JP5616588B2

JP5616588B2 - microscope

Info

Publication number: JP5616588B2
Application number: JP2009099985A
Authority: JP
Inventors: 桑原　洋平; 洋平桑原; 昭典顕谷
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2009-04-16
Filing date: 2009-04-16
Publication date: 2014-10-29
Anticipated expiration: 2029-04-16
Also published as: JP2010250102A

Description

本発明は、顕微鏡に関するものである。 The present invention relates to a microscope.

従来、試料から発せられた蛍光をスペクトル成分へ波長別に分割し、多チャネル光検出器で検出を行う顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照）。
この顕微鏡では、検出器の数量が多いほど波長分解能が高くなり、例えば３２ｃｈの光検出器を用いた場合、可視領域をカバーするために、１ｃｈあたり１０ｎｍを受け持つことになる。 Conventionally, there has been known a microscope in which fluorescence emitted from a sample is divided into spectral components according to wavelength and detected by a multichannel photodetector (see, for example, Patent Document 1).
In this microscope, the larger the number of detectors, the higher the wavelength resolution. For example, when a 32-channel photodetector is used, it is responsible for 10 nm per channel in order to cover the visible region.

一方、色素の放射帯域は、数１００ｎｍの波長領域に渡っているため、使用色素の蛍光帯域に相応して各チャネルの合算が行われ、ＧＵＩ（Graphical User Interface）上において合算された画像が表示される。このような顕微鏡によれば、ダイクロイックフィルタなどを用いて分光検出する場合に比べて、観測する波長範囲の切り替えを高速に行うことができる。 On the other hand, since the emission band of the dye extends over a wavelength region of several hundreds of nanometers, the channels are summed according to the fluorescence band of the dye used, and the summed image is displayed on the GUI (Graphical User Interface). Is done. According to such a microscope, the wavelength range to be observed can be switched at a higher speed than in the case of performing spectral detection using a dichroic filter or the like.

特開２００６−１１９１５２号公報JP 2006-119152 A

ところで、合算しているチャネルのうち、あるチャネルの出力が飽和していても、合算した結果は飽和していない場合がある。この場合、特許文献１に開示されている顕微鏡では、合算した結果のみを表示しているため、ユーザは、チャネルの出力が飽和したことを知ることができない。そのため、光検出器の感度を上げすぎてしまい、結果として、不正確な輝度データの画像が表示されてしまうという問題がある。 By the way, even if the output of a certain channel is saturated among the summed channels, the summed result may not be saturated. In this case, since the microscope disclosed in Patent Document 1 displays only the summed result, the user cannot know that the output of the channel is saturated. Therefore, the sensitivity of the photodetector is increased too much, and as a result, there is a problem that an image of inaccurate luminance data is displayed.

本発明は、上記事情に鑑みてなされたもので、多チャネル光検出器により検出した輝度データを合算して表示する顕微鏡において、標本から発せられた蛍光を正確な強度で観察することのできる顕微鏡を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and a microscope capable of observing fluorescence emitted from a specimen with an accurate intensity in a microscope that displays luminance data detected by a multi-channel photodetector. The purpose is to provide.

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明は、標本において発生した蛍光を集光する対物レンズと、該対物レンズにより集光された蛍光をスペクトル成分に分光する分光素子と、該分光素子により分光されたスペクトル成分をそれぞれ検出する複数のチャネルを有する光検出器と、観察しようとする蛍光色素の選択を受け付ける入力部と、前記複数のチャネルのうち、前記選択された蛍光色素に対応した合算チャネルを決定する色素選択処理部と、前記光検出器の複数のチャネルのうち前記合算チャネルにより検出されたスペクトル成分を合算して蛍光強度を算出する蛍光強度算出部と、前記蛍光強度算出部により算出された蛍光強度に基づいて画像を生成する画像生成部と、該画像生成部により生成された画像を表示する表示部と、前記光検出器の各チャネルにより検出されたスペクトル成分の輝度値が所定の閾値を超えたか否かを前記蛍光強度算出部における合算の対象となるチャネルのそれぞれについて判定する判定部と、該判定部により前記合算の対象となるチャネルの少なくとも１つのチャネルの輝度値が所定の閾値を超えたと判定された場合に、その判定結果を報知する報知手段とを備える顕微鏡を提供する。 In order to achieve the above object, the present invention employs the following means.
The present invention provides an objective lens that collects fluorescence generated in a specimen, a spectroscopic element that separates the fluorescence collected by the objective lens into spectral components, and a plurality of spectral components that are detected by the spectroscopic elements. A detector having a plurality of channels, an input unit that receives selection of a fluorescent dye to be observed, a dye selection processing unit that determines a summed channel corresponding to the selected fluorescent dye among the plurality of channels, and the fluorescence intensity calculating unit for calculating the fluorescence intensity by summing the detected spectral components by the sum channel of the plurality of channels of the photodetector, an image based on the fluorescence intensity calculated by the fluorescence intensity calculating unit and generating an image generating unit, and a display unit for displaying an image generated by the image generating unit, it is detected by each channel of the photodetector A determination unit that determines whether or not the luminance value of the spectral component exceeds a predetermined threshold value for each of the channels to be added in the fluorescence intensity calculation unit, and at least one of the channels to be added by the determination unit When it is determined that the luminance value of one channel exceeds a predetermined threshold value, a microscope is provided that includes notification means for notifying the determination result.

