD、−DMQD−、−YVDA−、−YEVD−、−LEVD−、−LEHD−、−DQMD−、VDQQD−、−VDVDA−、−VEID−、−VQVD−、−YVADGW−及び−VDVAD−からなる群から選択されるペプチド基質であり;
CPVは、ポリエチレンイミン、PEG、PEI−PEG、PEG−PEI、Lys4、ポリアミン類、ヒスチジル化ポリ−L−リジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、カチオン性リポソーム及び脂質、糖類誘導体並びにポリリジンからなる群から選択され;
Zは、キャッピング基であり;
pは、0〜4であり;
nは、1であり;そして、
sは、0である。
Xmは、X2X3X4であり、ここで、X2は、C1〜C6アルキレンであり、X3は、ヘテロアリール基であり、X4は、(C1〜10)アルキレニル基であり、ここで、(C1〜10)アルキレニル炭素原子のうち一つは、−CO−で置換されていてもよく;
Yは、結合又は連結基であり;
RLは、18Fであり;
Subは、−DEVD−、−DEVDD−、−DNLD−、−DQTD、−DMQD−、−YVDA−、−YEVD−、−LEVD−、−LEHD−、−DQMD−、VDQQD−、−VDVDA−、−VEID−、−VQVD−、−YVADGW−及び−VDVAD−からなる群から選択されるペプチド基質であり;
CPVは、ポリエチレンイミン、PEG、PEI−PEG、PEG−PEI、Lys4、ポリアミン類、ヒスチジル化ポリ−L−リジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、カチオン性リポソーム及び脂質、糖類誘導体並びにポリリジンからなる群から、独立して、選択され;
Zは、キャッピング基であり;
pは、0〜4であり;
nは、1であり;そして、
sは、1である。
(a)前記のうちいずれか一つの造影剤を前記患者に投与し;
(b)ポジトロン断層撮影法(PET)及び単一光子放出型コンピュータ断層撮影法(SPECT)からなる群から選択される放射線画像法を利用して、前記体内又はその一部における前記造影剤の分布を視覚化する
ことからなる、方法が提供される。
(a)前述の化合物及び組成物のうちいずれかを前記患者に投与し;
(b)ポジトロン断層撮影法(PET)及び単一光子放出型コンピュータ断層撮影法(SPECT)からなる群から選択される放射線画像法を利用して、前記体内又はその一部における前記化合物の分布を視覚化することからなる方法が含まれる。
スキームA:クリック化学による放射性標識化トレーサ合成の一般的な合成法
スキームB:クリック化学による放射性標識化トレーサ合成の一般的な合成法
スキーム1
10mLの丸底フラスコに2−アジド酢酸(50mg、0.48ミリモル)のTHF(2mL)溶液を入れて、それを室温でEDC(1−[3−(ジメチルアミノ)プロピル]−3−エチルカルボジイミド)(92mg、0.48ミリモル)、HOBt(1−ヒドロキシ−1H−ベンゾトリアゾール)5mg、0.48ミリモル)で処理して、2時間撹拌した。2時間後、化合物4(250mg、0.161ミリモル)のジメチルホルムアミド(DMF)(2mL)溶液及びDIPEA(N,N−ジイソプロピルエチルアミン、0.14mL、0.8ミリモル)を室温で加えて、12時間撹拌した。反応物を濃縮し、酢酸エチルで洗浄して、生成物を白色固体として得た。前記生成物(250mg、0.152ミリモル)を入れた0℃の10mL丸底フラスコに、4MのHClジオキサン溶液(3mL)を加えた。温度を室温まで上げて、2.5時間撹拌した。反応完了後、ジオキサンを除去し、残渣をH2Oに溶解し、HPLCで精製して、化合物5を白色固体として得た(84mg、52%)。
化合物6の合成:
磁気撹拌子を装備した5mL丸底フラスコにMeOH:H2O(1:1、1mL)を入れ、そこに化合物5(14mg、0.013ミリモル)及び5−フルオロペンタ−1−イン(2mg、0.026ミリモル)を入れた。この溶液にCuSO4(0.3mg、0.001ミリモル)及びアスコルビン酸ナトリウム(0.5g、0.003ミリモル)を加えて、2時間撹拌した。MeOHを蒸発させて、残渣をH2Oに溶解し、HPLCで精製して、生成物6を白色固体として得た(9mg、60%)。
実施例2:
スキーム2
10mLの丸底フラスコに2−(((9H−フルオレン−9−イル)メトキシ)カルボニルアミノ)酢酸(140mg、0.47ミリモル)のDCM(ジクロロメタン)(3mL)溶液を入れて、それを室温でEDC(90mg、0.47ミリモル)、HOBt(60mg、0.47ミリモル)で処理して2時間撹拌した。2時間後、化合物7(100mg、0.311ミリモル)のDCM(1mL)溶液及びDIPEA(0.08mL、0.47ミリモル)を室温で加えて、3時間撹拌した。反応物をシリカゲルで濃縮し、溶出液としてEtOAc:ヘキサン(1:1)を用いてシリカゲルで精製精製して、化合物8を白色固体として得た(178mg、95%)。
化合物10の合成
10mLの丸底フラスコに化合物8(178mg、0.297ミリモル)のDCM(5mL)溶液を入れて、それを室温で4−メチルピぺリジン(0.07mg、0.593ミリモル)で処理して2時間撹拌し、そして溶媒を蒸発させて、残渣をエーテルで2〜3回洗浄して、次の工程に使用した。10mLの丸底フラスコに化合物9(180mg、0.417ミリモル)のDCM(3mL)溶液を入れて、それを室温でEDC(80mg、0.417ミリモル)、HOBt(60mg、0.417ミリモル)で処理して、2時間撹拌した。2時間後、アミン(105mg、0.278ミリモル)のDCM(1mL)溶液及びDIPEA(0.07mL、0.417ミリモル)を室温で加えて、12時間撹拌した。反応物をシリカゲルで濃縮し、溶出液としてEtOAc:MeOH(95:5)を用いてシリカゲルで精製して、化合物10を白色固体として得た(119mg、35%)。
化合物11の合成:
10mLの丸底フラスコに化合物10(119mg、0.1ミリモル)のDCM(2mL)溶液を入れて、それを室温において4−メチルピぺリジン(0.1mg、1.0ミリモル)で処理して2時間撹拌し、溶媒を蒸発させて、残渣をエーテルで2〜3回洗浄して、次の工程に使用した。10mLの丸底フラスコにアジド酸(20mg、0.189ミリモル)のDCM(2mL)溶液を入れて、室温でEDC(40mg、0.189ミリモル)、HOBt(30mg、0.189ミリモル)で処理して、2時間撹拌した。2時間後、アミン(95mg、0.09ミリモル)のDCM(1mL)溶液及びDIPEA(0.03mL、0.189ミリモル)を室温で加えて、12時間撹拌した。反応物をシリカゲルで濃縮し、溶出液としてMeOH:DCM(1:9)を用いてシリカゲルで精製して、化合物11を白色固体として得た(83mg、81%)。
化合物12の合成:
磁気撹拌子を装備した5mLの丸底フラスコにTHF(1mL)を入れ、そこに化合物11(41mg、0.038ミリモル)と5−フルオロペンタ−1−イン(6mg、0.078ミリモル)を入れた。この溶液にCuI(0.7mg、0.004ミリモル)及びDIPEA(0.007mL、0.04ミリモル)を加えて、2時間撹拌した。THFを蒸発させて、次の工程で使用した。前記生成物(44mg、0.041ミリモル)を入れた0℃の5mL丸底フラスコに、4MのHClジオキサン(1mL)溶液を加えた。温度を室温まで上げて、2時間撹拌した。反応完了後、ジオキサンを除去し、残渣をH2Oに溶解し、HPLCで精製して、生成物を白色固体として得た(15mg、39%)。
実施例3:
