JP5602015B2 - ブレオマイシン水解酵素の活性を指標とした天然保湿因子による皮膚バリアー機能状態の評価方法 - Google Patents
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Description
さらに、かかる小ペプチド断片を分解する酵素を各種探索したところ、驚くべきことにこれら断片はブレオマイシン水解酵素(BH)によりアミノ酸単位、即ちNMFにまで分解されることが見出された。なお、ブレオマイシン水解酵素は脱イミノ化フィラグリン自体を分解することはできないことがわかった。
以上より、PADにより脱イミノ化されることでケラチン繊維の遊離された脱イミノ化フィラグリンは生体において、まずカルパイン−Iによりある程度の小分子にまで切断され、その後ブレオマイシン水解酵素によりアミノ酸単位にまで分解されてNMFとなることで、皮膚の保水機能、ひいては皮膚バリアー機能が発揮されるものと考えられる。
(1)皮膚組織におけるブレオマイシン水解酵素の活性を指標とした、天然保湿因子(NMF)による皮膚バリアー機能状態を評価する方法。
(2)前記皮膚組織におけるブレオマイシン水解酵素の活性が、対照の皮膚と比べ有意に低下していたら、NMFによる皮膚バリアー機能が低下していると判断し、対照の皮膚と比べ同程度以上であるなら、NMFによる皮膚バリアー機能が健常であると判断する、(1)の方法。
(3)さらに、皮膚組織におけるカルパイン−Iの活性を指標とする、(1)又は(2)の方法。
(4)前記皮膚組織におけるカルパイン−Iの活性が、対照の皮膚と比べ有意に低下していたら、NMFによる皮膚バリアー機能が低下していると判断し、対照の皮膚と比べ同程度以上であるなら、NMFによる皮膚バリアー機能が健常であると判断する、(3)の方法。
(5)皮膚組織におけるブレオマイシン水解酵素の活性を指標とした、NMFによる皮膚バリアー機能改善剤をスクリーニング評価する方法。
(6)さらに、皮膚組織におけるカルパイン−Iの活性を指標とする、(5)の方法。
(7)皮膚組織におけるブレオマイシン水解酵素の活性を亢進させることによる、NMFによる皮膚バリアー機能を改善する方法。
(8)さらに、皮膚組織におけるカルパイン−Iの活性をも亢進させる、(7)の方法。
「対照の皮膚と比べ有意に低下」とは、例えば皮膚医学的見地から健常であると医師により判断された正常な「対照の皮膚」と比べ、測定されたブレオマイシン水解酵素やカルパイン−Iの量が80%以下、又は70%以下、又は60%以下、又は50%以下、又は30%以下、又は10%以下である場合をいう。「対照の皮膚と比べ同程度以上」とは、例えば皮膚医学的見地から健常であると医師により判断された正常な「対照の皮膚」と比べ、測定されたブレオマイシン水解酵素やカルパイン−Iの量が例えば80%以上、又は90%以上、又は100%以上である場合をいう。
フィラグリン:(リコンビナントフィラグリンを大腸菌発現系を作製することにより調製した)
rPAD:(リコンビナントPADを大腸菌発現系を作製することにより作製した)
トリプシン:(Sigma社)
キモトリプシン:(Sigma社)
カテプシンL:(EMD Bioscience社)
カルパインI:(EMD Bioscience社)
カテプシンD:(EMD Bioscience社)
ブレオマイシン水解酵素:(新生児ラット表皮より、非特許文献5に従い作製)
本実験では、様々なプロテアーゼ(20種以上)によるフィラグリン(A)及び脱イミノ化フィラグリン(B)に対する分解作用を検討した。脱イミノ化フィラグリンはフィラグリンを50mM HEPES-NaOH バッファー(pH 7.4), 50 mM DTT, 100mM CaCl2の存在下、rPADと37℃で一晩反応し、完全に脱イミノ化させることで生成した。以下に、代表的なプロテアーゼによるフィラグリン及び脱イミノ化フィラグリンの分解結果を示す。
本実験では、様々なプロテアーゼによるカルパインIで分解した脱イミノ化フィラグリンペプチドからのアミノ酸産生を検討した。以下に、ブレオマイシン水解酵素によるのアミノ酸産生結果を示す。
Tris バッファーは蛍光試薬に反応するため、全ての反応をHEPES バッファー系で行った。ブレオマイシン水解酵素によって新しく生成したα-アミノ基はフルオレスカミンによるポストラベル蛍光法を用いて測定した。
フィラグリンは50mM HEPES-NaOH バッファー(pH 7.4), 50 mM DTT, 100mM CaCl2の存在下、rPADと37℃で一晩反応し、完全に脱イミノ化させた。それらをカルパインIと30℃で1時間反応後、煮沸によって反応停止した。分解されて生じたペプチド混合液には5mM EDTAを添加し、ブレオマイシン水解酵素と37℃で反応させ、経時的に反応溶液の一部を分取して、煮沸により反応を停止させた。対照溶液はブレオマイシン水解酵素の代わりにHEPES-NaOH バッファー (pH 7.4)を加え、同様に反応した。
Claims (6)
- 皮膚組織試料におけるブレオマイシン水解酵素の活性を指標とした、天然保湿因子(NMF)による皮膚バリアー機能状態を評価する方法。
- 前記皮膚組織試料におけるブレオマイシン水解酵素の活性が、対照の皮膚試料と比べ有意に低下していたら、NMFによる皮膚バリアー機能が低下していると判断し、対照の皮膚試料と比べ同程度以上であるなら、NMFによる皮膚バリアー機能が健常であると判断する、請求項1記載の方法。
- さらに、皮膚組織試料におけるカルパイン−Iの活性を指標とする、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記皮膚組織試料におけるカルパイン−Iの活性が、対照の皮膚試料と比べ有意に低下していたら、NMFによる皮膚バリアー機能が低下していると判断し、対照の皮膚試料と比べ同程度以上であるなら、NMFによる皮膚バリアー機能が健常であると判断する、請求項3記載の方法。
- 皮膚組織試料におけるブレオマイシン水解酵素の活性を指標とした、NMFによる皮膚バリアー機能改善剤をスクリーニング評価する方法。
- さらに、皮膚組織試料におけるカルパイン−Iの活性を指標とする、請求項5に記載の方法。
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