JP5619603B2 - 抗グリピカン3抗体を用いる肝癌細胞の検出法 - Google Patents
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Description
本発明はこのような情況に鑑みて為されたものであり、その目的は、肝癌組織におけるグリピカン3の発現の態様を正確に検出することを可能とする方法を提供することにある。
[1]被験体における肝癌細胞の存在を検出するためのインビトロの免疫アッセイ方法であって、
(a)前記被験体から調製された後に、パラフィンに包まれて透過性の支持体に取り付けられた、同一被験体より少なくとも二つの同視し得る一組の組織標品がパラフィン包埋切片として提供され、
(b)前記一組の組織標品の脱パラフィン処理が実施され、
(c)前記(b)処理が実施された同視し得る一組の組織標品の一方に対して熱誘導抗原賦活化法による抗原賦活化処理が施され、他方に対してプロテアーゼ抗原賦活化法による抗原賦活化処理が施され、
(d)前記(c)処理が施された組織標品中に存するグリピカン3と抗グリピカン3抗体との複合体の形成に適切な条件下で、当該標品に対して抗グリピカン3抗体が接触され、
(e)複合体の存在が検出され、ここで、複合体が存在する場合に被験体において肝癌細胞が存在すると判定される、
の各工程を含む方法;
[2]前記熱誘導抗原賦活化法がマイクロ波による加熱である[1]に記載の方法;
[3]前記熱誘導抗原賦活化法がオートクレーブによる加熱である[1]に記載の方法;
[4]前記プロテアーゼ抗原賦活化法に用いるプロテアーゼが、ペプシン、トリプシンおよびプロテアーゼKからなる群より選択される、[1]から[3]のいずれかに記載の方法;
[5]複合体を検出するための検出反応が酵素反応である、[1]から[4]のいずれかに記載の方法;
[6]前記抗グリピカン3抗体がグリピカン3のC末端ポリペプチドに結合する抗体である、[1]から[5]のいずれかに記載の方法;
[7]グリピカン3のC末端ポリペプチドが配列番号1に記載の359番目のアミノ酸から580番目のアミノ酸からなるポリペプチド、または、375番目のアミノ酸から580番目のアミノ酸からなるポリペプチドである[6]に記載の方法;
[8]前記抗グリピカン3抗体がGC33抗体である[6]または[7]に記載の方法;
[9]前記抗グリピカン3抗体が1G12抗体である[1]から[5]のいずれかに記載の方法;
[10]工程(e)において、複合体の存在が数値化されて検出される、[1]から[9]のいずれかに記載の方法;
[11]前記数値化が以下の式;
IRCp=PR+(SI−Cp)+SP
[式中、
IRCpは、グリピカン3の発現量スコアであり、
PRは、検鏡下で前記複合体が検出される細胞の割合をスコア化した数値であり、
SI−Cpは、検鏡下で前記複合体が視野中細胞の細胞質において検出される染色強度をスコア化した数値であり、SPは、検鏡下での視野中細胞の細胞膜において完全な膜染色を示す細胞の割合をスコア化した数値である]
にしたがって算出される、[10]に記載の方法;
[12]前記数値化が以下の式;
IRCm=PR+(SI−Cm)+SP
[式中、
IRCmは、グリピカン3の膜局在スコアであり、
PRは、検鏡下で前記複合体が検出される細胞の割合をスコア化した数値であり、
SI−Cmは、検鏡下で前記複合体が視野中細胞の細胞膜において検出される染色強度をスコア化した数値であり、
SPは、検鏡下での視野中細胞の細胞膜において完全な膜染色を示す細胞の割合をスコア化した数値である]
にしたがって算出される、[10]に記載の方法;
[13][11]および[12]に記載の方法により算出されたスコアに基づいて、被験体に存在する肝癌細胞を分類する方法;
[14][11]および[12]に記載の方法により算出されたスコアに基づいて、被験体に抗グリピカン3抗体を含む抗癌剤を投与するか否かを決定する方法;
