JP5596444B2 - 抗炎症剤の評価又は選択方法 - Google Patents
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Description
TNF−αは、炎症或いは免疫反応の極めて初期の段階で分泌され、免疫能力を持つ細胞を刺激し一連の反応を惹起し、或いはまた発熱を誘導することから、TNF−α産生を抑制する物質は、より初期の炎症反応に働きかけ、広範囲の炎症を制御する抗炎症剤として期待される。
しかしながら、これまでに炎症カスケード上流でのTIMP−1の関与は報告されていなく、TIMP−1がTNF−α産生に与える影響も明らかにされていない。
(A)TIMP−1遺伝子又はTIMP−1タンパク質が発現可能な細胞に、被験物質を接触させる工程、
(B)当該細胞におけるTIMP−1遺伝子又はTIMP−1タンパク質の発現量を測定する工程、
(C)上記(B)で算出された発現量を、被験物質をTIMP−1遺伝子又はTIMP−1タンパク質が発現可能な細胞に接触させない対照群におけるTIMP−1遺伝子又はTIMP−1タンパク質の発現量と比較する工程、
(D)上記(C)の結果に基づいて、TIMP−1遺伝子又はTIMP−1タンパク質の発現量を増加させる被験物質を抗炎症剤として評価又は選択する工程、
を含む、抗炎症剤の評価又は選択方法を提供するものである。
これらの結果は、TIMP−1がUVB照射時のTNF−α産生に関与していること、すなわち、TIMP−1の発現上昇とUVB照射時のTNF−α産生との間には負の相関関係があることを示している。また、TIMP−1が炎症カスケードの初期(上流)に関与していることを示唆している。TNF−αは前駆体タンパクである膜結合型TNF−α(mTNFα)として産生され、TNF−α変換酵素(TACE)によりその細胞外に存在するカルボキシル基側末端ドメインの切断を受けて可溶性TNF−α(sTNFα)蛋白となり、さらにホモ3量体を形成して血液中を循環するが、TIMP−1はTNF−α変換酵素(TACE)に対して不活性であることが報告されている(前記非特許文献2及びRoy A Black et al., Biochem Biophis Res Com 1996)。そのため、TIMP−1のTNF−α産生への関与が認められたことは意外である。
従って、TIMP−1の産生を増加させる物質は、TNF−α産生抑制剤として、また抗炎症剤として有用である。また、TIMP−1の産生増加作用を指標として抗炎症剤の評価又は選択が可能である。TNF−αは、一連のカスケードの上流に位置するサイトカインであることから、本発明の抗炎症剤は特にTNF−αが関与する初期炎症反応の抑制に有用である。
(A)TIMP−1遺伝子又はTIMP−1タンパク質が発現可能な細胞に、被験物質を接触させる工程、
(B)当該細胞におけるTIMP−1遺伝子又はTIMP−1タンパク質の発現量を測定する工程、
(C)上記(B)で算出された発現量を、被験物質をTIMP−1遺伝子又はTIMP−1タンパク質が発現可能な細胞に接触させない対照群におけるTIMP−1遺伝子又はTIMP−1タンパク質の発現量と比較する工程、
(D)上記(C)の結果に基づいて、TIMP−1遺伝子又はTIMP−1タンパク質の発現量を増加させる被験物質を抗炎症剤として評価又は選択する工程。
表皮細胞及び皮膚線維芽細胞は、皮膚組織中に存在するものでも、組織から単離したものでもよい。また、正常表皮細胞の他に、不死化した表皮細胞の細胞株(HaCaT)を使用することもできる。当該表皮細胞及び当該皮膚線維芽細胞の由来組織としては、生体から外科的に切除した皮膚組織、それを免疫不全マウス等に移植した皮膚組織、培養皮膚モデル、再構成皮膚等を使用することもできる。
ここで、TIMP−1遺伝子又はTIMP−1タンパク質が発現可能な細胞の播種時の細胞濃度は、6Wellプレートを使用した場合、1.0×103〜8.0×105cells/wellとするのが好ましく、特に1.0×104〜5.0×105cells/wellとするのが好ましい。また、被験物質の添加濃度は、0.00001〜10質量%(固形残分)とするのが好ましく、特に0.0001〜3質量%(固形残分)とするのが好ましい。
培養は、被験物質と接触後、室温(25℃)〜37℃で通常3時間〜96時間程度、好ましくは12〜76時間程度行うのが好ましい。
次いで、培養上清を回収してTIMP−1遺伝子又はTIMP−1タンパク質の発現量を測定する。
1)方法
細胞培養:培養ヒト表皮角化細胞(NHEK(F)新生児***由来、クラボウ社)を2×105cells/wellの細胞密度で6ウェルプレートに播種し、表皮角化細胞増殖用培地(HuMedia−KB2)に増殖添加剤(インスリン0.5mL,hEGF0.5mL,ハイドロコーチゾン0.5mL,抗菌剤0.5mL,BPE2mL)を添加したもので24時間培養した。継代には、0.5%トリプシン/EDTA(GIBCO)を用いた。