スキーム3
Fmoc(9−フルオレニルメトキシカルボニル)で保護したL−セリン(286mg、0.747ミリモル)のDCM(1ml)溶液に、HOBt(101mg、0.747ミリモル)及びEDC(143mg、0.747ミリモル)を加えた。20分後、NH2−d(PEG)4−O−tBu化合物7(200mg、0.622ミリモル)及びDIPEA(121mg、0.933ミリモル)を加えた。反応物を室温で2時間撹拌し、そして濃縮した。その後、残渣をシリカゲルカラム(EtOAc:ヘキサン=4:1)に注入して、無色のオイル状化合物13を得た(310mg、0.451ミリモル、収率72.5%)。
化合物14の合成:
化合物13(310mg、0.451ミリモル)を4−メチルピぺリジン(224mg、2.26ミリモル)及びDCM(2ml)に溶解した。混合物を室温で2時間撹拌した。反応物を濃縮し、MeCN(X2)と共蒸発させて、残留4−メチルピぺリジンを全て除去した。反応混合物をシリカゲルカラム(EtOAc、続いてMeOH:DCM=1:3)で精製して、無色のオイルとして化合物14を得た(200mg、0.430ミリモル、収率95%)。
化合物15の合成:
化合物9(85mg、0.098ミリモル)のDMF溶液(0.5ml)に、HOBt(14.5mg、0.108ミリモル)及びEDC(20.6mg、0.108ミリモル)を加えた。反応物を室温で20分間撹拌した、その後、化合物14(50mg、0.108ミリモル)をDIPEA(0.026ml、0.147ミリモル)のDCM(0.500ml)溶液とともに加えた。得られた混合物を室温で更に2時間撹拌した。反応物を濃縮し、シリカゲルカラムで精製(MeOH:DCM=15:85)して、化合物15を得た(111mg、0.085ミリモル、収率86%)。
化合物17の合成:
化合物15(111mg、0.085ミリモル)をDCM(3ml)に溶解した。この混合物に4−メチルピぺリジン(41.9mg、0.423ミリモル)を加えた。得られた混合物を室温で30分間撹拌した。混合物を真空下に濃縮して、脱保護された中間体を得た。この2−(4−(3−フルオロプロピル)−1H−1,2,3−トリアゾール−1−イル)酢酸16(27.4mg、0.147ミリモル)のDMF(2ml)溶液に、HOBt(19.81mg、0.147ミリモル)及びEDC(28.1mg、0.147ミリモル)を加えた。20分後、この混合物に前記の脱保護された中間体(80mg、0.073ミリモル)のDMF(1ml)溶液及びDIPEA(0.026mg、0.147ミリモル)を加えた。反応物を室温で15時間撹拌した。反応物を濃縮して、再度真空乾燥した。この残渣に、TFA(トリフルオロ酢酸):TIS(トリイソプロピルシラン):水(比率、95:2.5:2.5、10ml)を加えた。30分後、反応物を濃縮し、水に溶解して濾過し(0.45μm)、HPLCで精製して、生成物を得た(20mg、0.020ミリモル、収率27.8%)。
実施例4:
スキーム4
Fmocで保護したL−アラニン(246mg、0.747ミリモル)のDCM(1ml)溶液に、HOBt(101mg、0.747ミリモル)及びEDC(143mg、0.747ミリモル)を加えた。反応物を室温で20分間撹拌した。この反応物に、NH2−d(PEG)4−OtBu(200mg、0.622ミリモル)及びDIPEA(121mg、0.933ミリモル)を加えた。反応物を更に2時間撹拌した。その後、混合物を濃縮して、シリカゲルカラム(EtOAc:ヘキサン=4:1)で精製して、化合物18を得た(240mg、0.390ミリモル、収率62.7%)。
化合物19の合成:
化合物18(240mg、0.390ミリモル)をDCMに溶解して、4−メチルピぺリジン(194mg、1.95ミリモル)を室温で加えた。反応物を一晩撹拌した。この反応物を濃縮して、シリカゲルカラムで精製(EtOAc、続いてMeOH:DCM=1:3)して、無色のオイルとして化合物19を得た(110mg、0.280ミリモル、収率71.8%)。
化合物20の合成:
化合物9(100mg、0.116ミリモル)のDMF(1ml)溶液に、HOBt(17.2mg、0.127ミリモル)及びEDC(24.4mg、0.127ミリモル)を加えた。反応物を室温で20分間撹拌した。化合物19(50mg、0.127ミリモル)をDCM(1.0ml)に加え、次いで、DIPEA(22.5mg、0.174ミリモル)を加えた。反応物を室温で一晩撹拌した。その後、得られた混合物を濃縮して、シリカゲルカラムで精製(MeOH:DCM=1:9)して、化合物20を得た(100mg、0.081ミリモル、収率69.6%)。
化合物21の合成:
化合物20(100mg、0.081ミリモル)をDCM(1ml)に溶解した。この溶液にピぺリジン(343mg、4.03ミリモル)を加えた。2時間後、反応物を真空下に濃縮して、脱保護された中間体を得た。2−(4−(3−フルオロプロピル)−1H−1,2,3−トリアゾール−1−イル)酢酸(29.4mg、0.157ミリモル)のDCM(1ml)溶液に、HOBt(21.2mg、0.157ミリモル)及びEDC(30.1mg、0.157ミリモル)を加えた。反応混合物を室温で20分間撹拌した。この混合物に、前記脱保護された中間体(80mg、0.078ミリモル)のDMF(1.00ml)溶液及びDIPEA(0.027mg、0.157ミリモル)を加えた。反応物を室温で一晩撹拌した。この反応混合物を真空下に濃縮した。残渣に、TFA:TIS:水(比率、95:2.5:2.5、10ml)を加えた。30分後、反応物を濃縮して、水に溶解し、濾過(0.45μm)して、HPLCで精製して、化合物21を得た(30mg、0.031ミリモル、収率39.7%)。
放射性標識化化合物21用前駆体の合成
スキーム5
化合物20(95mg、0.077ミリモル)をDCM(1ml)に溶解した。この溶液にピぺリジン(326mg、3.83ミリモル)を加えた。2時間後、反応物を真空下に濃縮して、脱保護された中間体を得た(78mg)。2−アジド酢酸のDCM(1mL)溶液(258mg、6重量%DCM溶液、0.153ミリモル)に、HOBt(20.7mg、0.153ミリモル)及びEDC(29.3mg、0.153ミリモル)を加えた。この混合物を室温で20分間撹拌した。この混合物に、前記の脱保護された中間体(78mg、0.077ミリモル)のDMF(1.00ml)溶液及びDIPEA(0.027mg、0.153ミリモル)を加えた。反応物を室温で30分間撹拌した。この混合物を真空下に濃縮し、水(15mL)で希釈した。白色固体沈殿物を濾過して乾燥して、化合物22を得た(71mg、0.064ミリモル、収率84%)。
化合物23の合成:
化合物22(120mg、0.109ミリモル)をTFA:TIS:水の混合物(比率、95:2.5:2.5、1.1ml)に加えた、室温で2時間撹拌してから、この反応物を濃縮し、そして水(5mL)に溶解して濾過し(0.45μm)、HPLCで精製して(フェノメネックスC−18ルナ(Phenomenex C−18 LUNA)、10%MeCN水溶液から40%MeCN水溶液へ傾斜的に変化、前記両方の溶出液中、0.05重量%のTFAを含む。)、化合物23を得た(80mg、0.091ミリモル、収率84%)。
質量分析(低分解能):C34H55N9O18の計算値,計算値:877.4,実測値:878.2(M+H)+。
実施例5:
スキーム6