[15][11]および[12]に記載の方法により算出されたスコアに基づいて、被験体に対する肝癌治療における抗グリピカン3抗体を含む抗癌剤の投与量を決定する方法;を提供するものである。
本明細書中で使用される用語「組織標品」とは、個体、体液(例えば、血液、血清、血漿、および髄液)、組織培養物もしくは組織切片等から得られる任意の生物学的標品をいう。生物学的標品として用いられるものとして被験体標品が好適に挙げられる。好ましい被験体標品は、被験体から得られた組織であり、さらに好ましくは、被験体の肝組織である。肝組織を採取する方法としては公知の方法である生検(バイオプシー)が好適に用いられる。肝生検とは細く長い針が皮膚の表面から直接肝臓に刺され、肝臓の組織が採取される方法をいう。通常、針が穿刺される部位は右胸下部の肋間である。術前に超音波検査装置を用いて穿刺部の安全性が確認された上で、穿刺部が消毒される。更に皮膚から肝臓の表面までが麻酔の対象となり、穿刺部の皮膚が小切開された後に穿刺針が穿刺される。
本発明の方法においては、ホルマリン固定により抗体との反応性が減弱した抗原の反応性を賦活化する。本発明においては、二つの組織標品のうち一の標品に対して、プロテアーゼ抗原賦活化法(PIER法)を適用し、他方の標品に対して、熱誘導抗原賦活化法(HIER法)を適用し、抗体と反応させたときの両者間の染色程度の相違を数値化する。
本発明の方法に用いられる抗グリピカン3抗体は、グリピカン3に結合する活性を有していればいずれの抗体も好適に使用され得る。特に好適な抗体の例は、下記の実施例において開示されるGC33抗体(特許文献2)や1G12抗体(特許文献1)である。また、これらの公知の抗体の他にも、グリピカン3を免疫抗原として使用して非ヒト動物を免疫することによって、本発明に好適に用いられる抗グリピカン3抗体を取得することができる。特許文献1、特許文献2にはこうした抗グリピカン3抗体の作製方法が記載されており、当業者であれば当該方法に基づいて適宜所望の抗グリピカン3抗体を取得することが可能である。
熱誘導抗原賦活化法による抗原賦活化処理が施された組織標品およびプロテアーゼ抗原賦活化法による抗原賦活化処理が施された組織標品に対して、抗グリピカン3抗体を一次抗体として反応させる。当該反応は抗グリピカン3抗体が抗原中のエピトープを認識して抗原抗体複合体を形成するのに適切な条件下で実施される。通常、当該反応は4℃にて終夜、または37℃にて1時間実施されるが、反応条件は、抗体が抗原中のエピトープを認識して抗原抗体複合体を形成するのに適切な範囲で適宜変更され得る。例えば、反応温度は4℃から50℃の範囲内で変更され得るし、反応時間は1分から7日の間で変更され得る。低温での反応が実施される場合には長い時間反応させることが好ましい。一次抗体反応が終了した後、組織標品は洗浄用緩衝液によって洗浄される。洗浄用緩衝液はPBS(Phosphate buffer saline)が好適に用いられる他、Tris塩酸緩衝液も好適に使用され得る。通常、洗浄条件としては室温にて5分間の洗浄を3回実施する方法が採用されるが、洗浄の時間および温度は適宜変更され得る。
グリピカン3は肝癌組織において消化を受けてそのN末端部分が血清中に遊離することが知られている(特許文献3)。したがって、本発明の方法において、そのような消化を受けて血清中に遊離するグリピカン3のN末端の部分ペプチドに結合する抗体を用いた場合には、当該抗体は消化を受けた後になお細胞表面上に係留するC末端の部分ポリペプチドには結合することができない。一方、本発明の方法において、C末端の部分ペプチドに結合する抗体を用いた場合には、当該抗体は消化を受けた後になお細胞表面上に係留するC末端の部分ポリペプチドに結合することができる。すなわち、本発明に使用される抗グリピカン3抗体を目的によって適宜選択することによって、消化を受けるか否かに関わらず細胞表面上に係留するグリピカン3の部分ポリペプチドを検出することも、消化されるまでは細胞表面に係留されるが消化を受けた後には血清中に遊離されるグリピカン3の部分ポリペプチドを検出することも可能である。