本発明によれば、標本において発生して対物レンズにより集光された蛍光が、分光素子によりスペクトル成分に分光される。分光されたスペクトル成分は、複数のチャネルを有する光検出器によりそれぞれ検出され、蛍光強度算出部により合算されて、その蛍光強度が算出される。この場合において、判定部により、光検出器の各チャネルにより検出されたスペクトル成分の輝度値が所定の閾値を超えたか否かが判定され、少なくとも１つのチャネルの輝度値が所定の閾値を超えたと判定された場合に、その判定結果が報知手段により報知される。 According to the present invention, the fluorescence generated in the specimen and collected by the objective lens is split into spectral components by the spectroscopic element. The spectral components thus separated are respectively detected by a photodetector having a plurality of channels, and are added together by a fluorescence intensity calculation unit to calculate the fluorescence intensity. In this case, the determination unit determines whether or not the luminance value of the spectral component detected by each channel of the photodetector has exceeded a predetermined threshold, and the luminance value of at least one channel has exceeded the predetermined threshold. When the determination is made, the determination result is notified by the notification means.

これにより、ユーザは、少なくとも１つのチャネルの輝度値が飽和したことを知ることができる。したがって、光検出器の感度を調整することによって、全てのチャネルにおけるスペクトル成分を飽和させずに正確に検出することができ、標本から発せられた蛍光の正確な強度による観察を行うことができる。 Thereby, the user can know that the luminance value of at least one channel is saturated. Therefore, by adjusting the sensitivity of the photodetector, it is possible to accurately detect the spectral components in all the channels without saturating them, and it is possible to perform observation with an accurate intensity of the fluorescence emitted from the specimen.

上記発明において、前記光検出器の感度を調整する感度調整手段を備えることとしてもよい。
このようにすることで、全てのチャネルにおけるスペクトル成分が飽和しないように、感度調整手段により光検出器の感度を調整することができ、標本から発せられた蛍光の正確な強度による観察を行うことができる。 In the above invention, a sensitivity adjusting means for adjusting the sensitivity of the photodetector may be provided.
In this way, the sensitivity of the photodetector can be adjusted by the sensitivity adjustment means so that the spectral components in all channels do not saturate, and observation with an accurate intensity of the fluorescence emitted from the sample is performed. Can do.

上記発明において、前記蛍光を発生させるレーザ光を標本上で走査するレーザ走査手段を備え、前記画像生成部は前記レーザ光の走査に基づいてスキャン画像を生成し、前記判定部は、前記スキャン画像の画素毎に前記判定を行い、前記報知手段が、前記表示部に表示されたスキャン画像において、前記合算の対象となるチャネルの少なくとも１つのチャネルの輝度値が所定の閾値を超えたと判定された画素を視認可能に表示することとしてもよい。 In the above-described invention, the apparatus includes a laser scanning unit that scans the sample with the laser beam that generates the fluorescence, the image generation unit generates a scan image based on the scanning of the laser beam, and the determination unit includes the scan image. performs the determination for each pixel of said notification means in the displayed scanned image on the display unit, it is determined that the brightness value of at least one channel of the channel to be the sum exceeds a predetermined threshold value The displayed pixels may be displayed so as to be visible.

このようにすることで、蛍光強度算出部により算出された蛍光強度に基づいて、画像生成部により生成された画像が、表示部に表示される。この際に、報知手段により、表示部に表示された画面において、輝度値が所定の閾値を超えた領域が視認可能に表示される。これにより、画面上においてどの領域の輝度値が所定の閾値を超えているかを知ることができ、ユーザが注目する領域について、輝度値が飽和しているか否かを知ることができる。 By doing in this way, the image produced | generated by the image generation part based on the fluorescence intensity calculated by the fluorescence intensity calculation part is displayed on a display part. At this time, on the screen displayed on the display unit, the notification unit displays a region where the luminance value exceeds a predetermined threshold so as to be visible. As a result, it is possible to know in which area the luminance value exceeds a predetermined threshold on the screen, and it is possible to know whether or not the luminance value is saturated for the area of interest to the user.

上記発明において、前記蛍光強度算出部により算出された蛍光強度に基づいて画像を生成する画像生成部と、該画像生成部により生成された画像を表示する表示部とを備え、前記報知手段が、前記表示部に表示された画面において、前記光検出器により検出されたスペクトル成分の輝度値が所定の閾値を超えた領域の周辺領域を視認可能に表示することとしてもよい。 In the above invention, the notification means includes an image generation unit that generates an image based on the fluorescence intensity calculated by the fluorescence intensity calculation unit, and a display unit that displays the image generated by the image generation unit. On the screen displayed on the display unit, a peripheral region of a region where the luminance value of the spectral component detected by the photodetector exceeds a predetermined threshold may be displayed so as to be visible.

報知手段により、輝度値が所定の閾値を超えた領域の周辺領域を視認可能に表示することで、前記領域が画面上において微小な場合にも、該領域を目立つようにでき、その視認性を向上することができる。 By displaying the surrounding area of the area where the luminance value exceeds a predetermined threshold by the notifying means so that the area can be viewed, the area can be made conspicuous even when the area is minute on the screen, and the visibility can be improved. Can be improved.

