JP5598929B2 - Optical microscope - Google Patents
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Description
本発明は、光学顕微鏡に関する。The present invention relates to an optical microscope.
光学顕微鏡は、生きた生物試料をそのまま観察できるため、生命現象の解明において、非常に有効なツールとして用いられている。様々な機能を有する蛍光プローブが開発され、位相差光学系、共焦点光学系、全反射蛍光観察法など様々な光学系を利用することによって、細胞機能の解明、単一分子の観察などが実現されてきた。光を用いた生体試料の観察については、これまでの長い歴史によって、多くの実績と技術の蓄積がある。 Since an optical microscope can observe a living biological sample as it is, it is used as a very effective tool in elucidating life phenomena. Fluorescent probes with various functions have been developed. By using various optical systems such as phase contrast optical system, confocal optical system, and total reflection fluorescence observation method, elucidation of cell functions and observation of single molecules are realized. It has been. Regarding the observation of biological samples using light, there are many achievements and accumulated technologies due to the long history so far.
生命現象の解明におけるターゲットの一つとして、細胞やたんぱく質など最小構成要素一つの機能解明ではなく、複数の構成要素における相互作用、情報伝達のメカニズム、エネルギー伝達のメカニズム、細胞内の情報分子のダイナミクスなどを明らかにすることが期待されている。生体の器官、臓器などの働きは、生体の最小構成要素である細胞間の相互作用によって決定されるものである。従って、器官・臓器の詳細なメカニズムの解明には、細胞間の相互作用を明らかにすることが必要である。また、実時間観察を行うことによって、複数の生体分子のダイナミクスを理解することが必要である。 One of the targets in the elucidation of biological phenomena is not the elucidation of the function of one minimum component such as cells and proteins, but the interaction of multiple components, the mechanism of information transmission, the mechanism of energy transmission, and the dynamics of information molecules in the cell It is expected to clarify. The functions of living organs and organs are determined by the interaction between cells, which are the minimum components of the living body. Therefore, in order to elucidate the detailed mechanism of organs / organs, it is necessary to clarify the interaction between cells. It is also necessary to understand the dynamics of multiple biomolecules by performing real-time observation.
一方、光学顕微鏡の空間分解能は、光の波としての性質により制限され、たかだかサブミクロン程度の分解能しか実現できない。従って、複数の分子間または微小器官の間における相互作用、情報の伝達機構を解明するには、より高い空間分解能を有する光学顕微鏡を開発することが必要である。 On the other hand, the spatial resolution of an optical microscope is limited by the nature of light waves, and only a resolution of about submicron can be realized. Therefore, it is necessary to develop an optical microscope with higher spatial resolution in order to elucidate the interaction between a plurality of molecules or between micro-organs and the transmission mechanism of information.
光の回折限界を超えた微小領域を光学的に観察する顕微鏡として、近接場（ニアフィールド）顕微鏡が知られている。図４に近接場顕微鏡の光学的観察の原理を示す。図４に示すように、金属で遮蔽されたプローブの先端部にレーザ光が導入される。プローブの先端部には数ｎｍ〜数１０ｎｍの開口部が形成されている。前記開口部は光の波長に比べて非常に小さいので、プローブ先端部に導入されたレーザ光は前記開口部を通過できない。しかしながら、いわゆる近接場（ニアフィールド）効果によりレーザ光の一部が開口部から外部にしみ出す（エバネッセント波）。近接場顕微鏡では、このプローブ先端からしみ出した近接場光と測定対象物との相互作用が観察される。 As a microscope for optically observing a minute region exceeding the diffraction limit of light, a near-field microscope is known. FIG. 4 shows the principle of optical observation of the near-field microscope. As shown in FIG. 4, laser light is introduced into the tip of the probe shielded with metal. An opening of several nm to several tens of nm is formed at the tip of the probe. Since the opening is very small compared to the wavelength of light, the laser light introduced into the probe tip cannot pass through the opening. However, part of the laser light oozes out from the opening due to the so-called near-field effect (evanescent wave). In the near-field microscope, the interaction between the near-field light oozing out from the probe tip and the measurement object is observed.
この近接場顕微鏡を用いれば、光の波長未満の微小領域を観察することができる。しかしながら、近接場顕微鏡では、プローブの先端を測定対象物に近接させて観察する必要がある。図５に示すように、プローブを走査して測定対象物を観察するので、２次元の像を観察するのに非常に時間が掛かる。生体のダイナミクスを観察するためには、実時間観察が必要である。しかしながら、従来型の近接場顕微鏡では、上記の理由により実時間観察は不可能である。 By using this near-field microscope, it is possible to observe a minute region less than the wavelength of light. However, in the near-field microscope, it is necessary to observe the probe tip close to the measurement object. As shown in FIG. 5, since the measurement object is observed by scanning the probe, it takes a very long time to observe the two-dimensional image. In order to observe the dynamics of a living body, real-time observation is necessary. However, with a conventional near-field microscope, real-time observation is impossible for the reasons described above.
本発明に関連する先行技術として、以下の技術がある。
特表２００３−５２４７７９号公報（特許文献１）には、近接場光を用いた近接場顕微鏡において、複数のナノスケールの孔から光を照射して、近接場を生成する技術が記載されている。また、光を電子ビームにより励起することが示唆されている。この近接場顕微鏡では、微小光源はナノスケールの孔により生成されている。As prior arts related to the present invention, there are the following techniques.
Japanese Patent Application Publication No. 2003-52479 (Patent Document 1) describes a technique for generating a near field by irradiating light from a plurality of nanoscale holes in a near-field microscope using near-field light. . It has also been suggested that light is excited by an electron beam. In this near-field microscope, the micro light source is generated by nanoscale holes.
特開２００６−３０８４７５号公報（特許文献２）には、生体試料に光を照射して、発生した近接場光を光電変換膜により電子線に変換し、電子線を検出する近接場顕微鏡が記載されている。特許文献２では、近接場光を検出しているものの、光源自体は平行光である。 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2006-308475 (Patent Document 2) describes a near-field microscope that irradiates a biological sample with light, converts the generated near-field light into an electron beam by a photoelectric conversion film, and detects the electron beam. Has been. In Patent Document 2, although near-field light is detected, the light source itself is parallel light.