本発明は抗原賦活化反応(すなわち、熱誘導抗原賦活化法およびプロテアーゼ抗原賦活化法)の相違に基づいて、グリピカン3と抗グリピカン3抗体とから形成される抗原抗体複合体の顕微鏡下での検出の程度および態様の相違を数値化する方法を提供する。
IRCp=PR+(SI−Cp)+SP
[式中、
IRCpは、グリピカン3の発現量スコアであり、
PRは、検鏡下で前記複合体が検出される細胞の割合をスコア化した数値であり、
SI−Cpは、検鏡下で前記複合体が視野中細胞の細胞質において検出される染色強度をスコア化した数値であり、
SPは、検鏡下での視野中細胞の細胞膜において完全な膜染色を示す細胞の割合をスコア化した数値である]
にしたがって行う。
PRのスコアは、
(a)4倍または10倍の対物レンズを用いた検鏡下での視野中細胞のうち;
(i)前記複合体が検出される細胞の割合がゼロの検体のスコアを0、
(ii)当該割合が20%未満の検体のスコアを1、
(iii)当該割合が20%以上で50%未満の検体のスコアを2、
(iv)当該割合が50%以上の検体のスコアを3として算出し、
SI−Cpのスコアは、
(b)検鏡下での視野中細胞の細胞質において、
(i)前記顕鏡が4倍または10倍の対物レンズを用いられた場合に前記複合体が検出される細胞の割合がゼロの検体のスコアを0、
(ii)前記顕鏡が10倍の対物レンズを用いられた場合に不明りょうであるがうっすらと陽性反応が認められる検体のスコアを1、
(iii)4倍の対物レンズでうっすらと陽性反応が認められる検体のスコアを2、
(iv)4倍の対物レンズでも十分認識可能である陽性反応が認められる検体のスコアを3、
(v)4倍の対物レンズで、明確に認識され強い陽性反応が認められる検体のスコアを4として算出し、
SPのスコアは、
(c)検鏡下での視野中細胞の細胞膜における前記複合体の検出において、
(i)細胞膜における陽性反応が認められない検体のスコアを0、
(ii)陽性反応が認められる細胞のうち20%未満の細胞が完全な膜染色を示す検体のスコアを1、
(iii)陽性反応が認められる細胞のうち20%以上で50%未満の細胞が完全な膜染色を示す検体のスコアを2、
(iv)陽性反応が認められる細胞のうち50%以上の細胞が完全な膜染色を示す検体のスコアを3として算出する。
IRCm=PR+(SI−Cm)+SP
[式中、
IRCmは、グリピカン3の膜局在スコアであり、
PRは、検鏡下で前記複合体が検出される細胞の割合をスコア化した数値であり、
SI−Cmは、検鏡下で前記複合体が視野中細胞の細胞膜において検出される染色強度をスコア化した数値であり、
SPは、検鏡下での視野中細胞の細胞膜において完全な膜染色を示す細胞の割合をスコア化した数値である]
にしたがって行う。
PRのスコアは、
(a)4倍または10倍の対物レンズを用いた検鏡下での視野中細胞のうち;
(i)前記複合体が検出される細胞の割合がゼロの検体のスコアを0、
(ii)当該割合が20%未満の検体のスコアを1、
(iii)当該割合が20%以上で50%未満の検体のスコアを2、
(iv)当該割合が50%以上の検体のスコアを3として算出し、
SI−Cmのスコアは、
(b)検鏡下での視野中細胞の細胞膜において、
(i)前記顕鏡が4倍または10倍の対物レンズを用いられた場合に前記複合体が検出される細胞の割合がゼロの検体のスコアを0、
(ii)前記顕鏡が10倍の対物レンズを用いられた場合に不明りょうであるがうっすらと陽性反応が認められる検体のスコアを1、
(iii)4倍の対物レンズで不明りょうであるが10倍の対物レンズで十分認識可能である陽性反応が認められる検体のスコアを2、
(iv)4倍の対物レンズでも十分認識可能である陽性反応が認められる検体のスコアを3、
(v)4倍の対物レンズで、明確に認識され強い陽性反応が認められる検体のスコアを4として算出し、
SPのスコアは、
(c)検鏡下での視野中細胞の細胞膜における前記複合体の検出において、
(i)細胞膜における陽性反応が認められない検体のスコアを0、