丸底フラスコにアジド酢酸のDMF(6mL)溶液(1.185mg、0.293ミリモル、2.5%)を室温で入れて、そこにHATU(O−(7−アザベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N',N’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロリン酸塩)(67mg、0.176ミリモル)及び2,4,6−コリジン(35.5mg、0.293ミリモル)を加えた。反応物を室温で2時間撹拌した。次いで、この混合物に化合物24(220mg、0.117ミリモル)を加えた。LC/MSが反応完了を示すまで、反応物を室温で一晩撹拌した。この混合物を真空下に濃縮してから、EtOH(5mLで3回)で洗浄して、生成物を得た(160mg、収率80%)。
化合物26の合成:
化合物25(60mg、0.035ミリモル)をTFA:TIS:H2O=95:2.5:2.5の混合溶液(5mL)に溶解して、室温で2時間撹拌した。反応物を濃縮し、水に再度溶解し、濾過して、セミ分取HPLCで精製し、凍結乾燥して、生成物を得た(20mg、収率70%)。
化合物27の合成:
丸底フラスコに化合物26(14mg、0.012ミリモル)のMeOH(0.8mL)溶液を入れて、そこにCuSO4溶液(0.012mL、0.1M)、アスコルビン酸ナトリウム溶液(5μL、0.5M)及びフルオロペンチン1滴を加えた。LC/MSが反応完了を示すまで、反応物を室温で2時間撹拌した。反応物を濃縮し、水に再度溶解し、濾過して、セミ分取HPLCで精製し、凍結乾燥して、生成物を得た(10mg、収率66%)。
実施例6:
スキーム7
丸底フラスコに室温でペンタ−4−イン酸(15.68mg、0.16ミリモル)のDMF(5mL)溶液を入れ、そこにHATU(61mg、0.16ミリモル)及び2,4,6−コリジン(32mg、0.266ミリモル)を加えた。反応物を室温で45分間撹拌した。次いで、この混合物に化合物24(200mg、0.107ミリモル)を加えた。反応物を室温で3時間撹拌して、LC/MSが反応完了を示した。混合物を真空下に濃縮してから、水(5mLで3回)及びエーテル(5mLで3回)で洗浄して、生成物を得た(151mg、収率84%)。
化合物29の合成:
化合物28(38mg、0.022ミリモル)をTFA:TIS:H2O=95:2.5:2.5の混合溶液(2mL)に溶解し、室温で2時間撹拌した。反応物を濃縮し、水に再度溶解し、濾過して、セミ分取HPLCで精製し、凍結乾燥して、生成物を得た(24mg、収率94%)。
化合物30の合成:
バイアル瓶に、化合物29(15mg、0.013ミリモル)とフッ化アジドエチルのDMF溶液を加え、続いてCuSO4溶液(8μL、0.1M)及びアスコルビン酸ナトリウム溶液(8μL、0.2M)を加えた。2時間後、LC/MSは、出発原料が消費されたことを示した。その後、溶媒を蒸発させた。残渣をCANに溶解し、セミ分取HPLCを用いて精製し、凍結乾燥して、生成物が12mg得られた(収率75%)。
実施例7:
スキーム8
β−D−ガラクトース五酢酸(50g、0.12モル)のニトロメタン(200mL)溶液を、室温においてトリメチルシリルシアニド(TMSCN、15mL、0.21モル)及びBF3・OEt2(3mL、0.05モル)で処理した。この反応混合物を室温で1時間撹拌した。追加量のTMSCN(15mL、0.21モル)とBF3・OEt2(3mL、0.05モル)を加えて、室温で1時間撹拌した。揮発物を真空下に除去して、粗反応混合物を酢酸エチル(1L)に再度溶解して、NaHCO3溶液(250mLで2回)、水(500mLで1回)及びブライン(250mLで1回)で洗浄し、Na2SO4上で乾燥した。有機相を真空下に濃縮してその体積を半減し、0℃まで冷却して再結晶した。淡黄色固体を濾過してEtOAcで洗浄し、真空下に乾燥して、化合物31を得た(32g、0.08モル、収率75%)。
化合物32の合成:
水素化リチウムアルミニウム(17.7g、444ミリモル)をTHF(無水、75ml)に加えて懸濁液を形成した。化合物31(39.7g、111ミリモル)の無水THF(420ml)溶液を、この懸濁液に0℃で滴下漏斗から2時間かけて滴下して、淡黄色懸濁液を形成した。この混合物を室温に戻して一晩撹拌した。氷浴中で撹拌しながら、前記混合物にEtOH 80mLを滴加し、水酸化アンモニウム溶液(28〜30%水溶液)86mLを加えた。混合物を室温で2時間撹拌した。得られた混合物を濾過し、水(25mLで3回)及びジエチルエーテル(30mLで3回)で洗浄した。濾塊を減圧下、P2O5上で2日間乾燥して、無機塩と少量の水とを含む白色固体32を得た(約128g、純度16%、収率95%)。これを精製せずに次の工程へ移動させた。前記生成物は、そのD2O懸濁液を濾過した後、NMRで同定することができる。
化合物33の合成:
化合物32(132g、109ミリモル、純度16%)をNaHCO3の水溶液(10重量%、300mL)に溶解した。この混合物に氷浴温度でFmoc−Cl(26.5g、93ミリモル)のTHF(150mL)溶液を滴加した。滴下時間は1.5時間であった。滴下後、LC/MSは反応完了を示した。HCl(37%濃塩酸、90mL)をpHが3〜4に到達するまで滴下して、反応を停止した。懸濁液を真空下に濃縮してTHFを除去した。得られた粘稠懸濁液を高温のTHFで超音波を用いて洗浄した(250mLで5回)。液相を混合して真空下に濃縮して、白色固体粗生成物を得た(90g)。この粗生成物を高温のEtOAc(400mL)を用いて砕いて、水(50mL)及びジエチルエーテル(50mLで2回)で洗浄し、P2O5で一晩真空下に乾燥した後、所望の生成物33を白色固体として得た。(40g、106ミリモル、収率97%)。
化合物34の合成:
化合物33(1.65g、3.97ミリモル)をDCM(20ml)に溶解した。この溶液にピぺリジン(8mL、79ミリモル)を加えた。室温で3時間撹拌した後、反応物を真空下に濃縮し、MeCNと共蒸発させ、そして一晩凍結乾燥して、褐色固体34を得た(1.1g、4.0ミリモル、純度70%(1当量のピぺリジン炭酸塩を含む)、収率100%)。
化合物35の合成:
化合物34(300mg、1.087ミリモル)とN−Boc−L−アラニン活性化エステル(622mg、2.17ミリモル)のDMF(2ml)溶液に、DIPEA(0.568mL、3.26ミリモル)を加えた。反応物を室温で2時間撹拌した。この混合物をジエチルエーテル(50mL)で希釈した。不溶の残渣を単離し、水に溶解して、RP−HPLCで精製して、化合物35を得た(80mg、0.22ミリモル、収率20%)。
化合物36の合成:
化合物35(80mg、0.22ミリモル)にHCl(4Mのジオキサン溶液、2mL)を加えた。反応物を室温で3時間撹拌した。反応物を濃縮し、水に溶解し、凍結乾燥して、黄色固体36を得た(32mg、0.121ミリモル、収率55%)。
化合物37の合成:
化合物9(103mg、0.119ミリモル)、HOBt(15.3mg、0.114ミリモル)及びEDC(21.8mg、0.114ミリモル)をDMF(0.5mL)に溶解した。反応混合物を室温で30分間撹拌した。化合物36(30mg、0.116ミリモル)及びDIPEA(0.02mL、0.114ミリモル)のDMF(0.5mL)溶液を加えた。反応物を室温で5時間撹拌した。この混合物に水(20mL)を添加した。濾過によって白色沈殿物を回収して、化合物37を得た(120mg、0.112ミリモル、98%)。
化合物38の合成:
