JP5622351B2

JP5622351B2 - プロテアーゼ抵抗性ヒトおよび非ヒトＨＭＧＢ１Ｂｏｘ−Ａ変異体、ならびにそれらの治療／診断への使用

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Publication number: JP5622351B2
Application number: JP2007528791A
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Inventors: シルヴァノ・フメロ; ルシア・ベルタリオネ・ラヴァ・ロッサ; ドメニコ・ジ・バロネ; リラ・ドリッタンティ; ティエリー・ジュヨン; ジル・ボーレリー; バーバラ・カネパ; キアラ・ロレンゼット
Original assignee: クレアビリス・セラピューティクス・エスピーエー
Priority date: 2004-09-03
Filing date: 2005-09-05
Publication date: 2014-11-12
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Description

本発明は、HMGB-1高親和性結合ドメインBox-A(HMGB1 Box-A)のポリペプチド変異体、またはHMGB1 Box-Aの生物学的に活性な断片に関する。これらは、野生型HMGB1 Box-Aタンパク質中の1個のアミノ酸を系統的に変異させることによって得られたもので、かつプロテアーゼ抵抗性の改善が認められものであり、したがって、より好都合な薬物動態学的および薬物動力学的なプロフィールを有することを特徴とするものである。さらに、本発明は、細胞外HMGB1が関与する病態の診断、予防、緩和および/または治療に、当該HMGB1 Box-Aのポリペプチド分子を使用することにも関する。

敗血症および炎症の分野における最近の研究によって、それらの疾患に関して、発病機構ならびに臨床的な発病および進行をもたらす現象に関する理解が深まっている。例えば、敗血症の初期段階では、細菌の菌体内毒素が自然免疫系細胞を刺激し、これらの細胞が炎症促進性のサイトカイン(TNF、IL-1αおよびIL-6)を放出する。次いで、これら初期のサイトカインが、遅効性である下流のメディエーター(既知のタンパク質であるHMGB1と同定されている)の放出を促す。これがきっかけとなり、次に、TNF、IL-1α、IL-1β、IL-1Ra、IL-6、IL-8、IL-18、IFN-γ、PAF等のサイトカインが放出され、これらの仲介により病的な続発症が起きる。その結果、複数の系で発症したり、致命的な全身性の炎症が生じたりすることになる(Anderssonら、2002)。

HMGB1タンパク質は、高移動度(HMG:high mobility group)タンパク質のファミリーに属している。HMGタンパク質は、ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動で高い移動度を示すことから、このように呼ばれており、最も広範に存在する非ヒストン性のタンパク質であり、真核細胞から単離したクロマチンに結合している。これらのタンパク質は、DNAの屈曲、ループ形成、折りたたみおよび包み込みにおいて、「構築的」と一般に称される役割を果たしている。というのは、これらのタンパク質は、DNAの構造ならびにDNAの転写因子またはヒストンとの複合体を、歪めたり、屈曲させたり、あるいは改変したりするからである(Anderssonら、2002;Agrestiら、2003;Degryseら、2003)。高移動度1(HMGB1)タンパク質は、通常、核内因子であり、具体的には、DNAを屈曲させたり、数種の転写複合体の屈曲を促進したりする転写制御分子である。

構造的には、HMGB1タンパク質は、哺乳類の間で、高度に保存された配列を有する約25kDaのタンパク質であり、哺乳類全種にわたり、214個のアミノ酸のうち2個に保存的置換が認められる。HMGB1は、あらゆる脊椎動物の核に広範に存在し、具体的には、線維芽細胞、神経、肝実質細胞、グリア、ならびに単核球/マクロファージ、好中球および血小板をはじめとする造血幹細胞由来の細胞において認めることができる。HMGB1分子は、3つの特徴的なドメインからなる3部構造をとっている。HMG Box-AおよびBox-Bと呼ばれる2個のDNA結合ドメインと、1個の酸性のカルボキシル末端とからなっており、双極性分子である。

2個のHMGB1ボックスは、配列非特異的な、構築的DNA結合要素として本タンパク質の機能に関与しており、DNAを屈曲させて認識された歪んだDNA構造にすることができ、さらに、ヌクレオソームアセンブリーの安定化、再構築および滑り込みを行う。A-およびB-HMGボックスはいずれも、高度に保存された84個のアミノ酸残基から構成されており、正に強く帯電しており、類似のL型の折り畳みを有する3個のα-へリックスからなる形態をとっている。「L」の長腕は、N-末端延長鎖とへリックスIIIを含有し(Andressonら、2002;Agrestiら、2003;Thomas,J.O.、2001)、短腕は、へリックスIおよびIIを含んでいる。構造機能相関解析の結果、HMGB1の炎症促進性サイトカインのドメインは、B-Box、特に、最初の20個のアミノ酸配列にあることが明らかになっている。A-Boxは、HMGB1によって惹起される炎症性サイトカイン放出に対する非常に微弱な作動薬であり、B-Boxおよび本タンパク質全体の炎症促進活性を競合的に阻害する。したがって、薬学的には、A-Boxは、B-BoxおよびHMGB1によって誘発および/または維持される病的状態に対する拮抗薬として作用すると見なすことができる。

第3のドメインであるカルボキシル末端すなわち酸性の尾部は、交互に連なった30個のアスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基を含有しているため、負に極めて強く帯電しており、約20個の残基からなる塩基性の領域によって上記のボックスに結合している。マウスおよびラットのHMGB1とヒトのHMGB1との違いは、この連続したC-末端配列中のアミノ酸が2個置換されているだけである。

直鎖状の二本鎖DNAであるB型に対するHMGB1の結合は、配列非特異的で、決して強力ではない。一方、HMGB1は、核の内部において、高次コイル、ならびに十字形または、バルジおよび屈曲のような特殊な構造に対して強い親和力で結合する(Ferrariら、1992; Pontiggiaら、1993、出願第号PCT/EP2005/007198、出願人Creabilis Therapeutics)。

核に存在し、転写因子レギュレーターとして働く以外に、HMGB1は、細胞外環境でも認められている。免疫系の活性化された細胞単核球およびマクロファージによって能動的に放出されたり、あるいは損傷細胞または壊死細胞から受動的に放出されたりする(Anderssonら、2002; Scaffidiら、2002; Bonaldiら、2002; Taniguchiら、2003; Friedmanら、2003; Palumboら、2004)。

細胞外に放出されたHMGB1は、強力なサイトカインとして、かつ極めて強力なマクロファージ刺激因子として作用する。HMGB1は、細胞膜に結合することによって直接的に作用し、ケモカイン様機能により、シグナル伝達および化学走性を惹起する(Yangら、2001)。さらに、HMGB1は、炎症促進性サイトカインの発現および分泌を上方制御することによって間接的にも作用する。したがって、細胞外タンパク質は、強力な化学走性および免疫調節性タンパク質であり、効果的な炎症免疫応答を促進することができる。さらに、DNAを屈曲させることができる、HMGタンパク質のファミリーに属するその他のタンパク質も、HMGB1と共に、細胞外環境に放出される。これらのタンパク質は、特に、HMGB2、HMGB3、HMG-1L10、HMG-4LおよびSP100-HMGである。これらは、HMGB1と相同性の高いアミノ酸配列を有している。HMGB1と同様、これらは、同一の受容体に相互作用し、炎症性病態を惹起維持し、その後の下流の相互作用の経路も同一である。

健康な細胞では、HMGB1は、受動輸送および能動輸送の両方によって、細胞質へ移動する。しかし、全ての培養細胞と休止単核球は、ほとんど大部分のHMGB1を核に含有しており、このことは、ベースライン状態では移入が搬出に比べてはるかに効果的であることを示している。細胞は、HMGB1に豊富に存在するリジン残基をアセチル化することによって、HMGB1を核外に輸送していると思われる。アセチル化によって、リジン残基の塩基性の電荷が中和され、それらの残基は核局在化シグナルとして機能できないようになる。核のHMGB1が過剰アセチル化されると、このタンパク質が、(例えば、線維芽細胞においては)核から細胞質へ再配置されたり、あるいは(例えば、活性化された単核球およびマクロファージにおいては)分泌性のエンドリソソームに蓄積したりするようになる。これに続いて、非古典的小胞仲介分泌経路を介した放出へと方向が変わる。ここで、すでに活性化されている単核球によるHMGB1の分泌が、生理活性を有するリゾホスファチジルコリン(LPC)によって惹起される。この物質は、その後炎症部位において、単核球が活性化の数時間後に産出する分泌性ホスホリパーゼsPLA2の作用によって、ホスファチジルコリンから生ずる。したがって、HMGB1の分泌は、2種のシグナルによって惹起され(Bonaldiら、2003)、以下の3段階を経過するものと思われる。最初に、炎症シグナルが、HMGB1のアセチル化および核から細胞質への再配置を促進し(第1段階)、さらに、細胞質の分泌性小胞での貯蔵を促進する(第2段階)。続いて、分泌シグナル(細胞外ATPまたはリゾホスファチジルコリン)が、開口放出(エキソサイトーシス)を促進する(第3段階)(Anderssonら、2002;Scaffidiら、2002;Gardellaら、2002;Bonaldiら、2003;Friedmanら、2003)。