(ii)陽性反応が認められる細胞のうち20%未満の細胞が完全な膜染色を示す検体のスコアを1、
(iii)陽性反応が認められる細胞のうち20%以上で50%未満の細胞が完全な膜染色を示す検体のスコアを2、
(iv)陽性反応が認められる細胞のうち50%以上の細胞が完全な膜染色を示す検体のスコアを3として算出する。
グリピカン3を発現するヒト肝癌細胞株のマウス腹部皮下への移植モデルを用いたグリピカン3の免疫染色
(1)細胞株
肝癌細胞株としてHuH−7細胞(ヒューマンサイエンス研究資源バンク)、HepG2細胞(ATCC)が用いられた。HuH−7は、10%FBS(BIONET)を含むDulbecco’s Modifid Eagle’s Medium培地(SIGMA)にて、HepG2は10%FBS、1mmol/L MEM Sodium Pyruvate(Invitrogen)、1mmol/L MEM Non−Essential Amino Acid(Invitrogen)を含むMinimum Essential Medium Eagle培地(SIGMA)にて、維持継代された。
(2−1)測定方法
HuH−7細胞およびHepG2細胞におけるGPC3の発現量は、マウス抗ヒトGPC3モノクローナル抗体(クローン名:GC33、WO2006/006693に記載される。)を用いて、QIFI−Kit(DakoCytomation)により測定された。測定方法は付属の説明書に記載された方法が実施された。
HuH−7およびHepG2の各細胞が、(1)に記載されるその維持継代用の培地とMATRIGEL Matrix(BD Bioscicnce)を等量含む溶液にて1ml当たり5×107細胞になるように調製された。各細胞のマウスへの移植前日に、予め抗アシアロGM1抗体(和光純薬、1バイアルの内容物が1mlの蒸留水に溶解され更に4mlの生理食塩水によって希釈された。)100μlがオスで5週齢のSCIDマウス(日本クレア)の腹腔内へ投与された。当該抗アシアロGM1抗体(和光純薬)は、1バイアルの内容物が1mlの蒸留水に溶解され更に4mlの生理食塩水によって希釈されることによって調製された。その翌日、当該マウスの腹部皮下へ100μlの当該各細胞懸濁液(すなわち、マウス一匹当たり5×106細胞)が移植された。
(3)で作製したHepG2の移植モデルより採取された均一な移植組織片が手術用メスを用いて四等分された。その内の一断片が10%中性緩衝ホルマリンで24時間固定された。固定化された組織片はその後自動包埋装置ETP−150C(サクラファインテックジャパン)を用いてパラフィン包埋され、4℃にて保存された(A法)。
PR(陽性細胞率)グレードについて;
4倍または10倍の対物レンズを用いた検鏡下での視野中細胞のうち;
(i)前記複合体が検出される細胞の割合が50%以下の標品を「L」、
(ii)前記複合体が検出される細胞の割合が50%以上70%未満の標品を「ML」、
(iii)前記複合体が検出される細胞の割合が70%以上で90%未満の標品を「MH」、
(iv)前記複合体が検出される細胞の割合が90%以上の標品を「H」、
としてPRのグレードが決定され、
SI(染色強度スコア)について;
(i)軽微陽性の染色を示す標品を「+1」、
(ii)弱陽性の染色を示す標品を「+2」、
(iii)中程度陽性または/および強陽性を伴う、弱陽性の染色を示す標品を「+3」、
(iv)中程度陽性の染色を示す標品を「+4」、
(v)強陽性の染色を示す標品を「+5」、
としてSIのスコアが決定され、
SP(細胞膜染色性)について;
4倍または10倍の対物レンズを用いた検鏡下での視野中細胞のうち;
(i)細胞が細胞膜の一部のみ染色される標品を「I」、
(ii)ほとんどの細胞の細胞膜の一部が染色され、一部の細胞の細胞膜が円周状に染色される標品を「II」、
(iii)ほとんどの細胞の細胞膜が円周状に染色される標品を「III」、
としてSPのスコアが決定された。