特開２００４−１１１３３３号公報（特許文献３）には、１００ｎｍ以下の膜厚の蛍光薄膜が記載されている。しかしながら、この蛍光薄膜は、電界放射型ディスプレイ用に開発されたものである。光学顕微鏡のように、試料を載置することや、電子ビーム又は電磁波で走査されることは想定されていない。また、結晶成長により蛍光層を形成しているため、蛍光物質は結晶化が可能な物質に限定される。 Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2004-111333 (Patent Document 3) describes a fluorescent thin film having a thickness of 100 nm or less. However, this fluorescent thin film has been developed for a field emission display. It is not assumed that a sample is placed or scanned with an electron beam or an electromagnetic wave as in an optical microscope. In addition, since the fluorescent layer is formed by crystal growth, the fluorescent material is limited to a material that can be crystallized.
上述した通り、従来の光学顕微鏡では光の回折限界により分解能に限界があった。一方、光の回折限界を超えて光学的な観察を行う顕微鏡として近接場顕微鏡があるが、プローブを観察対象部に近接させて走査させる必要があり、像を形成するのに時間が掛かる、という問題があった。また、ディスプレイ用の蛍光薄膜はいくつか知られているが、光学顕微鏡のように、試料を載置することや、電子ビーム又は電磁波で走査されることは想定されていない。 As described above, the resolution of the conventional optical microscope is limited due to the diffraction limit of light. On the other hand, there is a near-field microscope as a microscope that performs optical observation beyond the diffraction limit of light, but it is necessary to scan the probe close to the observation target part, and it takes time to form an image. There was a problem. Several fluorescent thin films for display are known, but it is not assumed that a sample is placed or scanned with an electron beam or an electromagnetic wave as in an optical microscope.
本発明では、数ｎｍから数１０ｎｍの蛍光層を形成することが可能で、電子ビーム又は電磁波の照射により可視光の波長未満の大きさの微小光源を励起することができ、蛍光物質が剥がれ落ち難い蛍光薄膜を用いる。 In the present invention, a fluorescent layer of several nm to several tens of nm can be formed, a minute light source having a size less than the wavelength of visible light can be excited by irradiation with an electron beam or electromagnetic wave, and the fluorescent material is peeled off. Use difficult fluorescent thin film .
本発明の目的は、上記の蛍光薄膜に励起される微小光源により得られる近接場効果を利用して、上記蛍光薄膜上に載せ置かれた測定対象物に関し、光の回折限界を超えた分解能の近接場情報を高速で取得可能な光学顕微鏡を提供することにある。 An object of the present invention relates to a measurement object placed on the fluorescent thin film using a near-field effect obtained by a micro light source excited by the fluorescent thin film, and has a resolution exceeding the diffraction limit of light. An object of the present invention is to provide an optical microscope capable of acquiring near-field information at high speed .
本発明で用いる蛍光薄膜は、電子ビーム又は電磁波の照射により可視光の波長未満の大きさの微小光源が励起される蛍光薄膜であって、基板と、前記基板の表面に共有結合により結合された蛍光物質を含み且つ可視光の波長未満の膜厚を有する蛍光層と、を含む。 The fluorescent thin film used in the present invention is a fluorescent thin film in which a minute light source having a size less than the wavelength of visible light is excited by irradiation with an electron beam or electromagnetic wave, and is bonded to the substrate and the surface of the substrate by a covalent bond. And a fluorescent layer containing a fluorescent material and having a thickness less than the wavelength of visible light.
上記の蛍光薄膜の製造方法は、蛍光物質に、第１官能基を導入するステップと、基板に、前記第１官能基と共有結合を形成する第２官能基を導入するステップと、前記蛍光物質に導入された前記第１官能基と前記基板に導入された前記第２官能基との反応により、前記基板の表面に共有結合により蛍光物質を結合するステップと、を含む。 The method for producing a fluorescent thin film includes a step of introducing a first functional group into a fluorescent material, a step of introducing a second functional group that forms a covalent bond with the first functional group into a substrate, and the fluorescent material. And bonding a fluorescent substance to the surface of the substrate by a covalent bond by a reaction between the first functional group introduced into the substrate and the second functional group introduced into the substrate.
上記の蛍光薄膜を用いた微小光源励起装置は、基板と、前記基板の表面に共有結合により結合された蛍光物質を含み且つ可視光の波長未満の膜厚を有する蛍光層と、を含む蛍光薄膜と、電子ビーム又は電磁波を発生する電子ビーム又は電磁波発生部と、前記電子ビーム又は電磁波発生部で発生した電子ビーム又は電磁波を制御して前記蛍光薄膜に照射し、前記蛍光薄膜に可視光の波長未満の大きさの微小光源を励起させる電子ビーム又は電磁波制御部と、を含む。 A micro-light source excitation device using the above-described fluorescent thin film includes a substrate, and a fluorescent thin film including a fluorescent substance covalently bonded to the surface of the substrate and having a thickness less than the wavelength of visible light And an electron beam or electromagnetic wave generator that generates an electron beam or electromagnetic wave; and the electron beam or electromagnetic wave generated by the electron beam or electromagnetic wave generator is controlled to irradiate the fluorescent thin film, and the fluorescent thin film has a wavelength of visible light. An electron beam or electromagnetic wave control unit that excites a micro light source having a size less than that.
本発明の光学顕微鏡は、容器内に設けられ、電子ビーム又は電磁波を発生する電子ビーム又は電磁波発生部と、前記容器の隔壁の一部を形成する蛍光薄膜であって、基板と、前記基板の表面に共有結合により結合された蛍光物質を含み且つ可視光の波長未満の膜厚を有する蛍光層と、を含む蛍光薄膜と、前記電子ビーム又は電磁波発生部で発生した電子ビーム又は電磁波を制御して前記蛍光薄膜に照射し、前記蛍光薄膜に可視光の波長未満の大きさの微小光源を励起させる電子ビーム又は電磁波制御部と、前記微小光源で発生して前記蛍光薄膜上に載せ置かれた測定対象物に作用した測定光を検出する光検出部と、を含む。 The optical microscope of the present invention is a fluorescent thin film that is provided in a container and that forms an electron beam or electromagnetic wave generating part that generates an electron beam or electromagnetic wave, and a part of a partition wall of the container , the substrate, A fluorescent thin film comprising a fluorescent material covalently bonded to the surface and having a thickness less than the wavelength of visible light; and controlling the electron beam or electromagnetic wave generated by the electron beam or electromagnetic wave generator. An electron beam or electromagnetic wave control unit that irradiates the fluorescent thin film and excites the fluorescent thin film with a light source having a size less than the wavelength of visible light, and is generated on the fluorescent thin film and placed on the fluorescent thin film. And a light detection unit for detecting measurement light acting on the measurement object .