上記発明において、前記蛍光強度算出部の合算対象とするチャネルを選択可能であることとしてもよい。
このようにすることで、蛍光強度算出部により合算するスペクトル範囲を選択することができる。 In the above invention, the channels to be added up by the fluorescence intensity calculation unit may be selectable.
By doing in this way, the spectrum range added together by the fluorescence intensity calculation part can be selected.

本発明によれば、多チャネル光検出器により検出した輝度データを合算して表示する顕微鏡において、標本から発せられた蛍光を正確な強度で観察することのできるという効果を奏する。 According to the present invention, there is an effect that fluorescence emitted from a specimen can be observed with an accurate intensity in a microscope that displays luminance data detected by a multi-channel photodetector.

本発明の一実施形態に係る顕微鏡の概略構成図である。1 is a schematic configuration diagram of a microscope according to an embodiment of the present invention. 図１のＣＰＵの機能ブロック図である。It is a functional block diagram of CPU of FIG. 図１の顕微鏡により実行される処理を示すフローチャートである。It is a flowchart which shows the process performed by the microscope of FIG. 図１の顕微鏡の効果を説明する図である。It is a figure explaining the effect of the microscope of FIG. 図１の変形例に係る顕微鏡の効果を説明する図である。It is a figure explaining the effect of the microscope concerning the modification of FIG.

本発明の一実施形態に係る顕微鏡について、図面を参照して説明する。
図１は、本実施形態の顕微鏡１の構成図である。図１に示すように、本実施形態の顕微鏡１は、レーザ光を標本Ａに照射して標本Ａにおいて発生した蛍光を検出するレーザ走査型顕微鏡であり、顕微鏡本体１００と、レーザ光を出射する光源２００と、パーソナルコンピュータ（以降では「ＰＣ」と表記する。）３００と、コントローラ４００とを主な構成要素として備えている。 A microscope according to an embodiment of the present invention will be described with reference to the drawings.
FIG. 1 is a configuration diagram of a microscope 1 according to the present embodiment. As shown in FIG. 1, the microscope 1 according to the present embodiment is a laser scanning microscope that irradiates a specimen A with laser light and detects fluorescence generated in the specimen A. The microscope 1 emits laser light with the microscope main body 100. A light source 200, a personal computer (hereinafter referred to as “PC”) 300, and a controller 400 are provided as main components.

光源２００は、コントローラ４００により制御され、レーザ光を射出するようになっている。このレーザ光は、標本Ａ内の蛍光指示薬を励起させ、蛍光を発生させるようになっている。 The light source 200 is controlled by the controller 400 and emits laser light. This laser light excites the fluorescent indicator in the specimen A to generate fluorescence.

顕微鏡本体１００は、光源２００からのレーザ光を標本Ａに照射する照射光学系１０と、照射系１０によりレーザ光を照射することで標本Ａにおいて発生した蛍光を検出する検出光学系２０とを備えている。 The microscope main body 100 includes an irradiation optical system 10 that irradiates the specimen A with laser light from the light source 200, and a detection optical system 20 that detects fluorescence generated in the specimen A by irradiating the irradiation system 10 with laser light. ing.

照射光学系１０は、ダイクロイックミラー１１１、ミラー１１２、走査光学ユニット１１３、対物レンズ１１４、およびステージ１１５から構成されている。
検出光学系２０は、共焦点ピンホール１１６、ミラー１１７、分光素子１１８、多チャネル光検出器（光検出器）１１９、増幅器１２０、Ａ／Ｄ変換器１２１、およびＣＰＵ（蛍光強度算出部、判定部）１２２から構成されている。 The irradiation optical system 10 includes a dichroic mirror 111, a mirror 112, a scanning optical unit 113, an objective lens 114, and a stage 115.
The detection optical system 20 includes a confocal pinhole 116, a mirror 117, a spectroscopic element 118, a multichannel photodetector (photodetector) 119, an amplifier 120, an A / D converter 121, and a CPU (fluorescence intensity calculation unit, determination). Part) 122.

ダイクロイックミラー１１１は、光源２００からのレーザ光を反射する一方、標本Ａにおいて発生して対物レンズ１１４により集光された蛍光を透過するようになっている。このような構成を有することで、ダイクロイックミラー１１１は、レーザ光の光路と標本Ａからの蛍光の光路とを分岐するようになっている。 The dichroic mirror 111 reflects the laser light from the light source 200 while transmitting the fluorescence generated in the sample A and collected by the objective lens 114. By having such a configuration, the dichroic mirror 111 branches the optical path of the laser light and the optical path of the fluorescence from the specimen A.

走査光学ユニット１１３は、例えばアルミコートされた一対のガルバノミラー１１３ａ，１１３ｂを有しており、これら一対のガルバノミラー１１３ａ，１１３ｂの角度を変化させ、ラスタスキャン方式で駆動されるようになっている。これにより、光源２００からのレーザ光を標本Ａ上において二次元的に走査させるようになっている。 The scanning optical unit 113 has, for example, a pair of galvanometer mirrors 113a and 113b coated with aluminum. The angle of the pair of galvanometer mirrors 113a and 113b is changed, and the scanning optical unit 113 is driven by a raster scan method. . Thereby, the laser beam from the light source 200 is scanned two-dimensionally on the specimen A.

対物レンズ１１４は、走査光学ユニット１１３により走査されたレーザ光を標本Ａ上に照射する一方、標本Ａから発生した蛍光を集光するようになっている。 The objective lens 114 irradiates the laser beam scanned by the scanning optical unit 113 onto the sample A, while condensing the fluorescence generated from the sample A.

