JP5591209B2 - ファージディスプレイにより同定されたヒト及びマウスのターゲティングペプチド - Google Patents
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Description
本出願は、2000年9月8日に提出された米国特許仮出願第60/231,266号および2001年1月17日に提出された米国特許出願第09/765,101号からの優先権を主張する。本発明は、米国陸軍の助成金DAMD 17-98-1-8041および17-98-1-8581ならびに米国国立衛生研究所の助成金1R01CA78512-01A1、1R1CA90810-01、および1R01CA82976-01により政府の支援を受けて行われた。米国政府は本発明に一定の権利を保有する。
本発明は、分子薬品および治療剤の標的化送達の分野に関する。より具体的には、本発明は、インビボまたはインビトロにおいて、臓器、組織、または細胞型を選択的に標的にするペプチドの同定および使用のための組成物および方法に関する。
多くの疾患状態の治療的治療は、用いる治療剤の全身毒性のために制限される。癌治療剤は、特に非常に低い治療指数を示し、皮膚および骨髄のような急速に増殖する正常組織は、腫瘍細胞を殺すために用いる濃度ほど高くない薬剤の濃度で影響を受ける。癌および他の臓器、組織、または細胞型限定疾患の治療は、所望の臓器、組織、または細胞型への治療剤の標的化送達のための組成物および方法を開発することによって大きく促進されるであろう。
本発明は、臓器、組織、又は特定の細胞型に選択的なターゲティングペプチドを同定し、使用するための組成物及び方法を提供することにより、当技術分野における長年にわたる需要を満たす。いくつかの態様において、方法は、ファージと細胞受容体との選択的な結合を保持しつつ、非特異的なファージ結合のバックグラウンドを減少させる新規なファージディスプレイ法である、選択的相互作用リガンドのバイオパニング及び迅速な分析(Biopanning and Rapid Analysis of Selective Interactive Ligands)(BRASIL)に関する。好ましい態様において、ターゲティングペプチドは、被験者をファージディスプレイライブラリへと曝露すること、1つ又は複数の臓器、組織、又は細胞型の試料を収集すること、水相に懸濁した単離細胞又は小さい細胞塊へと試料を分離させること、水相を有機相の上に重層すること、細胞が遠心分離チューブの底にペレット化されるよう二相を遠心分離すること、及びペレットからファージを収集することにより同定される。さらに好ましい態様において、有機相はジブチルフタレートである。
本明細書において使用されるように、「一つの」(「a」又は「an」)とは、1以上を意味しうる。本発明の特許請求の範囲において使用されるように、「を含む」という用語と関連して、「一つの」(「a」又は「an」)とは、1以上を意味しうる。本発明において使用されるように、「もう一つの(another)」とは、少なくとも第二又はそれ以上の項目を意味しうる。
ターゲティングペプチドを同定するための本明細書に記載の方法は、ファージディスプレイライブラリのインビトロ投与を含む。ファージディスプレイの様々な方法およびペプチドの多様な集団を作製する方法は当技術分野で周知である。例えば、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,223,409号、第5,622,699号、および第6,068,829号は、ファージライブラリを調製する方法を開示する。ファージディスプレイ技術は、小さいペプチドがその表面上に発現されうるようにバクテリオファージを遺伝子操作することを含む(Smithら、1985、1993)。この技術を適用できる可能性がある範囲はかなり広く、過去10年の間に、ファージによって表示されたペプチドライブラリの構築、およびライブラリを用いてペプチドリガンドを単離するスクリーニング方法の開発にはかなりの進歩が認められている。例えば、ペプチドライブラリを用いることによって、相互作用部位、および炎症反応に関与する抗体または細胞接着を媒介するインテグリンのような多くのタンパク質における受容体-リガンド結合モチーフの特徴を調べることが可能となった。この方法は同様に、ペプチド模倣薬または造影剤を開発するためのリードとして役立つ新規ペプチドリガンドを同定するためにも用いられている(Arapら、1998a)。ペプチドの他に、一本鎖抗体のようなより大きいタンパク質ドメインもまた、ファージ粒子の表面上に表示されうる(Arapら、1998a)。
マウスにおいて行われたこれまでのインビボ選択研究は、fUSE5ベクターにおけるIII遺伝子莢膜タンパク質との融合タンパク質として発現されたランダムペプチドのライブラリを好んで用いた(PasqualiniおよびRuoslahti、1996)。所定のライブラリに存在する個々のクローンの数および多様性は、インビボ選択の成否にとって重要な要因である。欠損ファージクローンの過剰発現を有する可能性が低い一次ライブラリを用いることが好ましい(Koivunenら、1999)。ライブラリの調製は、108〜109形質導入単位(T.U.)/mlのあいだで最適化しなければならない。特定の態様において、各選択ラウンドの間にバルク増幅戦略を適用する。
マウスに投与されたファージディスプレイペプチドライブラリ由来のペプチドのインビボ選択を用いて、正常なマウス脳、腎臓、肺、皮膚、膵臓、網膜、腸、子宮、前立腺、および副腎に関して選択的なターゲティングペプチドを同定した(PasqualiniおよびRuoslahti、1996;Pasqualini、1999;Rajotteら、1998)。これらの結果は、正常な臓器の血管内皮が、ペプチドプローブによる異なるターゲティングを可能にするために十分に不均一であることを示している(PasqualiniおよびRuoslahti、1996;Rajotteら、1998)。腫瘍の新生血管に回帰するペプチドを同定する手段は、下記のように考案されている。ヌードマウスにおける腫瘍異種移植片の血管を標的とするペプチドモチーフのパネルが構築されている(Arapら、1998a;Pasqualini、1999により概説)。これらのモチーフには、配列RGD-4C、NGR、およびGSLが含まれる。RGD-4Cペプチドはこれまで、選択的に結合するαvインテグリンとして同定されており、ヌードマウスにおける腫瘍異種移植片の血管に回帰することが示されている(Arapら、1998a、1998b;Pasqualini、1997)。
腫瘍血管に回帰するペプチドを細胞毒性薬またはアポトーシス促進ペプチドにカップリングさせると、腫瘍異種移植片を有する実験的マウスモデルにおいて親化合物より有効でより毒性の低い化合物が得られている(Arapら、1998a;Ellerbyら、1999)。下記に示すように、RGD-4Cペプチドをアデノウイルスの表面タンパク質に挿入すると、腫瘍標的化遺伝子治療のために用いてもよいアデノウイルスベクターが得られる(Arapら、1998b)。
好ましい態様において、標的臓器、組織、または細胞型の細胞に結合したファージを未結合のファージから分離することは、BRASIL技術を用いて行う(2000年9月8日に提出された米国特許仮出願第60/231,266号;参照として本明細書に組み入れられており、本明細書と共に提出された、Arap、Pasqualini、およびGiordanoによる「選択的相互作用リガンドのバイオパニングおよび迅速な分析(Biopanning and Rapid Analysis of Selective Interactive Ligands(BRASIL))」と題する米国特許)。BRASIL(可溶性相互作用リガンドのバイオパニングおよび迅速な分析)では、臓器、組織、または細胞型を細胞または小さい細胞塊に穏やかに分離して、これを水相に懸濁する。水相を、適当な密度の有機相の上に層にして、遠心分離する。結合したファージに接着した細胞は遠心管の底に沈殿して、未結合のファージは水相に残ったままとなる。これによって、ファージと細胞との結合相互作用を維持しながら、結合したファージを未結合のファージからより効率よく分離することができる。臓器、組織、もしくは細胞型を静脈内投与によりファージディスプレイライブラリに曝露する、インビボプロトコールにおいて、または、細胞を水相においてファージライブラリに曝露してから遠心分離する、エクスビボプロトコールによって、BRASILを行ってもよい。
特定の態様において、本発明は、少なくとも一つのタンパク質またはペプチドを含む新規組成物に関する。本明細書において用いられるように、タンパク質またはペプチドは一般的に、アミノ酸約200個以上で遺伝子から翻訳された完全長の配列までのタンパク質;アミノ酸約100個以上のポリペプチド;および/またはアミノ酸約3〜約100個のペプチドを意味するがこれらに限定されない。便宜上、「タンパク質」、「ポリペプチド、および「ペプチド」という用語は、本明細書において互換的に用いられる。
本発明に従ってポリペプチドを調製するためのもう一つの態様は、ペプチド模倣体を用いることである。模倣体は、タンパク質の二次構造の要素を模倣するペプチド含有分子である。例えば、参照として本明細書に組み入れられる、「バイオテクノロジーと薬学(Biotechnology and Pharmacy)」、ペズット(Pezzuto)ら編、Chapman and Hall、ニューヨーク(1993)内、ジョンソン(Johnson)ら、「ペプチド折り返し模倣体(Peptide Turn Mimetics)」を参照のこと。ペプチド模倣体を用いる背景の基礎となる根本的理由は、タンパク質のペプチド骨格が、抗体と抗原の相互作用のような分子間相互作用を促進するようにアミノ酸側鎖を主に向けるように存在する点である。ペプチド模倣体は、天然の分子と類似の分子間相互作用を可能にすると予想される。これらの原理を用いて、本明細書に開示のターゲティングペプチドの天然の特性の多くを有するが、改変および改善すらされた特徴を有する第二世代の分子を操作してもよい。