本発明で用いる蛍光薄膜は、基板と蛍光物質とを共有結合することで、単層又は数層の蛍光物質の層を形成して数ｎｍから数１０ｎｍの蛍光層を形成することが可能で、電子ビーム又は電磁波の照射により可視光の波長未満の大きさの微小光源を励起することができる。また、基板と蛍光物質とを共有結合することで、蛍光物質が剥がれ落ち難くなる。 The fluorescent thin film used in the present invention can form a fluorescent layer of several nm to several tens of nm by forming a single layer or several fluorescent layers by covalently bonding the substrate and the fluorescent substance. A minute light source having a size smaller than the wavelength of visible light can be excited by irradiation with an electron beam or electromagnetic wave. Further, by covalently bonding the substrate and the fluorescent material, the fluorescent material is hardly peeled off.
本発明で用いる蛍光薄膜は、蛍光薄膜に励起される微小光源によれば近接場効果が得られるので、光学顕微鏡等の種々の用途に利用することが可能である。本発明の光学顕微鏡は、上記の蛍光薄膜を用いることにより、上記蛍光薄膜上に載せ置かれた測定対象物に関し、光の回折限界を超えた分解能の近接場情報を高速で取得することが可能である。 The fluorescent thin film used in the present invention can be used for various applications such as an optical microscope because a near-field effect is obtained by a micro light source excited by the fluorescent thin film. The optical microscope of the present invention can acquire near-field information with a resolution exceeding the diffraction limit of light at high speed for the measurement object placed on the fluorescent thin film by using the fluorescent thin film. It is.
以下、本発明の実施の形態の一例を詳細に説明する。 Hereinafter, an example of an embodiment of the present invention will be described in detail.
＜実施形態１（蛍光薄膜）＞
まず、本発明の実施の形態に係る蛍光薄膜について説明する。図１は本発明の実施形態に係る蛍光薄膜の構成の一例を示す模式図である。図１に示すように、蛍光薄膜１３は、基板４０、蛍光物質４２を含む蛍光層４４、及び金属蒸着層４６を含んで構成されている。基板４０上に複数の蛍光物質４２が配置されて、蛍光層４４が形成されている。金属蒸着層４６は、複数の蛍光物質４２を覆うように蛍光層４４上に形成されている。基板４０には、反応性の官能基４８が導入されている。また、後述する通り、蛍光物質４２には、官能基４８と共有結合を形成する官能基が導入されている。なお、金属蒸着層４６は、適宜省略することができる。<Embodiment 1 (fluorescent thin film)>
First, the fluorescent thin film which concerns on embodiment of this invention is demonstrated. FIG. 1 is a schematic diagram showing an example of the configuration of a fluorescent thin film according to an embodiment of the present invention. As shown in FIG. 1, the fluorescent thin film 13 includes a substrate 40, a fluorescent layer 44 including a fluorescent material 42, and a metal vapor deposition layer 46. A plurality of fluorescent materials 42 are disposed on the substrate 40 to form a fluorescent layer 44. The metal vapor deposition layer 46 is formed on the fluorescent layer 44 so as to cover the plurality of fluorescent materials 42. A reactive functional group 48 is introduced into the substrate 40. Further, as will be described later, a functional group that forms a covalent bond with the functional group 48 is introduced into the fluorescent material 42. The metal vapor deposition layer 46 can be omitted as appropriate.
本実施の形態では、蛍光物質４２として「量子ドット」が用いられている。また、基板４０として「ガラス基板」が用いられている。基板４０には、官能基４８として「活性化アミノ基」が導入されている。また、蛍光物質４２には、活性化アミノ基と「ペプチド結合」を形成する官能基が導入されている。各々の官能基は、メチレン基（-(CH2)n-）やポリエチレングリコール（略称ＰＥＧ、H-(CH2CH2O)n-）等、適当なスペーサ基を介して導入することができる。基板（ガラス基板）４０上には、これら官能基の共有結合（ペプチド結合/-C(=O)NH-）を介して、蛍光物質（量子ドット）４２が配置されている。また、金属蒸着層４６として「Ａｕ（金）」を蒸着した層が形成されている。In the present embodiment, “quantum dots” are used as the fluorescent material 42. Further, a “glass substrate” is used as the substrate 40. In the substrate 40, an “activated amino group” is introduced as a functional group 48. In addition, a functional group that forms a “peptide bond” with the activated amino group is introduced into the fluorescent substance 42. Each functional group can be introduced via an appropriate spacer group such as a methylene group (— (CH 2 ) n —) or polyethylene glycol (abbreviation PEG, H— (CH 2 CH 2 O) n —). . On the substrate (glass substrate) 40, a fluorescent substance (quantum dot) 42 is arranged through a covalent bond (peptide bond / -C (= O) NH-) of these functional groups. In addition, a layer in which “Au (gold)” is deposited is formed as the metal deposition layer 46.