共焦点ピンホール１１６は、標本Ａ上におけるレーザ光の焦点位置から発生した蛍光のみを通過させるようになっている。すなわち、対物レンズ１１４により集光されてダイクロイックミラー１１１を透過した蛍光は、共焦点ピンホール１１６を通過することによりレーザ光の焦点位置（測定点）から光軸方向にずれた位置からの光がカットされる。これにより、光軸方向に焦点位置と同一な面からの蛍光だけがミラー１１７に入射する。 The confocal pinhole 116 allows only the fluorescence generated from the focal position of the laser beam on the specimen A to pass. That is, the fluorescence condensed by the objective lens 114 and transmitted through the dichroic mirror 111 passes through the confocal pinhole 116, so that light from a position shifted in the optical axis direction from the focal position (measurement point) of the laser beam is emitted. Cut. Thereby, only the fluorescence from the same plane as the focal position in the optical axis direction enters the mirror 117.

分光素子１１８は、例えばプリズムや回折格子であり、標本Ａにおいて発生し、ミラー１１７により反射された蛍光を波長毎のスペクトル成分に分光し、分光したスペクトル成分を多チャネル光検出器１１９に入射させるようになっている。 The spectroscopic element 118 is, for example, a prism or a diffraction grating. The spectroscopic element 118 divides the fluorescence generated in the sample A and reflected by the mirror 117 into spectral components for each wavelength, and causes the spectral components to be incident on the multi-channel photodetector 119. It is like that.

多チャネル光検出器１１９は、分光素子１１８により分光されたスペクトル成分をそれぞれ検出する複数のチャネルを有しており、検出したスペクトル成分の輝度を電気信号へ変換する素子である。この場合は、波長毎に分割されたスペクトル成分が入射されるため、各チャネルにはそれぞれ異なる波長の光が入射される。この多チャネル光検出器１１９の具体例として、例えば浜松ホトニクス（株）製のＨ７２６０（３２チャネルフォトマルチプライヤ）を用いることができる。なお、多チャネル検出器１１９は、外部から感度調整を行うことができるが、感度は全チャネル一括でしか調整できないものである。 The multi-channel photodetector 119 has a plurality of channels that respectively detect the spectral components dispersed by the spectroscopic element 118, and is an element that converts the luminance of the detected spectral components into an electrical signal. In this case, since spectral components divided for each wavelength are incident, light of different wavelengths is incident on each channel. As a specific example of the multi-channel photodetector 119, for example, H7260 (32-channel photomultiplier) manufactured by Hamamatsu Photonics Co., Ltd. can be used. The multi-channel detector 119 can perform sensitivity adjustment from the outside, but the sensitivity can be adjusted only for all channels at once.

多チャネル光検出器１１９の後段には、電気信号を増幅する増幅器（ＡＭＰ）１２０がチャネル毎に設けられている。増幅器１２０は、多チャネル光検出器１１９により変換された微弱信号を増幅することができる。また、増幅器１２０の後段には、Ａ／Ｄ変換器１２１がチャネル毎に設けられている。Ａ／Ｄ変換器１２１は、増幅器１２０により増幅された電気信号をデジタル信号に変換するものである。 An amplifier (AMP) 120 that amplifies an electric signal is provided for each channel after the multi-channel photodetector 119. The amplifier 120 can amplify the weak signal converted by the multi-channel photodetector 119. Further, an A / D converter 121 is provided for each channel after the amplifier 120. The A / D converter 121 converts the electric signal amplified by the amplifier 120 into a digital signal.

Ａ／Ｄ変換器１２１の後段には、ＣＰＵ１２２が接続されている。ＣＰＵ１２２は、多チャネル光検出器１１９の複数のチャネルにより検出され、デジタル信号化されて送られてきた輝度信号を合算して蛍光強度を算出するようになっている。また、ＣＰＵ１２２は、送られてきた輝度信号と閾値との比較判定を行う機能を有しており、多チャネル光検出器１１９の各チャネルにより検出されたスペクトル成分の輝度値が予め設定された所定の閾値を超えたか否かを判定するようになっている。 A CPU 122 is connected to the subsequent stage of the A / D converter 121. The CPU 122 calculates the fluorescence intensity by adding together the luminance signals detected by a plurality of channels of the multi-channel photodetector 119 and converted into digital signals. Further, the CPU 122 has a function of comparing and determining the transmitted luminance signal and the threshold value, and the luminance value of the spectrum component detected by each channel of the multi-channel photodetector 119 is set in advance. It is determined whether or not the threshold value is exceeded.

ＣＰＵ１２２には、ＰＣ３００の内部にあるＰＣ本体（画像生成部）３０１が接続されている。このＰＣ本体３０１には、ディスプレイ（表示部）３０２および入力装置（感度調整手段）３０３が接続されている。 A PC main body (image generation unit) 301 inside the PC 300 is connected to the CPU 122. A display (display unit) 302 and an input device (sensitivity adjusting means) 303 are connected to the PC main body 301.