本発明の他の態様は、融合タンパク質に関する。これらの分子は一般的に、ターゲティングペプチドの全てまたは実質的な部分が、N末端またはC末端で第二のポリペプチドまたはタンパク質の全てまたは実質的な部分に結合している。例えば、融合体は、異種宿主においてタンパク質の組み換え型を発現させるように他の種からのリーダー配列を用いてもよい。もう一つの有用な融合には、融合タンパク質の精製を促進するために、抗体のエピトープのような免疫学的に活性なドメインを付加することが含まれる。融合部またはその近傍に切断部位を含めると、精製後の外来性のポリペプチドの除去が促進されるであろう。他の有用な融合には、酵素からの活性部位、グリコシル化ドメイン、細胞ターゲティングシグナル、または膜貫通領域のような機能的ドメインの連結が含まれる。好ましい態様において、本発明の融合タンパク質は、治療タンパク質またはペプチドに結合したターゲティングペプチドを含む。融合タンパク質に組み入れてもよいタンパク質またはペプチドの例には、細胞***阻害タンパク質、殺細胞タンパク質、アポトーシス促進剤、抗血管新生剤、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、ペプチド薬、抗体、Fab断片抗体、抗原、受容体タンパク質、酵素、レクチン、MHCタンパク質、細胞接着タンパク質、および結合タンパク質が含まれる。これらの例は、制限することを意味しておらず、実質的に本発明の範囲内において、タンパク質またはペプチドはターゲティングペプチドを含む融合タンパク質に組み入れることができることを意図している。融合タンパク質を作製する方法は、当業者に周知である。そのようなタンパク質は、例えば二官能架橋剤を用いる化学的結合によって、完全な融合タンパク質の新規合成によって、またはターゲティングペプチドをコードするDNA配列を第二のペプチドまたはタンパク質をコードするDNA配列に結合させた後、無傷の融合タンパク質を発現させることによって、産生することができる。
特定の態様において、タンパク質またはペプチドは単離または精製してもよい。タンパク質精製技術は当業者に周知である。これらの技術は、一つのレベルで細胞、組織、または臓器のポリペプチドおよび非ポリペプチド画分へのホモジナイゼーションならびに粗分画化を含む。関心対象のタンパク質またはポリペプチドは、部分的または完全な精製を得るために(または均一になるまで精製)、クロマトグラフィーおよび電気泳動技術を用いてさらに精製してもよい。純粋なペプチドの調製に特に適した分析法は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル排除クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アフィニティクロマトグラフィー、免疫アフィニティクロマトグラフィー、および等電点電気泳動である。アフィニティクロマトグラフィーによる受容体タンパク質精製の例は、その全文が参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,206,347号に開示されている。ペプチドを精製する特に効率のよい方法は、高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)またはHPLCである。
本発明のターゲティングペプチドは、その大きさが比較的小さいために、従来の技術に従って溶液または固体支持体上で合成することができる。様々な自動シンセサイザーが市販されており、既知のプロトコールに従って用いることができる。例えば、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、スチュワート(Stewart)およびヤング(Young)、1984;タム(Tam)ら、1983;メリフィールド(Merrifield)、1986;およびバラニー(Barany)およびメリフィールド(Merrifield)、1979を参照のこと。通常、アミノ酸約6個から約35〜50個までの短いペプチド配列は、そのような方法によって容易に合成することができる。または、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列が発現ベクターに挿入され、適当な宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトされ、発現に適した条件で培養される組み換え型DNA技術を用いてもよい。
特定の態様において、同定されたターゲティングペプチドまたはその受容体に対する抗体を作製することが望ましいかもしれない。適当なターゲティングペプチドまたは受容体、またはその一部をリンカー、ポリリンカー、または誘導体化アミノ酸によって一つまたは複数の物質にカップリング、結合(bonded)、結合(bound)、接合、または化学的に結合させてもよい。これは、二重特異的、または多価組成物またはワクチンが産生されるように行ってもよい。これらの組成物の調製において用いられる方法は、当業者に周知であり、ヒトに投与するために適していなければならない、すなわち薬学的に許容されなければならないとさらに想像される。好ましい物質は、担体であり、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、またはウシ血清アルブミン(BSA)である。
特定の態様において、臓器、組織、または細胞型に標的化送達するために、特異的生物活性物質を一つまたは複数のターゲティングペプチドにカップリングさせることが望ましいかもしれない。そのような物質には、サイトカイン、ケモカイン、アポトーシス促進因子、および抗血管新生因子が含まれるがこれらに限定されない。「サイトカイン」という用語は、細胞間メディエータとしてもう一つの細胞に作用する、一つの細胞集団によって放出されたタンパク質の総称である。そのようなサイトカインの例は、リンフォカイン、モノカイン、増殖因子、および従来のポリペプチドホルモンである。サイトカインには、ヒト成長ホルモン、N-メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンのような成長ホルモン;副甲状腺ホルモン;チロキシン;インスリン;プロインスリン;リラキシン;プロリラキシン;卵胞刺激ホルモン(FSH)、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、および黄体形成ホルモン(LH)のような糖タンパク質ホルモン;肝増殖因子;プロスタグランジン、線維芽細胞増殖因子、プロラクチン;胎盤ラクトゲン、OBタンパク質;腫瘍壊死因子-αおよび腫瘍壊死因子-β;ムレリアン阻害物質;マウスゴナドトロピン関連ペプチド;インヒビン;アクチビン;血管内皮増殖因子;インテグリン;トロンボポエチン(TPO);NGF-βのような神経生長因子;血小板増殖因子;TGF-αおよびTGF-βのようなトランスフォーミング増殖因子(TGF);インスリン様増殖因子-Iおよびインスリン様増殖因子-II;エリスロポエチン(EPO);骨誘導因子;インターフェロン-α、-β、および-γのようなインターフェロン;マクロファージ-CSF(M-CSF)、顆粒球-マクロファージ-CSF(GM-CSF)、および顆粒球-CSF(G-CSF)のようなコロニー刺激因子(CSF);IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18のようなインターロイキン(IL)、LIF、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、EPO、キット-リガンドまたはFLT-3、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、腫瘍壊死因子ならびにLTが含まれる。本明細書において用いられるように、サイトカインという用語には、天然起源からのタンパク質または組み換え型細胞培養からのタンパク質、および本来の配列サイトカインの生物活性同等物が含まれる。
特定の態様において、本発明で主張されるペプチドまたはタンパク質は、様々な疾患を有する臓器、組織、または細胞型を造影および診断するために用いられる造影剤に結合してもよい。多くの適当な造影剤が、それらをタンパク質またはペプチドに結合させる方法と共に当技術分野で既知である(例えば、いずれも参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,021,236号および第4,472,509号を参照のこと)。タンパク質またはペプチドはまた、グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩のようなカップリング剤の存在下で酵素と反応させてもよい。蛍光マーカーとの接合体は、これらのカップリング剤の存在下で、またはイソチオシアネートとの反応によって調製する。
二官能架橋試薬は、アフィニティマトリクスの調製、多様な構造の改変および安定化、リガンドおよび受容体結合部位の同定、ならびに構造研究を含む多様な目的のために広く用いられている。二つの同一の官能基を有するホモ二官能試薬は、同一および異なる高分子または高分子サブユニット間の架橋を誘導するために、ならびにポリペプチドリガンドをその特異的結合部位に結合させるために非常に効率がよいことが判明した。ヘテロ二官能試薬は、異なる二つの官能基を含む。異なる二つの官能基の異なる反応性を利用することによって、架橋は、選択的および連続的に制御することができる。二官能架橋試薬はその官能基の特異性に従って、例えばアミノ、スルフヒドリル、グアニジノ、インドール、カルボキシル特異的基に分類することができる。これらの中で、遊離のアミノ基に対する試薬は、それらが市販されているため、合成が容易であるため、およびそれらを適用できる緩和な反応条件のために特に一般的となった。ヘテロ二官能架橋試薬の大部分は、一級アミン反応基とチオール反応基とを含む。
本発明による核酸は、ターゲティングペプチド、受容体タンパク質、または融合タンパク質をコードしてもよい。核酸は、ゲノムDNA、相補的DNA(cDNA)、または合成DNAに由来してもよい。発現ベクターに組み入れることが望ましい場合、核酸はまた、天然のイントロンまたはもう一つの遺伝子に由来するイントロンを含んでもよい。そのような操作された分子は時に、「ミニ遺伝子」と呼ばれる。
特定の態様において、発現ベクターを用いてターゲティングペプチドまたは融合タンパク質を発現して、次にこれを精製および用いることができる。他の態様において、発現ベクターは、遺伝子治療において用いられる。発現は、適当なシグナルがベクターにおいて提供される必要があり、宿主細胞において関心対象の遺伝子の発現を促進するウイルスおよび哺乳動物起源の双方からのエンハンサー/プロモーターのような様々な調節要素が含まれる。宿主細胞においてメッセンジャーRNA安定性および翻訳可能性を最適にするように設計した要素も同様に既知である。
「発現構築物」または「発現ベクター」という用語は、核酸コード配列の一部または全てが転写されることが可能である遺伝子産物をコードする核酸を含む任意の種類の遺伝子構築物が含まれることを意味する。好ましい態様において、遺伝子産物をコードする核酸は、プロモーターの転写制御下である。「プロモーター」とは、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識され、遺伝子の特異的転写を開始するために必要なDNA配列を意味する。「転写制御下」という用語は、プロモーターが、RNAポリメラーゼの開始および遺伝子の発現を制御するために、核酸に対して正しい位置および方向に存在することを意味する。