放出されたHMGB1は、RAGE受容体に結合するリガンドの1つであると同定されている。この受容体は、大部分の細胞型で発現しており、主に、内皮細胞、血管平滑筋細胞、単核球およびマクロファージ、ならびに単核貪食細胞中で高発現している。認識には、HMGB1のC-末端が関与する。HMGB1とRAGEが相互作用すると、RAGEの上方制御および受容体依存性シグナル伝達によって仲介される、持続性の細胞の活性化が惹起される。特に、HMGB1とRAGEとの相互作用は、***促進因子活性化タンパク質キナーゼ(MAPK)、Cdc-42、p21ras、Rac、および炎症過程に古典的に結合する転写因子である核転写因子κB(NF-κB)をはじめとする数種の細胞内シグナル伝達経路を活性化する(Schmidtら、2001)。

いくつかの実験的証拠から、放出されたHMGB1は、1つまたは複数のトール様受容体ファミリーのサブクラスに属する受容体とも相互作用することができることが示されている。さらに、HMGB1は、トロンボモジュリンの機能性N-末端レクチン様ドメイン(D1)とも相互作用することができる。トロンボモジュリンの機能性D1ドメインは、循環中のHMGB1を妨害し、それに結合することができるので、それによって、HMGB1のRAGE受容体およびトール様受容体との相互作用が阻止される。

本発明においては、「HMGB1」には、HMGB1の非アセチル化体または/およびアセチル化体を含むものとする。同様に、「HMGB1相同タンパク質」には、HMGB1相同タンパク質の非アセチル化体または/およびアセチル化体を含むものとする。好ましいHMGB1相同タンパク質は、HMGB2、HMGB3、HMG-1L10、HMG-4Lまたは/およびSP100-HMGである。

in vivoで放出されると、HMGB1は、極めて強力なサイトカインおよび強力なマクロファージ刺激因子となる。事実、内毒血症のその他のサイトカインメディエーターのように、HMGB1は、in vitroで、ヒトマクロファージから複数の炎症促進性サイトカイン(TNF、IL-1α、IL-1β、IL-1Ra、IL-6、IL-8、 MIP-1αおよびMIP-1β)のカスケードを活性化する。したがって、HMGB1は、急性炎症における逸発型メディエーターとして作用し、初期のメディエーター応答が消散した後に、全身性炎症の発病において重要な役割を果たしている。

in vitroにおいて、HMGB1に炎症促進性効果が観察されること、ならびにin vivoにおいて、循環HMGB1レベルと全身性炎症の一連の病原進行との間に相関関係が認められることから、このサイトカイン様分子を治療の標的とすることには、相応の臨床価値があるに違いないことが示唆される。HMGB1の細胞外活性に対する(選択的)拮抗薬/阻害剤を「遅れて」投与する、新規な治療方法が提示される。

したがって、この細胞外HMGB1ケモ-サイトカイン(chemo-cytokine)タンパク質を阻止する目的で、いくつかの試みがなされた。いくつかの重要な方法として、HMGB1に対する抗体、HMGB1断片(例えば、HMGB1 A-Box)、RAGEに対する抗体、可溶性RAGE(sRAGE)およびピルビン酸エチルを投与する方法が検討された(Czuraら、2003;Lotzeら、2003)。

HMGB1中和抗体を用いてマウスを受動免疫すると、TNFのピーク後に抗体を初回投与した場合でさえ、致死量の菌体内毒素に対し、極めて顕著な、用量依存性の持続する保護作用が得られた。このことから、臨床治療の遅い時期にHMGB1活性を拮抗することによって、死に至る恐れのある敗血症の効果的な治療アプローチである可能性が示唆される(Yangら、2004)。

別の可能性として、HMGB1 B-Boxと、あるいはRAGEを介してシグナル伝達するHMGB1 B-Boxの20個のアミノ酸からなる適切なコアと結合するモノ-もしくはオリゴクローナル抗体の投与があげられる。さらに、HMGB1の2個のDNA結合ドメインの1つであるHMGB1 A-Boxが、HMGB1に対する特異的な拮抗薬であると同定されている。高度に精製された組換えA-Boxが、治療を遅らせ、病態惹起24時間後に初回投与した場合でさえ、致命的な実験的敗血症からマウスを保護したとの報告がある。このことから、さらに、その他の既知のサイトカインに使用されたものに比べ、より広範な臨床関連ウインドウで、HMGB1拮抗薬を投与し良好な効果が得られる可能性が示唆される(Yangら、2004)。

HMGB1切断変異体の構造機能相関解析により、HMGB1のA-BoxドメインはHMGB1のマクロファージへの飽和性の結合を競合的に置換し、特異的にHMGB1活性を拮抗することが明らかになっている。これまでに述べてきた抗HMGB1抗体の保護活性と同様、A-Boxの投与により、敗血症を外科的に惹起した後、24時間後にようやく治療を開始した場合でさえ、マウスを敗血症から救うことができる(Yangら、2004)。HMGB1タンパク質に結合する抗体および抗体の断片からなる群から選択されるHMGB1拮抗薬または阻害剤、HMGB1遺伝子アンチセンス配列ならびにHMGB1受容体拮抗薬は、米国特許第6468533号、国際出願第WO02/074337号および米国出願第2003/0144201号に記載されている。

さらに、sRAGEを投与することによって、循環するHMGB1を飽和させると、細胞性のRAGEによって仲介されるHMGB1の活性が阻止される。この結果は、RAGE自体を、抗RAGE抗体の投与により阻害することによっても得ることができる。

その上、敗血症の過程において、類似の遅発性の保護応答が、ピルビン酸エチルの投与によって観察されている。ピルビン酸エチルは、安定な親油性の誘導体で、比較的無毒性の食品添加物である。ピルビン酸エチルは、実験的抗炎症剤としても使用され、虚血/再灌流組織障害および致命的な出血性ショックの全身性炎症を減弱する。ピルビン酸エチルは、in vitroでは、菌体内毒素によって刺激されたマウスのマクロファージからのHMGB1およびTNFの放出を阻害し、in vivoでは、腹膜炎により惹起した致命的な敗血症からマウスを保護した。ここでも、本病態を実験的に惹起して24時間後に投与を開始している。

最後に、トロンボモジュリンのN-末端レクチン様ドメイン(D1)は、HMGB1の阻害剤であることが知られている。何故なら、このドメインは、このケモカインに結合し、これを捕捉して、HMGB1がRAGEおよびトール様受容体に結合するのを阻むので、炎症性病態に至る下流のカスケードをなす現象が阻止されるからである。

上述したように、細胞外HMGB1ケモ-サイトカインタンパク質を阻害および/またはそれに拮抗する目的で、いくつかの試みがなされた。本発明は、DNAに対し高い親和力で結合する2個のドメイン、すなわちHMGB1分子内に存在するHMGB1 Box-AおよびHMGB1 Box-Bが、細胞外空間に放出された本タンパク質において、2つの対抗する役割を担っているという実験的証拠に基づいている。HMGB1 Box-Aの主たる活性は、HMGB1タンパク質が有すると思われる炎症促進性活性を仲介することである。一方、HMGB1 Box-Aは、HMGB1 Box-Bドメインの炎症促進活性と競合する拮抗薬としても作用する。
PCT出願第EP2005/007198号米国特許第6468533号国際出願第WO02/074337号米国出願第2003/0144201号国際出願第WO2004/7022593号 PCT出願第FR00/03503号 PCT出願第FR01/01366号米国出願第10/022249号米国出願第10/022390号米国出願第10/375192号米国出願第60/409898号米国出願第60/457135号米国出願第60/410258号米国出願第60/410263号国際出願第WO2004/022593号米国仮出願第60/584678号 PCT出願第EP2005/008258号「認知変異率(%)」(PAM)(Dayhoffら、Atlas of protein sequence and structure、5(3):345-352、1978)

したがって、本発明の課題は、HMGB1が関与する病態の予防、緩和および/または治療に用いる新規な薬剤を提供することにある。本発明の課題は、具体的には、HMGB1ケモカイン自体よって、かつ/またはHMGB1タンパク質の細胞外放出の結果として生じた複数の炎症性サイトカインのカスケードによって惹起された広範な病的効果を、予防、緩和および/または治療するために、選択的細胞外HMGB1拮抗薬および/または阻害剤としての新規な薬剤を開発することであった。

したがって、本課題を解決するための手段は、ヒトおよび/または非ヒトのHMGB-1高親和性結合ドメインBox-A(HMGB1 Box-A)のポリペプチド変異体、あるいはヒトおよび/または非ヒトのHMGB1 Box-Aの生物学的に活性な断片のポリペプチド変異体を提供することであり、1個または複数の単一のアミノ酸が変異しているという点で、当該ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、野生型HMGB1 Box-Aタンパク質のアミノ酸配列とは異なるという特徴を有する。驚くべきことに、本発明の発明者らは、当該ポリペプチド変異体においては、野生型HMGB1 Box-Aまたは野生型HMGB1 Box-Aの生物学的に活性な断片よりも、タンパク質分解に対する抵抗性が向上していることを見出した。