入力装置３０３は、ユーザにより感度調整、色素選択、閾値設定についての入力が行われるようになっており、その入力結果をＰＣ本体３０１に送信するようになっている。
入力装置３０３によりユーザが感度調整を行うと、ＰＣ本体３０１、ＣＰＵ１２２を介して多チャネル光検出器１１９の感度が調整されるようになっている。 The input device 303 is configured such that the user performs input regarding sensitivity adjustment, pigment selection, and threshold setting, and the input result is transmitted to the PC main body 301.
When the user adjusts sensitivity using the input device 303, the sensitivity of the multi-channel photodetector 119 is adjusted via the PC main body 301 and the CPU 122.

また、入力装置３０３によりユーザが色素選択についての入力を行うと、図２に示すように、その設定がＰＣ本体３０１を介してＣＰＵ１２２に送られ、ＣＰＵ１２２内では選択した色素に対応する合算チャネルを決定し、決定したチャネルにより検出されたスペクトル成分の合算処理が行われるようになっている（色素選択処理）。 Further, when the user inputs the pigment selection by the input device 303, as shown in FIG. 2, the setting is sent to the CPU 122 via the PC main body 301, and in the CPU 122, the total channel corresponding to the selected pigment is selected. Then, a summation process of the spectral components detected by the determined channel is performed (dye selection process).

また、入力装置３０３によりユーザが閾値設定についての入力を行うと、図２に示すように、その設定がＰＣ本体３０１を介してＣＰＵ１２２に送られ、ＣＰＵ１２２内では設定した閾値と合算対象であるチャネルそれぞれとの比較が行われるようになっている（飽和検出処理）。 When the user inputs a threshold value setting with the input device 303, as shown in FIG. 2, the setting is sent to the CPU 122 via the PC main body 301. Comparison with each is performed (saturation detection processing).

ＰＣ本体３０１は、ＣＰＵ１２２により算出された蛍光強度に基づいてスキャン画像を生成するようになっている。
ディスプレイ３０２は、ＰＣ本体３０１に接続されており、ＰＣ本体３０１により生成されたスキャン画像の表示が行われるようになっている。 The PC main body 301 generates a scan image based on the fluorescence intensity calculated by the CPU 122.
The display 302 is connected to the PC main body 301 so that a scan image generated by the PC main body 301 is displayed.

また、ＰＣ本体３０１は、ディスプレイ３０２に表示された画面において、多チャネル光検出器１１９により検出されたスペクトル成分の輝度値が所定の閾値を超えた領域（飽和部分）を視認可能に表示するようになっている。具体的には、例えば図４に示すように、所定の閾値を超えた領域を、周辺領域に対する補色で着色して表示するようになっている。 Further, the PC main body 301 displays a region (saturated portion) in which the luminance value of the spectral component detected by the multi-channel photodetector 119 exceeds a predetermined threshold on the screen displayed on the display 302 so as to be visible. It has become. Specifically, for example, as shown in FIG. 4, an area exceeding a predetermined threshold is displayed in a color that is complementary to the surrounding area.

コントローラ４００は、走査ミラー１１３、ＣＰＵ１２２、および光源２００を制御して、これら装置間の同期をとるようになっている。 The controller 400 controls the scanning mirror 113, the CPU 122, and the light source 200 to synchronize these devices.

上記構成を有する顕微鏡１の作用について以下に説明する。
光源２００から出射されたレーザ光は、顕微鏡装置本体１００内にあるダイクロイックミラー１１１およびミラー１１２によりそれぞれ反射され、走査光学ユニット１１３に入射し、走査光学ユニット１１３の動作によって偏向され、標本Ａ上において二次元的に走査される。 The operation of the microscope 1 having the above configuration will be described below.
The laser light emitted from the light source 200 is reflected by the dichroic mirror 111 and the mirror 112 in the microscope apparatus main body 100, enters the scanning optical unit 113, is deflected by the operation of the scanning optical unit 113, and is reflected on the specimen A. Scanned two-dimensionally.

走査されたレーザ光は、対物レンズ１１４に入射し、ステージ１１５上に置かれた標本Ａ上に集光されて照射される。標本Ａの焦点面においては、レーザ光により標本Ａ内の蛍光物質が励起されて蛍光が発生する。 The scanned laser light is incident on the objective lens 114 and is condensed and irradiated on the specimen A placed on the stage 115. On the focal plane of the specimen A, the fluorescent material in the specimen A is excited by the laser light, and fluorescence is generated.

標本Ａから発せられた蛍光は、対物レンズ１１４により集光され、走査光学ユニット１１３及びミラー１１２を通過して、ダイクロイックミラー１１１に入射する。ダイクロイックミラー１１１に入射した蛍光は、ダイクロイックミラー１１１を透過し、共焦点ピンホール１１６へ導光される。 The fluorescence emitted from the specimen A is collected by the objective lens 114, passes through the scanning optical unit 113 and the mirror 112, and enters the dichroic mirror 111. The fluorescence incident on the dichroic mirror 111 passes through the dichroic mirror 111 and is guided to the confocal pinhole 116.

共焦点ピンホール１１６では、標本Ａの焦点面において発生した蛍光のみを通過させ、レーザ光の焦点位置（測定点）に対して光軸方向にずれた位置からの光がカットされる。これにより、光軸方向に測定点と同一な面からの蛍光だけがミラー１１７に入射される。 In the confocal pinhole 116, only the fluorescence generated on the focal plane of the specimen A is allowed to pass, and light from a position shifted in the optical axis direction with respect to the focal position (measurement point) of the laser light is cut. Thereby, only the fluorescence from the same plane as the measurement point in the optical axis direction is incident on the mirror 117.