本発明の特定の態様において、本発明の核酸構築物を含む細胞は、発現構築物にマーカーを含めることによってインビトロまたはインビボで同定してもよい。そのようなマーカーは、細胞に対して同定可能な変化を付与して、発現構築物を含む細胞を容易に同定できるようにするであろう。通常、薬物選択マーカーを含めると、形質転換体のクローニングおよび選択に役立つ。例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、DHFR、GPT、ゼオシン、およびヒスチジノールに対して抵抗性を付与する遺伝子は、有用な選択マーカーである。または、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(tk)のような酵素、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)のような酵素を用いてもよい。免疫学的マーカーも同様に用いることができる。用いられる選択マーカーは、それが遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現されることができる限り、重要ではないと考えられる。選択マーカーのさらなる例は当業者に周知である。
発現ベクターを細胞に導入する多くの方法がある。本発明の特定の態様において、発現構築物は、ウイルス、またはウイルスゲノムに由来する操作された構築物を含む。特定のウイルスは受容体媒介エンドサイトーシスによって細胞内に入ることができること、宿主細胞ゲノムに組み入れられうること、およびウイルス遺伝子を安定かつ効率よく発現できることによって、それらは、哺乳動物細胞に外来遺伝子を移入するための魅力的な候補物質となる(Ridgeway、1988;NicolasおよびRubenstein、1988;BaichwalおよびSugden、1986;Temin、1986)。一般的に、好ましい遺伝子治療ベクターはウイルスベクターである。
臨床応用を考慮する場合、薬学的組成物発現ベクター、ウイルス保存液、タンパク質、抗体、および薬物を意図する適用にとって適当な形で調製する必要があるかもしれない。一般的に、これは、ヒトまたは動物に対して有害となりうる不純物を本質的に含まない組成物を調製することを含むであろう。
特定の態様において、化学療法剤を、腫瘍に選択的に送達するためのターゲティングペプチドまたは融合タンパク質に結合してもよい。用いるために適した物質または因子には、細胞に適用した場合にDNA損傷を誘導する任意の化学化合物が含まれてもよい。化学療法剤には、5-フルオロウラシル、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン(CDDP)、シクロホスファミド、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エストロゲン受容体結合物質、エトポシド(VP16)、ファルネシル-タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ゲムシタビン、イフォスファミド、メクロレタミン、メルファラン、マイトマイシン、ナベルビン、ニトロソウレア、プリコマイシン、プロカルバジン、ラロキシフェン、タモキシフェン、タキソール、テマゾロミド(DTICの水溶性型)、トランスプラチナ、ビンブラスチンおよびメソトレキセート、ビンクリスチン、または上記の任意の類似体もしくは誘導体変種が含まれるがこれらに限定されない。ほとんどの化学療法剤は以下の分類に入る:アルキル化剤、抗代謝剤、抗腫瘍抗生物質、コルチコステロイドホルモン、有糸***阻害剤、およびニトロソウレア、ホルモン物質、雑多な物質、およびその任意の類似体または誘導体変種。
アルキル化剤は、ゲノムDNAと直接相互作用して癌細胞の増殖を防止する薬物である。この範疇の化学療法剤は、細胞周期の全ての期に影響を及ぼす、すなわちそれらは期特異的ではない物質を表す。アルキル化剤には、ニトロジェンマスタード、エチレニメン、メチルメラミン、アルキルスルホネート、ニトロソウレア、またはトリアジンが含まれてもよいがこれらに限定されない。それらには、ブスルファン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド(シトキサン)、ダカルバジン、イフォスファミド、メクロレタミン(マスタージェン)、およびメルファランが含まれるがこれらに限定されない。
抗代謝剤はDNAおよびRNA合成を破壊する。アルキル化剤とは異なり、それらは細胞周期のS期に特異的に影響を及ぼす。抗代謝剤は、葉酸類似体、ピリミジン類似体およびプリン類似体ならびに関連阻害化合物のような様々な範疇に分類することができる。抗代謝剤には、5-フルオロウラシル(5-FU)、シタラビン(Ara-C)、フルダラビン、ゲミシタビンおよびメソトレキセートが含まれるがこれらに限定されない。
天然物は一般的に、最初に天然資源から単離された化合物を意味する。そのような化合物、その類似体および誘導体は天然起源から単離してもよく、当業者に既知の任意の技術によって化学合成または組み換えによって産生してもよい。天然物には、***阻害剤、抗腫瘍抗生物質、酵素および生物反応修飾剤のような分類が含まれる。
抗腫瘍抗生物質は、抗菌および細胞毒性活性の双方を有する。これらの薬物はまた、酵素および有糸***を化学的に阻害することによって、または細胞膜を変化させることによって、DNAを妨害する。これらの物質は、それらが細胞周期の全ての期において作用するため細胞周期特異的ではない。抗腫瘍抗生物質の例には、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン(アドリアマイシン)、プリカマイシン(ミスラマイシン)、およびイダルビシンが含まれるがこれらに限定されない。
コルチコステロイドホルモンは、それらが癌細胞を殺すまたは増殖を遅らせる場合に、化学療法薬と見なされる。コルチコステロイドホルモンは、他の化学療法剤の有効性を増加させるため、併用治療において用いられることが多い。プレドニゾンおよびデキサメタゾンは、コルチコステロイドホルモンの例である。
いくつかの化学療法剤は、その活性に基づくこれまでの範疇に入らない。それらには、白金配位複合体、アントラセンジオン、置換ウレア、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、アムサクリン、L-アスパラギナーゼ、およびトレチノインが含まれるがこれらに限定されない。それらは、本発明の組成物および方法において用いてもよいと考慮される。
アポトーシスまたはプログラムされた細胞死は、正常な胚発生の際に、成人組織において恒常性を維持し、および発癌を抑制するための本質的なプロセスである(Kerrら、1972)。Bcl-2タンパク質ファミリーおよびICE-様プロテアーゼが、他の系においてアポトーシスの重要な調節物質およびエフェクターであることが証明されている。濾胞性リンパ腫に関連して発見されたBcl-2タンパク質は、アポトーシスの制御および多様なアポトーシス刺激に反応した細胞の生存を増強するために顕著な役割を果たしている(Bakhshiら、1985;ClearyおよびSklar、1985;Clearyら、1986;Tsujimotoら、1985;TsujimotoおよびCroce、1986)。進化的に保存されたBcl-2タンパク質は今では、関連タンパク質ファミリーのメンバーであると認識され、これらは死のアゴニストまたは死のアンタゴニストとして分類することができる。
特定の態様において、本発明は、アンジオテンシン、ラミニンペプチド、フィブロネクチンペプチド、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤、組織メタロプロテイナーゼ阻害剤、インターフェロン、インターロイキン12、血小板因子4、IP-10、Gro-β、トロンボスポンジン、2-メトキシエストラジオール、プロリフェリン関連タンパク質、カルボキサミドトリアゾール、CM101、マリマスタット、ペントサンポリスルフェート、アンジオポエチン2(レジェネロン)、インターフェロン-α、ハービマイシンA、PNU145156E、16Kプロラクチン断片、リノマイド、サリドマイド、ペントキシフィリン、ゲニステイン、TNP-470、エンドスタチン、パクリタキセル、アキュチン、アンジオスタチン、シドフォビル、ビンクリスチン、ブレオマイシン、AGM-1470、血小板因子4、またはミノサイクリンのような抗血管新生剤に結合したターゲティングペプチドを投与することに関してもよい。
当業者は、「レミントンの薬科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)」、第15版、第33章、特に624頁〜652頁に従う。治療すべき被験者の状態に応じて用量の何らかの変更が必然的に起こるであろう。投与の責任者は、いずれにせよ、個々の被験者にとって適当な用量を決定するであろう。その上、ヒトでの投与に関して、調製物は、FDAの生物医薬品標準局によって必要とされる滅菌性、発熱性、および全身的安全性および純度標準を満たさなければならない。
ターゲティングペプチドに関して特に関心対象となる臓器の非限定的な例は骨髄である。骨は、前立腺癌を有する患者の大多数において転移の好ましい部位である(Fidler、1999)。この顕著な選択性は、癌の進行にとって必須である部位特異的相互作用の例として見なされている(Rak、1995;Zetter、1998)。臨床での関連性にもかかわらず、骨に広がった前立腺癌を制御する機構に関してはほとんどわかっていない。さらに、転移性前立腺癌の治療のために治療剤をターゲティングするための有効な戦略はなかった(Brodtら、1996)。
マウスにおいて骨髄と結合するペプチドを単離するために、ファージライブラリのインビボスクリーニングを使用した。骨髄ターゲティングペプチドを、前立腺癌マウスモデルにおいて転移を阻害する能力に関して特徴決定した。骨髄結合ペプチドの受容体を同定するために、アフィニティクロマトグラフィ及び分子クローニングを使用した。ここに開示される組成物及び方法は、骨転移の予防及び治療に焦点を当てた、新たな抗前立腺癌治療戦略を開発するために有用であった。
ファージライブラリを静脈注射した。後述の改良を施したSmithおよびScott(1985)のプロトコルに従い、ライブラリを調製した。これらのライブラリに含まれるファージは、5残基〜11残基の範囲の挿入物を表示していた。ガラスチューブ内の1ml DMEM-PIへと移すことによりファージレスキューのため組織試料を処理し、グラインダーでホモジナイズした。骨髄は、ホモジナイゼーションを必要としないが、対照として使用された他の臓器は、効率的にホモジナイズされうる前に切り刻む必要があった。試料を、オートクレーブ処理された2mlエッペンドルフチューブへと移した。組織を、1%BSAを含む氷冷DMEM-PIで洗浄した。3回の洗浄後、ペレットを再懸濁させ、37℃にした後、細胞を添加した。ファージ粒子を回収するため、洗浄された組織試料の、1.5mlのコンピテントK91-kan細菌(1:10希釈率でOD600 0.2)との、室温における1時間のインキュベーションを使用した。