図２は基板と蛍光物質とが共有結合で結合される様子を示す模式図である。図２に示すように、ガラス基板（Glass Substrate）上には、メチレン基を介して活性化アミノ基（-NH2）が導入されている。また、量子ドット（Quantum Dot/Ｑドット）には、ＰＥＧを介してカルボキシル基（-COOH）が導入されている。即ち、量子ドットは、表面吸着化合物（Surface & Attachment Chemistry）であるＰＥＧで覆われており、ＰＥＧに結合された生体活性分子（Bioactive Molecule）がカルボキシル基（-COOH）を有している。ガラス基板の活性化アミノ基（-NH2）と、量子ドットのカルボキシル基（-COOH）とが反応して、ペプチド結合（-C(=O)NH-）により量子ドットがガラス基板に結合される。FIG. 2 is a schematic view showing a state in which the substrate and the fluorescent material are bonded by covalent bonds. As shown in FIG. 2, an activated amino group (—NH 2 ) is introduced on the glass substrate (Glass Substrate) via a methylene group. In addition, a carboxyl group (—COOH) is introduced into the quantum dot (Quantum Dot / Q dot) via PEG. That is, the quantum dots are covered with PEG which is a surface adsorption compound (Surface & Attachment Chemistry), and the bioactive molecule (Bioactive Molecule) bonded to PEG has a carboxyl group (—COOH). The activated amino group (-NH 2 ) of the glass substrate reacts with the carboxyl group (-COOH) of the quantum dot, and the quantum dot is bound to the glass substrate by a peptide bond (-C (= O) NH-). The
図１に示す構成の蛍光薄膜１３は、基板４０と蛍光物質４２との結合に共有結合を用いているため、単層または数層の蛍光物質４２の層を形成できる。そのため、数ｎｍから数１０ｎｍの蛍光層４４を形成することができ、例えば細く絞った電子ビーム又は電磁波を用いて励起すれば、可視光の波長に比べて非常に小さな光源を形成することができる。波長よりも小さな光源は近接場効果を起こすので、さまざまな用途に利用することが可能である。また、基板４０と蛍光物質４２との結合に共有結合を用いているため、水や接触などに対して強く、蛍光層４４の上に生体などの測定対象物を載置しても、蛍光物質４２が剥がれ落ちることが少ない。 Since the fluorescent thin film 13 having the configuration shown in FIG. 1 uses a covalent bond for bonding the substrate 40 and the fluorescent material 42, a single layer or several layers of the fluorescent material 42 can be formed. Therefore, it is possible to form a fluorescent layer 44 of several nanometers to several tens of nanometers. For example, if excitation is performed using a finely focused electron beam or electromagnetic wave, a light source that is very small compared to the wavelength of visible light can be formed. . Since a light source having a wavelength smaller than the wavelength causes a near-field effect, it can be used for various applications. In addition, since a covalent bond is used for bonding the substrate 40 and the fluorescent material 42, the fluorescent material is strong against water and contact, and the fluorescent material 44 is placed on the fluorescent layer 44 even if a measurement object such as a living body is placed thereon. 42 hardly peels off.
基板４０としては、これらに限定される訳ではないが、ガラス基板、酸化シリコン基板、窒化シリコン基板などを用いることができる。なお、直接、蛍光物質４２とのペフチド結合を形成できる点で、ガラス基板、酸化シリコン基板がより好ましい。窒化シリコン基板を用いる場合には、表面酸化を行う、酸化シリコンや金などを数ｎｍ程度に蒸着やスパッタする等してから、蛍光物質４２とのペフチド結合を形成する。また、基板４０の厚さは、電子線ビームへの影響が少ないため特に限定されない。例えば、電子線ビームの加速電圧にもよるが、１００ｎｍ程度の膜厚としてもよい。 The substrate 40 is not limited to these, but a glass substrate, a silicon oxide substrate, a silicon nitride substrate, or the like can be used. Note that a glass substrate and a silicon oxide substrate are more preferable in that a peptide bond with the fluorescent material 42 can be directly formed. When a silicon nitride substrate is used, surface coupling is performed, silicon oxide, gold, or the like is deposited or sputtered to a few nanometers, and then peptide bonds with the fluorescent material 42 are formed. Further, the thickness of the substrate 40 is not particularly limited because it has little influence on the electron beam. For example, although depending on the acceleration voltage of the electron beam, the film thickness may be about 100 nm.
蛍光層４４は、単層または数層の蛍光物質４２の層からなることが好ましい。蛍光物質４２を、共有結合により単層または数層に形成することにより、数ｎｍ〜数１０ｎｍの蛍光層４４を形成することができる。 The fluorescent layer 44 is preferably composed of a single layer or several layers of the fluorescent material 42. By forming the fluorescent material 42 into a single layer or several layers by covalent bonding, a fluorescent layer 44 of several nm to several tens of nm can be formed.
蛍光物質４２としては、用途に応じて、電子ビームまたは波長２００ｎｍ以下の電磁波により励起される物質を用いる。蛍光物質４２としては、これらに限定される訳ではないが、量子ドットを利用した蛍光物質が好ましい。量子ドットは微小ながら発光強度が大きいので、蛍光物質として好ましい。また、量子ドットは無機物質からなるので、電子線励起用の蛍光物質として好ましい。更に、蛍光薄膜１３の強度を高める点から、量子ドットを共有結合で結合させて蛍光薄膜１３を作成することが望ましい。蛍光層４４の形成工程からも、蛍光物質４２として量子ドットを用いることが好ましい。共有結合せずに残った量子ドットは、超音波洗浄などで除去することが容易である。 As the fluorescent material 42, a material that is excited by an electron beam or an electromagnetic wave having a wavelength of 200 nm or less is used depending on the application. The fluorescent material 42 is not limited to these, but a fluorescent material using quantum dots is preferable. Quantum dots are preferable as fluorescent materials because they are small but have high emission intensity. Moreover, since a quantum dot consists of inorganic substances, it is preferable as a fluorescent substance for electron beam excitation. Further, in order to increase the strength of the fluorescent thin film 13, it is desirable to form the fluorescent thin film 13 by bonding quantum dots by covalent bonds. From the step of forming the fluorescent layer 44, it is preferable to use quantum dots as the fluorescent material 42. Quantum dots remaining without being covalently bonded can be easily removed by ultrasonic cleaning or the like.
量子ドットは、ＣｄＳｅ／ＺｎＳやＩｎＧａＰ／ＺｎＳのような無機半導体のため、有機化合物の蛍光物質と比較して、長時間の紫外線照射や電子線照射に耐えられる。この量子ドットを細く絞った紫外線や、走査型電子顕微鏡のような極めて細い電子線で励起して発光させることで、直径が数ｎｍ〜数１０ｎｍの微小光源を得ることができる。このサイズの微小光源を得るには、蛍光発光波長に応じて選択された直径５ｎｍから３０ｎｍまでの量子ドットを一層から数層で整列させることが好ましい。 Since the quantum dots are inorganic semiconductors such as CdSe / ZnS and InGaP / ZnS, they can withstand ultraviolet irradiation and electron beam irradiation for a long time as compared with fluorescent materials of organic compounds. A minute light source with a diameter of several nanometers to several tens of nanometers can be obtained by emitting light by exciting the quantum dots with ultraviolet rays or an extremely thin electron beam such as a scanning electron microscope. In order to obtain a micro light source of this size, it is preferable to align quantum dots having a diameter of 5 nm to 30 nm selected according to the fluorescence emission wavelength in one to several layers.