プロテアーゼのタンパク質分解活性に対する抵抗性を向上させることによって、より好都合な薬物動態学的および薬物動力学的なプロフィールを達成することができる。何故なら、本発明のポリペプチド変異体の体液中での安定性を高めることができるからである。その結果として、体液中で、本発明のタンパク質の変異体の半減期の延長も認められる。タンパク質のin vivoでの推定半減期は、わずか数分であることが知られている。本発明の変異体は、プロテアーゼ抵抗性が高まっている等の理由から、より長い半減期を有していることが好ましい。

本発明の最も好ましい実施形態においては、定向進化の手法(directed evolution process)を使用することによって、ポリペプチド変異体を得る。この技術は、国際出願第WO2004/7022593号ならびにその他のいくつかの特許出願(PCT出願第FR00/03503号、PCT出願第FR01/01366号、米国出願第10/022249号、米国出願第10/022390号、米国出願第10/375192号、米国出願第60/409898号、米国出願第60/457135号、米国出願第60/410258号および米国出願第60/410263号)に広範に記載されている。これらはいずれも、Nautilus Biotech S.A.(パリ、フランス)による出願で、参照によって本明細書に組み入れられている。

一般に、「定向進化」という用語は、標的タンパク質の特徴を改良するための生物工学の手法を意味し、それは、当該タンパク質のアミノ酸配列に特定の変化をもたらすことによってなされる。定向進化法では、標的遺伝子の変異遺伝子ライブラリーを作製するステップと、次いで、所望の特徴を示す変異遺伝子を選択するステップとを含む。この手法は繰り返すことができ、その場合、所望の特徴が改善された遺伝子産物を、さらに変異させ選択し、これを何度も行う。

HMGB1タンパク質のBox-Aを最適化し、かつプロテアーゼに対してより優れた安定性を有する本発明のポリペプチド変異体を得るために、Nautilus社が特許出願中の特定の定向進化の手法が応用されている。具体的には、いわゆる2次元合理的変異誘発スキャニング法(two-dimensional rational mutagenesis scanning approach;"2-D scanning")を応用してきている。本法は、Nautilus社の国際出願第WO2004/022593号に記載されており、本出願は、参照によって本明細書に組み入れられている。

タンパク質の合理的進化に用いるNautilus社の2-D scanning法は、適切なアミノ酸位置において求められる適切なアミノ酸の変化を見出すために、標的タンパク質を、連続的に変異誘発させることによって、2次元的にスキャンするプロセスに基づいている。スキャンする第1次元は、標的タンパク質配列上のアミノ酸の位置である。これは、異なるアミノ酸で置換しようとする特定のアミノ酸残基を同定するために行う。これらのアミノ酸の位置は、is-HIT標的位置と呼ばれる。第2次元は、特定のis-HIT標的位置を置換するために選択される特定のアミノ酸の種類である。2-D scanning法の特定の方法によれば、タンパク質配列上で、標的位置をいくつかin silico(コンピュータ)で選択する。本明細書では、in silicoとは、コンピュータを使用して実施する研究および実験を意味する。これに関しては、in silico法には、それらに限定されないが、分子モデル化法(molecular modeling study)および生体分子ドッキング実験(biomolecular docking experiment)が含まれる。したがって、生物学的な実験法を使用することなく、タンパク質配列上のアミノ酸標的位置が同定される。最適化しようとするタンパク質の特徴が選択されると、異なるアミノ酸で置換することによって当該タンパク質の適合性を向上させるために変化させることが可能であろうアミノ酸位置を決定することを目指して、広範な情報源または以前の知見が利用される。具体的には、「is-HIT標的位置」は、以下の3つの要因をもとに同定される。(i)進化および最適化させようとするタンパク質の特徴、(ii)当該タンパク質のアミノ酸配列、および/または(iii)個々のアミノ酸の既知の性質。

本発明に限って、「in silico HIT」(「is-HIT」)とは、プロテアーゼのタンパク質分解活性の標的として関わると思われる、標的タンパク質の一次配列上の候補アミノ酸位置として予想されるもの全てを意味する。本発明の観点から検討された、プロテアーゼの特定のリスト(図1)をもとに、野生型HMGB1 Box-Aのアミノ酸配列内で、標的とすることができるであろうと思われる全てのアミノ酸配列の完全なリストを決定する。

is-HIT標的位置が選択されると、次いで、変異誘発を行う。変異誘発は、タンパク質のバックボーン上の特定のアミノ酸標的位置における単一のアミノ酸残基を置換することによってもたらされる。この変異誘発は、アドレスで参照可能なアレイ中で、「1対1」の対応で残基を置換することによって行い、標的アミノ酸位置のそれぞれにおいて、あらかじめ選択されたアミノ酸変化を含有する分子を作成する。

置換するアミノ酸の選択にあたっては、必須である残基(例えば、触媒性および結合性残基)の疎水性、電荷および/または極性等の物理化学的性質を保存する必要性を考慮する。置換するアミノ酸を選択する多くの方法が、当技術分野において周知である。特に、アミノ酸置換マトリックスが、この目的に使用されている。本発明において、非常に好ましい方法では、図2に示す、いわゆる「認知変異率(%)」(PAM)(Dayhoffら、Atlas of protein sequence and structure、5(3):345-352、1978)を使用する。置換アミノ酸の適切な群を選択するために、PAM値を使用する。PAM値は、もともとタンパク質の配列比較のために開発されたものであるが、進化距離を反映する、確率マトリックスの形態で入手できる。参照配列中の残基の「保存的置換」とは、対応する参照残基と物理的および機能的に類似する置換である。例として、類似の大きさ、形、電荷、共有結合または水素結合を形成する能力をはじめとする化学的性質等を有する置換基があげられる。好ましい保存的置換基は、「許容点変異」の形態でPAMマトリックス基準に適合する最も高いスコアを示す。PAM250マトリックスを2-D scanning法に使用し、タンパク質の機能を変化させずに保存的変異を起こすために、is-HITを置換するアミノ酸を同定する。少なくとも、「保存的置換基」または「許容点変異」に対応するPAM250マトリックスにおける最高値を有するアミノ酸が2個選択される。システイン残基によるアミノ酸の置換は、積極的に避ける。というのは、この変化によって、分子間ジスルフィド結合が形成される恐れがあるからである。

上記のNautilus Biotech社の定向進化法を使用して、本出願の発明者らは、HMGB1 Box-Aのポリペプチド変異体を得ることができた。この変異体は、未変性の標的ポリペプチドのアミノ酸配列とは、1個または複数の変異によって異なっている。

本発明では、「HMGB1 Box-AまたはHMGB1 Box-Aのアミノ酸配列」という用語は、ヒトHMGB1 Box-Aおよび非ヒトHMGB1 Box-Aのいずれをも意味する。本発明の好ましい実施形態では、野生型ヒトHMGB1 Box-Aタンパク質および野生型Anopheles gambia HMGB1 Box-Aタンパク質において、プロテアーゼに対して重要なis-HIT位置の単一のアミノ酸を系統的に変異させた。適切な構造解析および系統学的解析により、ヒトおよびAnopheles HMGB1 Box-Aが、68%同一性および88%相同性を示したことから、本出願の発明者らは、Anopheles gambia種を選んだ。

本明細書の「HMGB1 Box-Aの生物学的に活性な断片」には、既知の野生型HMGB1 Box-Aタンパク質の一部を含む。このようなタンパク質の一部には、対応する成熟タンパク質の生物学的活性の少なくとも1つが、既知の試験によって依然として認められる。好ましくは、HMGB1 B-BoxおよびHMGB1タンパク質全体の炎症促進性活性に対する拮抗活性が検出できる場合、この成熟したタンパク質の断片が生物学的に活性であると見なされる。未変性HMGB1 Box-Aの生物学的に活性な断片は、少なくとも20、25、30、35、45、50、55、60、65、70、75または80個のアミノ酸からなる断片である。本発明の好ましい未変性HMGB1 Box-Aの生物学的に活性な断片として、少なくとも77個のアミノ酸からなる断片または少なくとも54個のアミノ酸からなる断片のいずれかを含む。

本発明では、「変異」という場合、標的配列の単一のアミノ酸に置換、欠失および/または付加が生じていることと理解されたい。好ましくは、本発明の標的配列の変異は、置換である。遺伝的にコードされた異なるアミノ酸で置換されてもよいし、あるいは非遺伝的にコードされたアミノ酸で置換されてもよい。非遺伝的にコードされたアミノ酸の例として、ホモシステイン、ヒドロキシプロリン、オルニチン、ヒドロキシリジン、シトルリン、カルニチン等がある。

定向進化法を使用することによって得られる本発明のポリペプチド変異体は、1個または複数の単一アミノ酸が変異したことによって、野生型HMGB1 Box-Aのアミノ酸配列とは異なる変異タンパク質である。本発明の非常に好ましい実施形態は、未変性タンパク質の配列上に起きているアミノ酸置換が1個のみの場合である。この場合、本発明のポリペプチド変異体は、未変性タンパク質の改変によって得られ、改変の結果、変異体のアミノ酸配列は、is-HIT標的位置のうちの1箇所においてのみ単一のアミノ酸が変化している点で、未変性タンパク質のアミノ酸配列とは異なる。しかし、本発明では、同一のタンパク質分子上で、複数、例えば2箇所以上のis-HIT標的位置で置換することによって、未変性タンパク質を、さらに最適化することもできる。本発明のこのような変異体の場合、単一のタンパク質分子に単一の変異を合わせることによってポリペプチド変異体を得る。複数の単一アミノ酸置換を有する、改変ポリペプチド変異体は、1〜10、好ましくは、2、3、4、5および6個の異なるアミノ酸標的位置におけるアミノ酸置換によって、野生型タンパク質の配列とは異なることができる。