ミラー１１７で反射された蛍光は、分光素子１１８に入射し、波長毎のスペクトル成分に分解される。分解されたスペクトル成分は、多チャネル光検出器１１９の各チャネルに入射し、各チャネルによりそれぞれの波長成分についての輝度に応じた電気信号に変換される。 The fluorescence reflected by the mirror 117 enters the spectroscopic element 118 and is decomposed into spectral components for each wavelength. The decomposed spectral component enters each channel of the multi-channel photodetector 119 and is converted into an electric signal corresponding to the luminance of each wavelength component by each channel.

これらの電気信号は、増幅器１２０によりそれぞれ増幅され、Ａ／Ｄ変換器１２１によりアナログ信号からデジタル信号に変換される。デジタル信号となった電気信号はＣＰＵ１２２に送られる。ここで、階調の不足によりＡ／Ｄ変換器の出力が飽和する場合がある。この場合、以下のように飽和判定とその表示が行われる。 These electric signals are respectively amplified by the amplifier 120 and converted from an analog signal to a digital signal by the A / D converter 121. The electrical signal that has become a digital signal is sent to the CPU 122. Here, the output of the A / D converter may be saturated due to insufficient gradation. In this case, saturation determination and display are performed as follows.

この飽和判定について、図３に示すフローチャートを用いて以下に説明する。
図３において、ステップＳ１では、ユーザが入力装置３０３を操作することによって、色素の選択と閾値の設定が行われる。ここで、ユーザは、観察対象に応じて使用している色素を選択することができる。また、設定する閾値は飽和値と同じ値でもよいし、ほぼ飽和する値（例えば飽和値の９０％）でもよい。 This saturation determination will be described below using the flowchart shown in FIG.
In FIG. 3, in step S <b> 1, the user operates the input device 303 to select a pigment and set a threshold value. Here, the user can select the pigment used according to the observation target. Further, the threshold value to be set may be the same value as the saturation value, or may be a value that is substantially saturated (for example, 90% of the saturation value).

上記の設定は、ＰＣ本体３０１を介してＣＰＵ１２２へ送られる。ステップＳ２以降は、ＣＰＵ１２２内での処理である。
ステップＳ２では、ＣＰＵ１２２は色素情報を受け取り、データテーブルを呼び出して合算すべきチャネルが決定される。ステップＳ３では、ＣＰＵ１２２により、合算の対象となるチャネル一つ一つに対して、閾値との比較が行われる。 The above settings are sent to the CPU 122 via the PC main body 301. Step S2 and subsequent steps are processing in the CPU 122.
In step S2, the CPU 122 receives the dye information, calls a data table, and determines a channel to be added. In step S <b> 3, the CPU 122 compares each channel to be added with a threshold value.

ステップＳ４では、合算の対象となるチャネルのうち、１つでも閾値を超えたチャネルがあったか否かが判定される。判定の結果、合算の対象となるチャネルのうち、いずれのチャネルも飽和していない場合には、後述するステップＳ５およびステップＳ６の処理が実行され、１つでも閾値を超えるチャネルがあった場合には、後述するステップＳ７およびステップＳ８の処理が実行される。 In step S4, it is determined whether there is any channel that exceeds the threshold among the channels to be added. As a result of the determination, when none of the channels to be added is saturated, the processing of Step S5 and Step S6 described later is executed, and there is even one channel exceeding the threshold value. In step S7 and step S8, which will be described later, are executed.

いずれのチャネルも飽和していない場合には、ステップＳ５において、合算の対象となるチャネルについての合算が行われる。そして、ステップＳ６において、二次元画像の１画素のデータとして合算した値がＰＣ本体３０１へ出力される。 If none of the channels is saturated, in step S5, summing is performed on the channels to be summed. In step S <b> 6, a value summed as one pixel data of the two-dimensional image is output to the PC main body 301.

一方、一つでも閾値を超えるチャネルがあった場合には、ステップＳ７において、飽和を示すためのデータが生成される。そして、ステップＳ８において、二次元画像の１画素データとしてＰＣ本体３０１へ出力される。 On the other hand, if there is even one channel that exceeds the threshold, data for indicating saturation is generated in step S7. In step S8, the data is output to the PC main body 301 as one-pixel data of a two-dimensional image.

上記のステップＳ３〜Ｓ６またはステップＳ３〜Ｓ８までの処理が、二次元画像を得るために、画素数分繰り返される（ステップＳ９）。これにより、ＰＣ本体３０１ではＣＰＵ１２２から受け取ったデータに基づいてスキャン画像が生成され、ディスプレイ３０２にそのスキャン画像が表示される。この際、いずれのチャネルも閾値を超えていなければそのまま表示し、１つでも閾値を超えるチャネルがあった場合には、図４に示すように、飽和している画素については色を変えて表示される。 The process from step S3 to S6 or step S3 to S8 is repeated for the number of pixels to obtain a two-dimensional image (step S9). As a result, the PC main body 301 generates a scan image based on the data received from the CPU 122, and the scan image is displayed on the display 302. At this time, if any channel does not exceed the threshold value, it is displayed as it is. If there is any channel exceeding the threshold value, as shown in FIG. 4, the saturated pixels are displayed in different colors. Is done.