化合物37(100mg、0.09ミリモル)のDCM(5mL)溶液にピぺリジン(382mg、4.49ミリモル)を加えた。反応物を室温で2時間撹拌した。反応物を濃縮して、エーテル(30mL)に懸濁させた。濾過によって固体を回収した。粗生成物を水に溶解し、RP−HPLCで精製して、化合物38を得た(50mg、0.056ミリモル、収率63%)。
化合物39の合成:
アジド酢酸(349mg、0.224ミリモル、DCM中6重量%)、HOBt(15.2mg、0.112ミリモル)及びEDC(43mg、0.224ミリモル)を、室温でDCM(1mL)中で撹拌した。30分後、化合物38(50mg、0.056ミリモル)のDMF(1ml)溶液をDIPEA(0.02mL、0.112ミリモル)と共に加えた。反応物を室温で30分間撹拌してから、水で希釈して、HPLCで精製して、化合物39を得た(35mg、0.036ミリモル、収率64%)。
化合物40の合成:
化合物39(35mg、0.036ミリモル)にTFA/TIS/水(95:2.5:2.5、1mL)を加えた。反応物を室温で30分間撹拌した。反応物を濃縮し、水に再度溶解し、RP−HPLCで精製して、化合物40を得た(25mg、0.031ミリモル、収率86%)。
化合物41の合成:
化合物40(2mg、2.5マイクロモル)のMeOH(0.2ml)溶液にCuSO4(5滴、0.1M水溶液)、アスコルビン酸ナトリウム(3mg)及びフルオロペンチン(3滴)を加えた。反応物を室温で30分間撹拌した。反応物を濃縮して、HPLCで精製して、化合物41を得た(1.4mg、1.6マイクロモル、収率63%)。
実施例8:
スキーム9
丸底フラスコに室温で化合物9(300mg、0.346ミリモル)のDMF(5mL)溶液を入れ、そこへHATU(145mg、0.381ミリモル)及びDIPEA(0.181mL、1.038ミリモル)を加えた。反応物を室温で45分間撹拌した。その後、この混合物に2−アミノアセトアミド塩酸塩(38.3mg、0.346ミリモル)を加えた。反応物を室温で3時間撹拌すると、LC/MSが反応完了を示した。この混合物を真空下に濃縮した後、水(5mLで3回)とエーテル(5mLで3回)で洗浄して、生成物を得た(300mg、収率94%)。
化合物43の合成:
丸底フラスコに化合物42(300mg、0.325ミリモル)のDCM(5mL)溶液を入れ、そこへピぺリジン(0.161mL、1.625ミリモル)を加えた。一晩撹拌した後、LCMSが反応完了を示した。反応物を濃縮してピぺリジンを除去した。アセトニトリル(10mLを3回)を加えて共蒸発を促進した。残渣を2時間真空下に乾燥した。次いで、超音波を用いてエーテル(10mLで3回)で白色固体残渣を洗浄した。固体残渣を濾過し、一晩真空下に乾燥して、化合物43を得た(200mg、収率88%)。
化合物45の合成:
丸底フラスコに室温で化合物44(43mg、0.1ミリモル)のDMF(5mL)溶液を入れ、そこへHATU(42mg、0.11ミリモル)及びDIPEA(0.052mL、0.3ミリモル)を加えた。反応物を室温で1分間撹拌した。次いで、この混合物に化合物43(70mg、0.1ミリモル)を加えた。反応物を室温で4時間撹拌し、そしてLC/MSが反応完了を示した。この混合物を真空下に濃縮してから、水(5mLで3回)及びエーテル(5mLで3回)で洗浄して、生成物を得た(70mg、収率63%)。
化合物46の合成:
丸底フラスコに化合物45(65mg、0.058ミリモル)のDCM(3mL)溶液を入れ、そこへピぺリジン(0.029mL、0.292ミリモル)を加えた。4時間後に、LCMSが反応完了を示した。反応物を濃縮してピぺリジンを除去した。アセトニトリル(5mLを3回)を加えて共蒸発を促進した。残渣を2時間真空下に乾燥した。その後、超音波を用いて白色固体残渣をエーテル(5mLで3回)で洗浄した。固体残渣を濾過し、一晩真空下に乾燥して、化合物46を得た(46mg、収率88%)。
化合物47の合成:
丸底フラスコに室温でアジド酢酸(21mg、0.103ミリモル、50%THF溶液)のDMF(5mL)溶液を入れて、そこへHATU(41.3mg、0.109ミリモル)及びDIPEA(45μL、0.258ミリモル)を加えた。反応物を室温で2時間撹拌した。その後、この混合物に化合物46(46mg、0.052ミリモル)を加えた。反応物を室温で一晩撹拌して、LC/MSが反応完了を示した。この混合物を真空下に濃縮してから、EtOH(5mLで3回)で洗浄して、生成物を得た(40mg、収率80%)。
化合物48の合成:
化合物47(20mg、0.021ミリモル)をTFA:TIS:H2O=95:2.5:2.5の混合溶液(2mL)に溶解して、室温で2時間撹拌した。反応物を濃縮し、水に再度溶解して濾過し、セミ分取HPLCで精製し、そして凍結乾燥して、生成物を得た(11.5mg、収率69.5%)。
化合物49の合成:
丸底フラスコに化合物48(11.5mg、0.014ミリモル)のMeOH(0.8mL)溶液を入れて、そこへCuSO4溶液(0.014mL、0.1M水溶液)、アスコルビン酸ナトリウム溶液(6μL、0.5M)及びフルオロペンチン1滴を加えた。反応物を室温で2時間撹拌して、LC/MSが反応完了を示した。反応物を濃縮し、水に再度溶解し、濾過し、セミ分取HPLCで精製し、凍結乾燥して、生成物を得た(8mg、収率63%)。
実施例9:
スキーム10
化合物20(95mg、0.077ミリモル)をDCM(1mL)に溶解した。この溶液にピぺリジン(326mg、3.83ミリモル)を加えた。2時間後、反応物を真空下に濃縮して、脱保護された中間体(78mg)を得た。2−アジド酢酸(258mg、6重量%DCM溶液、0.153ミリモル)のDCM(1mL)溶液に、HOBt(20.7mg、0.153ミリモル)及びEDC(29.3mg、0.153ミリモル)を加えた。この混合物を室温で20分間撹拌した。この混合物に、前記脱保護された中間体(78mg、0.077ミリモル)のDMF(1.00ml)溶液及びDIPEA(0.027ml、0.153ミリモル)を加えた。反応物を室温で30分間撹拌した。この混合物を真空下に濃縮し、水(15mL)で希釈した。白色固体沈殿物を濾過し、乾燥して、RP−HPLCで精製して、化合物22を得た(71mg、0.064ミリモル、収率84%)。
化合物50の合成:
化合物22(10mg、9.1ミリモル)のMeOH(0.5ml)溶液に、CuSO4(5滴、0.1M水溶液)、アスコルビン酸ナトリウム(20mg)及びフルオロペンチン(2滴)を加えた。反応物を室温で30分間撹拌した。反応物を濃縮し、HPLCで精製して、化合物50を得た(6mg、5.1マイクロモル、収率56%)。
実施例10:
スキーム11
THF(115ml)及び水(115ml)に溶解した化合物33(10g、24ミリモル)に、重炭酸ナトリウム(12g、143ミリモル)を加えた。この混合物にTEMPO(2,2,6,6−テトラメチルピペリジニルオキシ、遊離基)(0.752g、4.81ミリモル)及び臭化ナトリウム(0.743g、7.22ミリモル)を滴加した。この混合物を氷浴で0℃まで冷却して、次亜塩素酸ナトリウム溶液(水溶液、塩素10%〜13%)(39.4g、53.0ミリモル)を45分かけて滴下した。滴下後、反応混合物を加熱せずに真空下に濃縮して、有機揮発物質を除去した。水層をEt2O(50mLで2回)で抽出してから、pH2に達するまでHCl(37%濃水溶液、15mL)で酸性化した。水層を酢酸エチル(100mLで4回)で抽出した。混合した有機層を濃縮して、粗生成物を白色固体として得た。この粗生成物を、超音波処理しながら高温のジエチルエーテル(75mLで3回)を用いて粉砕して、白色固体51を得た(9.2g、収率89%)。