金属蒸着層４６は適宜省略することができる。電子線励起するときに表面に導電層が必要な場合には、蛍光層４４の上に金などの金属蒸着層４４を設けることが望ましい。 The metal vapor deposition layer 46 can be omitted as appropriate. When a conductive layer is required on the surface when the electron beam is excited, it is desirable to provide a metal vapor deposition layer 44 such as gold on the fluorescent layer 44.
また、電子線励起する場合には導電層が必要であるため、基板４０の表面に金属蒸着層を形成してもよい。この場合には、蛍光層４４は金属蒸着層の上に形成される。つまり、基板４０と蛍光層４４との間に、金属蒸着層を挟みこんでも良い。 In addition, since a conductive layer is required for electron beam excitation, a metal vapor deposition layer may be formed on the surface of the substrate 40. In this case, the fluorescent layer 44 is formed on the metal vapor deposition layer. That is, a metal vapor deposition layer may be sandwiched between the substrate 40 and the fluorescent layer 44.
次に、図１に示す蛍光薄膜の製造方法について説明する。蛍光薄膜の製造方法は、少なくとも以下の３つのステップを含んでいる。
（１）蛍光物質４２に第１官能基を導入するステップ
（２）基板４０に第１官能基と共有結合を形成する第２官能基を導入するステップ
（３）蛍光物質４２に導入された第１官能基と基板４０に導入された第２官能基との反応により基板４０の表面に共有結合により蛍光物質４２を結合するステップNext, a method for manufacturing the fluorescent thin film shown in FIG. 1 will be described. The manufacturing method of the fluorescent thin film includes at least the following three steps.
(1) Introducing the first functional group into the fluorescent material 42 (2) Introducing the second functional group that forms a covalent bond with the first functional group into the substrate 40 (3) The first functional group introduced into the fluorescent material 42 The step of binding the fluorescent substance 42 to the surface of the substrate 40 by a covalent bond by the reaction between the first functional group and the second functional group introduced into the substrate 40.
第１官能基及び第２官能基としては、カルボキシル基、アミノ基、チオール基、エポキシ基などがある。基板４０に導入される第２官能基は、蛍光物質４２に導入される第１官能基と共有結合を形成する官能基である。第１官能基、第２官能基としては、上記の例示された官能基群の中から、互いに共有結合を形成する組合せを選択すればよい。図２に示した例では、蛍光物質４２に導入される第１官能基がカルボキシル基であり、基板４０に導入される第２官能基がアミノ基である。 Examples of the first functional group and the second functional group include a carboxyl group, an amino group, a thiol group, and an epoxy group. The second functional group introduced into the substrate 40 is a functional group that forms a covalent bond with the first functional group introduced into the fluorescent material 42. What is necessary is just to select the combination which forms a covalent bond mutually from said functional group group illustrated as a 1st functional group and a 2nd functional group. In the example shown in FIG. 2, the first functional group introduced into the fluorescent material 42 is a carboxyl group, and the second functional group introduced into the substrate 40 is an amino group.
蛍光層４４の表面に金属蒸着層４６を形成する場合には、金属蒸着層４６を形成するステップを更に含む。 When forming the metal vapor deposition layer 46 on the surface of the fluorescent layer 44, the method further includes the step of forming the metal vapor deposition layer 46.
＜実施形態１の実施例（蛍光薄膜の作製例）＞
次に、蛍光薄膜の作製する具体的な方法について説明する。
（手順１）まず、ガラス基板上や酸化シリコン基板上に、シラン化試薬を用いてアミノ基を導入する。例えば、シラン化試薬である(3-aminopropyl)-triethoxysilanの濃度が２％のアセトン溶液に、上記基板を浸漬する。５分後に基板を取り出し、アセトンで洗浄した後に、次いで純水で洗浄し、洗浄後の基板を乾燥する。<Example of Embodiment 1 (Preparation Example of Fluorescent Thin Film)>
Next, a specific method for producing the fluorescent thin film will be described.
(Procedure 1) First, an amino group is introduced onto a glass substrate or a silicon oxide substrate using a silanizing reagent. For example, the substrate is immersed in an acetone solution having a concentration of (3-aminopropyl) -triethoxysilan which is a silanization reagent of 2%. After 5 minutes, the substrate is taken out, washed with acetone, then washed with pure water, and the washed substrate is dried.
（手順２）次に、カルボジイミド試薬を用いてカルボキシル基を導入した量子ドットを用意する。そして、基板に導入したアミノ基と量子ドットに導入したカルボキシル基とを反応させて、基板と量子ドットをペプチド結合で結合する。例えば、ｐＨ７．４のphosphate buffered saline１．０ｍｌ（ミリリットル）に、カルボジイミド試薬であるN-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride（ＥＤＣ）１０ｍｇとN-hydroxysuccinimide０．７５ｍｇとを溶解し、得られた溶液と量子ドット分散液である５μｌ（マイクロリットル）の８μＭ（マイクロモル）のQ dot 655 ITK carboxyl quantum dotsとを混合する。ＥＤＣとN-hydroxysuccinimideのモル比は、１：０．１２５である。 (Procedure 2) Next, a quantum dot having a carboxyl group introduced using a carbodiimide reagent is prepared. And the amino group introduce | transduced into the board | substrate and the carboxyl group introduce | transduced into the quantum dot are made to react, and a board | substrate and a quantum dot are couple | bonded by a peptide bond. For example, carbodiimide reagent N- (3-dimethylaminopropyl) -N'-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) 10 mg and N-hydroxysuccinimide 0.75 mg can be obtained by dissolving in 1.0 ml (milliliter) of phosphate buffered saline at pH 7.4. The solution is mixed with 5 μl (microliter) of 8 μM (micromol) Q dot 655 ITK carboxyl quantum dots as a quantum dot dispersion. The molar ratio of EDC and N-hydroxysuccinimide is 1: 0.125.
得られた分散液にアミノ基を導入した基板を浸漬し、１０分静置して、量子ドットを結合する。反応後に基板を分散液から取り出し、ｐＨ７．４のphosphate buffered saline で洗浄した後に、次いで純水で洗浄する。その後、基板を更に純水中で超音波洗浄し、未結合の量子ドットを除去する。純水で洗浄後、量子ドットが結合された基板を完全に乾燥させる。 A substrate into which an amino group has been introduced is immersed in the obtained dispersion and allowed to stand for 10 minutes to bind quantum dots. After the reaction, the substrate is taken out from the dispersion, washed with pH 7.4 phosphate buffered saline, and then washed with pure water. Thereafter, the substrate is further ultrasonically cleaned in pure water to remove unbound quantum dots. After cleaning with pure water, the substrate to which the quantum dots are bonded is completely dried.