以上のように、本実施形態に係る顕微鏡１によれば、標本Ａにおいて発生した蛍光が、分光素子１１８によりスペクトル成分に分光され、多チャネル光検出器１１９によりスペクトル成分毎に検出され、ＣＰＵ１２２により合算されてその蛍光強度が算出される。この場合において、ＣＰＵ１２２により、多チャネル光検出器１１９の各チャネルにより検出されたスペクトル成分の輝度値が所定の閾値を超えたか否かが判定され、少なくとも１つのチャネルの輝度値が所定の閾値を超えたと判定された場合に、その判定結果がユーザに報知される。 As described above, according to the microscope 1 according to the present embodiment, the fluorescence generated in the specimen A is dispersed into spectral components by the spectroscopic element 118, detected for each spectral component by the multichannel photodetector 119, and by the CPU 122. The fluorescence intensity is calculated by adding up. In this case, the CPU 122 determines whether or not the luminance value of the spectral component detected by each channel of the multi-channel photodetector 119 exceeds a predetermined threshold value, and the luminance value of at least one channel has the predetermined threshold value. When it is determined that it has exceeded, the determination result is notified to the user.

これにより、ユーザは、少なくとも１つのチャネルの輝度値が飽和したことを知ることができる。したがって、入力装置３０３により多チャネル光検出器１１９の感度を調整することによって、全てのチャネルにおけるスペクトル成分を飽和させずに正確に検出することができ、標本Ａから発せられた蛍光の正確な強度による観察を行うことができる。 Thereby, the user can know that the luminance value of at least one channel is saturated. Therefore, by adjusting the sensitivity of the multi-channel photodetector 119 with the input device 303, it is possible to accurately detect the spectral components in all the channels without saturating them, and to accurately detect the fluorescence emitted from the specimen A. Can be observed.

また、本実施形態に係る顕微鏡１によれば、ＣＰＵ１２２により算出された蛍光強度に基づいて、ＰＣ本体３０１により生成されたスキャン画像が、ディスプレイ３０２に表示される。この際に、図４に示すように、ディスプレイ３０２に表示されたスキャン画像において、輝度値が所定の閾値を超えた領域（飽和部分）が視認可能に表示される。これにより、ユーザは、スキャン画像上において標本Ａのどの領域で輝度値が飽和しているか分かるため、自分が注目している領域に関して飽和しているか知ることができる。なお、この表示を行うか否かは、ＧＵＩ等によりユーザが選択することが可能としてもよい。 Further, according to the microscope 1 according to the present embodiment, the scan image generated by the PC main body 301 is displayed on the display 302 based on the fluorescence intensity calculated by the CPU 122. At this time, as shown in FIG. 4, in the scanned image displayed on the display 302, a region (saturated portion) where the luminance value exceeds a predetermined threshold is displayed so as to be visible. As a result, the user can know in which region of the specimen A the luminance value is saturated on the scanned image, so that the user can know whether the region of interest is saturated. Note that whether or not to perform this display may be selectable by the user using a GUI or the like.

つまり、もし注目していない領域において飽和していれば、見たいところに感度を合わせて観察を行い、後に注目領域だけ切り出せばよい。例えば、図４において、領域ＲＯＩ２の中では飽和している部分があるが、領域ＲＯＩ１に注目しているのであれば、そのまま領域ＲＯＩ１に感度を合わせて観察を続行すればよい。 In other words, if saturation occurs in a region that is not focused, it is only necessary to perform observation with matching sensitivity to a desired location and then cut out only the focused region later. For example, in FIG. 4, although there is a saturated portion in the region ROI2, if attention is paid to the region ROI1, the observation may be continued with the sensitivity adjusted to the region ROI1 as it is.

なお、本実施形態に係る顕微鏡１の変形例として、図５に示すように、ディスプレイ３０２に表示されたスキャン画面において、多チャネル光検出器１１９により検出されたスペクトル成分の輝度値が所定の閾値を超えた領域（飽和部分）の周辺領域を視認可能に表示することとしてもよい。
このようにすることで、飽和部分がスキャン画像において微小な場合にも、該飽和部分を目立つようにでき、その視認性を向上することができる。 As a modification of the microscope 1 according to the present embodiment, as shown in FIG. 5, the luminance value of the spectrum component detected by the multi-channel photodetector 119 on the scan screen displayed on the display 302 is a predetermined threshold value. It is good also as displaying the peripheral region of the area | region (saturated part) beyond this so that visual recognition is possible.
By doing in this way, even when the saturated portion is minute in the scan image, the saturated portion can be made conspicuous, and the visibility can be improved.

以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。
例えば、本実施形態において、スペクトル成分の輝度値が所定の閾値を超えたことをディスプレイ３０２に表示することでユーザに報知することとして説明したが、これに代えて、例えばアラーム等によってユーザに報知することとしてもよい。 As mentioned above, although embodiment of this invention was explained in full detail with reference to drawings, the specific structure is not restricted to this embodiment, The design change etc. of the range which does not deviate from the summary of this invention are included.
For example, in the present embodiment, it has been described that the user is notified by displaying on the display 302 that the luminance value of the spectral component has exceeded a predetermined threshold value. Instead, the user is notified by, for example, an alarm or the like. It is good to do.