本発明に使用する方法を用いて作成した一連のポリペプチド変異体の中から、有望な候補を選択するにあたっては、より好都合な薬物動態学的プロフィールと薬物動力学的プロフィールの両方を根拠とした。より好都合なプロフィールとは、薬物動態学的には、プロテアーゼに対してより長期の抵抗性を示すことを意味し、薬物動力学的には、内因性の活性および結合親和性が高まっており、それによって未変性HMGB1 Box-Aタンパク質よりも優れた拮抗活性を示すことを意味する。

本発明の特定の実施形態では、出発未変性タンパク質としてヒトHMGB1 Box-Aから出発して、3群のポリペプチド変異体を得る。具体的には、ポリペプチド変異体の1群は、ヒトHMGB1 Box-A由来の完全長アミノ酸配列(84個のアミノ酸)に単一の変異を導入して得る。ヒトHMGB1 Box-Aの生物学的に活性な断片である77個のアミノ酸および54個のアミノ酸のそれぞれを出発物質として、本発明のポリペプチド変異体のその他の2つの群は作成される。

本発明の別の特定の実施形態では、出発未変性タンパク質としてAnopheles gambia HMGB1 Box-Aから出発して、3群のポリペプチド変異体を得る。具体的には、ポリペプチド変異体の1群は、Anopheles gambia HMGB1 Box-A由来の完全長アミノ酸配列(84個のアミノ酸)に単一の変異を導入して得る。Anopheles gambia HMGB1 Box-Aの生物学的に活性な断片である77個のアミノ酸および54個のアミノ酸のそれぞれを出発物質として、本発明のポリペプチド変異体のその他の2つの群は作成される。

したがって、上記の本発明の非常に好ましいポリペプチド変異体は、以下のように定義される。

1)配列番号1(図3a)に示す84個のアミノ酸からなる完全長断片であるヒトHMGB1 Box-A上で、種々のプロテアーゼ(図1を参照)の基質として認識される53個のアミノ酸の位置が同定されている。以下の番号は、野生型タンパク質の番号に対応する:
K2、D4、P5、K6、K7、P8、R9、K11、M12、Y15、F17、F18、R23、E24、E25、K27、K28、K29、P31、D32、F37、E39、F40、K42、K43、E46、R47、W48、K49、M51、K54、E55、K56、K58、F59、E60、D61、M62、K64、D66、K67、R69、Y70、E71、R72、E73、M74、K75、Y77、P79、P80、K81、E83。

これらの位置のそれぞれにおける未変性アミノ酸が、置換マトリックスPAM250(図2を参照)によって規定される残基で置換されている。具体的には、行われた残基の置換を以下に列挙する。

RからH、Q
EからH、Q、N
KからQ、T
DからN、Q
MからI、V
PからA、S
YからI、H
FからI、V
WからY、S

ヒトHMGB1のBox-Aのポリペプチド変異体を合計115個作成した(図3a)。これらのポリペプチド変異体を、配列番号2〜116に示す。

2)配列番号117(図4a)に示す77個のアミノ酸からなるヒトHMGB1 Box-Aの生物学的に活性な断片上で、種々のプロテアーゼ(図1を参照)の基質として認識される48個のアミノ酸の位置が同定されている。以下の番号は、配列番号117中それらの位置を示す:
P1、R2、K4、M5、Y8、F10、F11、R16、E17、E18、K20、K21、K22、P24、D25、F30、E32、F33、K35、K36、E39、R40、W41、K42、M44、K47、E48、K49、K51、F52、E53、D54、M55、K56、D59、K60、R62、Y63、E64、R65、E66、M67、K68、Y70、P72、P73、K74、E76。

77個のアミノ酸からなる、ヒトHMGB1のBox-Aの断片のポリペプチド変異体を合計105個作成した(図4b)。これらのポリペプチド変異体を、配列番号118〜222に示す。

3)配列番号223(図5a)に示す54個のアミノ酸からなるヒトHMGB1 Box-Aの生物学的に活性な断片上で、種々のプロテアーゼ(図1)の基質として認識される35個のアミノ酸の位置が同定されている。以下の番号は、配列番号223中それらの位置を示す:
P1、D2、F7、E9、F10、K12、K13、E16、R17、W18、K19、M21、K24、E25、K26、K28、F29、E30、D31、M32、K34、D36、K37、R39、Y40、E41、R42、E43、M44、K45、Y47、P49、P50、K51、E53。

54個のアミノ酸からなる、ヒトHMGB1のBox-Aの断片のポリペプチド変異体を合計77個作成した(図5b)。これらのポリペプチド変異体を、配列番号224〜300に示す。

4)配列番号301(図6a)に示す84個のアミノ酸からなる完全長断片であるAnopheles gambia(XP_311154)HMGB1 Box-A上で、種々のプロテアーゼ(図1)の基質として認識される53個のアミノ酸の位置が同定された。以下の番号は、未変性タンパク質の位置を示す:
K2、K4、D5、K7、P8、R9、R11、M12、Y15、F17、F18、R23、E24、E25、K27、K28、K29、P31、E32、E33、F37、E39、F40、R42、K43、E46、R47、W48、K49、M51、L52、D53、K54、E55、K56、R58、F59、E61、M62、E64、K65、D66、K67、R69、Y70、E71、L72、E73、M74、Y77、P79、P80、K81。

これらの位置のそれぞれにおける未変性アミノ酸が、置換マトリックスPAM250(図2を参照)によって規定される残基で置換されている。実際に行われた残基の置換を以下に列挙する。

Anopheles gambia(XP_311154)HMGB1のBox-Aの変異体を合計117個作成し(図6b)、配列番号302〜418の配列中に同定した。

5)配列番号419(図7a)に示す77個のアミノ酸からなるAnopheles gambia(XP_311154)HMGB1 Box-Aの生物学的に活性な断片上で、種々のプロテアーゼ(図1を参照)の基質として認識される49個のアミノ酸の位置が同定された。以下の番号は、配列番号419中それらの位置を示す:
P1、R2、R4、M5、Y8、F10、F11、R16、E17、E18、K20、K21、K22、P24、E25、E26、F30、E32、F33、R35、K36、E39、R40、W41、K42、M44、L45、D46、K47、E48、K49、R51、F52、E54、M55、E57、K58、D59、K60、R62、Y63、E64、L65、E66、M67、Y70、P72、P73、K74。

これらの位置のそれぞれにおける未変性アミノ酸が、置換マトリックスPAM250(図2を参照)によって規定される残基で置換された。実際に行われた残基の置換を以下に列挙する。

77個のアミノ酸からなる、HMGB1断片のBox-Aのポリペプチド変異体を合計109個作成した(図7b)。これらのポリペプチド変異体を、配列番号420〜528に示す。

6)配列番号529(図8a)に示す54個のアミノ酸からなるAnopheles gambia(XP_311154)HMGB1 Box-Aの生物学的に活性な断片上で、種々のプロテアーゼ(図1を参照)の基質として認識される36個のアミノ酸の位置が同定された。以下の番号は、配列番号529中それらの位置を示す:
P1、E2、E3、F7、E9、F10、R12、K13、E16、R17、W18、K19、M21、L22、D23、K24、E25、K26、R28、F29、E31、M32、E34、K35、D36、K37、R39、Y40、E41、L42、E43、M44、Y47、P49、P50、K51。

54個のアミノ酸からなる、Anopheles gambia(XP_311154)HMGB1のBox-Aの断片のポリペプチド変異体を合計81個作成した(図8b)。これらのポリペプチド変異体を、配列番号530〜610に示す。

本明細書に記載されている種々のアミノ酸配列中のアミノ酸は、既知の一文字によるコード化表示によって示されていることに留意されたい。さらに、一文字によるコード化表示によって本明細書に示されているアミノ酸残基配列はいずれも、慣例に従って、左から右に向けて、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって表示されていることにも留意されたい。

したがって、本発明は、プロテアーゼおよび/またはペプチダーゼのタンパク質分解活性に対して、野生型HMGB1のBox-Aタンパク質より優れた抵抗性を示す改変ポリペプチド変異体を提供するものである。本発明のポリペプチド変異体においては、特に、ヒトのプロテアーゼおよび/またはペプチダーゼ、とりわけ、ヒト血清プロテアーゼおよび/またはヒト胃腸管のプロテアーゼもしくはペプチダーゼのタンパク質分解活性に対する抵抗性が向上している。好ましいプロテアーゼが、図1に列挙されている。本発明のより好ましい実施形態では、ポリペプチド変異体においては、キモトリプシン、トリプシン、エンドプロテアーゼ、エンドペプチダーゼおよびそれらの組合せを含む群から選ばれた少なくとも1つのプロテアーゼのタンパク質分解活性に対する抵抗性が向上している。