マウスにおけるインビボのマウス骨髄ターゲティング
ファージライブラリをマウスへと静脈注射し、骨髄よりファージを回収することにより、骨髄ターゲティング配列モチーフが同定された。ファージは、静脈注射され、骨髄より回収され、十分な濃縮が得られるまで反復的にインビトロで増幅され、再注射された。3回の選択の後、マウス骨髄へと回帰するファージ調製物が得られた。個々のファージは、静脈注射の後、プールされたファージと類似した臓器特異性を示した。いくつかのペプチドモチーフが同定され、特徴決定された。インビボで特異性を示す最も有望なモチーフを、表3に示す。
ターゲティングのための特に重要な非限定的なもう一つの臓器は、前立腺である。前立腺は、成体期の間中、増殖を継続するため、通常とは異なる臓器である。結果として、良性前立腺肥大(BPH)は、大部分の高齢の男性に、ある程度の影響を与えている。さらに重大なことに、前立腺は悪性腫瘍の好発部位である。11人に1人の男性が、一生のうちに前立腺癌を発症するとされる。前立腺癌の血清マーカーが利用可能となったため、現在では、これらの悪性腫瘍の多くは、疾患の経過の初期に検出された。臨床的に進行するであろう者を予測するための信頼性の高い手段が存在しないため、多くは、失禁及び***不能のような壊滅的な副作用を伴うことが多い、手術又は放射線療法により侵襲的に治療された(LaneおよびShah、1999;Mikolajczykら、2000)。ヒト前立腺癌の検出、診断、及び治療のための改良された方法が、明らかに必要とされている。
前立腺のインビボファージターゲティング
ファージディスプレイライブラリを静脈注射した。試料は、常に、氷上に維持した。前立腺組織試料を、以下のようにして処理した。第一の試料は、バックアップとして-80℃で保存した。第二の試料は、組織学/病理学、及びHE又は抗M13ファージ免疫染色のため処理した。第三の試料は、同じ重量の断片を3個得るため、清潔な条件下で分割した。
腫瘍血管は、漏出性であることが知られている。マウス被験者のファージディスプレイライブラリへの比較的長期間の曝露は、ファージの遊走及び前立腺癌細胞マーカーとの結合をもたらしうる。癌細胞マーカーをターゲティングするため、マウスを、ファージライブラリと共に24時間インキュベートした。
正常マウス前立腺
上に開示された方法により得られたマウス前立腺ターゲティングペプチドモチーフを、表4に示す。
3回目のインビボスクリーニングにより、対照正常腎組織と比較して高い腫瘍局在の選択性を示したファージが得られた(示していない)。ファージ挿入物をDNA配列決定することにより同定された前立腺癌ターゲティング配列を、表5に挙げる。
胎盤回帰ペプチドの同定
マウス胎盤へと回帰するペプチドを、ファージディスプレイライブラリを使用したポストクリアリング(post-clearing)プロトコルにより同定した。1回目のバイオパニングを、妊娠マウスにおいて実施した。胎盤の試料を摘出し、一つの修飾を含む前記の標準的なプロトコルに従いファージをレスキューした。典型的なバイオパニングプロトコルにおいては、単一の臓器、組織、又は細胞型から数千個のファージが回収されうる。典型的には、播種されたファージから200個〜300個の独立のコロニーを選択し、これらを増幅し、プールして、2回目又は3回目のバイオパニングのためのファージディスプレイライブラリを形成させた。本実施例においては、1回目のバイオパニングからレスキューされたファージ全てを固体培地上でバルク増幅し、次いで2回目のバイオパニングのためのファージディスプレイライブラリを形成させるため、プールした。即ち、1回目のバイオパニングからレスキューされたファージの制限が存在しなかった。この制限なしのインビボバイオパニングを3回(1回目〜3回目)実施し、次いでポストクリアリング法を使用した。
妊娠マウスへの注射及び胎盤からの回収により、胎盤回帰ペプチドの確認をインビボで行った。図1は、選択された胎盤回帰ファージに関する確認研究の結果を示している。ファージクローンは、PA- TPKTSVT(配列番号:39)、PC- RAPGGVR(配列番号:41)、PE- LGLRSVG(配列番号:44)、PF- YIRPFTL(配列番号:43)として同定される。PAクローンが、対照fd-tetファージで観察されたよりも1桁超大きい胎盤回帰を示したことが、示されている。PCクローンも、有意に高い胎盤局在を示したが、PEクローン及びPFクローンは、対照ファージと比較して、胎盤において実質的には濃縮されなかった。
遺伝的に肥満のマウス(Zhangら、1994;Pelleymounterら、1995)より、脂質ターゲティングペプチドを単離するため、正常マウスにおいて実施されたポストクリアリングを含む、類似のプロトコルを使用した。単離された脂質ターゲティングペプチドには、TRNTGNI(配列番号:48)、FDGQDRS(配列番号:49)、WGPKRL(配列番号:50)、WGESRL(配列番号:51)、VMGSVTG(配列番号:52)、KGGRAKD(配列番号:53)、RGEVLWS(配列番号:54)、TREVHRS(配列番号:47)、及びHGQGVRP(配列番号:55)が含まれる。
図2に示されるように、脂質回帰ペプチドの確認を、インビボ回帰により行った。選択された脂質回帰クローンは、FA-KGGRAKD(配列番号:53)、FC- RGEVLWS(配列番号:54)、FE-TREVHRS(配列番号:47)、及びFX-VMGSVTG(配列番号:52)であった。図2に示されるように、これらのクローンは、全て、脂肪組織への回帰の上昇を示し、クローンFXは、対照fd-tetファージよりも数桁高い脂肪局在を示した。クローンFXは、他の選択された脂質回帰クローンよりも実質的に高い局在を示した。しかしながら、上に開示された胎盤回帰ペプチドからの類推により、当業者であれば、比較的低レベルの脂肪組織局在を示す脂質回帰クローンであっても、治療剤の標的化送達に有用であり得ることを理解するであろう。
さらに、以下に挙げられる、マウスの卵巣及び腹水に対するターゲティングペプチド配列が同定された。
表7に開示される、C57B1マウスにおける尿道ターゲティングペプチドを同定するため、類似のプロトコルを使用した。
脾臓に対するターゲティングペプチドは、従来同定されていない。網膜内皮系の一部として、非特異的なファージの脾臓への局在の高いバックグラウンドのため、脾臓組織に対するバイオパニングは複雑である。BRASIL法によるバイオパニングにおいて観察される減少したバックグラウンドは、脾臓のような組織に対するターゲティングペプチドの同定にとって有利である。
ライブラリ構築
白色レグホン(white leghorn)ニワトリを、還流(10ml MEM)されたBalb/cマウスに由来する脾臓ホモジネート(注射1回当たり約150mg)で免疫した。初回免疫後4週目及び8週目に、脾臓ホモジネートの追加接種をニワトリに与えた。FACS分析によるマウス脾臓に対する免疫応答は、ニワトリ免疫血清が、マウス細胞系(TRAMP-C1)に対する抗体を含むことを示した。初回免疫後12週目に、ニワトリを屠殺し、その脾臓をTRI試薬(Molecular Research Center,Inc.、Cincinatti、OH)へと摘出した。
ニワトリα脾臓ライブラリを使用して、マウスにおける4回のインビボスクリーニングを実施した。約0.8〜2.0×1010TUをBalb/cマウスに注射した。ライブラリを5分間循環させた。屠殺後、マウス脾臓を回収し、70μm細胞濾過ナイロンメッシュへと脾臓を通すことにより、単一細胞懸濁液を調製した。BRASIL技術を使用して、単一細胞懸濁液を油(9:1ジブチルフタレート:シクロヘキサン)で遠心分離し、対数増殖期のER2537大腸菌200μlにペレットを感染させた。マウス脾臓から回収された増幅されたファージを、次回のスクリーニングに使用した。BRASILの前に得られた脾臓片を使用した従来のバイオパニング法と比較して、脾臓及び脳へと回帰するファージの数に、スクリーニング中、明らかな濃縮は見られなかった。
単一細胞懸濁液を、2個のマウス脾臓より調製した。懸濁液を5個のチューブに分割し、3×109TUのFabクローン#2、#6、#10、#12、及び2×109TUのtetファージと共に、氷上でインキュベートした。マウス脾細胞と結合したファージをBRASILにより回収した。200μlの対数増殖期ER2537大腸菌にペレットを感染させ、ファージ結合の評価のため、段階希釈物をLB/カルベニシリンプレート及びLB/テトラサイクリンプレートに播いた。fd-tetを、全てのファージ回帰実験を規準化するための内部標準として使用した。
Fabクローン#2、#6、#10、#12のファージ(3×109)、及び2×109TUのtetファージを、Balb/cマウスの尾静脈に注射し、5分間循環させた。脾臓を回収し、全脾臓から単一細胞懸濁液を氷上で調製した。細胞結合ファージをBRASILにより回収した。200μlの対数増殖期ER2537大腸菌にペレットを感染させ、ファージ回収の評価のため、段階希釈物をLB/カルベニシリンプレート及びLB/テトラサイクリンプレートに播いた。
Fabクローン#10及びNPC-3TT(対照Fabファージ)のファージ(3×109TU)、並びに1×109TUのFd-tetファージをマウス(NPC-3TTについて2匹、クローン#10について2匹)に注射し、5分間循環させた。脾臓を回収し、単一細胞懸濁液を氷上で調製した。細胞結合ファージをBRASILにより回収した。200μlの対数増殖期ER2537大腸菌にペレットを感染させ、段階希釈物をLB/カルベニシリンプレート及びLB/テトラサイクリンプレートに播いた。NPC-3TTファージは、ヒト抗破傷風毒素Fab断片を表示しているファージである。
Fabクローン#10及びNPC-3tt対照のファージ(3×109TU)、並びに1×109TUのFd-tet対照ファージをマウス(NPC-3TTについて2匹、クローン#10について2匹)に注射し、5分間循環させた。脾臓を回収し、単一細胞懸濁液を氷上で調製した。臓器特異的回帰の対照として、同じマウスから骨髄(両大腿骨)を回収した。細胞結合ファージをBRASILにより回収した。
ニワトリFab挿入物を含むプラスミドpComb3を、ER2537大腸菌へとエレクトロポレーションした。段階希釈物をLB/カルベニシリンプレートに播き、37℃で一晩インキュベートした。Fab産生培養物(100μg/mlのカルベニシリンを含むスーパーブロス(super broth)中)を、単一の播種されたコロニーから開始させた。1mM IPTGにより、30℃で7時間、Fab産生を誘導した。細菌上清、周辺質画分SN1及びSN2、並びに細菌溶解物の中のFab濃度のELISAによる決定の後、アフィニティ精製により、周辺質画分SN2からFab断片を精製した。標準的なプロトコル(HarlowおよびLane、1988)を使用して、α-Fab-プロテインGカラムに、ジメチルピメリミデート(DMP)をカップリングさせた(2mg/ml)。
