JP5622569B2 - 加水分解性ポリマーfmoc−リンカー - Google Patents
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Description
本願は、2007年6月26日に出願された米国仮特許出願第60/937,169号、および2008年4月7日に出願された米国仮特許出願第61/123,263号への優先権の利益を主張し、これらの米国仮特許出願の双方の全体は、本明細書中に参考として援用される。
本発明は、少なくとも1つの半合成ポリマーと結合している加水分解性リンカーの作製に関する。これらの加水分解性リンカーは、タンパク質およびペプチド系の薬物のインビボでの循環を延長するのに有用である。
ほとんどのタンパク質またはペプチド薬物は寿命が短く、しばしば、インビボで短い循環半減期を有する。タンパク質またはペプチド薬物が経口で吸収されないことを考慮すると、循環系において治療活性のある薬物を長く保持することは、臨床的重要性の点で明らかに望ましい特徴である。
しばらくの間、ポリ(エチレングリコール)(PEG)を用いた修飾が知られていた。しかし、PEGを用いたタンパク質の修飾はしばしば、タンパク質の活性の低下をもたらす。
本発明は例えば、以下の項目を提供する:
(項目1)
式Iの化合物
Zは脱離基であり、1、2、3、4、5、6、7または8の位置の少なくとも1つはY基と結合しており、
Yは、N−スクシンイミジル部分と結合した半合成バイオポリマーを含む基であり、
利用可能な1、2、3、4、5、6、7または8の位置の少なくとも1つは任意選択でX基と結合しており、
Xは−SO 3 −R 3 であり、
R 3 は、水素、(C 1 〜C 8 )−アルキルおよび(C 1 〜C 8 )−アルキル−R 4 からなる群から独立に選択され、
R 4 はポリマーである)。
(項目2)
ZがN−スクシンイミジルエステルであり、
Yが、
POLYMERは半合成バイオポリマーであり、
R 1 はその出現ごとに独立に(C 1 〜C 8 )−アルキルであり、
R 2 は、−C(O)NR−、−C(O)NR−(C 1 〜C 8 )−アルキル−NR−、−NRC(O)−および−NRC(O)−(C 1 〜C 8 )−アルキル−NRからなる群から独立に選択され、
Rは、独立に、水素または(C 1 〜C 8 )−アルキルである、
項目1に記載の化合物。
(項目3)
R 2 が−C(O)NR−またはNRC(O)−であり、ここで、Rは、独立に、水素または(C 1 〜C 8 )−アルキルである、項目2に記載の化合物。
(項目4)
前記POLYMERがチオエーテル結合を介して結合している、項目3に記載の化合物。
(項目5)
前記半合成バイオポリマーが炭水化物である、項目1から4のいずれか一項に記載の化合物。
(項目6)
前記半合成バイオポリマーが多糖である、項目5に記載の化合物。
(項目7)
前記多糖がポリシアル酸(PSA)である、項目6に記載の化合物。
(項目8)
前記多糖が少なくとも3単位の単糖を含む、項目6に記載の化合物。
(項目9)
以下のI、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、XおよびXI
からなる群から選択される、項目1に記載の化合物。
(項目10)
項目1に記載の化合物の調製方法であって、中間化合物をカップリング反応にかけるステップを含み、ここで
POLYMERは半合成バイオポリマーであり、
R 1 はその出現ごとに独立に(C 1 〜C 8 )−アルキルであり、
R 2 は、−C(O)NR−、−C(O)NR−(C 1 〜C 8 )−アルキル−NR−、−NRC(O)−および−NRC(O)−(C 1 〜C 8 )−アルキル−NRからなる群から独立に選択され、
Rは、独立に、水素または(C 1 〜C 8 )−アルキルであり、
Xは−SO 3 −R 3 であり、
R 3 は、水素、(C 1 〜C 8 )−アルキルおよび(C 1 〜C 8 )−アルキル−R 4 からなる群から独立に選択され、
R 4 はポリマーであり、
nは、0、1、2、3または4から選択される整数であり、
mは、1、2、3または4から選択される整数である、
方法。
(項目11)
HS−POLYMERが
である、項目8に記載の方法。