具体的には、タンパク質分解作用に対する抵抗性は、未改変である野生型HMGB1のBox-Aに比べ、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、70%、80%、90%、95%またはそれ以上高まっている。20μgのBox-Aの野生型または変異体をタンパク質の全量に対して1%w/wの濃度でプロテアーゼを含有する混合物と共に、25℃で、インキュベートし、(5分と8時間の間の)種々の時点において、プロテアーゼ抵抗性を求めた。プロテアーゼの混合物は、原液から測定の度に調製した。原液には、200μg/mlのエンドプロティナーゼGlu-C(SIGMA社製)、400μg/mlのトリプシン(SIGMA社製)および400μg/mlのα-キモトリプシン (SIGMA社製)を含有する。プロテアーゼとインキュベートした後、抗プロテアーゼ溶液 (Roche社製)を10μl加えて、反応を停止させた。試料は、-20℃で保存し、生物学的活性の測定に供した。

プロテアーゼ活性に対して抵抗性が向上した結果、安定性が高まる。それによって、さらに、本発明のポリペプチド変異体の体液中における半減期が、野生型HMGB1のBox-Aよりも長くなる。具体的には、血清および/または血液中の半減期が延長し、そのため、野生型HMGB1のBox-Aと比較して、少なくとも10分、20分、30分、60分またはそれ以上の延長が認められる。

本発明の別の態様は、本発明のポリペプチド変異体をコードする核酸分子である。具体的には、本発明では、配列番号2〜116、118〜222、224〜300、302〜418、420〜528および530〜610に示すポリペプチド変異体をコードする核酸分子を含む。

本発明のさらに別の態様は、上記で定義した核酸分子を含むベクターである。

さらに、本発明は、上記のポリペプチド変異体を作成する方法であって、(i)上記で定義した核酸分子を宿主細胞に導入するステップと、(ii)上記細胞を、コードされたポリペプチド変異体が発現する状態下で培養するステップとを含む方法を含む。好ましくは、宿主細胞は、哺乳類、昆虫または細菌にする細胞であり、特に、大腸菌、好ましくは、M15株である。

上記のポリペプチド変異体を作成する別の方法では、ペプチドの化学合成法、例えば、標準的な方法による固相ペプチド合成法を使用する。

本発明のポリペプチド変異体は、タンパク質分解に対する抵抗性が向上しており、したがって、未改変である野生型のタンパク質に比べ、安定性が優れている。その結果、本発明のペプチドはまた、治療的および生物学的特徴ならびに活性が改善されている。事実、これらは、未変性HMGB1のBox-Aと比較して、より好都合な薬物動態学的および薬物動力学的なプロフィールを示す。

したがって、本発明の目的は、HMGB1 Box-AまたはHMGB1 Box-Aの生物学的に活性な断片の配列中の単一のアミノ酸を系統的に変異させることによって得た、上記のHMGB1 Box-Aのポリペプチド変異体を、医薬品中の活性剤として使用することである。

したがって、本発明のさらに別の態様は、細胞外HMGB1に関連する病態またはHMGB1に相同なタンパク質に関連する病態の予防および/または治療に用いる医薬品を製造するために本発明のポリペプチド変異体を使用することである。具体的には、HMGB1に関連する病態とは、複数の炎症性サイトカインカスケードによって仲介される病態である。

HMGB1ケモカインおよびHMGB1によって惹起される炎症性サイトカインのカスケードによって誘発される病態は広い範囲におよび、以下のように大別される。炎症性疾患、自己免疫疾患、全身性炎症反応症候群、臓器移植後の再灌流障害、心血管病、産婦人科系疾患、(ウイルス性および細菌性)感染症、アレルギー性およびアトピー性疾患、固形腫瘍および液性腫瘍の病態、移植拒絶反応、先天性疾患、皮膚疾患、神経疾患、悪液質、腎疾患、医原性中毒状態、代謝疾患ならびに特発性疾患。

本発明のHMGB1に関連する病態とは、好ましくは、炎症性サイトカインカスケードの活性化によって仲介される病的状態をいう。本発明を使用して通常治療することができる状態の例として、これらに限定されないが、HMGB1ケモカインおよびHMGB1によって惹起される炎症性サイトカインのカスケードによって誘発される病態は広い範囲におよび、以下のように大別される。再狭窄およびその他の心血管病、再灌流障害、炎症性腸疾患、全身性炎症反応症候群(例えば、敗血症、成人呼吸促迫症候群等)等の炎症性疾患、リウマチ性関節炎、変形性関節炎等の自己免疫疾患、産婦人科系疾患、感染症、喘息、湿疹等のアトピー性疾患、腫瘍の病態、例えば臓器または組織移植に伴う固形または非固形腫瘍の疾患(具体例として、臓器移植後の再灌流障害、臓器拒絶反応および移植片対宿主病)、先天性疾患、乾癬、脱毛症等の皮膚疾患、神経疾患、眼科疾患、腎疾患、代謝疾患、特発性疾患および中毒状態、例えば医原性毒性。ただし、上記の疾患が、HMGB1タンパク質の放出が原因で、HMGB1タンパク質の放出に関連して、かつ/またはHMGB1タンパク質の放出に伴って生じる場合をいう。

具体的には、炎症性疾患および自己免疫疾患に属する病態として、リウマチ性関節炎/血清陰性関節疾患、変形性関節炎、炎症性腸疾患、クローン病、腸梗塞、全身性エリテマトーデス、虹彩毛様体炎/ブドウ膜炎、視神経炎、特発性肺線維症、全身性血管炎/ウェゲナー肉芽腫、サルコイドーシスおよび精巣炎/精管復元術があげられる。全身性炎症反応には、敗血症症候群(グラム陽性敗血症、グラム陰性敗血症、培養陰性敗血症、真菌性敗血症、好中球減少性発熱、尿路性敗血症および肺血性結膜炎を含む)、髄膜炎菌血症、外傷性出血、hums、電離放射線被爆、急性および慢性の前立腺炎、急性および慢性の膵臓炎、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、腹膜炎、潰瘍性大腸炎、偽膜性大腸炎、急性大腸炎、虚血性大腸炎、憩室炎、アカラシア、胆肝炎、胆嚢炎、腸炎ならびに成人呼吸促迫症候群(ARDS)が含まれる。再灌流障害には、post-pump症候群および虚血再灌流障害が含まれる。心血管病には、心機能不全症候群(cardiac stun syndrome)、心筋梗塞および虚血症、アテローム性動脈硬化症、血栓性静脈炎、心内膜炎、心膜炎、うっ血性心不全ならびに再狭窄が含まれる。産婦人科系疾患には、早産、子宮内膜症、流産、膣炎および不妊症が含まれる。感染症には、HIV感染症/HIV神経障害、髄膜炎、B型およびC型肝炎、単純ヘルペス感染、敗血症性関節炎、腹膜炎、E.coli O157:H7、肺炎、喉頭蓋炎、溶血性尿毒素症症候群/血栓性溶解性血小板減少性紫斑病(thrombolytic thrombocytopenic purpura)、カンジダ症、糸状虫症、アメーバ症、マラリア、デング出血熱、リーシュマニア症、ライ病、毒素ショック症候群、レンサ球菌性筋肉炎、ガス壊疽、結核菌、マイコバクテリウム・アビウム・イントラセルラーレ、カリニ肺炎、骨盤内炎症性疾患、精巣炎/精巣上体炎、レジオネラ、ライム病、A型インフルエンザ、エプスタイン-バーウイルス、サイトメガロウイルス、ウイルス関連部分非食作用症候群(viral associated hemiaphagocytic syndrome)ならびにウイルス性脳炎/無菌性髄膜炎が含まれる。アレルギー性およびアトピー性疾患には、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合体病、枯草熱、アレルギー性鼻炎、湿疹、アレルギー性接触性皮膚炎、アレルギー性結膜炎および過敏性肺炎が含まれる。悪性腫瘍(液性腫瘍および固形腫瘍の病態)には、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、結腸直腸癌、上咽頭癌、悪性組織球症ならびに腫瘍随伴症候群/悪性の高カルシウム血症が含まれる。移植疾患には、移植拒絶反応および移植片対宿主病が含まれる。先天性疾患には、嚢胞性線維症、家族性食血細胞性リンパ組織球症(familial hematophagocytic lymphohistiocytosis)および鎌状赤血球貧血が含まれる。皮膚病には、乾癬、乾癬性関節炎および脱毛症が含まれる。神経疾患には、神経変性疾患(多発性硬化症、偏頭痛、頭痛、アミロイド関連病態、プリオン病/クロイツフェルト-ヤコブ病、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症および筋萎縮性側索硬化症)、ならびに末梢神経障害、偏頭痛および頭痛が含まれる。腎疾患には、ネフローゼ症候群、血液透析および***が含まれる。医原性中毒状態には、OKT3療法、抗CD3療法、サイトカイン療法、化学療法、放射線療法および慢性サリチル酸中毒が含まれる。代謝疾患および特発性疾患には、ウィルソン病、血色素症、α1アンチトリプシン欠乏症、糖尿病、体重減少、摂食障害、悪液質、肥満、橋本甲状腺炎、骨粗鬆症、視床下部-下垂体-副腎軸の評価および原発性胆汁性肝硬変が含まれる。眼科疾患として、緑内障、網膜症およびドライアイが含まれる。その他の病態として、多臓器不全症候群、筋ジストロフィー、敗血症性髄膜炎、アテローム性動脈硬化症、喉頭蓋炎、ウィップル病、喘息、アレルギー、アレルギー性鼻炎、臓器の壊死、発熱、敗血症、内毒素ショック、異常高熱症、好酸球肉芽腫症、肉芽腫症、サルコイドーシス、敗血症性流産、尿道炎、肺気腫、鼻炎、肺胞炎、気管支炎、咽頭炎、上皮性関門障害、ニューモウルトラミクロピクシリコボルカノコニオーシス(pneumoultramicropicsilicovolcanoconiosis)、胸膜炎、副鼻腔炎、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス感染症、散発性菌血症、単包虫症、皮膚筋炎、熱傷、日焼け、蕁麻疹、warst、膨疹、脈管炎、血管炎、心筋炎、関節炎、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、セリアック病、脳炎、脳梗塞症、Guillaume-Barre症候群、神経炎、神経痛、医原性の合併症/末梢神経病変、脊髄損傷、麻痺、ブドウ膜炎、関節炎(arthriditis)、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、通風、歯周病、滑膜炎、重症筋無力症、グッドパスチャー症候群、Babcets症候群、強直性脊椎炎、バルジェ病、Retier症候群、水疱性皮膚炎(水疱性類天疱瘡)、天疱瘡および尋常性天疱瘡、ならびに脱毛症があげられる。