回収されたFab断片のインビボ分布を決定するため、50〜60μgのFab断片(Fab#10、NPC3-tt、又はR#16)をBalb/cマウスの尾静脈に注射し、8分間循環させた。50μgのトマト(L.esculentum)レクチン-FITCをマウスに注射し、2分間のレクチン循環の後、25〜30mlの4%パラホルムアルデヒド/PBSの灌流によりマウス組織を固定した。組織を摘出し、4%パラホルムアルデヒドで、1時間、後固定した。固定された組織を、溶液を少なくとも2回変えながら、4℃で一晩、30%ショ糖/PBS中でインキュベートした。組織を凍結培地で包埋し、ドライアイス上で凍結させた。
ニワトリFab断片を発現するファージクローンのマウス脾細胞へのインビトロ局在を、BRASILにより調査した。図3に示されるように、BRASILにより単離されたFabファージクローンは、挿入物を含まないFd-tet対照ファージと比較して、ディファレンシャルなマウス脾細胞との結合を示した。クローン#6は、Fab断片を含むが、マウス脾臓から単離されたのではない対照ファージNPC-3TTと類似した、最も低い程度のディファレンシャル結合を示した。クローン#2、#10、及び#12は、全て、Fd-tet対照と比較して、マウス脾細胞との選択的な結合を示し、クローン#2及び#10については少なくとも2倍増加した結合が観察された。クローン挿入物について決定されたアミノ酸配列は、以下の通りである:
血管新生性網膜系は、血管新生性腫瘍組織のモデルとして開発された。新生マウスにおける低酸素は、網膜における血管新生応答を引き起こす。血管新生性網膜組織受容体は、ファージディスプレイ結合に関して血管新生性腫瘍組織との類似性を示す。
血管新生性モデル系
1週齢C57BL/6Jマウスを、5日間、75%酸素雰囲気に曝露し、次いでさらに5日間、大気中で維持した。6μm横断切片において網膜から硝子体領域へと伸長した新血管の核を計数することにより、増殖性新生血管応答を定量した。このモデルを、マウスへ静脈注射されたファージディスプレイライブラリの、新たに形成された血管新生性血管への結合を評価するために使用した。血管新生のピークは、生後17〜21日目に観察された。
脾臓に関して既に開示したのと同じ方法を使用して、ウサギへと免疫されたカポジ肉腫腫瘍組織に対するFabファージライブラリ(α-KS)を作製した。血管新生性網膜モデル系において、α-KS ライブラリを使用して、3回のインビボスクリーニングを実施した。生後18〜20日目に低酸素により誘導された網膜血管新生を有する2匹のC57BL/6Jマウスに、約3〜10×1010TUのα-KSファージを注射した。ライブラリを5分間、循環させた。眼を摘出し、網膜を眼の残部から分離した。2枚のスライドガラスの間で破砕することにより、網膜から単一細胞懸濁液を調製した。単一細胞懸濁液を、前記のようなBRASILにより処理し、200μlの対数増殖期ER2537大腸菌にペレットを感染させた。一晩増幅したファージを網膜組織から回収し、次回のスクリーニングに使用した。各選択後の回収は、3400〜5000TUであった。
本発明のいくつかの態様は、様々な用途のための受容体/リガンド対の同定に関する。臓器、組織、又は細胞型に選択的なターゲティングペプチドは、通常は標的内の血管の内腔側表面上に位置している(前記定義のような)受容体と結合する。いくつかの態様において、ターゲティングペプチドは、直接的又は間接的に、そのような受容体を同定又は特徴決定するために使用されうる。遺伝子治療ベクター、その他の治療剤、又はインビボ画像化用の造影剤の送達のための標的としての使用に加え、そのような天然に存在する受容体は、受容体自体に対する新たな治療剤の開発、受容体に対するワクチンの開発、及び様々な疾患状態の基礎となっている分子機構の理解のための可能性のある標的として有用である。当然、ターゲティングペプチド自体は、受容体に対する新たな治療剤のための基礎として有益であり得る。
インテグリンの機能は、多様な生物学的系においてサイトカイン及びその他の可溶性因子により制御されている。最も一般的には、そのような因子の曝露は、受容体の活性化状態の変化(即ち、特定のリガンドに対する親和性の増加もしくは減少、及び/又は原形質膜内での受容体クラスター形成)をもたらすコンフォメーションの改変へと至る。インテグリン依存性接着の変化は、最終的には、様々な複雑なシグナル伝達経路を活性化する。分子レベルにおいては、誘導された細胞骨格タンパク質のインテグリン細胞質ドメインとの共局在が、シグナル伝達を調節する。
二次元細胞培養
β3及びβ5インテグリンを発現する3個のヒト内皮細胞系:KS1767細胞(Herndierら、1996)、HUVEC(ATCC)、及びBCE細胞(Solowskaら、1991)を使用した。異なるタンパク質(即ち、ビトロネクチン、フィブロネクチン、コラーゲン、又はラミニン)で覆われた無菌のガラス製カバーガラスを基質として使用した。細胞が接着し拡散した後、0.05%ウシ胎仔血清を含む培地中での12時間のインキュベーションにより、単層を休止状態にした。ペネトラチン(penetratin)膜透過性タグ(下記参照)を使用して、ペプチドを細胞へと導入した。細胞を、接着及び拡散のため、ECMタンパク質へと播いた。単層を、bFGF、TNFα、VEGF、及びTGFβを含む、αvにより媒介される血管新生に関与している各増殖因子で6時間刺激した。未処理の細胞が、陰性対照であった。
24穴組織培養プレートのウェルに各150μlのマトリゲル(Matrigel)を添加し、37℃で10分間ゲル化させた。2%FCSが補足されたM199培地中で24時間、HUVECを枯渇状態にした後、トリプシン処理したものを使用した。104個の細胞を3通り、各ウェルに穏和に添加し、37℃で30分間、ゲルコーティングへと接着させた。次いで、培地を、ペプチドを含む完全培地に交換した。24時間後、倒立顕微鏡(Canon)を用いて、プレートをモニタリングし、写真撮影した。
細胞遊走アッセイを、以下のようにして実施した。48ウェルマイクロケモタキシスチャンバーを使用した。8μm孔を有する、ポリビニルピロリドンを含まないポリカーボネートフィルター(Nucleopore、Cambridge、MA)に、室温で10分間、1%ゼラチンをコーティングし、2%FCSが補足されたM199培地で平衡化した。ペプチドを含む2%FCS、20ng/ml VEGF-A(R&D System)、及び1U/mlヘパリンが補足されたM199を、ボイデン(Boyden)チャンバーの下室に置いた。一晩、枯渇状態にしたサブコンフルエントの培養物を迅速にトリプシン処理し、最終濃度2×106個/mlで、2%FCSが補足されたM199に再懸濁させた。フィルターを下チャンバーと上チャンバーの間に置いた後、50μlの細胞懸濁液を上室に蒔いた。5%CO2を含む湿潤雰囲気中で37℃で5時間、細胞を遊走させた。次いで、フィルターを除去し、上側の細胞を、ゴムポリスマン(policeman)を用いて剥離した。遊走した細胞をメタノールで固定し、ギムザ溶液(Diff-Quick、Baxter Diagnostics、Rome、Italy)で染色した。各ウェル内の5個のランダムな高倍率視野(40倍)を計数した。
細胞増殖は、記載されているようにして(PasqualiniおよびHemler、1994)測定した。簡単に説明すると、4×104個のHUVECを24ウェルプレート内でインキュベートした。細胞を24時間枯渇状態にし、次いで培地を除去し、VEGF及び15μMの各ペプチドの存在下で交換し、18時間インキュベートした。次いで、50μlの[3H]チミジン(1μCi/ml)を含む培地をウェルに添加し、さらに6時間37℃でインキュベートした後、培地を除去し、細胞を10%TCAで4℃で30分間固定し、エタノールで洗浄し、0.5N NaOHで可溶化した。LS 6000SCベックマン(Beckman)シンチレーションカウンターを用いて液体シンチレーションにより放射能を計数した。各実験を3通り3回実施し、結果を平均値±SDで表した。
およそ1×106個の細胞を完全培地中に採集し、15μMのペプチドを4時間、8時間、又は12時間添加した。次いで、細胞をPBSで洗浄し、0.5mlのヨウ化プロピジウム溶液(50μg/ml PI、0.1%Triton X-100、0.1%クエン酸ナトリウム)に再懸濁させた。4℃で24時間のインキュベーションの後、細胞を、488nmレーザーを用いてXLコールター(Coulter)(Coulter Corporation)で計数し;各ヒストグラムについて12,000個の細胞を計数し、細胞周期分布をマルチサイクル(Multicycle)プログラムで分析した。
CAMへと移植された血管新生因子及び腫瘍細胞は、新たな毛細血管の成長を刺激する。10日ニワトリ胚に由来するCAMにおいて、以前には無血管であった領域に移植されたVEGF又はbFGFのフィルターにより、血管新生を誘導した。異なる処理(ペネトラチンペプチド及び対照)を局所適用し、3日後、フィルター及び周囲のCAMを切除しホルマリンで固定した。立体顕微鏡を用いて、CAMの焦平面内で、ディスクに侵入した血管の数を定量した。各群8個のCAMからの血管数の平均値及び標準誤差を比較した。
srcファミリーのプロテインキナーゼ(Fyn、c-Src、Lyn、及びSyc)、並びにMAPキナーゼのようなセリン/トレオニンキナーゼによるペプチドライブラリのリン酸化を、以前に記載されたようにして実施した(Schmitzら、1996;Denteら、1997;Gramら、1997)。簡単に説明すると、20%ポリエチレングリコール8000を含む2.5M NaClによる二重沈殿により、培養上清からファージ粒子を収集した。粒子を1012個/mlで溶解させた。精製されたファージ(10μl)を、50μlの反応緩衝液容量で、異なる濃度(35〜3,500単位)のプロテインキナーゼと共に、室温で3時間インキュベートした。リン酸化されたペプチドを表示しているファージを選択するため、反応混合物を、10μgのアガロースと接合した抗P-Tyr、抗P-Ser、又は抗P-Thrモノクローナル抗体を含むチューブに移した。結合したファージを、0.3mlの溶出緩衝液(0.1 M NaCl/グリシン/1mg/ml BSA、pH2.35)でカラムを洗浄することにより溶出させた。溶出液を2Mトリス塩基で中和し、2mlの対数増殖期中期(mid-log)の細菌培養物と共にインキュベートした。その一部20μlを播種のため取り出し、記載されているようにしてファージを採集した。リン酸化から選択までの工程を繰り返した。β3及びβ5の細胞質ドメインと結合するリン酸化されたペプチドを、先のセクションに記載されたようにして分析した。