(項目12)
R 2 が、−C(O)NR−または−NRC(O)−のいずれかであり、ここで、Rは、独立に、水素またはC 1 〜C 8 −アルキルである、項目9に記載の方法。
(項目13)
前記化合物が、置換のための1つまたは複数の基を含むタンパク質またはペプチド薬物とコンジュゲートしている、項目10に記載の方法。
(項目14)
項目1から7のいずれか一項に記載の化合物およびタンパク質またはペプチド薬物を含むコンジュゲート。
POLYMERは半合成バイオポリマーであり、
R1はその出現ごとに独立に(C1〜C8)−アルキルであり、
R2は、−C(O)NR−、−C(O)NR−(C1〜C8)−アルキル−NR−、−NRC(O)−および−NRC(O)−(C1〜C8)−アルキル−NRからなる群から独立に選択され、ただし、Rは、独立に、水素またはC1〜C8−アルキルである。
Xは−SO3−R3であり、
R3は、水素、(C1〜C8)−アルキルおよび(C1〜C8)−アルキル−R4からなる群から独立に選択され、
R4はポリマーであり、
nは0、1、2、3または4から選択される整数であり、
mは、1、2、3または4から選択される整数である。
末端SH基を含むPSAの調製
ポリシアル酸(Sigma)をNaIO4で酸化し(Fernandesら、Biochim Biophys Acta、第1341巻、26〜34頁(1997年))、末端アルデヒド基を生成させた。次いで、WO05/016973に記載されているようにして、NH4Clで還元的アミノ化ステップを実施し、シッフ塩基をNaCNBH3で還元して末端アミノ基を含むPSA−NH2を得た。続いて、メーカーの使用説明書に従って、2−イミノチオラン(Pierce 26101)と反応させて、末端SH基を含む改変されたPSAを調製した。生成したSH基のモル濃度はEllmans試薬を用いて判定した。さらに、同じ手順を、TimTec、LLC、Newark、USAから得たN−アセチルノイラミン酸トリマーにSH基を導入するために用いた。
MAL−FMS−OSUリンカーを用いたrFVIIaのPSAとのコンジュゲート
50mMリン酸緩衝液(pH7.2)中のrFVIIa(0.7mg/ml)の15ml溶液に、二官能性リンカーMAL−FMS−OSU(Tsuberyら、J Biol Chem.、第279巻、38118〜38124頁(2004年)によって概要が示されているようにして調製した)を加え(濃度:0.5mg/mgタンパク質)、室温で30分間インキュベートした。次いで、実施例1に従って末端SH基を含む誘導体化PSAを調製した。PSA誘導体をその混合物(濃度:10mg PSA−SH/mgタンパク質)に加え、さらに2時間インキュベートした。次いで、0.1Mグリシン(最終濃度10mM)および5mMシステイン(終末濃度0.5mM)の水溶液を加えて反応を停止させた。QHyperD F 50μm樹脂(BioSepra)およびPharmacia XK−10カラム(Pharmacia XK10;h=10cm)を用いてイオン交換クロマトグラフィーにより、遊離試薬を、rFVIIa−PSAコンジュゲートから分離した。PSA−rFVIIaを含む溶液をそのカラムにかけ、続いてこれを10CV平衡緩衝液(20mMクエン酸ナトリウム、20mM NaCl、pH6.5)で洗浄した。次いでポリシアル化されたrFVIIaを、溶出緩衝液(20mMクエン酸ナトリウム、500mM NaCl、pH6.1)で溶出させた。溶出液は0.06mg/mlのタンパク質を含んでおり、レゾルシノールアッセイ(Svennerholm;Biochim Biophys Acta、第24巻:604〜11頁(1957年))によって、コンジュゲートと結合したPSAの証拠が示された。コンジュゲート中のrFVIIaの活性を放出させるために、450μlの溶出液を50μlの1M TRIS緩衝液(pH8.3)に加え、FVIIa活性の放出を測定した(Staclot、Diagnostica Stago、Asnieres、France)。結果を図2に示す。
MAL−FMS−OSUリンカーを用いたトリマーPSAのrFVIIaとのコンジュゲート