図３に本実施例で形成した蛍光薄膜のＡＦＭ像を示す。図３から、基板上に１層の量子ドット層が形成されていることがわかる。 FIG. 3 shows an AFM image of the fluorescent thin film formed in this example. FIG. 3 shows that one quantum dot layer is formed on the substrate.
＜実施形態２（光学顕微鏡）＞
以下、実施形態１で形成した蛍光薄膜を微小光源の励起に用い、近接場光学顕微鏡に適用した例を示す。本発明の実施形態２に係る光学顕微鏡は、実施形態１で形成した蛍光薄膜を用い、電子ビーム又は電磁波を走査できるようにした以外は、一般的な近接場光学顕微鏡と同じ構成であるために、図４を用いてその構成を説明する。<Embodiment 2 (Optical microscope)>
Hereinafter, an example in which the fluorescent thin film formed in Embodiment 1 is used for excitation of a minute light source and applied to a near-field optical microscope will be described. The optical microscope according to the second embodiment of the present invention has the same configuration as a general near-field optical microscope except that the fluorescent thin film formed in the first embodiment is used and an electron beam or an electromagnetic wave can be scanned. The configuration will be described with reference to FIG.
図４に示すように、光学顕微鏡は、電子顕微鏡結像系１０と光学顕微鏡部２０とを備えている。電子顕微鏡結像系１０は、電子ビーム又は電磁波を射出する電子源１１と、電子源１１から射出された電子ビーム又は電磁波を所定位置にフォーカスさせる電子レンズ１２と、電子ビーム又は電磁波が照射される蛍光薄膜１３と、内部が真空状態になっている真空容器１４と、を備えている。電子源１１及び電子レンズ１２は、真空容器１４内に設けられている。蛍光薄膜１３は、真空容器１４の隔壁に形成された貫通孔を塞ぐように、当該隔壁に貼り付けられ、隔壁の一部を成している。そして、試料３０は、貫通孔の上で且つ蛍光薄膜１３の上に配置されている。 As shown in FIG. 4, the optical microscope includes an electron microscope imaging system 10 and an optical microscope unit 20. The electron microscope imaging system 10 is irradiated with an electron source 11 that emits an electron beam or electromagnetic wave, an electron lens 12 that focuses the electron beam or electromagnetic wave emitted from the electron source 11 at a predetermined position, and an electron beam or electromagnetic wave. A fluorescent thin film 13 and a vacuum container 14 whose inside is in a vacuum state are provided. The electron source 11 and the electron lens 12 are provided in the vacuum container 14. The fluorescent thin film 13 is affixed to the partition so as to block a through hole formed in the partition of the vacuum vessel 14, and forms a part of the partition. The sample 30 is arranged on the through hole and on the fluorescent thin film 13.
また、図４に示すように、光学顕微鏡部２０は、試料３０からの光を集光する対物レンズ２１と、対物レンズ２１からの光を検出する光検出器２２と、光検出器２２で検出された信号を記録する信号記録部２３と、を備えている。なお、図４では、蛍光薄膜１３が、真空容器１４の上面全面に形成されているように見えるが、実際には大気圧に耐えられるように上面の隔壁に形成された微小の貫通孔を塞ぐような構成とされている。 As shown in FIG. 4, the optical microscope unit 20 is detected by an objective lens 21 that collects light from the sample 30, a photodetector 22 that detects light from the objective lens 21, and a photodetector 22. And a signal recording unit 23 for recording the received signal. In FIG. 4, the fluorescent thin film 13 appears to be formed on the entire upper surface of the vacuum vessel 14, but actually closes the minute through-hole formed in the upper partition so as to withstand atmospheric pressure. It is set as such.
電子源１１で発生された電子ビーム又は電磁波は、電子レンズ１２により蛍光薄膜１３内に（例えば、数１０ｎｍオーダで）フォーカスされる。フォーカスされた電子ビーム又は電磁波により蛍光薄膜１３内で光が励起され、微小光源が（〜数１０ｎｍ）が生成される。蛍光薄膜１３の蛍光層４４の膜厚は、可視光の波長よりも薄い。このため電子ビーム又は電磁波を数ｎｍ〜数１０ｎｍに絞って蛍光薄膜１３に照射することで、可視光波長未満の大きさの微小光源を励起することができる。 The electron beam or electromagnetic wave generated by the electron source 11 is focused in the fluorescent thin film 13 (for example, on the order of several tens of nm) by the electron lens 12. Light is excited in the fluorescent thin film 13 by the focused electron beam or electromagnetic wave, and a micro light source (˜several tens of nm) is generated. The thickness of the fluorescent layer 44 of the fluorescent thin film 13 is thinner than the wavelength of visible light. For this reason, by irradiating the fluorescent thin film 13 with an electron beam or electromagnetic wave narrowed down to several nanometers to several tens of nanometers, it is possible to excite a micro light source having a size smaller than the visible light wavelength.
なお、電子ビーム又は電磁波は電場や磁場などにより制御可能であるので、電子ビーム又は電磁波を制御することにより蛍光部材内の任意の場所に微小光源を励起させることができ、２次元走査などが可能になる。なお、上記の光の回折限界を超えた分解能の近接場（ニアフィールド）情報を高速で取得可能な走査型の光学顕微鏡は、本発明者等が開発したものである（特願2008-146335）。実施形態２に係る光学顕微鏡では、その走査型の光学顕微鏡の蛍光薄膜１３が改良されている。 In addition, since the electron beam or electromagnetic wave can be controlled by an electric field or a magnetic field, the minute light source can be excited at an arbitrary location in the fluorescent member by controlling the electron beam or electromagnetic wave, and two-dimensional scanning is possible. become. The present inventors have developed a scanning optical microscope capable of acquiring near-field (near field) information with a resolution exceeding the diffraction limit of the above light at high speed (Japanese Patent Application No. 2008-146335). . In the optical microscope according to the second embodiment, the fluorescent thin film 13 of the scanning optical microscope is improved.