GST融合タンパク質を記載されたようにしてインビトロでリン酸化した(Schmitzら、1996;Denteら、1997;Gramら、1997)。簡単に説明すると、10μg/mlを、5.5単位のFynプロテインキナーゼを含む反応緩衝液(50 mM Tris、5mM MgCl2、500μM Na3VO4、 500μM ATP、全容量50μl)と共に室温で3時間インキュベートした。40%のTCAを添加することにより、反応を停止させた。キナーゼ基質タンパク質を沈殿させた後、それをPBSに再懸濁させ、マイクロタイターウェル上に10μg/ウェルでコーティングした。CX7Cライブラリの一部(2.5×1011形質導入単位)をGST融合タンパク質上でインキュベートした。ランダムに選択されたクローンから、ファージを配列決定した。
質量分析によるペプチド質量マッピングを、β3及び/又はβ5の細胞質ドメインの新規リガンドを同定するために使用した。細胞質ドメイン結合ペプチドに対して産生させたポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を、標的タンパク質(細胞骨格分子又はシグナル伝達分子)を精製するために使用した。これらのタンパク質をSDS-PAGEにより分離し、SDSゲルから切り出し、トリプシンでゲル内消化した。ペプチドの抽出後、ペプチド質量のリストを作製するためMALDI-TOF質量分析を実施した。このペプチド質量のリストは、プロテアーゼ特異性と組み合わされ、配列データベースを検索するために使用されうる比較的特異的な「サイン」を与える。タンパク質配列がデータベース内に存在する場合には、この方法により、高い信頼性でタンパク質が同定されうる。この手法の検出下限は、現在のところ、N末端エドマン配列決定法よりも少なくとも10〜20倍低い1pmolである。
β3及びβ5の細胞質ドメインに対するファージペプチドライブラリのパニング
β3及びβ5の細胞質ドメインと結合するタンパク質を、マイクロタイターウェルにコーティングされたGST-β3cyto又はGST-β5cytoのいずれかを含む組換えGST融合タンパク質を用いた複数のファージライブラリのスクリーニングにより単離した。固定化GSTを、各細胞質ドメインのパニングにおける濃縮についての陰性対照として使用した。他に開示されたようにして(Koivunenら、1995;Pasqualiniら、1995)、3回のパニングの後、ランダムに選択されたクローンからファージを配列決定した。β3又はβ5細胞質ドメインと特異的に相互作用する別個の配列が単離された(表9)。2回目及び3回目のパニングからランダムに選択されたクローンを配列決定した。ファージミドによりコードされたペプチドのアミノ酸配列を、ヌクレオチド配列から推定した。示されたライブラリを用いたパニングの後、最も高頻度に見出されたモチーフが、表9に示されている。比率は、β3-GSTでコーティングされたウェルから回収されたコロニーの数を、GST又はBSAから回収されたもので割ることにより計算した。
結合特性に基づき、さらなる研究のため、特定のファージを選択した。各ファージにより表示された配列に相当する合成ペプチドを、結合阻害研究を実施するために使用した。このアッセイにより、ファージ結合が各ファージにより表示されたターゲティングペプチドにより完全に媒介されるのか、又は非特異的成分も含んでいるのか、が決定された。予想通り、合成ペプチドは、用量依存的に対応するファージの結合を阻害した(図11及び図12)。無関係のアミノ酸を含む対照ペプチドは、同一濃度で試験した場合、ファージ結合に対する効果を有していなかった。
リン酸化を含む事象は、シグナル伝達の制御において重要である。ファージディスプレイ系を、二つのレベルでチロシンリン酸化の効果を評価するために使用した。第一に、β3又はβ5の細胞質ドメインを含む組換え融合タンパク質を、チロシン含有ペプチドを表示しているファージライブラリのパニングに使用した。第二に、細胞質ドメイン自体をリン酸化した後、ファージ選択を実施した。特定のチロシンキナーゼの、選択されたペプチドの細胞質ドメインとの相互作用を調整する能力を調査するための実験を、実施した。チロシン含有ペプチドを表示しているファージライブラリのパニングにおいて得られた結果は、表10に示されている。
インテグリン細胞質ドメイン結合ファージにより表示されたペプチドは、細胞骨格タンパク質及びシグナル伝達に関与しているタンパク質に見出されるいくつかの領域と類似していた(表11)。単離ペプチドのいくつかと、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ5のある領域(MAPK5、アミノ酸227〜234)との類似性は、特に興味深かった。MAPKカスケード、細胞の接着、遊走、及び増殖を含む関連が提唱されている(Linら、1997)。
ペネトラチンは、親水性化合物に原形質膜を通過させることができるペプチドである。浸透部分との融合は、明らかな崩壊なしに、オリゴペプチドを細胞質、核、又はその両方へと直接的にターゲティングすることを可能にする(Derossiら、1994)。この膜透過性ペプチドは、ショウジョウバエ(Drosophila)転写因子(Jolietら、1991a、1991b ;Le Rouxら、1993)であるアンテナペディアのホメオドメインのアミノ酸43〜58に相当する16残基
からなる。ペネトラチンにより媒介される取り込みは、37℃及び4℃の両方で起こり、取り込まれたペプチドは細胞から完全な状態で回収されうる。
β3及びβ5インテグリン細胞質ドメイン結合モチーフの、内皮細胞増殖に対する効果を、内皮細胞を活性化する因子による刺激の後、評価した(図15)。細胞増殖は、パスカリーニ(Pasqualini)およびエルマー(Hemler)(1994)に従い測定した。簡単に説明すると、4×104個のHUVECを24ウェルプレートでインキュベートし、24時間枯渇状態にし、その後、培地を除去し、VEGF及び15μMの各ペプチドの存在下で交換した。さらに18時間のインキュベーションの後、50μlの[3H]チミジン(1μCi/ml)を含む培地をウェルに添加した。さらに6時間37℃でインキュベートした後、培地を除去し、細胞を10%TCAで4℃で30分間固定し、エタノールで洗浄し、0.5N NaOHで可溶化した。LS 6000SCベックマン(Beckman)シンチレーションカウンターを使用することにより、液体シンチレーションにより放射能を計数した。各実験を3通り3回実施し、結果を平均値±SDで表した。
細胞遊走は、48ウェルマイクロケモタキシスチャンバーにおいてアッセイした。8μm孔を有する、ポリビニルピロリドンを含まないポリカーボネートフィルターを、室温で10分間1%ゼラチンでコーティングし、2%FCSが補足されたM199培地で平衡化した。ペプチドを含む2%FCS、20ng/ml VEGF-A(R&D System)、及び1U/mlヘパリンが補足されたM199を、ボイデンチャンバーの下室に置いた。一晩、枯渇状態にしたサブコンフルエントの培養物を迅速にトリプシン処理し、最終濃度2×106個/mlで、2%FCSを含むM199培地に再懸濁させた。フィルターを下チャンバーと上チャンバーの間に置いた後、50μlの細胞懸濁液を上室に蒔いた。5%CO2を含む湿潤雰囲気中で37℃で5時間、細胞を遊走させた。次いで、フィルターを除去し、上側の細胞を、ゴムポリスマンを用いて剥離した。遊走した細胞をメタノールで固定し、ギムザ溶液で染色した。各ウェル内の5個のランダムな高倍率視野(40倍)を計数した。結果は、両方のβ3インテグリン細胞質ドメイン結合ペプチドが細胞の遊走を増加させたが、ペネトラチンは細胞に影響を与えなかったことを示している。
およそ1×106個の細胞を完全培地中に採集し、15μMのペプチドを4時間、8時間、又は12時間添加した。次いで、細胞をPBSで洗浄し、0.5mlのヨウ化プロピジウム溶液(50μg/ml PI、0.1%Triton X-100、0.1%クエン酸ナトリウム)に再懸濁させた。4℃での24時間のインキュベーションの後、細胞を、488nmレーザーを用いてXLコールター(Coulter Corporation)で計数し;各ヒストグラムについて12,000個の細胞を計数し、細胞周期分布をマルチサイクルプログラムで分析した。
標準的な技術を使用して、αvβ3結合ペプチド及びαvβ5結合ペプチドを認識するポリクローナル抗体を、合成ペプチドを用いて作製されたKLH接合体を使用して生成させた。2個の異なる合成ペプチドに対する抗体を作製した(図18)。血清は、ウェスタンブロット分析により示されるように、固定化ペプチドを認識するだけでなく、全細胞抽出物中の特異的タンパク質も認識する(図19)。
実施例9は、ペネトラチンへの結合により細胞へと輸入されたVISYペプチド(VVISYSMPD、配列番号:112)が、HUVEC細胞においてアポトーシスを誘導しうることを示した。ここでアネキシンVとして同定されたペプチドの内因性細胞類似体を同定するため、VISYペプチドに対して産生された抗体が使用された。結果は、アネキシンVが、新規アポトーシス経路に関与しているインテグリンの内因性リガンドであることを示している。
タンパク質精製
前記実施例9に記載の方法を使用して、VISYペプチド(VVISYSMPD、配列番号:112)に対するポリクローナル抗体を調製した。MDA-MB-435乳癌細胞を、内因性VISYペプチド類似体の精製のため使用した。細胞を氷冷PBSで3回洗浄し、冷水で20分間溶解させた。膜画分から細胞質画分を分離するため、細胞抽出物を100,000×gで30分間遠心分離した。細胞質画分をゲル濾過カラム(10〜50kDa)及び陰イオン交換カラム(monoQ)でのカラムクロマトグラフィに供した。陰イオン交換カラムを、50mM〜1M NaClの塩勾配で溶出させた。1ml画分を収集し、SDS-PAGEを実行し、抗VISY抗体と反応性の内因性タンパク質の存在に関してウェスタンブロッティングにより試験した。36kDaの抗体反応性バンドを含む目的の画分は、約300mM NaClで溶出した。
アネキシンVのβ5インテグリンとの結合、及びVISYペプチドの効果を調査するため、競合結合アッセイを実施した。プレートに様々なインテグリンの細胞質ドメインのGST融合タンパク質をコーティングし、アネキシンVをプレートに添加した。抗アネキシンV抗体を使用して、アネキシンVの結合を決定した。図20Aに示されるように、アネキシンVはGST-β1インテグリンともGST-β3インテグリンとも結合しなかった。アネキシンVは、GST-β5インテグリンと強く結合したが、結合は使用された緩衝液に依存していた(図20A)。トリス緩衝生理食塩水(TBS)においては低い結合が観察され、カルシウム(2mM)が添加された、又は添加されていない「細胞質緩衝液」(100 mM KCl、3mM NaCl、3.5 mM MgCl2、10mM PIPES、3mM DTT)では高い結合が観察された(図20A)。カルシウムは、アネキシンV活性がカルシウムにより調整されることが報告されているため、使用した。アネキシンVのGST-β5との結合は、VISYペプチドの添加により阻止された(図20A)。図20Bは、抗アネキシンV抗体の精製されたアネキシンV及びVISYペプチドとの結合の相対レベルを示している。