化合物53の合成:
化合物20(1.0g、0.81ミリモル)をDCM(25mL)に溶解した。この溶液にピぺリジン(0.399mL、4.03ミリモル)を加えた。反応物を室温で6時間撹拌した。混合物を濃縮し、そしてヘキサンで洗浄した(15mLで3回)。得られた白色固体(580mg、0.569ミリモル、収率71%)は、それ以上精製せず、そのままカップリング反応に使用した。化合物51(120mg、0.279ミリモル)をDMF(1mL)に溶解し、そこへHOBt(37.8mg、0.279ミリモル)及びEDC(58.9mg、0.279ミリモル)を加えた。反応混合物を室温で20分間撹拌した。この反応混合物に、前記白色固体(285mg、0.279ミリモル)のDMF溶液及びDIPEA(0.107mL、0.615ミリモル)を加えた。反応物を室温で2時間撹拌してから、水(30mL)で希釈して、白色固体化合物52(350mg)を得た。次に、前記中間体52をDCM(5mL)に溶解した。この反応懸濁液にピぺリジン(104mg、1.22ミリモル)を添加して撹拌した。30分後、反応物を濃縮した。残渣をヘキサン(5mLで2回)とエーテル(5mLで2回)で洗浄して、化合物53を得た(140mg、0.116ミリモル、収率47%)。
化合物54の合成:
2−アジド酢酸(1,171mg、6重量%DCM溶液、0.695ミリモル)のDCM(2mL)溶液に、HOBt(94mg、0.695ミリモル)及びEDC(133mg、0.695ミリモル)を加えた。この混合物を室温で20分間撹拌した。この混合物に化合物53(140mg、0.116ミリモル)及びDIPEA(45mg、0.348ミリモル)のDMF(1.00ml)溶液を加えた。反応物を室温で2時間撹拌した。反応物を濃縮し、そして水(20mL)で希釈した。白色沈殿物を回収し、MeOH(3mL)に再度溶解して、HPLCで精製して、化合物54を得た(40mg、0.031ミリモル、収率27%)。
化合物55の合成:
化合物54(40mg、0.031ミリモル)に、TFA/TIS/水(95:2.5:2.5、2mL)を加えた。反応物を室温で30分間撹拌した。反応物を濃縮し、水に溶解して、RP−HPLCで精製して、化合物55を得た(30mg、0.028ミリモル、収率91%)。
化合物56の合成:
化合物55(7.0mg、6.6マイクロモル)のMeOH(1ml)溶液に、CuSO4(5滴、0.1M水溶液)、アスコルビン酸ナトリウム(5mg)及びフルオロペンチン(2滴)を加えた。反応物を室温で30分間撹拌した。反応物を濃縮し、HPLCで精製して、化合物56を得た(4.5mg、3.9マイクロモル、収率60%)。
実施例11:
スキーム12
化合物23(25mg、0.028ミリモル)のMeOH(3ml)溶液に、塩化チオニル(0.042mL、0.57ミリモル)を加えた。反応混合物を室温で20分間撹拌した。この混合物を水(3mL)で希釈して、HPLCで精製して、化合物57を得た(20mg、0.021ミリモル、収率75%)。
化合物58の合成:
化合物57(4.0mg、4.28マイクロモル)のMeOH(1mL)溶液に、CuSO4(5滴、0.1M水溶液)、アスコルビン酸ナトリウム(5mg)及びフルオロペンチン(2滴)を加えた。反応物を室温で30分間撹拌した。反応物を濃縮し、HPLCで精製して、化合物58を得た(3.0mg、2.94マイクロモル、収率68.7%)。
実施例12:
スキーム13
Fmocで保護されたD−アラニン(685mg、2.2ミリモル)及びNH2−d(PEG)4−OtBu(575mg、1.8ミリモル)のDCM(4mL)溶液に、HATU(895mg、2.6ミリモル)、次いでDIPEA(349mg、2.7ミリモル)を加えた。反応物を室温で2時間撹拌した。次いで、反応混合物をDCM(50ml)で希釈し、NH4Cl(飽和水溶液、30mL)で、次いでH2O(30mL)で、洗浄した。この混合物を濃縮し、シリカゲルカラムで溶出液としてEtOAcを用いて精製して、化合物59を得た(993mg、1.6ミリモル、収率73%)。
化合物60の合成:
化合物59(990mg、1.6ミリモル)のDCM(4mL)溶液にピぺリジン(682mg、8.0ミリモル)を加えた。反応物を室温で8時間撹拌した。反応物をロータリーエバポレータで濃縮してから、MeCNと共蒸発させた(5mLで3回)。次いで、残渣を、EtOAc、次いでDCM:MeOH(3:1)を用いて、シリカゲルカラムで精製して、化合物60を溶出させた(569mg、1.5ミリモル、収率90%)。
化合物61の合成:
化合物9(2.0mg、2.3ミリモル)のDMF(7mL)溶液に、HOBt(360mg、2.7ミリモル)及びEDC(507mg、2.7ミリモル)を加えた。反応物を室温で20分間撹拌した。化合物60(569mg、1.5ミリモル)をDCM(6.0mL)に加え、次いで、DIPEA(491mg、3.8ミリモル)を加えた。反応物を室温で一晩撹拌した。次に、得られた混合物をDCM(30mL)で希釈して、H2O(30mLで2回)で洗浄し、乾燥して(MgSO4)、蒸発させた。残渣をシリカゲルカラムでEtOAcで溶出させて精製して、化合物61を得た(850mg、0.68ミリモル、収率46%)。
化合物62の合成:
化合物61(25mg、0.020ミリモル)をDCM(1mL)に溶解した。この溶液にピぺリジン(86mg、1.0ミリモル)を加えた。2時間後、反応物をロータリーエバポレータで濃縮した。残渣をMeCN(2mLで3回)と共蒸発させて、脱保護された中間体を得た。2−アジド酢酸(60mg、0.060ミリモル)のDCM(1mL)溶液に、HOBt(9mg、0.067ミリモル)及びEDC(15mg、0.078ミリモル)を加えた。この混合物を室温で20分間撹拌した。この混合物に前記の脱保護された中間体(20mg、0.020ミリモル)のDMF(1.0mL)/DIPEA(0.013ml、0.070ミリモル)溶液を加えた。反応物を室温で一晩撹拌した。その後、反応物をDCM(20mL)で希釈して、H2Oで洗浄した(10mLで2回)。DCM層をMgSO4で乾燥してから真空下に濃縮した。残渣をMeCN(5mLで2回)と共蒸発させた。残渣にTFA:TIS:水(比率、95:2.5:2.5、1ml)を加えた。30分後、反応物を濃縮し、水に溶解して、濾過し(0.45ミクロン)、HPLCで精製して、化合物62を得た(5mg、0.006ミリモル、収率30%)。
化合物63の合成:
化合物62(5mg、5.7マイクロモル)のMeOH(0.5mL)溶液に、0.1M CuSO4水溶液(5.7μL、0.57マイクロモル)、0.2M アスコルビン酸ナトリウム水溶液(5.5μL、1.1マイクロモル)、最後に5−フルオロペンタ−1−イン2滴を、加えた。室温で20分間撹拌してから、反応物を0.45μmシリンジフィルターで濾過し、蒸発させ、水に溶解し、HPLCで精製して、化合物63を得た(1.3mg、1.3マイクロモル、収率23%)。
実施例13:
スキーム14
HATU(0.044g、0.115ミリモル)を、化合物9(0.1g、0.115ミリモル)及びDIPEA(0.100ml、0.577ミリモル)を含むDMF(1.153ml)溶液に、加えた。この反応物を10分間撹拌した。N−Me−ALA(0.024g、0.231ミリモル)を加えて、この溶液を1時間撹拌した。この溶液中で、スパチュラを用いてアミノ酸を粉砕し、そして2分間超音波処理した。その後、反応混合物を飽和NH4Cl(水溶液)で希釈して、酢酸エチルで抽出した。有機層を集め、MgSO4で乾燥し、濾過して濃縮して、化合物64を白色固体として得た(0.1g、0.105ミリモル、収率91%)。