照射した直後に0nM、5nM又は10nM rhTIMP−1(R&D Systems)をそれぞれ添加した。さらに48時間培養後、同様に30mJ/cm2のUVBを照射した。
図1に示すように、UVB照射により上昇したTNF−α産生が、rhTIMP−1により濃度依存的に抑制された。
1)方法
細胞培養:培養ヒト表皮角化細胞(NHEK(F)新生児***由来、クラボウ社)を2×105cells/wellの細胞密度で35mmディッシュに播種し、表皮角化細胞増殖用培地(HuMedia−KB2)に増殖添加剤(インスリン0.5mL,hEGF0.5mL,ハイドロコーチゾン0.5mL,抗菌剤0.5mL,BPE2mL)を添加したもので培養した。継代には、0.5%トリプシン/EDTA(GIBCO)を用いた。
24時間細胞培養後、新鮮な培地に交換し、同時に評価サンプルを添加した。評価サンプルの添加濃度は0.001%(固形残分濃度)とし、コントロールとして、等量の50(v/v)% EtOHを添加したものを用いた。
また、スピンカラム(アミコンウルトラ−4、10K、ミリポア)を用いて限外ろ過濃縮を行った後、濃縮した上清のタンパク質量をBCA Protein Assayにより常法に従って測定した。5xSDS Sample Buffer(Immunopure,Amersham)を添加して濃度を揃えた後、100℃で5分加熱、変性させたものをウエスタンブロット用サンプルとして調製した。12.5%ゲルを用いたSDS−PAGEで培地中の蛋白質を分離し、一次抗体:Anti−TIMP−1(Rabbit Polyclonal Antibody,GeneTex:1000倍希釈)、二次抗体:HRP標識抗ヤギIgG抗体(R&D systems:1000倍希釈)を用いたウェスタンブロッティング法によりTIMP−1を検出した。検出試薬には化学発光法であるECL Plusウェスタンブロッティング検出試薬(GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社)を用い、LAS4000 System(Fuji Film)により検出を行った。
図2A及びBに示すように、シソエキスにおいてTIMP−1発現量がコントロール(対照群)に対する相対値で約1.5倍増加していた。なお、コントロールに対してタンパク質量比が0.5以下になるものは排除した。
1)方法
細胞培養:培養ヒト表皮角化細胞(NHEK(F)新生児***由来、クラボウ社)を2×105cells/wellの細胞密度で35mmディッシュに播種し、表皮角化細胞増殖用培地(HuMedia−KB2)に増殖添加剤(インスリン0.5mL,hEGF0.5mL,ハイドロコーチゾン0.5mL,抗菌剤0.5mL,BPE2mL)を添加したもので24時間培養した。継代には、0.5%トリプシン/EDTA(GIBCO)を用いた。
図3に示すように、UVB照射により表皮角化細胞からのTNF−α産生が増加したが、シソエキスは当該TNF−α産生を顕著に抑制した。なお、今回評価を行ったシソエキスは、既に抗炎症効果が知られている(特開2005−139070号公報、特開2006−45181号公報)。
これらの結果は、被験物質の抗炎症効果が、TIMP−1の産生レベルの測定によって評価可能であることを示している。従って、本発明方法は、抗炎症剤の評価又は選択方法として妥当な方法であると考えられる。
Claims (2)
- 以下の工程(A)〜(D):
(A)TIMP−1遺伝子又はTIMP−1タンパク質が発現可能な表皮細胞に、被験物質を接触させる工程、
(B)当該表皮細胞におけるTIMP−1遺伝子又はTIMP−1タンパク質の発現量を測定する工程、
(C)上記(B)で算出された発現量を、被験物質をTIMP−1遺伝子又はTIMP−1タンパク質が発現可能な表皮細胞に接触させない対照群におけるTIMP−1遺伝子又はTIMP−1タンパク質の発現量と比較する工程、
(D)上記(C)の結果に基づいて、TIMP−1遺伝子又はTIMP−1タンパク質の発現量を増加させる被験物質を表皮細胞におけるTNF−α産生を抑制する抗炎症剤として評価又は選択する工程、
を含む、表皮細胞におけるTNF−α産生を抑制する抗炎症剤の評価又は選択方法。 - TIMP−1遺伝子又はTIMP−1タンパク質が発現可能な表皮細胞がヒト表皮角化細胞である請求項1記載の表皮細胞におけるTNF−α産生を抑制する抗炎症剤の評価又は選択方法。
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