50mMリン酸緩衝液(pH7.2)中のrFVIIa(0.7mg/ml)の15ml溶液に、二官能性リンカーMAL−FMS−OSU(Tsuberyら、J Biol Chem.、第279巻、38118〜38124頁(2004年)によって概要が示されているようにして調製した)を加え(濃度:0.07mg/mgタンパク質)、室温で30分間インキュベートした。次いで、実施例1に記載のようにしてトリマーPSA(TimTec、LLC、Newark、USA)を誘導体化して遊離SH基を導入した。トリマーPSA−SH誘導体を混合物(濃度:0.43mgトリマーPSA−SH/mgタンパク質)に加え、さらに2時間インキュベートした。次いで、0.1Mグリシン(最終濃度10mM)および5mMシステイン(終末濃度0.5mM)の水溶液を加えて反応を停止させた。QHyperD F 50μm樹脂(BioSepra)およびPharmacia XK−10カラム(Pharmacia XK10;h=10cm)を用いてイオン交換クロマトグラフィーにより、遊離試薬をrFVIIa−PSAコンジュゲートから分離した。PSA−rFVIIaを含む溶液をそのカラムにかけ、続いてこれを10CV平衡緩衝液(20mMクエン酸ナトリウム、20mM NaCl、pH6.5)で洗浄した。次いでポリシアル化されたrFVIIaを溶出緩衝液(20mMクエン酸ナトリウム、500mM NaCl、pH6.1)で溶出させた。溶出液は0.06mg/mlのタンパク質を含んでおり、レゾルシノールアッセイ(Svennerholmら、Biochim Biophys Acta、第24巻、604〜11頁(1957年))によって、コンジュゲート中での結合したPSAの証拠が示された。コンジュゲート中のrFVIIaの活性を放出させるために、450μlの溶出液を50μlの1M TRIS緩衝液(pH8.3)に加え、FVIIa活性の放出を測定した(Staclot、Diagnostica Stago、Asnieres、France)。結果を図1に示す。
MAL−FMS−OSUリンカーを用いたヒト血清アルブミンのPSAとのコンジュゲート
ヒト血清アルブミン(HSA)を、25mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH6.2)中で二官能性リンカーMal−FMSOSUリンカー(Tsuberyら、J Biol Chem.、第279巻、38118〜38124頁(2004年)によって概要が示されているようにして調製した)で1時間インキュベートする。次いで、過剰のリンカーを、同じ緩衝剤系を用いてSephadex G−25(GE−Healthcare)によるゲルろ過によって分離する。タンパク質を含む画分を収集し、PSA−SH(実施例1に従って調製)を加える。混合物を室温で2時間インキュベートする。次いでコンジュゲートを、DEAE−Sepharose FF(GE Healthcare)を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製する。タンパク質−PSAコンジュゲートを、25mM酢酸ナトリウム緩衝液pH4.5で溶出させる。コンジュゲートを含む画分を集め、10K膜を用いた限外ろ過により濃縮する。次いでその溶液を、25mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH6.2)に対してダイアフィルトレーションにかける(diafiltrated)。
正常ラットにおけるrFVIIa−PSA−コンジュゲートの薬物動態
rFVIIa−PSAコンジュゲートを、0.05mg/mgの濃度のタンパク質のMAL−FMS−OSUを用いて、実施例2に従って調製した。8匹の正常ラット(4匹のオス、4匹のメス)に麻酔をかけ、緩衝液(1.3g/Lグリシルグリシン、3g/L塩化ナトリウム、30g/Lマンニトール、1.5g/L CaCl2×2H2O、0.1g/L Tween80、pH5.5)中のrFVIIa−PSA−コンジュゲートを、10ml/kg(1200μgタンパク質/kg)の体積用量で尾静脈に静脈注射を施した。1200μgタンパク質/kgの用量の非修飾rFVIIaを、8匹の正常ラット(4匹のオス、4匹のメス)での対照として用いた。上記コンジュゲート(substance)を注射した後、5分、1時間、2時間、4時間、7時間、10時間および24時間後に、尾動脈から血液試料を採取し、クエン酸血漿を調製し、さらなる分析用に冷凍した。