本発明の別の態様は、ヒトHMGB1 Box-Aおよび非ヒトHMGB1 Box-Aまたは上記のHMGB1 Box-Aの生物学的に適切な断片のアミノ酸配列を系統的に変異させることによって得たポリペプチド変異体を、さらに別の薬剤と組み合わせて使用することである。

この別の薬剤は、好ましくは、炎症性サイトカインカスケードの初期のメディエーターを阻害することができる薬剤である。これらの別の薬剤は、好ましくは、TNF、IL-1α、IL-1β、IL-Ra、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13、IL-18、IFN-γ、MIP-1α、MIF-1β、MIP-2、MIFおよびPAFからなる群から選択されるサイトカインに対する拮抗薬または阻害剤である。

HMGB1 Box-AまたはHMGB1 Box-Aの生物学的に適切な断片のポリペプチド変異体と組み合わせて使用する、この別の薬剤は、RAGEに対する抗体等のRAGEの阻害剤、アンチセンス分子、リボザイムもしくはRNA干渉分子等のRAGEの発現を阻害することができる核酸または核酸類似体、HMGB1、好ましくは、HMGB1の非アセチル化もしくは/およびアセチル化体のRAGEとの相互作用を拮抗する合成小分子からなる薬剤、または可溶性RAGE(sRAGE)であることもできる。RAGEに対する抗体は、好ましくは、モノクローナル抗体、より好ましくは、キメラもしくはヒト化抗体または組換え抗体であり、例えば、一本鎖抗体またはそのような抗体の抗原結合断片があげられる。可溶性RAGE類似体を、融合タンパク質、例えば、ヒト抗体のFcドメインとの融合タンパク質として、場合により存在させることもできる。HMGB1のRAGEとの相互作用を拮抗する合成小分子からなる薬剤は、好ましくは、1000ダルトンを下回る分子量を有する。合成小分子拮抗薬は、好ましくは、RAGEの、HMGB1の非アセチル化もしくは/およびアセチル化体との相互作用、ならびにRAGEのHMGB1相同タンパク質、具体的には、HMGB2、HMGB3、HMG-1L10、HMG-4Lまたは/およびSP100-HMGの非アセチル化もしくは/およびアセチル化体との相互作用を阻害する。

HMGB1 Box-AまたはHMGB1 Box-Aの生物学的に適切な断片のポリペプチド変異体と組み合わせて使用する、この別の薬剤は、TLR2、TLR4、TLR7、TLR8または/およびTLR9等のトール様受容体(TLR)のHMGB1との相互作用の阻害剤であることもできる。このような阻害剤は、好ましくは、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体、アンチセンス分子、リボザイムもしくはRNA干渉分子等のTLRの発現を阻害することができる核酸または核酸類似体、または合成分子、好ましくは、1000ダルトン未満のサイズの合成分子である。このような阻害剤は、トール様受容体の既知の阻害剤であることができる。具体的なトール様受容体は、TLR2、TLR4、TLR7、TLR8または/およびTLR9である。この阻害剤は、好ましくは、トール様受容体のHMGB1の非アセチル化もしくは/およびアセチル化体との相互作用、ならびにトール様受容体の、HMGB1相同タンパク質、具体的には、HMGB2、HMGB3、HMG-1L10、HMG-4Lまたは/およびSP100-HMGの非アセチル化もしくは/およびアセチル化体との相互作用を阻害する。

さらに別の態様では、HMGB1 Box-AまたはHMGB1 Box-Aの生物学的に適切な断片のポリペプチド変異体と組み合わせて使用する、この別の薬剤は、トロンボモジュリンの機能性N-末端レクチン様ドメイン(D1)である。トロンボモジュリンのD1ドメインは、放出されたHMGB1の非アセチル化もしくは/およびアセチル化体、ならびに放出されたHMGB1相同タンパク質、具体的には、HMGB2、HMGB3、HMG-1L10、HMG-4Lまたは/およびSP100-HMGの非アセチル化もしくは/およびアセチル化体を妨害し、それによって、それらがRAGEおよびトール様受容体と相互作用するのを阻害することができる。トロンボモジュリンのD1ドメインは、未変性であっても、変異体であっても、プロテアーゼ抵抗性を得ることができる。

この別の薬剤は、屈曲形構造を有する合成二本鎖の核酸または核酸類似体分子であることもできる。具体的には、二本鎖屈曲のDNA、PNAまたはDNA/PNAのキメラもしくはハイブリッド、あるいは二本鎖十字形のDNA、PNAまたはDNA/PNAのキメラもしくはハイブリッド構造で、HMGB1タンパク質に結合することができるものである。好ましい核酸または核酸類似体分子は、現在共同係争中である2005年7月4日出願の共同所有の国際特許出願PCT出願第EP2005/007198号(2004年7月2日出願の米国仮出願第60/584678号の優先権を主張している)に開示されている。本出願は、参照によって本明細書に組み入れられている。屈曲形構造を有する合成二本鎖の核酸または核酸類似体分子は、好ましくは、HMGB1の非アセチル化もしくは/およびアセチル化体、ならびにHMGB1相同タンパク質、具体的には、HMGB2、HMGB3、HMG-1L10、HMG-4Lまたは/およびSP100-HMGの非アセチル化もしくは/およびアセチル化体に結合することができる。

さらに別の態様では、本発明のポリペプチド変異体と組み合わせて使用する、この別の薬剤は、K-252aまたは/およびその塩もしくは誘導体、あるいはK-252aまたは/およびその誘導体のポリマー複合体である。K-252aあるいはK-252aおよびその誘導体のポリマー複合体の使用は、共同所有かつ現在共同係争中の2005年8月25日出願の国際特許出願PCT出願第EP2005/008258号および米国仮出願に開示されている。

したがって、本発明の別の態様は、HMGB1に関連する病態の治療に用いる有効成分として、HMGB1 Box-AまたはHMGB1 Box-Aの生物学的に活性な断片のポリペプチド変異体の少なくとも1種の有効量と、薬学的に許容される担体、希釈剤および/またはアジュバントとを含む薬学的組成物である。本発明の薬学的組成物は、好ましくは、HMGB1の非アセチル化もしくは/およびアセチル化体、または/ならびにHMGB1相同タンパク質の非アセチル化もしくは/およびアセチル化体に関連する病態の治療に適する。さらに好ましい実施形態においては、少なくとも1種のポリペプチド変異体を含む本発明の薬学的組成物が、さらに、上記で定義された別の薬剤を含む。本発明の薬学的組成物は、診断に利用されてもよいし、または治療に利用されてもよい。

的確な製剤、投与経路および用量は、個々の医師が患者の状態に照らしてその都度選択することができる。単回投与してもよいし、または間隔をあけて投与を繰り返してもよい。患者に症状の寛解または延命効果をもたらすような治療効果を提供するために、用量および投与間隔を個別に調節することができる。当然のことながら、組成物の実際の投与量は、患者の状態、患者の体重、疾患の重症度、投与経路および処方医師の判断によって異なるであろう。適切な1日あたりの投与量の範囲は、0.001〜10mg/kgであり、特に、0.1〜5mg/kgであろう。

既知の方法によって、投与することができる。例えば、特に、静脈注射、筋肉内注射、経粘膜注射、皮下注射もしくは腹腔内注射等の注射、ならびに/または経口、外用、経鼻、吸入、エアロゾルおよび/もしくは直腸投与等である。局所投与であっても、全身投与であってもよい。

さらに、本発明の発明品であるHMGB1 Box-AまたはHMGB1 Box-Aの薬学的に活性な断片の変異体を、医療用具または薬物の放出/輸送系(マイクロスフェア)の表面および/もしくは内部に、可逆的に固定化および/または吸着させることもできる。本発明の発明品であるBox-Aのポリペプチド変異体を、医療用具またはマイクロスフェアの表面上にあるいはそのような表面の被覆層上に、結合、浸透および/あるいは吸着させることによって、医療用具およびマイクロスフェアに可逆的に載せることができる。医療用具またはマイクロスフェアが、体液と接触すると、可逆的に固定化されたBox-A変異体が放出される。したがって、医療用具およびマイクロスフェアは、本発明の発明品である分子を溶出する薬剤放出の手段として働き、医療用具およびマイクロスフェアからの放出の動態は制御することができ、治療に求められるような放出の制御または持続が達成される。医療用具の被覆/浸透方法およびマイクロスフェアへ載せる方法は、当業者には周知である。