(3)で作製したHepG2の移植モデルより採取された均一な移植組織片の固定化時間が以下のように検討された。(4)で記載されたA法における10%中性緩衝ホルマリンによる固定時間を24時間と7日間とした標品が調製された。また、それぞれの固定時間で調製された標品は、以下に記載されるオートクレーブ、マイクロウェーブ、プロテアーゼのうちのいずれかの賦活化法によりそれぞれ賦活化された。target retrieval solution,pH6(DAKO)が10倍希釈された溶液中で標品を121℃において10分間のオートクレーブ処理することによって、オートクレーブにより賦活化された標品が調製された。同一溶液中において標品を4回、780Wにて5分間加熱することによりマイクロウェーブにより賦活化された標品が調製された。HistofineHer2 kit(MONO)(ニチレイバイオサイエンス)に付属のAR試薬によって室温にて5分反応された標品もまた別に調製された。
(6−1)組織標品の作製および染色
(2)で作製した移植モデルより採取された移植組織片が10%中性緩衝ホルマリンに7日間浸漬することによって固定され、次いで常法に従い当該組織片のパラフィン包埋ブロック標本が作製された。このブロック標本より薄切された組織切片が以下に示す免疫組織化学的染色に用いられた。
マウス抗ヒトグリピカン3抗体を用いた免疫染色による染色性が、下記に示される3つのパラメーター(陽性細胞率:PR、染色強度:SI、細胞膜染色パターン:SP)によって評価された。
PR(陽性細胞率)値を;
4倍または10倍の対物レンズを用いた検鏡下での視野中細胞のうち;
(i)前記複合体が検出される細胞の割合がゼロの検体のスコアを0、
(ii)当該割合が20%未満の検体のスコアを1、
(iii)当該割合が20%以上で50%未満の検体のスコアを2、
(iv)当該割合が50%以上の検体のスコアを3としてPRのスコアを算出し、
細胞質の染色性を反映する(SI−Cp)(細胞質染色強度)値を;
検鏡下での視野中細胞の細胞質において、
(i)前記検鏡が4倍または10倍の対物レンズを用いられた場合に前記複合体が検出される細胞の割合がゼロの検体のスコアを0、
(ii)前記検鏡が10倍の対物レンズを用いられた場合に不明りょうであるがうっすらと陽性反応が認められる検体のスコアを1、
(iii)4倍の対物レンズでうっすらと陽性反応が認められる検体のスコアを2、
(iv)4倍の対物レンズでも十分認識可能である陽性反応が認められる検体のスコアを3、
(v)4倍の対物レンズで、明確に認識され強い陽性反応が認められる検体のスコアを4としてSI−Cpのスコアを算出し、
細胞膜の染色性を反映する(SI−Cm)(細胞膜の染色強度)値を;
検鏡下での視野中細胞の細胞膜において、
(i)前記検鏡が4倍または10倍の対物レンズを用いられた場合に前記複合体が検出される細胞の割合がゼロの検体のスコアを0、
(ii)前記検鏡が10倍の対物レンズを用いられた場合に不明りょうであるがうっすらと陽性反応が認められる検体のスコアを1、
(iii)4倍の対物レンズ不明りょうであるが10倍の対物レンズで十分認識可能である陽性反応が認められる検体のスコアを2、
(iv)4倍の対物レンズでも十分認識可能である陽性反応が認められる検体のスコアを3、
(v)4倍の対物レンズで、明確に認識され強い陽性反応が認められる検体のスコアを4としてSI−Cmのスコアを算出し、
SP(細胞膜染色パターン)値を;
検鏡下での視野中細胞の細胞膜における前記複合体の検出において、
(i)細胞膜における陽性反応が認められない検体のスコアを0、
(ii)陽性反応が認められる細胞のうち20%未満の細胞が完全な膜染色を示す検体のスコアを1、
(iii)陽性反応が認められる細胞のうち20%以上で50%未満の細胞が完全な膜染色を示す検体のスコアを2、
(iv)陽性反応が認められる細胞のうち50%以上の細胞が完全な膜染色を示す検体のスコアを3としてSPのスコアを算出する;