正常ラットにおけるrFVIIa−トリマー−PSA−コンジュゲートの薬物動態
rFVIIa−トリマー−PSAコンジュゲートを、0.05mg/mgの濃度のタンパク質のMALFMS−OSUを用いて、実施例3に従って調製した。6匹の正常ラット(3匹のオス、3匹のメス)に麻酔をかけ、緩衝液(1.3g/Lグリシルグリシン、3g/L塩化ナトリウム、30g/Lマンニトール、1.5g/L CaCl2×2H2O、0.1g/L Tween80、pH5.5)中のrFVIIa−トリマー−PSA−コンジュゲートを、10ml/kg(1200μgタンパク質/kg)の体積用量で尾静脈に静脈注射を施した。1200μgタンパク質/kgの用量の非修飾rFVIIaを、6匹の正常ラット(3匹のオス、3匹のメス)での対照として用いた。上記コンジュゲートを注射した後、5分、1時間、2時間、4時間、7時間、10時間および24時間後に、尾動脈から血液試料を採取し、クエン酸血漿を調製し、さらなる分析用に冷凍した。
MAL−FMS−OSUリンカーを用いたrFIXのPSAとのコンジュゲート
20mM Hepes緩衝液(pH7.4)中の組換えFIX(8mg/ml)の0.6ml溶液に、二官能性リンカーMAL−FMS−OSU(Tsuberyら、J Biol Chem.、第279巻、38118〜38124頁(2004年)によって概要が示されているようにして調製した)を加え(濃度:0.07mg/mgタンパク質)、室温で30分間インキュベートした。末端SH基を含む誘導体化PSAを実施例1に従って調製した。PSA誘導体を混合物(濃度:32mgPSA−SH/mgタンパク質−100倍モル過剰)に加え、さらに室温で2時間インキュベートした。次いで、0.1Mグリシン(最終濃度10mM)および5mMシステイン(終末濃度0.5mM)の水溶液を加えて反応を停止させた。事前充填型ブチルセファロースカラム(HiTrapブチルFF 5ml、GE Healthcare)を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィーにより遊離試薬をrFIX−PSAコンジュゲートから分離した。5M NaCl(50mM Hepes緩衝液、5M NaCl、0.01%Tween80、6.7mM CaCl2、pH6.9)を含む緩衝液を、PSA−rFIXを含む溶液に加えて3M NaClの最終濃度を得た。この混合物をそのカラムにかけ、続いてこれを10CV平衡緩衝液(50mM Hepes緩衝液、3M NaCl、0.01%Tween80、6.7mM CaCl2、pH6.9)で洗浄し、6.7mM CaCl2を含む50mM Hepes緩衝液(pH7.4)でrFIX−PSAコンジュゲートを溶出させた。コンジュゲートを溶出させた後、pHをpH6.9に調節した。BCAアッセイで測定すると、溶出液は0.24mg/mlのタンパク質を含んでおり、レゾルシノールアッセイ(Svennerholm、Biochim Biophys Acta、第24巻、604〜611頁(1957年))によって、コンジュゲート中での結合したPSAの証拠が示された。最終ステップにおいて、溶出液を、30kD膜(再生セルロース/Millipore)を用いた限外ろ過/膜分離法(UF/DF)により、20mM Hepes、50mM NaCl、1mM CaCl2、pH7.4に対して10倍に濃縮した。
MAL−FMS−OSUリンカーを用いたrFVIIIのPSAとのコンジュゲート
rFVIII−PSAコンジュゲートを調製するために、20mM Hepes緩衝液(pH7.4)中のAdvateの製造プロセスにより得られた組換えFVIII(4.5mg/ml)の6mlの溶液に、二官能性リンカーMAL−FMS−OSU(Tsuberyら、J Biol Chem.、第279巻、38118〜38124頁(2004年)によって概要が示されているようにして調製した)を加え(濃度:0.315mg/mgタンパク質)、室温で30分間インキュベートした。末端SH基を含む誘導体化PSAを実施例1に従って調製した。PSA誘導体を混合物(濃度:27.8mgPSA−SH/mgタンパク質−450倍モル過剰)に加え、さらに室温で2時間インキュベートした。