実施例9において示されたVISYペプチドによるアポトーシスの誘導を確認した。106個のHUVEC細胞を15μMのVISYアンテナペディア(ペネトラチン)キメラ、又は15μMのアンテナペディアペプチド(ペントラチン(pentratin))単独で2〜4時間処理し、アガロースゲル電気泳動によりクロマチン断片化を分析した。図21は、クロマチン断片化により示されるようなVISY-Ant(ペネトラチン)によるアポトーシスの誘導を示している。VISYも、ペネトラチンも、単独ではアポトーシスを誘導しなかった。アポトーシスの誘導は、カスパーゼ阻害剤(zVAD、カスパーゼインヒビター(caspase inhibitor)I、Calbiochem #627610、San Diego、CA)をVISYキメラペプチドと同時に培地へ添加した場合に、最大70%阻害された。
腫瘍血管の内皮細胞は、特異的な血管新生マーカーを発現する。アミノペプチダーゼA(APA、EC 3.4.11.7)は、血管新生中の微小血管においてアップレギュレートされる。APAは、オリゴペプチドからN末端のグルタミル残基又はアスパルチル残基を加水分解するホモダイマーの膜結合型亜鉛メタロペプチダーゼである(Nanusら、1993)。インビボで、APAは、アンジオテンシンIIをアンジオテンシンIIIへと変換する。レニン-アンジオテンシン系は、いくつかの内分泌機能、心血管機能、及び行動的機能の制御において重要な役割を果たしている(Ardaillou、1997;StrothおよびUnger、1999)。最近の研究は、血管新生におけるアンジオテンシンの役割も示唆しているが(Andradeら、1996)、血管新生過程におけるAPAの機能は、従来検討されていない。
細胞培養
腎癌細胞系SK-RC-49に、全長APA cDNA(Gengら、1998)をコードする発現ベクターをトランスフェクトした。細胞を、2mMグルタミン、1%非必須アミノ酸、1%ビタミン(Gibco BRL)、100U/mlストレプトマイシン、100U/mlペニシリン(Irvine Scientific)、10mMピルビン酸ナトリウム(Sigma-Aldrich)、及び10%ウシ胎仔血清(FCS)(Tissue Culture Biological、Tulare、CA)が補足されたMEM(Irvine Scientific、Santa Ana、CA)の中で維持した。安定的にトランスフェクトされた細胞を、G418含有培地中で維持した。HUVECをコラゲナーゼ処理により単離し、1〜4代の間で使用した。細胞を、ゼラチンでコーティングされたプラスチック上で、20%FCS、ペニシリン(100 U/ml)、ストレプトマイシン(50μg/ml)、ヘパリン(50μg/ml)、ウシ脳抽出物(100μg/ml)が補足されたM199培地(Sigma)の中で増殖させた。培地補助剤は、全て商業的に入手した(Life Technologies,Inc.、Milan、Italy)。
抗APA mAb RC38(Schlingemannら、1996)を、トランスフェクトされた細胞溶解物からAPAを免疫捕獲(immunocapture)するために使用した。CPRECESIC(配列番号:123)及び GACVRLSACGA(配列番号:124)環状ペプチドを化学合成し、非還元条件下で自発的に環状化させ、質量分析(AnaSpec San Jose、CA)により精製した。CPRECESIC(配列番号:123)ペプチドの質量分析機分析は、おそらくは異なるジスルフィド結合の位置及びダイマーの形成を反映している6個の異なるピークを明らかにした。異なる画分のAPA酵素活性に対する生化学的挙動は類似していたため、下記の全ての手順において、6個のピークの混合物を使用した。
セミコンフルエントのプレートから、100 mM N-オクチル-β-グルコピラノシド(Calbiochem)を含む冷PBSへと細胞を剥離し、氷上で2時間溶解させ、13,000×gで15分間遠心分離した。マイクロタイター丸底ウェル(Falcon)に、2μgのRC38を室温で4時間コーティングし、室温で1時間、PBS/3%BSA(Intergen、Purchase、NY)でブロッキングし、その後、150μlの細胞溶解物(1mg/ml)をmAbでコーティングされたウェル上で4℃で一晩インキュベートし、PBS/0.1%Tween-20(Sigma)で5回洗浄し、PBSで2回洗浄した。
細胞及び免疫捕獲されたタンパク質を、リルン(Liln)ら(1998)に従い、特異的酵素活性について試験した。簡単に説明すると、接着細胞又はRC38で免疫捕獲された細胞の抽出物を、3mM α-L-グルタミル-p-ニトロアニリド(Fluka)及び1 mM CaCl2を含むPBSと共に、37℃で2時間インキュベートした。マイクロプレートリーダー(Molecular Devices、Sunnyvale、CA)で405nmにおける吸光度(O.D.)を読み取ることにより、酵素活性を決定した。
CX3CX3CX3C(Cはシステインであり、Xは任意のアミノ酸である)ライブラリを調製した(Rajotteら、1998)。ファージ粒子の増幅及び精製、並びにファージ表示された挿入物のDNA配列決定を、前記と同様にして実施した。2.5mM EDTAを含むPBSとのインキュベーションにより細胞を脱離させ、結合培地(20mM HEPES及び2%FCSが補足されたDMEMハイグルコース)で1回洗浄し、2×106細胞/mlの濃度で同培地に再懸濁させた。1010TUのファージを500μlの細胞懸濁液に添加し、混合物を穏和に回転させながら一晩(1回目)又は2時間(後続回)4℃でインキュベートした。細胞を室温で結合培地で5回洗浄し、100μlの同培地に再懸濁させた。1mlの対数増殖期K91kan大腸菌を添加し、混合物を室温で1時間インキュベートすることにより、ファージをレスキューした。細菌を、10mlの0.2μg/mlテトラサイクリンが補足されたLB培地で希釈し、室温でさらに20分間インキュベートした。段階希釈物を40μg/mlテトラサイクリンを含むLBプレートに播き、プレートを37℃で一晩インキュベートした後、コロニーを計数した。
細胞パニングについて記載したようにして、109TUの入力量を用いて細胞結合アッセイを実施した。増加性の濃度でCPRECESIC(配列番号:123)ペプチドを結合培地へ添加することにより、特異性を確認した。ファージを免疫捕獲されたAPAと結合させるため、ウェルをPBS/3%BSAで室温で1時間ブロッキングし、50μlのPBS/3%BSA の中で109TUと共に室温で1時間インキュベートした。PBS/1%BSA/0.01%Tween-20で8回洗浄し、PBSで2回洗浄した後、200μlの対数増殖期K91kan大腸菌を添加することにより、ファージをレスキューした。各実験を少なくとも3回繰り返した。
MDA-MB-435に由来する腫瘍異種移植片を、2ヶ月齢の雌ヌードマウス(Jackson Labs、Bar Harbor、Maine)で確立した。マウスにアバーチン(Avertin)麻酔を施し、109TUのファージを含む200μl容量のDMEMを尾静脈から静脈注射した。ファージを5分間循環させ、5mlのDMEMで心臓を通って動物を還流した。各マウスから腫瘍及び脳を切除し、計量し、等量の組織をホモジナイズした。組織ホモジネートを、プロテイナーゼ阻害剤カクテル及び0.1%BSAを含む氷冷DMEMで3回洗浄した。結合したファージをレスキューし、細胞パニングについて記載したようにして計数した。Fd-tetファージを、対照として同じ入力量で注射した。その実験を2回繰り返した。平行して、同組織試料の一部をブアン溶液で固定し、組織切片の調製のためパラフィン包埋した。M-13ファージに対する抗体(Amersham-Pharmacia)を染色に使用した。
HUVECを含む完全M199培地を、48ウェルプレート(104個/ウェル)に蒔き、24時間付着させた。次いで、2%FCSを含むM199培地中で24時間細胞を枯渇状態にした。CPRECESIC(配列番号:123)ペプチド又は対照GACVRLSACGA(配列番号:124)ペプチド(1 mM)を含む、2%FCS及び10ng/ml VEGF-A(R&D System、Abingdom、UK)を含む培地を、ウェルに添加した。示された時間インキュベートした後、細胞を2.5%グルタルアルデヒドで固定し、0.1%クリスタルバイオレットを含む20%メタノールで染色し、10%酢酸で可溶化した。全ての処理を3通り行った。細胞増殖は、マイクロプレートリーダー(Biorad、Hercules、CA)で590nmのO.D.を測定することにより評価した。較正曲線を確立し、O.D.と細胞数との直線的な相関が、103〜105細胞で観察された。
細胞遊走アッセイは、ブリッソーニ(Bussolini)ら(1995)に従い、48ウェルマイクロケモタキシスチャンバー(NeuroProbe、Gaithersburg、MD)において実施した。8μm孔を有する、ポリビニルピロリドンを含まないポリカーボネートフィルター(Nucleopore、Cambridge、MA)を、室温で10分間1%ゼラチンでコーティングし、2%FCSが補足されたM199培地で平衡化した。CPRECESIC(配列番号:123)ペプチド又は対照GACVRLSACGA(配列番号:124)ペプチド(1mM)を含む、2%FCS及び10ng/ml VEGF-A(R&D System)が補足されたM199培地を、ボイデンチャンバーの下室に置いた。一晩、枯渇状態にしたサブコンフルエントの培養物を、2.5mM EDTAを含むPBSに採集し、PBSで1回洗浄し、最終濃度2×106個/mlで2%FCSを含むM199培地に再懸濁させた。フィルターを下チャンバーと上チャンバーの間に置いた後、50μlの細胞懸濁液を上室に蒔き、5%CO2を含む湿潤雰囲気中で37℃で5時間、細胞を遊走させた。次いで、フィルターを除去し、上側の細胞を、ゴムポリスマンを用いて剥離した。遊走した細胞をメタノールで固定し、ギムザ溶液(Diff-Quick、Baxter Diagnostics、Rome、Italy)で染色した。各ウェル内の5個のランダムな高倍率視野(100倍)を計数した。各アッセイを3通り実行した。
48穴組織培養プレートのウェルに各100μlのマトリゲル(Matrigel)(Collaborative Research、Bedford、MA)を添加し、37℃で10分間、固体化させた。2%FCSが補足されたM199培地中で24時間、HUVECを枯渇状態にした後、2.5mM EDTAを含むPBSに採集した。104個の細胞を3通り各ウェルに穏和に添加し、37℃で30分間、ゲルコーティングへと接着させた。次いで、培地を、示された濃度のCPRECESIC(配列番号:123)ペプチド又はGACVRLSACGA(配列番号:124)ペプチドを含む完全培地に交換した。24時間後、倒立顕微鏡(Canon)を用いてプレートを写真撮影した。そのアッセイを3回繰り返した。