方法によって各パラメーターが数値化された。なお、SI−Cmを用いて算出されるトータルスコアはIRCm、SI−Cpを用いて算出されるトータルスコアはIRCpと表記された。
HuH−7およびHepG2が移植された動物モデルから由来する組織標品がオートクレーブ処理された場合の染色像が図3に示される。AはHuH−7移植モデルから調製された切片にオートクレーブ処理による熱誘導抗原賦活化処理をした標品の染色像を、BはHuH−7移植モデルから調製された切片にプロテアーゼ抗原賦活化処理をした標品の染色像を、CはHepG2移植モデルから調製された切片にオートクレーブ処理による熱誘導抗原賦活化処理をした標品の染色像を、DはHepG2移植モデルから調製された切片にプロテアーゼ抗原賦活化処理をした標品の染色像を表す。
ヒト肝細胞癌組織標品を用いたGPC3免疫染色におけるプロテアーゼによる抗原賦活化効果
(1)ヒト肝細胞癌サンプルにおける免疫組織化学染色
(1−1)標本作製および染色方法
ヒト肝細胞癌サンプルが10%中性緩衝ホルマリンに一定時間以上浸漬固定された。次に、常法に従いパラフィン包埋ブロック標本が作製された。上記ブロック標本より薄切された組織切片が免疫組織化学的染色に用いられた。免疫組織化学染色は実施例1と同様の手法により、実施された。
実施例1(6−2)の記載に基づいて、マウス抗ヒトGPC3抗体免疫染色による染色性が下記に示される3つのパラメーター(陽性細胞率:PR、染色強度:SI、細胞膜染色パターン:SP)によって評価された。
PR(陽性細胞率)値を;
4倍または10倍の対物レンズを用いた検鏡下での視野中細胞のうち;
(i)前記複合体が検出される細胞の割合がゼロの検体のスコアを0、
(ii)当該割合が20%未満の検体のスコアを1、
(iii)当該割合が20%以上で50%未満の検体のスコアを2、
(iv)当該割合が50%以上の検体のスコアを3としてPRのスコアを算出し、
細胞質の染色性を反映する(SI−Cp)(細胞質染色強度)値を;
検鏡下での視野中細胞の細胞質において、
(i)前記検鏡が4倍または10倍の対物レンズを用いられた場合に前記複合体が検出される細胞の割合がゼロの検体のスコアを0、
(ii)前記検鏡が10倍の対物レンズを用いられた場合に不明りょうであるがうっすらと陽性反応が認められる検体のスコアを1、
(iii)4倍の対物レンズでうっすらと陽性反応が認められる検体のスコアを2、
(iv)4倍の対物レンズでも十分認識可能である陽性反応が認められる検体のスコアを3、
(v)4倍の対物レンズで、明確に認識され強い陽性反応が認められる検体のスコアを4としてSIのスコアを算出し、
細胞膜の染色性を反映する(SI−Cm)(細胞膜の染色強度)値を;
検鏡下での視野中細胞の細胞膜において、
(i)前記検鏡が4倍または10倍の対物レンズを用いられた場合に前記複合体が検出される細胞の割合がゼロの検体のスコアを0、
(ii)前記検鏡が10倍の対物レンズを用いられた場合に不明りょうであるがうっすらと陽性反応が認められる検体のスコアを1、
(iii)4倍の対物レンズで不明りょうであるが10倍の対物レンズで十分認識可能である陽性反応が認められる検体のスコアを2、
(iv)4倍の対物レンズでも十分認識可能である陽性反応が認められる検体のスコアを3、
(v)4倍の対物レンズで、明確に認識され強い陽性反応が認められる検体のスコアを4としてSIのスコアを算出し、
SP(細胞膜染色パターン)値を;
検鏡下での視野中細胞の細胞膜における前記複合体の検出において、
(i)細胞膜における陽性反応が認められない検体のスコアを0、
(ii)陽性反応が認められる細胞のうち20%未満の細胞が完全な膜染色を示す検体のスコアを1、
(iii)陽性反応が認められる細胞のうち20%以上で50%未満の細胞が完全な膜染色を示す検体のスコアを2、
(iv)陽性反応が認められる細胞のうち50%以上の細胞が完全な膜染色を示す検体のスコアを3としてSPのスコアを算出する;
方法によって各パラメーターが数値化された。