化合物65の合成:
HATU(0.040g、0.105ミリモル)を、化合物64(0.1g、0.105ミリモル)、アミノ−PEG4−tブチルエステル(0.068g、0.210ミリモル)及びDIPEA(0.055ml、0.315ミリモル)を含むDMF(1.050ml)溶液に、加えた。反応物を15分間撹拌した。次いで、反応物を水で希釈して、酢酸エチルで洗浄した。有機層を集め、乾燥して、濾過して濃縮し、酢酸エチルのDCM溶液によるフラッシュクロマトグラフィを用いて精製して、化合物65を得た(0.07g、0.056ミリモル、収率53.1%)。
化合物66の合成:
ピぺリジン(0.028ml、0.279ミリモル)を、化合物65(0.07g、0.056ミリモル)のDCM(0.558ml)溶液に加えた。この反応混合物を2時間撹拌した。その後、反応混合物を水で希釈して、酢酸エチルで抽出した。有機層を集め、MgSO4で乾燥し、濾過して濃縮して、粗化合物66を得た(0.056g、0.054ミリモル、収率97%)。
化合物67の合成:
HATU(0.032g、0.084ミリモル)を、化合物66(0.058g、0.056ミリモル)、アジド酢酸の10%THF溶液(0.113g、0.112ミリモル)及びDIPEA(0.015ml、0.084ミリモル)を含むDMF(0.561ml)溶液に、加えた。反応物を10分間撹拌した。その後、反応物を水で希釈して、酢酸エチルで洗浄した。有機層を集め、MgSO4で乾燥して、濾過して濃縮し、セミ分取HPLCを用いて精製して、化合物67を得た(0.049g、0.044ミリモル、収率78%)。
化合物68の合成:
トリフルオロ酢酸(0.338mL、4.39ミリモル)を、化合物67(0.049g、0.044ミリモル)及びトリイソプロピルシラン(8.99μL、0.44ミリモル)を含む溶液に、加えた。この反応混合物を20分間撹拌し、濃縮し、セミ分取HPLCを用いて精製して、化合物68を得た。
化合物69の合成:
0.001Mの5−フルオロペンチンTHF溶液(1.9mg、0.022ミリモル)を、化合物68(5mg、0.011ミリモル)、アスコルビン酸ナトリウム(20mg、0.101ミリモル)及び硫酸銅(II)(4.48μL、1.121マイクロモル)を含むDMF(112μL)/水(56.0μL)溶液に、加えた。この反応物を1時間撹拌した。反応物を水で希釈し、濾過し、セミ分取HPLCを用いて濾液を精製して、化合物69を得た(1mg、1.02マイクロモル、収率18.24%)。
スキーム15
固相反応容器において、DEVD−Cl−Trt−樹脂(トリチルクロリド樹脂)(200mg、添加量0.43ミリモル/g)を、2−(4−(3−フルオロプロピル)−1H−1,2,3−トリアゾール−1−イル)酢酸(32mg、0.172ミリモル、2当量)、HBTU(65mg、0.172ミリモル、2当量)、HOBt(23mg、0.172ミリモル、2当量)及びN,N−ジイソプロピルエチルアミン2,4,6−コリジン(0.27ml、2.04ミリモル)のDMF(5ml)溶液に、15時間懸濁させた。この溶液を乾固して、樹脂をDMF(10mlで3回)、MeOH(10mLで2回)及びDCM(10mlで3回)で洗浄した。カップリングの首尾は、TNBS試験を行なって評価した。
実施例15:18F標識化プロセス及び[F−18]トレーサのプロセス制御についての説明
Cu(I)で触媒された「クリック化学」を利用して、実施例1〜14の18F放射性標識化基質類似体を調製することができる。例えば、[18F]フルオロアルキンは、対応するトシル化アルキンを前駆体として用いて調製することができる。[18F]フルオロアルキンの、アジド基で誘導体化された基質(例えば、実施例1〜14に示した典型的な標準物質の前駆体)への、Cu(I)媒介1,3−双極性環化付加を用いた接合により、所望の18F標識化生成物が良好な収率と優れた放射化学的純度で得られる。
スキーム16
フッ素−18[F−18]は、次の反応スキームで表されるように、安定な同位体である酸素−18(O−18)のプロトン照射によって生成する。
サイクロトロン標的中で生成された水性[F−18]フッ化物イオンを、前節に記載されているように、アニオン交換樹脂カートリッジに通す。[O−18]H2Oは、アニオン交換樹脂を容易に通過するが、[F−18]フッ化物は保持される。炭酸カリウム(3mg)の水(0.4mL)溶液を用いてカラムから[F−18]フッ化物を溶出して、反応容器に回収する。アセトニトリル(1mL)に溶解したクリプトフィックス(Kryptofix)(登録商標)222(20mg)を、反応容器内の水性[F−18]フッ化物混合物に加える。クリプトフィックス(Kryptofix)は、カリウムイオンを封鎖して、強力なK+/Fイオン対の形成を阻止する。これにより、[F−18]フッ化物イオンの化学反応性が増強される。
無水[F−18]フッ化物とトシル酸ペンチンとの反応
トシレート前駆体(20mg±5mg、75マイクロモル)を18F−フッ素化に適した、DMSO、テトラヒドロフラン、DMF又はMeCN等の、極性非プロトン溶媒(0.5mL)に溶解した溶液を、無水[F−18]フッ化物を入れた反応容器に加える。この容器を約110±5℃に3分間加熱して、スキーム17に示すように、[F−18]フッ化物によるトシレート離脱基の置換を生じさせる。18F−フルオロペンチンを反応容器から、前駆体を含む混合物の中へ蒸留する。この蒸留は、トシレートを反応混合物に加えて直ぐに開始してもよい。
18F−ペンチンを、200μLのDMF:MEOH=1:1に溶解した前駆体(3.0〜4.0mg)、TBTA(15mg)、アスコルビン酸ナトリウム(40mg)及び250μLの0.1M CuSO4を含む溶液中に蒸留する。この反応は、室温において10〜20分間で反応させる。HPLCで精製する前に、4mLのHPLC充填ループに注入するために、この反応物を水(3.5mL)で希釈する。
[F−18]生成物のHPLC精製
粗[F−18]生成物を含む反応混合物を、HPLCサンプルループに移して、セミ分取HPLCカラムを用いるクロマトグラフィー分離により精製する(アイザー(Either)製エースC18ピラミッド(ACE C18 Pyramid)、7μ、250×10mm、フェノメネックス(Phenomenex)製ルナ、C18(Luna, C18)、5μ、10×250mm、フェノメネックス(Phenomenex)製ジェミニC18(Gemini C18)、250×10mm、又はフェノメネックス(Phenomenex)製サイナージハイドロ−RP C18(Synergi HydroRP C18)、250×10mm、クラジエントシステム利用、最大毎分5.5mL。但し、高い背圧がある場合は、より少ない流量を用いてもよく、又は前記システムをより少ない流量で始動して、その後、最大流量まで増加させてもよい。)。直列に接続したUV検出器(254nm又は280nm)と放射量検出器を用いて、カラム溶出液をモニターする。対応するCP参照基準で求めた、放射量検出器がメインピークを表示し始める時間と一致する、保持時間枠で、精製された[F−18]生成物トレーサをカラムから回収する。このシステムでの[F−18]生成物の保持時間は、約20〜40分の間で変化する。