微小光源の大きさは、微小光源の形状が球状（略球状を含む）であれば、直径が可視光波長未満であり、微小光源の形状が球形以外であれば、最短軸の長さが可視光波長未満である。微小光源と試料３０との相互作用により生成された光は、対物レンズ２１を通して光検出器２２で検出される。即ち、可視光波長未満の大きさの微小光源により、光源周辺の試料３０（測定対象物）の近接場効果が測定され、測定対象物により近接場効果の影響を受けた光は光検出器２２により検出される。これにより測定対象物の可視光波長未満の近接場効果が観察される。対物レンズ２１からの光により光検出器２２で生成された信号は、信号記録部２３で記録される。 If the micro light source has a spherical shape (including a substantially spherical shape), the diameter of the micro light source is less than the visible light wavelength. If the micro light source has a non-spherical shape, the length of the shortest axis is visible. It is less than the light wavelength. The light generated by the interaction between the micro light source and the sample 30 is detected by the photodetector 22 through the objective lens 21. That is, the near-field effect of the sample 30 (measurement object) around the light source is measured by a micro light source having a size less than the visible light wavelength, and the light affected by the near-field effect by the measurement object is detected by the photodetector 22. Is detected. Thereby, the near-field effect below the visible light wavelength of the measurement object is observed. The signal generated by the photodetector 22 by the light from the objective lens 21 is recorded by the signal recording unit 23.
以上説明した通り、電子ビーム又は電磁波の照射により可視光の波長未満の大きさの微小光源が励起される蛍光薄膜により、光の回折限界を超えた分解能の近接場情報を高速で取得可能な光学顕微鏡の実現が可能である。本実施の形態に係る光学顕微鏡は、光の回折限界を超えた分解能の近接場情報を高速で取得可能である。このため、近接場光を用いて生きた生物試料を実時間で観察でき、ナノメートルオーダーの空間分解能を有する実時間・ナノイメージング手法を実現することができる。実時間で観察可能な高分解能を実現することによって、分子・たんぱく質レベルでの機能解析から細胞・臓器レベルでの機能解析まで、統一的な観察を行うことが可能となる。 As described above, optics capable of acquiring near-field information with resolution exceeding the diffraction limit of light at high speed by using a fluorescent thin film that excites a light source with a size less than the wavelength of visible light by irradiation with an electron beam or electromagnetic wave. A microscope can be realized. The optical microscope according to the present embodiment can acquire near-field information with resolution exceeding the diffraction limit of light at high speed. For this reason, a living biological sample can be observed in real time using near-field light, and a real-time / nano-imaging technique having a nanometer-order spatial resolution can be realized. By realizing a high resolution that can be observed in real time, it is possible to perform unified observations from functional analysis at the molecular / protein level to functional analysis at the cell / organ level.
本実施の形態に係る光学顕微鏡は、小さな領域に照射可能な電子ビーム又は電磁波を用いて、蛍光薄膜内に微小光源を励起できるため、可視光波長未満の大きさの微小光源を生成できる。また、可視光波長未満の大きさの微小光源を用いているため、ナノメートルオーダーの近接場情報が収集可能である。微小光源の励起に電子ビーム又は電磁波を用いているため制御が容易であり、高速スキャンが可能であるので、高速に近接場（ニアフィールド）の画像を得ることができる。 The optical microscope according to the present embodiment can excite a minute light source in the fluorescent thin film using an electron beam or an electromagnetic wave that can irradiate a small region, so that a minute light source having a size smaller than the visible light wavelength can be generated. In addition, since a minute light source having a size smaller than the visible light wavelength is used, near-field information on the order of nanometers can be collected. Since an electron beam or electromagnetic wave is used to excite a minute light source, control is easy and high-speed scanning is possible, so that a near-field (near field) image can be obtained at high speed.
走査型電子顕微鏡は、既に確立された技術であり、１０ｎｍ以下の領域に電子を集光することと、高速に走査することが可能である。したがって、電子顕微鏡の技術を光励起に応用することによって、１０ｎｍ以下のスポット持ち且つ高速に走査可能な微小光源を実現することが可能となる。また、蛍光薄膜に含まれる蛍光物質として、様々な発光波長、偏光特性などを有する材料を選択することによって、分光計測、偏光計測など高機能化を実現できる。 The scanning electron microscope is an established technique, and can condense electrons in a region of 10 nm or less and scan at high speed. Therefore, by applying the electron microscope technology to photoexcitation, it is possible to realize a micro light source having a spot of 10 nm or less and capable of scanning at high speed. Further, by selecting a material having various emission wavelengths, polarization characteristics, and the like as the fluorescent substance contained in the fluorescent thin film, high functionality such as spectroscopic measurement and polarization measurement can be realized.
蛍光薄膜上に生じた微小光源は、近接場光学顕微鏡において、微小開口によって生じたエバネッセント波を利用して試料を照明することと原理的に全く同等である。試料と蛍光薄膜の距離が十分小さい場合、電子線励起によって生じた微小蛍光光源のエバネッセント波で試料を観察することができ、回折限界を超えた分解能を実現することが可能となる。電子線によって微小光源を実現するため、観察系は走査による光の変化を検出するシステムとなる。したがって、既にこれまでに開発されてきた光学顕微鏡の光学系を検出システムに応用することによって、高い空間分解能と多くの機能を持つ検出システムを構築することが可能である。 In principle, a micro light source generated on a fluorescent thin film is completely equivalent to illuminating a sample using an evanescent wave generated by a micro aperture in a near-field optical microscope. When the distance between the sample and the fluorescent thin film is sufficiently small, the sample can be observed with an evanescent wave of a minute fluorescent light source generated by electron beam excitation, and resolution exceeding the diffraction limit can be realized. In order to realize a micro light source with an electron beam, the observation system becomes a system that detects a change in light due to scanning. Therefore, it is possible to construct a detection system having high spatial resolution and many functions by applying an optical system of an optical microscope that has been developed so far to the detection system.