抗原賦活化処理をした標品の染色像が図4に示される。Aは症例Aの検体から調製された切片にオートクレーブ処理による熱誘導抗原賦活化処理をした標品の染色像を、Bは症例Aの検体から調製された切片にプロテアーゼ抗原賦活化処理をした標品の染色像を、Cは症例Bの検体から調製された切片にオートクレーブ処理による熱誘導抗原賦活化処理をした標品の染色像を、Dは症例Bの検体から調製された切片にプロテアーゼ抗原賦活化処理をした標品の染色像を、Eは症例Cの検体から調製された切片にオートクレーブ処理による熱誘導抗原賦活化処理をした標品の染色像を、Fは症例Cの検体から調製された切片にプロテアーゼ抗原賦活化処理をした標品の染色像をそれぞれ表す。
GPC3発現ヒト肝癌細胞株移植マウスモデルに対する抗GPC3抗体の薬効
(1)細胞株
移植に供する細胞としてHuH−7細胞およびHepG2細胞が用いられた。HuH−7細胞は10%FBS(BIONET)を含むDulbecco’s Modifid Eagle’s Medium培地(SIGMA)中で、HepG2細胞は10%FBS、1mmol/l MEM Sodium Pyruvate(Invitrogen)、1mmol/l MEM Non−Essential Amino Acid(Invitrogen)を含むMinimum Essential Medium Eagle培地(SIGMA)中で、それぞれ維持継代された。
各細胞が、上述の継代用培地とMatrigel Matrix(BD Bioscience)とをそれぞれ等量含む溶液を用いて1ml当たり5×107個細胞になるように調製された。細胞の移植前日に、あらかじめ100μlの抗アシアロGM1抗体(和光純薬、1バイアルが5mlのPBSで溶解されたもの)がその腹腔内へ投与されたSCIDマウス(オス、5週齢、日本クレア)の腹部皮下へ、100μlの当該細胞懸濁液が移植された。すなわち、マウス一匹当たり5×106細胞が投与された。腫瘍体積は以下の式にて算出され、腫瘍体積の平均が117〜330mm3になった時点でモデルが成立したものとした。
式1:腫瘍体積=長径×短径×短径/2
治療用抗体として、ヒト化抗ヒトGPC3モノクローナル抗体(クローン名:hGC33、公開出願 WO2006/006693に記載されている。)が投与の当日に、濾過滅菌されたPBSを用いて、0.5mg/ml、0.1mg/mlまたは0.05mg/mlになるように調製され、それぞれ5mg/kg投与群、1mg/kg投与群、0.5mg/kg投与群に対する投与試料として用いられた。
(2)で記載したように作製されたHuH−7細胞移植マウスモデルに対してはその移植後20日目より、HepG2細胞移植マウスモデルに対してはその移植後26日より、それぞれ週に1回ずつ、三週間の間にわたり、上記(3)で調製された投与試料が10ml/kgの用量で尾静脈より投与された。陰性対照として、濾過滅菌したPBS(Vehicle)が前記と同様に週に1回ずつ、三週間の間にわたり、10ml/kgの用量で尾静脈より投与された。いずれの群も、1群当たり5〜6匹のマウスから構成された。
hGC33抗体のヒト肝癌移植マウスモデルにおける抗腫瘍効果が、腫瘍体積の継時変化(図5A)および最終投与日より一週間後の腫瘍湿重量(図5B)で評価された。図5Aは、HepG2移植マウスモデルにおける腫瘍体積の継時変化を表す図である。菱形はベヒクルを投与した群、四角はhGC33抗体を1mg/kgで投与した群、丸はhGC33抗体を5mg/kgで投与した群の腫瘍体積の経時変化を表す。hGC33抗体を投与した時点を矢印で示す。図中*は有意差検定による有意水準PがP<0.05であることを表す。また、図中**は有意差検定による有意水準PがP<0.0001であることを表す。図5Bは、HuH−7移植マウスモデルにおける腫瘍体積の継時変化を表す図である。菱形はベヒクルを投与した群、四角はhGC33抗体を1mg/kgで投与した群、丸はhGC33抗体を5mg/kgで投与した群の腫瘍体積の経時変化を表す。hGC33抗体を投与した時点を矢印で示す。