0.1Mグリシン(最終濃度10mM)および5mMシステイン(終末濃度0.5mM)の水溶液を加えて反応を停止させた。事前充填型ブチルセファロースカラム(HiTrapブチルFF 5ml、GE Healthcare)を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィーにより遊離試薬をrFVIII−PSAコンジュゲートから分離した。5M NaCl(50mM Hepes緩衝液、5M NaCl、0.01%Tween80、6.7mM CaCl2、pH6.9)を含む緩衝液を、PSA−rFVIIIを含む溶液に加えて3M NaClの最終濃度を得た。この混合物をそのカラムにかけ、続いてこれを10CV平衡緩衝液(50mM Hepes緩衝液、3M NaCl、0.1%Tween80、5mM CaCl2、pH6.9)で洗浄し、rFVIII−PSAコンジュゲートを、クエン酸緩衝液(pH7.4)(13.6mM Na3クエン酸、20mM CaCl2、20mMヒスチジン、0.01%Tween80)で溶出させた。コンジュゲートを溶出させた後、pHをpH6.9に調節した。溶出液は2.5mg/mlのタンパク質を含んでいた(BCAアッセイ)。
Claims (12)
- 式Iの化合物
Zは脱離基であり、1、2、3、4、5、6、7または8の位置の少なくとも1つはY基と結合しており、
Yは、以下の構造を有する基であり、
R 2 は、−C(O)NR−または−NRC(O)−のいずれかであり、
Rは、独立に、水素または(C 1 〜C 8 )−アルキルのいずれかであり、
炭水化物は、チオエーテル結合を介して結合しており、
利用可能な1、2、3、4、5、6、7または8の位置の少なくとも1つは任意選択でX基と結合していてもよく、
Xは−SO3−R3であり、
R3は、水素、(C1〜C8)−アルキルおよび(C1〜C8)−アルキル−R4からなる群から独立に選択され、そして、
R4はポリマーである)。 - ZがN−ヒドロキシスクシンイミジル、N−ヒドロキシベンゾトリアゾリル、ハロゲン、N−ヒドロキシフタリミジル、p−ニトロフェノキシ、イミダゾリル、チアゾリジニルチオン、または、O−アシル尿素である、請求項1に記載の化合物。
- 前記炭水化物が多糖である、請求項1または2に記載の化合物。
- 前記多糖がポリシアル酸(PSA)である、請求項3に記載の化合物。
- 前記多糖が少なくとも3単位の単糖を含む、請求項3に記載の化合物。
- 式(2)の化合物
の調製方法であって、チオール基を有する炭水化物(HS−POLYMER)と、以下の式を有する中間化合物
をカップリング反応にかけて、式(2)の化合物を形成するステップを含み、ここで
POLYMERは炭水化物であり、
R1はその出現ごとに独立に(C1〜C8)−アルキルであり、
R2は、−C(O)NR−、−C(O)NR−(C1〜C8)−アルキル−NR−、−NRC(O)−および−NRC(O)−(C1〜C8)−アルキル−NRからなる群から独立に選択され、
Rは、独立に、水素または(C1〜C8)−アルキルであり、
Xは−SO3−R3であり、
R3は、水素、(C1〜C8)−アルキルおよび(C1〜C8)−アルキル−R4からなる群から独立に選択され、
R4はポリマーであり、
nは、0、1、2、3または4から選択される整数であり、
mは、1、2、3または4から選択される整数である、
方法。 - R2が、−C(O)NR−または−NRC(O)−のいずれかであり、ここで、Rは、独立に、水素またはC1〜C8−アルキルである、請求項7に記載の方法。
- 前記式(2)の化合物と、タンパク質またはペプチド薬物とを反応させるステップをさらに含む、請求項7に記載の方法。
- 請求項1から4のいずれか一項に記載の化合物およびタンパク質またはペプチド薬物を含むコンジュゲート。
- 前記タンパク質またはペプチド薬物が血漿タンパク質または血液凝固因子である、請求項11に記載のコンジュゲート。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US93716907P | 2007-06-26 | 2007-06-26 | |
US60/937,169 | 2007-06-26 | ||
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