HPLC精製カラムから溶出された精製[F−18]生成物画分を、水(40〜100mL)で希釈して、C18 SepPakカートリッジに捕捉させる。C18 SepPakカートリッジを、水(10mL)で洗浄した後、0.5〜1.0mLのEtOHで前記生成物を溶出させる。次に、試料を滅菌水(水4.5〜9.0mL)で希釈して、最終製剤である、最大10%のEtOH/水中に溶解された[F−18]生成物が得られる。滅菌用量を製造するために、この最終溶液を0.22μmの滅菌フィルターで濾過する。
最終生成物の高速液体クロマトグラフィー(HPLC)分析
移動相:A−0.05%TFAのアセトニトリル溶液、B−0.05%TFAの脱イオン水溶液
流量:毎分1mL
スキーム18
2−(tert−ブトキシカルボニルアミノオキシ)酢酸(0.036g、0.186ミリモル)と2,4,6−コリジン(0.041ml、0.310ミリモル)とを含むDMF(5mL)溶液に、HATU(0.071g、0.186ミリモル)を加えた。反応物を5分間撹拌した。化合物24(0.2g、0.124ミリモル)をこの反応混合物に加えて、30分間撹拌した。次いで、この混合物を水で希釈して濾過した。未精製の白色固体として化合物84が単離された(0.2g、0.112ミリモル、収率90%)。
化合物85の合成:
化合物84(0.2g、0.112ミリモル)にTFA(1mL)を加えた。この混合物を10分間撹拌し、そして濃縮した。その残渣を水に再度溶解し、セミ分取HPLCで精製して、化合物85を白色固体として得た(0.05g、0.041ミリモル、収率36.3%)。
化合物85(3.9mg、3.16マイクロモル)を含む水(0.013mL)とMeOH(0.051mL)との溶液に、4−フルオロベンズアルデヒド(0.017mL、3.48マイクロモル)を加えた。反応物を60℃まで30分間加熱した。次いで、この混合物をセミ分取HPLCを用いて精製して、化合物86を白色固体として得た(1.5mg、1.225マイクロモル、収率38.7%)。
実施例17
スキーム19
蛍光性の開裂生成物AFC(7−アミノ−4−トリフルオロメチルクマリン)の蓄積を調べることで、カスパーゼ−3の酵素活性を求めた。カスパーゼ−3は、DとAFCとの間でテトラペプチドを開裂して、UV蛍光分光分析で定量化可能な蛍光性AFCを放出する。酵素と基質、細胞溶解物又は組織均質化物、とを、150mM NaCl、50mM HEPES(4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジン エタンスルホン酸)、5mM EDTA、1mM DTT(ジチオトレイトール)及び10%グリセロールを含むpH7.0の分析緩衝液で、希釈した。反応試薬を混合してから、37℃で、UV蛍光分光分析によってカスパーゼ−3活性を測定する。
カスパーゼ基質の開裂は、開裂生成物の蓄積又は基質の減少を測定して評価した。これらは、質量分析で測定した。基質とカスパーゼ−3酵素とを試験緩衝液(150mM NaCl、50mM HEPES、5mM EDTA、1mM DTT、10%グリセロール、pH7.0)中に混合する。様々な時点における基質又は開裂生成物の量を、MSで測定した。基質の開裂速度は、時間当たりの単位カスパーゼ−3酵素当たりの、全基質に対する開裂した基質の百分率で表される。
実施例20:癌細胞株への[18F]−トレーサ化合物の取り込み手順
6穴プレートで一晩増殖させて約80%コンフルエンスに達した細胞を、1mMのアポトーシス誘発剤5FUに、細胞培養インキュベータ内で2日間暴露した。 [18F]−標識化トレーサを、各穴(対照用と5FU処理用の3個一組)に、10μCi/穴で添加した(阻害剤としてカスパーゼ3抑制剤を用いる必要がある実験の場合は、[18F]−トレーサの添加1時間前に前記抑制剤を細胞に加えた。)。次いで、細胞を2時間インキュベートした。細胞を掻き集めて、遠心分離した。細胞ペレットを1X PBSで2回洗浄した。細胞内及び培地内のトレーサ量をy−カウンタで計測した。取り込み率(%)=(細胞内部の総CPM(毎分当りカウント)/全トレーサCPM)×100%。取り込み率(%)は、細胞タンパク質抽出物量(mg)で正規化した(取り込み率(%)/タンパク質抽出物mg)。
6穴プレートで増殖させた細胞が80%コンフルエンスに達したときに、成長培地を、1mMの5FUを含む新たな培地2mlと交換した。アポトーシス誘発から2日後に、前記標準化合物を培養液(対照及び5FU処理したもの)に最終濃度10μMで添加した。化合物の取り込みのために、細胞をインキュベータで2時間培養した。(阻害剤としてカスパーゼ3抑制剤を用いる必要がある実験の場合は、標準化合物を添加する1時間前に前記抑制剤を細胞に加えた。)。次いで、各試料から細胞培養液100μlを収集し、遠心分離によって細胞を採取した。細胞ペレットを1X PBSで2回洗浄して、溶解緩衝液100μlに溶解した。細胞溶解物及び培養液を、いずれも5分間、煮沸してタンパク質を変性させて、氷で冷却してからクロロホルム/メタノール(50/50比)100μlを加えた。ボルテックスして抽出した後、試料をエッペンドルフ(Eppendorf)チューブに入れて、微量遠心機で4℃において13,000rpmで15分間遠心分離した。上澄み50μlをHPLCバイアル瓶に移した。細胞内及び培養液中の化合物(又はカスパーゼ3開裂生成物)の量をLC/MSで測定した。取り込み率(%)=(細胞の総取り込み量/化合物総量)×100(%)。取り込み率(%)は、細胞タンパク質抽出物の量(mg)で正規化した(取り込み率(%)/タンパク質抽出物(mg))。
本発明の化合物を投与した後で、麻酔したFoxnlnu(ホモ接合体nu/nu)マウスに関するマウスのインビボマイクロPET撮像を行なう。
腫瘍細胞を、SBR手順に従ってトリパンブルー色素排除法で計数した。マウス当たり約5百万〜1千万個の細胞を滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)約0.2mLの容積で皮下移植した。
生前実験評価
ポジトロン断層撮影法/コンピュータ断層撮影(PET/CT)走査
試験造影化合物の投与後に、動物のPET走査を行なう。得られるデータを解析して、異種移植腫瘍による試験化合物の取り込みを評価する。動物には、麻酔するまでは5%のイソフルラン/酸素を吸入させ、その後、各PET/CT走査法中(最大2時間)は2〜2.5%のイソフルラン/酸素吸入を維持する。各PET/CT走査の間、麻酔した動物は加熱パッドの上に置く。
ポジトロン断層撮影法の説明
線量レベル
1走査当たり、動物当たり最大250μCi
投与量
最大投与量200μL
F18−試験造影化合物の投与直後に、連続した動的PET走査を開始した。予想走査時間は最大2時間である。データを解析して、試験造影化合物の異種移植腫瘍による取り込み率ID/g(%)(1グラム当たりの注入投与量割合)とT:M(腫瘍/筋肉)比を評価した。典型的な結果を表13に示す。
安楽死の方法
特に断りのない限り、二酸化炭素吸入により安楽死させた後、採血を行った。
Xは、ペプチド基質のN−末端に結合した結合又は連結基であり;
Yは、結合又は連結基であり;
RLは、放射性標識であり;
Subは、ペプチド基質であり;
CPVは、細胞透過性ベクターであり;
Zは、キャッピング基であり;
m、n、p及びsは、独立して、0〜4であり;
tは、0又は1であり;そして、
uは、1又は2である。)
2.Xが、ペプチド基質のN−末端に結合した結合又は連結基であり;
Yが、結合又は連結基であり;
RLが、放射性標識であり;
Subが、ペプチド基質であり;
CPVが、細胞透過性ベクターであり;
Zが、キャッピング基であり;
m、p及びsが、独立して、0〜4であり;
nが0であり;
tが1であり;そして、
uが1である、段落1に記載の造影剤。