図中*は有意差検定による有意水準PがP<0.05であることを表す。また、図中**は有意差検定による有意水準PがP<0.0001であることを表す。図5Cは、HepG2移植マウスモデルにおける、最終投与日から一週間後の腫瘍湿重量を示す図である。図中*は有意差検定による有意水準PがP<0.05であることを表す。また、図中**は有意差検定による有意水準PがP<0.0001であることを表す。図5Dは、HuH−7移植マウスモデルにおける、最終投与日から一週間後の腫瘍湿重量を示す図である。図中*は有意差検定による有意水準PがP<0.05であることを表す。また、図中**は有意差検定による有意水準PがP<0.0001であることを表す。
[配列表]
Claims (12)
- 被験体における肝癌細胞の存在を検出するためのインビトロの免疫アッセイ方法であって、
(a)前記被験体から調製された後に、パラフィンに包まれて透過性の支持体に取り付けられた、同一被験体より少なくとも二つの同視し得る一組の組織標品がパラフィン包埋切片として提供され、
(b)前記一組の組織標品の脱パラフィン処理が実施され、
(c)前記(b)処理が実施された同視し得る一組の組織標品の一方に対して熱誘導抗原賦活化法による抗原賦活化処理が施され、他方に対してプロテアーゼ抗原賦活化法による抗原賦活化処理が施され、
(d)前記(c)処理が施された組織標品中に存するグリピカン3と抗グリピカン3抗体との複合体の形成に適切な条件下で、当該標品に対して抗グリピカン3抗体が接触され、
(e)複合体の存在が検出され、ここで、複合体が存在する場合に被験体において肝癌細胞が存在すると判定される、
の各工程を含む方法。 - 前記熱誘導抗原賦活化法がマイクロ波による加熱である請求項1に記載の方法。
- 前記熱誘導抗原賦活化法がオートクレーブによる加熱である請求項1に記載の方法。
- 前記プロテアーゼ抗原賦活化法に用いるプロテアーゼが、ペプシン、トリプシンおよびプロテアーゼKからなる群より選択される、請求項1から3のいずれかに記載の方法。
- 複合体を検出するための検出反応が酵素反応である、請求項1から4のいずれかに記載の方法。
- 前記抗グリピカン3抗体がグリピカン3のC末端ポリペプチドに結合する抗体である、請求項1から5のいずれかに記載の方法。
- グリピカン3のC末端ポリペプチドが配列番号1に記載の359番目のアミノ酸から580番目のアミノ酸からなるポリペプチド、または、375番目のアミノ酸から580番目のアミノ酸からなるポリペプチドである請求項6に記載の方法。
- 前記抗グリピカン3抗体がGC33抗体である請求項6または7に記載の方法。
- 前記抗グリピカン3抗体が1G12抗体である請求項1から5のいずれかに記載の方法。
- 工程(e)において、複合体の存在が数値化されて検出される、請求項1から9のいずれかに記載の方法。
- 前記数値化が以下の式;
IRCp=PR+(SI−Cp)+SP
[式中、
IRCpは、グリピカン3の発現量スコアであり、
PRは、検鏡下で前記複合体が検出される細胞の割合をスコア化した数値であり、
SI−Cpは、検鏡下で前記複合体が視野中細胞の細胞質において検出される染色強度をスコア化した数値であり、
SPは、検鏡下での視野中細胞の細胞膜において完全な膜染色を示す細胞の割合をスコア化した数値である]にしたがって算出される、請求項10に記載の方法。 - 前記数値化が以下の式;
IRCm=PR+(SI−Cm)+SP
[式中、
IRCmは、グリピカン3の膜局在スコアであり、
PRは、検鏡下で前記複合体が検出される細胞の割合をスコア化した数値であり、
SI−Cmは、検鏡下で前記複合体が視野中細胞の細胞膜において検出される染色強度をスコア化した数値であり、
SPは、検鏡下での視野中細胞の細胞膜において完全な膜染色を示す細胞の割合をスコア化した数値である]
にしたがって算出される、請求項10に記載の方法。
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