したがって、本発明の別の態様は、HMGB1 Box-AまたはHMGB1 Box-Aの薬学的に適切な断片の変異体を使用する方法であって、当該変異ポリペプチド分子が、医療用具またはマイクロスフェアの表面上に可逆的に固定化されているか、あるいはそれらの内部に吸着されていることを特徴とする方法である。これらの医療装置は、好ましくは、手術具、インプラント、カテーテルまたはステント、例えば、血管形成術に用いるステント、特に、薬剤溶出ステントである。

本発明の別の態様は、本発明の少なくとも1種のポリペプチド変異体を用いて可逆的に被覆した医療用具に関するものである。そのような用具を、手術装置、インプラント、カテーテルまたはステントから選択することができる。そのような用具は、血管形成術に有用であろう。

本発明を、図および実施例を用いて、以下にさらに説明する。実施例は、一般的な方法を例示するためのものであって、説明の目的に限って提示されているに過ぎず、本発明の範囲を限定するためのものではない。

(実施例)
(実施例1)
細菌内におけるHMGB1 Box-Aの未変性および変異体の生成
HMGB1タンパク質からHMGB1 Box-Aの変異体をin silicoで生成し、誘導プラスミドベクター(図9)にクローン化した。このベクターを使用し、大腸菌M15株のコンピテント細胞を形質転換した。M15細胞を、96穴ディープウェルプレートを用い、カナマイシンおよびアンピシリンを含有するLB培地1mL中で、一晩振とう(750rpm)しながら成長させた。培養液は、600nmにおける吸光度が0.2〜0.3であり、これを24穴ウェルプレート内のLB培地5mL中に希釈すると、600nmにおける吸光度は0.07となった。

このM15細胞を、37℃で、常時振とう(200rpm)しながらインキュベートした。600nmにおける吸光度0.6において、IPTG(イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド)(最終濃度として、1mM)を添加することによって、Box-A(未変性または変異体)の生成を誘導した。培養液は、37℃で、振とう(200rpm)しながら、さらに3時間培養した。その後、M15細胞を、1000gで15分間遠心分離することによって収集した。上澄液を捨て、ペレットを-80℃で少なくとも1時間保存してから、細胞を溶解し、Box-Aを精製した。

(実施例2)
HMGB1 Box-Aの未変性体および変異体の精製
M15細胞ペレットを、氷上で15分間解凍した後、1mg/mLリゾチームを含有するNPI-10緩衝液1mL中に再び懸濁し、室温下、プレート振とう機上で750rpmにて振とうしながら30分間インキュベートした。Ni-NTA QIAフィルターを200μLのSuperflow樹脂(QIAGENカタログ番号969261)および600μLのNPI-10緩衝液で平衡化した後、溶菌液を装荷し、200μLの無水アルコールを添加した。1mLのNPI-20による洗浄を4度繰り返した。2度目と3度目の洗浄には、LPS汚染物質を除去する目的で、ポリミキシン(Flukaカタログ番号81271)を100μg/mL添加したNPI-20を1mL用いた。洗浄の後、Box-Aの未変性および変異体を、450μLのNPI-250を用いて溶出した。試料を4℃で保存した。

Box-Aの未変性および変異体を、DetoxiGelポリミキシンカラム(PIERCE社製)を用いて、4℃において、マニュアルに従い再精製した。最後に、溶出タンパク質をPBS中にろ取(0.22μm)し、4℃で保存し、試験に共した。

(実施例3)
Box-Aの生物学的活性の測定
HMGB1は、TNFαおよびその他のサイトカインの分泌ならびにマクロファージおよび単核球の増殖を刺激する。Box-Aは、HMGB1の活性を阻害することによって拮抗薬として作用する。

生成したBox-Aの未変性および変異体の活性を、HMGB1がRAW 264.7細胞(マウスのマクロファージ、ATCC)に対して生じた刺激の阻害レベルによって測定した。

上記で生成したHMGB1 Box-Aの未変性体および変異体を、i)HMGB1によって惹起されるTNFαの放出の阻害と、ii)HMGB1のタンパク質分解に対する抵抗性とを試験する2段階からなるスクリーニング法で試験した。

阻害アッセイにおいて使用するのに適したHMGB1の濃度を決定するために、RAW 264.7細胞を96ウェルプレートに接種(4×10⁵細胞/ウェル)し、0.1%BSAを添加したRPMI1640培地中で一晩成長させた。一晩培養後、細胞を、HMGB1(100μg/mLから0.05μg/mLの2段階連続希釈)を用いて24時間刺激した。細胞培養液に生成したTNFαの濃度を、ELISA法(R&D systems社製)を用い、マニュアルに従い測定した。図10に示すように、HMGB1は、マクロファージ培養液中のTNFαの放出を顕著に刺激した。

(実施例4)
スクリーニング試験としてのHMGB1のTNFα放出に対するBox-Aによる阻害
マウスのマクロファージ様RAW 264.7細胞を、96ウェルプレートに接種(4×10⁵細胞/ウェル)し、0.1%BSAを添加したRPMI1640培地中で一晩成長させた。一晩培養後、適切な濃度のHMGB1と、Box-Aの未変性体または変異体またはHis-tagged体(20μg/mLから0.5μg/mLの2段階連続希釈)とを用いて、細胞を24時間刺激した。細胞培養液に生成したTNFαの濃度を、ELISA法(R&D systems社製)を用い、マニュアルに従い測定した。

図11に、HMGB1のTNF放出に対するBox-Aによる阻害の例を示す。これは、濃度依存性で、EC₅₀は、7.5μg/mLであった(実線)。TNFα放出が、Box-Aの濃度20μg/mLで100%阻害されている。同様に、HMGB1非存在下でBox-Aにより刺激された細胞中のTNFα濃度を測定した。これは、Box-A製剤中の菌体内毒素による汚染の有無を調べ、非HMGB1依存性TNFα放出があれば、その量を知るためである。測定に使用したBox-Aの全ての濃度で、TNFαの放出は全く認められなかった(破線)。

(実施例5)
Box-A変異体のタンパク質分解に対する抵抗性
Box-A変異体を選択したプロテアーゼの混合物にインキュベートする時間を増加させて接触させた後に、Box-A変異体のタンパク質分解に対する抵抗性を、(HMGB1/ RAW細胞系における)残存生物学的活性として測定した。

20μgのBox-Aの未変性体または変異体を、タンパク質全量に対し1%w/wの濃度を有するプロテアーゼ混合物で処理した。プロテアーゼ混合物は、原液から測定の度に調製した。原液には、200μg/mLのエンドプロティアーゼGlu-C(SIGMA社製)、400μg/mLのトリプシン(SIGMA社製)および400μg/mLのα-キモトリプシン(SIGMA社製)を含有した。

プロテアーゼとインキュベートした後、抗プロテアーゼ溶液(Roche社製)を10μL加えて、反応を停止させた。インキュベート中、5分と8時間の間の種々の時点において試料を採集した。次いで、各時点における残存活性を評価する目的で、各試料の生物学的活性を、上記のスクリーニング試験法によって調べた。
(参考文献)