Yが、結合又は連結基であり;
RLが、11C及び18Fからなる群から選択される放射性標識であり;
Subが、−DEVD−、−DE(N−アルキルV)D−、−DEVDD−、−DNLD−、−DQTD、−DMQD−、−YVDA−、−YEVD−、−LEVD−、−LEHD−、−DQMD−、VDQQD−、−VDVDA−、−VEID−、−VQVD−、−YVADGW−、−VDVAD−、−VDVADGW−、−RGVDQQDGKNHW−、−GVDQQDGKNW、−VDQQDGKNW−、−DQQDGKNW−、−QQDGKNW−、−VDQQDGKW−、−VDQQDGW−、−VDQQDW−、−WEHD−、−YVAD−、−AEVD−、−IETD−、−AEVD−、−VEHD−、−XEXDAMC−、−DEVDAMC−、−VEHDAMC−、−VADFMK−、−YEVDGW−、−LEVDGW−、−VDQMDGW−、−VDVADGW−、−VQVDGW−、VDQVDGW−、−DEVDAMC−、−VD−fmk−、−VAD−fmk−、−YVAD−fmk−、−ID−fmk−、−LD−fmk、−FD−fmk−、−AD−fmk−、−GD−fmk−、−KD−fmk−、−ED−fmk−及び−DEVDAFC−からなる群から選択されるペプチド基質であり;
CPVが、ポリエチレンイミン、PEG、PEI−PEG、PEG−PEI、Lys4、ポリアミン類、ヒスチジル化ポリ−L−リジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、カチオン性リポソーム及び脂質、糖類誘導体、並びにポリリジンからなる群から選択され;
Zが、キャッピング基であり;
pが0〜4であり;
nが0であり;
sが1であり;
tが1であり;そして、
uが1である、段落1又は2に記載の造影剤。
Yが、結合又は連結基であり;
RLが、18Fであり;
Subが、−DEVD−、−DE(N−アルキルV)D−、−DEVDD−、−DNLD−、−DQTD、−DMQD−、−YVDA−、−YEVD−、−LEVD−、−LEHD−、−DQMD−、VDQQD−、−VDVDA−、−VEID−、−VQVD−、−YVADGW−及び−VDVAD−からなる群から選択されるペプチド基質であり;
CPVが、ポリエチレンイミン、PEG、PEI−PEG、PEG−PEI、Lys4、ポリアミン類、ヒスチジル化ポリ−L−リジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、カチオン性リポソーム及び脂質、糖類誘導体、並びにポリリジンからなる群から選択され;
Zがキャッピング基であり;
pが0〜4であり;
nが0であり;
sが1であり;
tが1であり;そして、
uが1である、段落1から3のいずれか1つに記載の造影剤。
Yが、−AlaNH−であり;
RLが、18Fであり;
Subが、−DEVD−であり;
CPVが、(−CH2CH2O−)4であり;
Zが、−CH2CH2CO2Hであり;
nが0であり;
sが1であり;
tが1であり;そして、
uが1である、段落1から4のいずれか1つに記載の造影剤。
Yが、結合又は連結基であり;
RLが、放射性標識であり;
Subが、ペプチド基質であり;
CPVが、細胞透過性ベクターであり;
Zが、キャッピング基であり;
m、p及びnが、独立して、0〜4であり;
sが、0であり;
tが1であり;そして、
uが1である、段落1に記載の造影剤。
Yが、結合又は連結基であり;
RLが、18Fであり;
Subが、−DEVD−、−DE(N−アルキルV)D−、−DEVDD−、−DNLD−、−DQTD、−DMQD−、−YVDA−、−YEVD−、−LEVD−、−LEHD−、−DQMD−、−VDQQD−、−VDVDA−、−VEID−、−VQVD−、−YVADGW−及び−VDVAD−からなる群から選択されるペプチド基質であり;
CPVが、ポリエチレンイミン、PEG、PEI−PEG、PEG−PEI、Lys4、ポリアミン類、ヒスチジル化ポリ−L−リジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、カチオン性リポソーム及び脂質、糖類誘導体、並びにポリリジンからなる群から選択され;
Zが、キャッピング基であり;
pが0〜4であり;
nが1であり;
sが0であり;
tが1であり;そして、
uが1である、段落1又は6に記載の造影剤。
Yが、結合又は連結基であり;
RLが、18Fであり;
Subが、−DEVD−、−DE(N−アルキルV)D−、−DEVDD−、−DNLD−、−DQTD、−DMQD−、−YVDA−、−YEVD−、−LEVD−、−LEHD−、−DQMD−、VDQQD−、−VDVDA−、−VEID−、−VQVD−、−YVADGW−及び−VDVAD−からなる群から選択されるペプチド基質であり;
CPVが、ポリエチレンイミン、PEG、PEI−PEG、PEG−PEI、Lys4、ポリアミン類、ヒスチジル化ポリ−L−リジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、カチオン性リポソーム及び脂質、糖類誘導体、並びにポリリジンからなる群から、独立して、選択され;
Zが、キャッピング基であり;
pが0〜4であり;
nが1であり;
sが1であり;
tが1であり;そして、
uが1である、段落1に記載の造影剤。
生体内の前記レポータを画像化することからなる、生体内のレポータを画像化する方法。
前記哺乳動物内の残存放射能の有無を検出することからなる哺乳動物での異常なアポトーシスを伴う疾病の検出又は診断方法。
(b)体内又はその一部における前記造影剤の分布を視覚化するためにポジトロン断層撮影法(PET)及び単一光子放出型コンピュータ断層撮影法(SPECT)からなる群から選択される放射線画像法を利用することからなる
患者の体内のカスパーゼ活性を視覚化する方法。
Claims (10)
- 式Idで表される化合物又はその薬学的に受容可能な塩を含有してなる造影剤。
Xは、X2X3X4 からなる連結基であり、ここで、X2は−(CH2)2−、−(CH 2 ) 3 −又は−(CH 2 ) 4 −であり、X3はトリアゾールであり、X4は−CH2C(O)−又は−CH 2 CH 2 C(O)−であり;
Yは、−AlaNH−及び−NHCH 2 CO−から選ばれる連結基であり;
Subは、−DEVD−を含有してなるペプチド基質であり、
CPV 1 及びCPV 2 は、それぞれ、−(CH2CH2O)4−、
Zは、−CH2CH2CO2H、CH 2 CONH 2 及びNH 2 からなる群から選ばれるキャッピング基であり;
mが1であり;
nが0又は1であり;
pが1であり;
sが0又は1であり;
但し、nとsとが同時に0となることはなく;
tが1であり;そして、
uが1である。) - 前記18Fが、クリック化学、キレート化学、オキシム形成法、又はアミドをベースとする共役化学を利用して基質に結合される、請求項1から7のいずれか1項に記載の造影剤。
- 請求項1から8のいずれか1つに記載の造影剤を用いて、哺乳動物内の残存放射能の有無を検出することからなる、カスパーゼ3によって仲介される異常なアポトーシスが誘導された細胞を検出する方法。
- 前記検出工程において、体内又はその一部における造影剤の分布をモニターするためにポジトロン断層撮影法(PET)及び単一光子放出型コンピュータ断層撮影法(SPECT)からなる群から選択される放射線画像法を利用する、請求項9に記載の方法。
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