さらに、実施形態１に係る蛍光薄膜は、共有結合により基板と蛍光物質とが結合されているため、蛍光薄膜上に生物試料を載せたり水で洗い流しても、蛍光物質が溶け出したり遊離したりしない。生きた状態の生物試料は大気中や水中という条件下で観察しなければならないので、生きた試料の観測の際には有効である。また、実施形態１に係る蛍光薄膜は、基板の真空側（電子ビーム又は電磁波発生器側）に形成しても試料側に形成しても良いが、試料側に形成すれば微小光源と試料との距離をより近づけられ、ニアフィールド効果が観測しやすい。 Furthermore, since the fluorescent thin film according to Embodiment 1 has the substrate and the fluorescent substance bonded by covalent bonding, the fluorescent substance is dissolved or released even when a biological sample is placed on the fluorescent thin film or washed with water. do not do. A living biological sample must be observed in the atmosphere or in water, which is effective when observing a living sample. In addition, the fluorescent thin film according to Embodiment 1 may be formed on the vacuum side (electron beam or electromagnetic wave generator side) of the substrate or on the sample side. The near field effect is easier to observe.
また、実施形態１に係る蛍光薄膜では、薄膜状になった量子ドットの上に細胞を培養して、観察試料としてもよい。量子ドットを有する蛍光薄膜と細胞間の距離が短くできるので、分解能の低下が生じ難い。特に、量子ドットを有する蛍光薄膜に接着している細胞の細胞膜部分は、薄膜間距離が数十ｎｍ以下になるので、更に高い分解能を得ることができる。また、細胞培養や観察に用いる培養液は電気伝導性であるため、金属蒸着膜は不要になり、蛍光薄膜と試料との距離を更に近づけることが可能となる。 In the fluorescent thin film according to the first embodiment, cells may be cultured on the quantum dots that are in the form of a thin film to form an observation sample. Since the distance between the fluorescent thin film having quantum dots and the cells can be shortened, the resolution is hardly lowered. In particular, since the cell membrane portion of the cells adhered to the fluorescent thin film having quantum dots has a distance between the thin films of several tens of nm or less, higher resolution can be obtained. Moreover, since the culture solution used for cell culture and observation is electrically conductive, a metal vapor deposition film is not necessary, and the distance between the fluorescent thin film and the sample can be further reduced.
なお、量子ドットの材質や細胞の種類によっては、量子ドットを有する蛍光薄膜上に細胞が生育しない場合も予想される。このような場合であっても、蛍光薄膜上にポリスチロール樹脂（細胞培養フラスコなどに使用されるプラスチック）やコラーゲン、ポリリジン、フィブロネクチンなどを、スピンコーティングなどにより数十ｎｍ程度の厚さにコートすればよい。これらは、いずれも難接着性や難培養性の細胞を培養する場合に、培養フラスコにコーティングされる材料である。 Depending on the material of the quantum dot and the type of cell, it may be expected that the cell does not grow on the fluorescent thin film having the quantum dot. Even in such a case, a polystyrene resin (plastic used for cell culture flasks), collagen, polylysine, fibronectin, etc., is coated on the fluorescent thin film to a thickness of about several tens of nanometers by spin coating or the like. That's fine. These are materials that are coated on a culture flask when culturing difficult-to-adhere or difficult-to-cultivate cells.
以上、本発明の実施形態の一例を説明したが、本発明はこれに限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された技術的思想の範疇において各種の変更が可能であることは言うまでもない。 Although an example of the embodiment of the present invention has been described above, the present invention is not limited to this, and it goes without saying that various modifications can be made within the scope of the technical idea described in the claims. Yes.
Claims (9)
前記容器の隔壁の一部を形成する蛍光薄膜であって、基板と、前記基板の表面に共有結合により結合された蛍光物質を含み且つ可視光の波長未満の膜厚を有する蛍光層と、を含む蛍光薄膜と、
前記電子ビーム又は電磁波発生部で発生した電子ビーム又は電磁波を制御して前記蛍光薄膜に照射し、前記蛍光薄膜に可視光の波長未満の大きさの微小光源を励起させる電子ビーム又は電磁波制御部と、
前記微小光源で発生して前記蛍光薄膜上に載せ置かれた測定対象物に作用した測定光を検出する光検出部と、
を含む光学顕微鏡。 An electron beam or electromagnetic wave generating section that is provided in the container and generates an electron beam or an electromagnetic wave;
A fluorescent thin film forming a part of a partition wall of the container , comprising: a substrate; and a fluorescent layer containing a fluorescent substance covalently bonded to the surface of the substrate and having a thickness less than a wavelength of visible light. Including a fluorescent thin film,
An electron beam or electromagnetic wave control unit that controls the electron beam or electromagnetic wave generated by the electron beam or electromagnetic wave generation unit to irradiate the fluorescent thin film, and excites the micro light source having a size less than the wavelength of visible light on the fluorescent thin film; ,
A light detection unit that detects measurement light generated by the micro light source and acting on a measurement object placed on the fluorescent thin film;
Including optical microscope.
請求項１に記載の光学顕微鏡。 The fluorescent material is a quantum dot,
The optical microscope according to claim 1.
請求項１又は請求項２に記載の光学顕微鏡。 The fluorescent layer of the fluorescent thin film is composed of a single layer or several layers of the fluorescent material.
The optical microscope according to claim 1 or 2.
請求項１から請求項３までの何れか１項に記載の光学顕微鏡。 A first metal vapor deposition layer is further provided on the fluorescent layer of the fluorescent thin film .
The optical microscope according to any one of claims 1 to 3.
請求項１から請求項４までのいずれか１項に記載の光学顕微鏡。 The fluorescent thin film substrate is a glass substrate, a silicon oxide substrate or a silicon nitride substrate.
The optical microscope according to any one of claims 1 to 4.
前記基板の表面に、更に第２の金属蒸着層を有し、
前記第２の金属蒸着層の上に、前記蛍光層を有する、
請求項１から請求項５までのいずれか１項に記載の光学顕微鏡。 The fluorescent thin film is
On the surface of the substrate, further has a second metal vapor deposition layer,
The fluorescent layer is provided on the second metal deposition layer.
The optical microscope according to any one of claims 1 to 5.
請求項１から請求項６までのいずれか１項に記載の光学顕微鏡。 The fluorescent material can be excited by an electron beam or an electromagnetic wave having a wavelength of 200 nm or less.
The optical microscope according to any one of claims 1 to 6.
請求項２から請求項７までのいずれか１項に記載の光学顕微鏡。The optical microscope according to any one of claims 2 to 7.
請求項１から請求項８までのいずれか１項に記載の光学顕微鏡。The optical microscope according to any one of claims 1 to 8.
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