HMGB1 Box-Aのアミノ酸配列上のアミノ酸の位置(is-HIT)のin silicoによる同定に使用したプロテアーゼを列挙する。これらのアミノ酸の位置は、タンパク質分解活性の標的である。「認知変異率(%)」(PAM250)マトリックスを示す。同一残基に与えられた値は、灰色の四角で示されている。このマトリックス中、最高値は、黒色の四角で示されており、2種の残基間での置換の最高頻度に相当する。 84個のアミノ酸残基からなる未変性ヒトHMGB1 Box-Aのアミノ酸配列を示す。太字は、プロテアーゼによるタンパク質分解に感受性であると同定されたアミノ酸、すなわちis-HIT残基位置を示す。完全長ヒトHMGB1 Box-Aのポリペプチド変異体を生成するために選択された各is-HIT標的位置を置換するアミノ酸の種類を示す。さらに、生成したポリペプチド変異体の各アミノ酸配列を、配列番号2〜116に示す。 77個のアミノ酸残基からなるヒトHMGB1 Box-Aの生物学的に活性な断片のアミノ酸の配列を示す。太字は、プロテアーゼによるタンパク質分解に感受性であると同定されたアミノ酸、すなわちis-HIT残基位置を示す。 77個のアミノ酸残基からなるヒトHMGB1 Box-Aの生物学的に活性な断片のポリペプチド変異体を生成するために選択された各is-HIT標的位置を置換するアミノ酸の種類を示す。さらに、生成したポリペプチド変異体の特定のアミノ酸配列を、配列番号118〜222に示す。 54個のアミノ酸残基からなるヒトHMGB1 Box-Aの生物学的に活性な断片のアミノ酸の配列を示す。太字は、プロテアーゼによるタンパク質分解に感受性であると同定されたアミノ酸、すなわちis-HIT残基位置を示す。 54個のアミノ酸残基からなるヒトHMGB1 Box-Aの生物学的に活性な断片のポリペプチド変異体を生成するために選択された各is-HIT標的位置を置換するアミノ酸の種類を示す。さらに、生成したポリペプチド変異体の特定のアミノ酸配列を、配列番号224〜300に示す。 84個のアミノ酸残基からなる未変性Anopheles gambia HMGB1 Box-Aのアミノ酸配列を示す。太字は、プロテアーゼによるタンパク質分解に感受性であると同定されたアミノ酸、すなわちis-HIT残基位置を示す。完全長Anopheles gambia HMGB1 Box-Aのポリペプチド変異体を生成するために選択された各is-HIT標的位置を置換するアミノ酸の種類を示す。さらに、生成したポリペプチド変異体の特定のアミノ酸配列を、配列番号302〜418に示す。 77個のアミノ酸残基からなるAnopheles gambia HMGB1 Box-Aの生物学的に活性な断片のアミノ酸の配列を示す。太字は、プロテアーゼによるタンパク質分解に感受性であると同定されたアミノ酸、すなわちis-HIT残基位置を示す。 77個のアミノ酸残基からなるAnopheles gambia HMGB1 Box-Aの生物学的に活性な断片のポリペプチド変異体を生成するために選択された各is-HIT標的位置を置換するアミノ酸の種類を示す。さらに、生成したポリペプチド変異体の特定のアミノ酸配列を、配列番号420〜528に示す。 54個のアミノ酸残基からなるAnopheles gambia HMGB1 Box-Aの生物学的に活性な断片のアミノ酸の配列を示す。太字は、プロテアーゼによるタンパク質分解に感受性であると同定されたアミノ酸、すなわちis-HIT残基位置を示す。 54個のアミノ酸残基からなるAnopheles gambia HMGB1 Box-Aの生物学的に活性な断片のポリペプチド変異体を生成するために選択された各is-HIT標的位置を置換するアミノ酸の種類を示す。さらに、生成したポリペプチド変異体の特定のアミノ酸配列を、配列番号530〜610に示す。本発明のポリペプチド変異体をコードする核酸配列を含有するプラスミドベクターを示す。このプラスミドは、本発明のポリペプチド変異体をコードする遺伝子を含有し、IPTG誘導T5プロモーターの制御下にある。このプラスミドは、さらに、アンピシリン耐性遺伝子、6×His-tagおよびいくつかの制限部位も含有する。 RAW 264.7細胞におけるHMGB1による刺激とそれによって惹起されたTNFα放出との相関関係を示すグラフである。 HMGB1惹起TNFα放出が、Box-A His-taggedタンパク質により用量依存的に阻害される様子を示す。

Claims

ヒトのHMGB-1高親和性結合ドメインBox-A(HMGB1 Box-A)のポリペプチド変異体、またはHMGB1 Box-Aの生物学的に活性な断片のポリペプチド変異体であって、前記ポリペプチド変異体が、配列番号59および64からなる群より選択されるアミノ酸配列により規定されることを特徴とするポリペプチド変異体。
前記ポリペプチド変異体が、野生型HMGB1 Box-Aまたは野生型HMGB1 Box-Aの生物学的に活性な断片よりも向上したプロテアーゼのタンパク質分解活性に対する抵抗性を示すことを特徴とする請求項1に記載のポリペプチド変異体。
タンパク質分解に対する抵抗性の向上が、キモトリプシン、トリプシン、エンドプロテアーゼ、エンドペプチダーゼまたはそれらの組合せを含む群から選択される少なくとも1種のプロテアーゼに対するものであることを特徴とする請求項1または2に記載のポリペプチド変異体。
タンパク質分解に対する抵抗性が、野生型HMGB1 Box-Aに比べ、少なくとも10%向上していることを特徴とする請求項1から3のいずれか一項に記載のポリペプチド変異体。
ポリペプチド変異体が、野生型HMGB1 Box-Aまたは野生型HMGB1 Box-Aの生物学的に活性な断片よりも長い半減期を体液中で示すことを特徴とする請求項1から4のいずれか一項に記載のポリペプチド変異体。
半減期が、野生型HMGB1 Box-Aに比べ、少なくとも10分延長されていることを特徴とする請求項5に記載のポリペプチド変異体。
請求項1から6のいずれか一項で定義されているポリペプチド変異体をコードすることを特徴とする核酸分子。
請求項7に記載の核酸分子を含むことを特徴とするベクター。
請求項1から6のいずれか一項に記載のポリペプチド変異体を製造する方法であって、
(i)請求項7に記載の核酸分子を、宿主に導入するステップと、
(ii)前記細胞を、コードされたポリペプチド変異体が発現される状態下で培養するステップと
を含むことを特徴とする方法。
ペプチドの化学合成法を使用することを特徴とする請求項1から6のいずれか一項に記載のポリペプチド変異体を製造する方法。
医薬品中の活性剤として使用することを特徴とする請求項1から6のいずれか一項に記載のポリペプチド変異体。
HMGB1に関連する病態を予防または治療するための医薬品の製造を目的とすることを特徴とする請求項1から6のいずれか一項に記載のポリペプチド変異体の使用。
HMGB1に関連する病態が、炎症性サイトカインカスケードの活性化によって仲介される病的状態であることを特徴とする請求項12に記載の使用。
前記病的状態が、炎症性疾患、自己免疫疾患、全身性炎症反応症候群、臓器移植後の再灌流障害、心血管病、産婦人科系疾患、(ウイルス性および細菌性)感染症、アレルギー性およびアトピー性疾患、固形腫瘍および液性腫瘍の病態、移植拒絶反応、先天性疾患、皮膚疾患、神経疾患、悪液質、腎疾患、医原性中毒状態、代謝疾患および特発性疾患、ならびに眼科疾患からなる群から選択されることを特徴とする請求項12または13に記載の使用。
炎症性サイトカインカスケードの初期のメディエーターを阻害することができる別の薬剤と組み合わせることを特徴とする請求項12から14のいずれか一項に記載の使用。
前記別の薬剤が、TNF、IL-1α、IL-1β、IL-R_a、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13、IL-18、IFN-γ、MIP-1α、MIF-1β、MIP-2、MIFおよびPAFからなる群から選択されるサイトカインに対する拮抗薬または阻害剤であることを特徴とする請求項15に記載の使用。
前記別の薬剤が、RAGEに対する抗体、アンチセンス分子、リボザイムまたはRNA干渉分子等のRAGEの発現を阻害することができる核酸または核酸類似体、RAGEまたは可溶性RAGE(sRAGE)とのHMGB1相互作用に対する合成小分子拮抗薬であることを特徴とする請求項15に記載の使用。
前記別の薬剤が、トール様受容体(TLR)のHMGB1との相互作用の阻害剤であることを特徴とする請求項15に記載の使用。
前記トール様受容体(TLR)が、TLR2、TLR4、TLR7、TLR8およびTLR9のうち一つ以上である、請求項18に記載の使用。
前記阻害剤が、TLRの発現を阻害することができる、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体、リボザイムもしくはRNA干渉分子、核酸もしくは核酸類似体、または1000ダルトン未満のサイズの合成分子である、請求項18または19に記載の使用。
前記核酸もしくは核酸類似体が、アンチセンス分子である、請求項20に記載の使用。
前記別の薬剤が、野生型または変異型トロンボモジュリンのN-末端レクチン様ドメイン(D1)であることを特徴とする請求項15に記載の使用。
前記別の薬剤が、屈曲または十字形のDNA、PNAまたはDNA/PNAのキメラもしくはハイブリッドから選択される、屈曲形構造を有する合成二本鎖の核酸または核酸類似体分子であることを特徴とする請求項15に記載の使用。
前記別の薬剤が、K-252aまたは/およびその塩もしくは誘導体、あるいはK-252aまたは/およびその誘導体のポリマー複合体であることを特徴とする請求項15に記載の使用。
活性剤として、請求項1から6のいずれか一項に記載の少なくとも1種のポリペプチド変異体の有効量と、場合により、薬学的に許容される担体とを含むことを特徴とする薬学的組成物。
少なくとも1種のポリペプチド変異体が、請求項16から24のいずれか一項に記載の少なくとも1種の別の薬剤と組み合わされていることを特徴とする請求項25に記載の組成物。
診断に応用することを特徴とする請求項25または26に記載の組成物。
治療に応用することを特徴とする請求項25または26に記載の組成物。
HMGB1による炎症性サイトカインカスケードの活性化を特徴とする患者の状態を治療するための、請求項25から28のいずれか一項に記載の組成物。
請求項1から6のいずれか一項に記載の少なくとも1種のポリペプチド変異体の使用であって、前記分子が、医療用具の表面上に可逆的に固定されていることを特徴とする使用。
前記医療用具が、手術具、インプラント、カテーテルまたはステントであることを特徴とする請求項30に記載の使用。
請求項1から6のいずれか一項に記載の少なくとも1種のポリペプチド変異体を用いて可逆的に被覆されていることを特徴とする医療用具。
前記医療用具が、手術具、インプラント、カテーテルまたはステントから選択されることを特徴とする請求項32に記載の医療用具。