また、ディスプレイ３０２において飽和部分を表示する方法として、周辺領域に対する補色で飽和部分を着色することとして説明したが、飽和部分を視認可能に表示することができればよく、例えば、飽和部分を点滅あるいは拡大することとしてもよい。 In addition, as a method of displaying the saturated portion on the display 302, the saturated portion has been described as being colored with a complementary color with respect to the peripheral region. However, it is only necessary that the saturated portion can be displayed in a visible manner. It is good to do.

また、図３で説明した処理方法は一例であり、異なる構成で処理を行ってもよい。例えば、ステップＳ７においては、ステップＳ５と同様に合算処理を行うこととしてもよい。その場合、次のステップＳ８において、飽和を示すためのデータを生成し、合算した結果と置き換える処理が行われる。 Moreover, the processing method demonstrated in FIG. 3 is an example, and you may process by a different structure. For example, in step S7, the summation process may be performed in the same manner as in step S5. In that case, in the next step S8, data for indicating saturation is generated, and processing for replacing the summed result is performed.

Ａ標本
１顕微鏡
１０照射光学系
２０検出光学系
１００顕微鏡本体
１１１ダイクロイックミラー
１１２ミラー
１１３走査光学ユニット
１１４対物レンズ
１１５ステージ
１１６共焦点ピンホール
１１７ミラー
１１８分光素子
１１９多チャネル光検出器
１２０増幅器
１２１Ａ／Ｄ変換器
１２２ＣＰＵ
２００光源
３００パーソナルコンピュータ（ＰＣ）
４００コントローラ A Specimen 1 Microscope 10 Irradiation optical system 20 Detection optical system 100 Microscope main body 111 Dichroic mirror 112 Mirror 113 Scanning optical unit 114 Objective lens 115 Stage 116 Confocal pinhole 117 Mirror 118 Spectral element 119 Multichannel photodetector 120 Amplifier 121 A / D converter 122 CPU
200 Light source 300 Personal computer (PC)
400 controller

Claims

標本において発生した蛍光を集光する対物レンズと、
該対物レンズにより集光された蛍光をスペクトル成分に分光する分光素子と、
該分光素子により分光されたスペクトル成分をそれぞれ検出する複数のチャネルを有する光検出器と、
観察しようとする蛍光色素の選択を受け付ける入力部と、
前記複数のチャネルのうち、前記選択された蛍光色素に対応した合算チャネルを決定する色素選択処理部と、
前記光検出器の複数のチャネルのうち前記合算チャネルにより検出されたスペクトル成分を合算して蛍光強度を算出する蛍光強度算出部と、
前記蛍光強度算出部により算出された蛍光強度に基づいて画像を生成する画像生成部と、
該画像生成部により生成された画像を表示する表示部と、
前記光検出器の各チャネルにより検出されたスペクトル成分の輝度値が所定の閾値を超えたか否かを前記蛍光強度算出部における合算の対象となるチャネルのそれぞれについて判定する判定部と、
該判定部により前記合算の対象となるチャネルの少なくとも１つのチャネルの輝度値が所定の閾値を超えたと判定された場合に、その判定結果を報知する報知手段とを備える顕微鏡。 An objective lens for collecting fluorescence generated in the specimen;
A spectroscopic element that separates the fluorescence condensed by the objective lens into spectral components;
A photodetector having a plurality of channels that respectively detect spectral components dispersed by the spectroscopic element;
An input unit for receiving selection of a fluorescent dye to be observed;
A dye selection processing unit that determines a total channel corresponding to the selected fluorescent dye among the plurality of channels;
And the fluorescence intensity calculating unit for calculating the fluorescence intensity by summing the detected spectral components by the sum channel of the plurality of channels of the photodetector,
An image generator that generates an image based on the fluorescence intensity calculated by the fluorescence intensity calculator;
A display unit for displaying an image generated by the image generation unit;
A determination unit for determining whether or not the luminance value of the spectral component detected by each channel of the photodetector exceeds a predetermined threshold for each of the channels to be added in the fluorescence intensity calculation unit;
A microscope provided with a notifying means for notifying the determination result when the determination unit determines that the luminance value of at least one of the channels to be added exceeds a predetermined threshold.

前記光検出器の感度を調整する感度調整手段を備える請求項１に記載の顕微鏡。 The microscope according to claim 1, further comprising sensitivity adjusting means for adjusting sensitivity of the photodetector.

前記蛍光を発生させるレーザ光を標本上で走査するレーザ走査手段を備え、
前記画像生成部は前記レーザ光の走査に基づいてスキャン画像を生成し、
前記判定部は、前記スキャン画像の画素毎に前記判定を行い、
前記報知手段が、前記表示部に表示されたスキャン画像において、前記合算の対象となるチャネルの少なくとも１つのチャネルの輝度値が所定の閾値を超えたと判定された画素を視認可能に表示する請求項１または請求項２に記載の顕微鏡。 Laser scanning means for scanning the sample with laser light for generating fluorescence,
The image generation unit generates a scan image based on the scanning of the laser beam,
The determination unit performs the determination for each pixel of the scan image,
The informing means displays in a scan image displayed on the display section a pixel in which a luminance value of at least one channel of the channels to be summed is determined to have exceeded a predetermined threshold so as to be visible. Item 3. The microscope according to item 1 or 2.

前記蛍光強度算出部の合算対象とするチャネルを選択可能である請求項３に記載の顕微鏡。 The microscope according to claim 3, wherein channels to be summed by the fluorescence intensity calculation unit can be selected.