CAMアッセイ(Ribattiら、1994)によりインビボ血管新生を評価した。白色レグホンニワトリ由来の受精卵を一定の湿度で37℃で維持した。インキュベーション3日目、卵殻に四角形の窓を開け、殻から発達中のCAMを脱離させるために2〜3mlの卵白を取り出した。同サイズのガラスプレートで窓を密封し、卵をインキュベーターに戻した。8日目、1mm3の滅菌したゼラチンスポンジ(Gelfoam、Upjohn Co、Kalamazoo、Milan)に、VEGF-A(20ng、R&D System)と、CPRECESIC(配列番号:123)又は対照GACVRLSACGA(配列番号:124)ペプチド(1mM)のいずれかとを含む3μlのPBSを吸収させ、無菌条件下で成長中のCAMの頂部に移植した。12日目まで毎日CAMを調査し、ライカ(Leica)実体顕微鏡でインオボ(in ovo)で写真撮影した。スポンジから出現した毛細血管を計数した。そのアッセイを2回繰り返した。
APAヌルマウスは記載されている(Linら、1998)。P7(生後7日目)の仔マウスを授乳する母親と共に5日間75%酸素に曝露した。P12に正常酸素(大気)へとマウスを戻した。組織学的分析のため、P17〜P21にマウスを屠殺し、眼を摘出し、4%パラホルムアルデヒドを含むPBSで+4℃で一晩固定した。固定された眼をパラフィン包埋し、5μmの連続切片を切り出した。切片をヘマトキシリン/エオシン(h/e)溶液で染色した。各眼について20個のh/e染色切片から、内境界膜の硝子体側の新生血管核を計数した。切片1個当たりの新生血管核数の平均値を計算し、スチューデントt検定を使用して動物群間で比較した。
ファージディスプレイによる細胞パニングによりAPA結合モチーフが選択される
APAと結合することができるペプチドを同定するため、細胞をランダムペプチドファージライブラリでスクリーニングした。まず、天然コンフォメーションでのAPA発現のモデルを得るため、APAを発現していないSK-RC-49腎癌細胞に、全長APA cDNAをトランスフェクトした。トランスフェクションの結果として発現されたAPAは、APA酵素アッセイにより立証されたように機能的に活性であったが(示していない)、親SK-RC-49細胞はAPAの発現も活性も示さなかった(示していない)。
の特異的な濃縮が明らかとなった。この配列は、2回目からランダムに選択され18個のファージ挿入物の50%を占め、3回目からのファージ挿入物の100%を占めていた。2回目から得られた4個のペプチド挿入物は、タンデムファージとの配列類似性を有していた(表12、太字フォント)。2回目ペプチドの中には、明らかに保存されているモチーフが他にもいくつか観察された(表12、下線又はイタリック体)。これらのうちの1個は、タンデムリピート配列と一部重複していた。選択されたペプチドのヒトデータベースに対する配列相同性の検索は、有意な一致を与えなかった。
ペプチド挿入物
を表示しているファージを、個々にAPA結合に関して試験した。3個のファージは、全て、SK-RC-49親細胞に対して6倍濃縮された類似のパターンで、特異的にSK-RC-49/APA細胞の表面と結合した(示していない)。対照の挿入物非含有ファージは、結合優先性を示さなかった(示していない)。2回目に選択されたCGTGCAVECEVVC(配列番号:128)及びその他のファージは、SK-RC-49/APA細胞との選択的結合を示さなかった(データは示していない)。APA結合ファージ挿入物を再現するコンセンサス配列を含む可溶性ペプチドCPRECESIC(配列番号:123)を合成した。
ファージの結合も、CPRECESIC(配列番号:123)ペプチドによって置換されたが、CLGQCASICVNDC(配列番号:126)ファージの結合は影響を受けなかった(データは示していない)。
ファージは、RC38免疫捕獲されたSK-RC-49親細胞由来細胞溶解物とのファージの結合と比較して10〜12倍の濃縮で、免疫捕獲されたAPAと選択的に結合した(示していない)。
同定されたペプチドの、腫瘍へと回帰する能力を、ヒト***腫瘍異種移植片が移植されたヌードマウスをモデル系として使用して評価した。ファージを腫瘍保持マウスの尾静脈に注射し、組織ホモジネートからのファージ回収によりターゲティングを評価した。CPKVCPRECESNC(配列番号:127)ファージは、対照として使用された脳組織と比較して腫瘍移植片において4倍濃縮されていた(図22)。挿入物非含有ファージは、腫瘍をターゲティングしなかった(図22)。CYNLCIRECESICGADGACWTWCADGCSRSC(配列番号:125)ファージもCLGQCASICVNDC(配列番号:126)ファージも、腫瘍回帰優先性を示さなかった(データは示していない)。
APA酵素活性に対するCPRECESIC(配列番号:123)の効果を検討するため、SK-RC-49/APA細胞を、増加性の濃度のCPRECESIC(配列番号:123)ペプチド又は対照GACVRLSACGA(配列番号:124)ペプチドの存在下で、APA特異的基質α-グルタミル-p-ニトロアニリドと共にインキュベートした。37℃での2時間のインキュベーションの後、比色アッセイにより酵素活性を評価した。CPRECESIC(配列番号:123)は、APA酵素活性を阻害し、試験された最高濃度では活性を60%減少させた(図23)。酵素阻害に関するCPRECESIC(配列番号:123)のIC50は、800μMと計算された。CPRECESIC(配列番号:123)は、近縁のプロテアーゼであるアミノペプチダーゼNの活性には影響を与えなかった(データは示していない)。
抗血管新生薬としてのCPRECESIC(配列番号:123)ペプチドの可能性のある使用を決定した。まず、インビトロのCPRECESIC(配列番号:123)ペプチドによるAPA阻害の、VEGF-A(10ng/ml)で刺激されたヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)の遊走及び増殖に対する効果を調査した。HUVEC上の機能性APAの存在を、酵素アッセイにより評価した(示していない)。試験された最高濃度(1mM)において、CPRECESIC(配列番号:123)ペプチドは、ボイデンチャンバーアッセイにおいてHUVECの走化性を70%阻害した(図24)。同じペプチド濃度で、細胞増殖は50%阻害された(図25)。比較的低濃度のCPRECESIC(配列番号:123)ペプチド又はGACVRLSACGA(配列番号:124)対照ペプチドは、細胞の遊走及び増殖に対する有意な効果を有していなかった(示していない)。
異なるインビトロ及びインビボの血管新生モデルにおけるCPRECESIC(配列番号:123)ペプチドの阻害効果を調査した。三次元マトリックスゲル上に播かれたHUVECは、毛細血管様の構造へと分化し、インビトロ血管新生モデルを与える。増加性の濃度のCPRECESIC(配列番号:123)ペプチドは、このネットワークの形成の進行的な減損をもたらした(示していない)。1mMのペプチド濃度で、血管様枝分かれ構造は、有意に少なく、かつ短くなり、結果として細胞は完全なネットワーク組織を形成することができなかった(示していない)。対照ペプチドGACVRLSACGA(配列番号:124)は、HUVEC形態形成に影響を与えなかった(示していない)。
*スチューデント-ニューマン-クールズ(Student-Newman-Keuls)検定によりp<0.01。結果は、2回の独立の実験からの平均値及び標準誤差として表されている。
未成熟マウスにおける低酸素網膜症のモデルにおいて、APA+/-マウス及びAPA-/-ヌルマウスの血管新生能を調査した。相対的低酸素による網膜血管新生の誘導は、野生型マウスと比較してAPA+/-マウスに既に存在していた(示していない)。APAヌルマウスにおいて、血管新生はほぼ検出不可能であった(示していない)。血管新生は、低酸素眼の切片20個から硝子体の突出している新生血管核を計数することにより定量した。P7〜P12の75%酸素処理の後、網膜血管新生の有意な誘導(眼切片1個当たり16.17±1.19個の新生血管核)が生後17日目(P17)の野生型マウスにおいて見られた。P7〜P12の75%酸素曝露の後、P17のAPA+/-マウス(眼切片1個当たり10.76±1.03個の新生血管核)及びAPAヌルマウス(眼切片1個当たり4.25±0.45個の新生血管核)の網膜には、減少した量の新生血管核が見られた。
インビボで、APAは、腫瘍を含む活性化された微小血管により過剰発現されているが、休止期血管系にはほぼ検出不可能であり、従って血管指向腫瘍療法のための適当な標的である。本実施例は、APAの新規ターゲティングペプチドリガンドCPRECESIC(配列番号:123)を同定した。可溶性CPRECESIC(配列番号:123)ペプチドは、800μMのIC50でAPA酵素活性を阻害した。
特定の態様において、臓器または組織の不均一な試料から特定の細胞型を選択することができることが望ましい。そのような選択的サンプリングを行う一つの方法はPALM(レーザーマイクロビームによる位置決定と剥離)によることである。
インビトロおよびインサイチューパニング
CX7Cペプチドファージライブラリ(109 TU)を、C57BL/6雄性マウスの尾静脈へ注射し、膵臓を採取して細菌感染によってファージを回収した。コロニー246個からのファージをLB/カナマイシン(100 μg/ml)/テトラサイクリン(40 μg/ml)5ml中で37℃の暗所で攪拌しながら個々に増殖させた。一晩培養物をプールして、ファージを別のインビボバイオパニングラウンドのためにNaCl/PEG沈殿によって精製した。コロニー300個を2回目のパニングラウンドから採取して、ファージを沈殿によって回収した。次に、2回目のバイオパニングラウンドからのファージをもう一回のバイオパニングラウンドのために用いて、同様に、一回のインサイチューパニングラウンドのために凍結融解したマウス膵臓切片と共にインキュベートした。
ファージは、PALM(レーザーマイクロビームによる位置決定と剥離)コールドレーザー圧発射システムを用いて14 μm切片から微小切除した、凍結保存FITC-レクチン染色マウス膵島および周辺の腺房から回収した。膵島および対照切片をpH8の1mM EDTAに発射して、PCR増幅のために十分な材料が回収されるまで-20℃で凍結した。ファージDNAを、fUSE5プライマーを用いて増幅した。
重なり合った組のプライマーを用いて、PCR産物に、もう1回のPCRラウンドを行った。第二のプライマーの組の3'末端に、配列決定目的のためにM13リバースプライマーによってテールをつけた。用いた入れ子(nested)プライマーセットは、
であった。隣接するSfiI制限部位を含むペプチド挿入物配列を作製するために、さらに2つのプライマーを用いた。
入れ子プライマーから作製したPCR産物をゲル精製して(Qiagen)、自動配列決定によってM13リバースプライマーを用いてCX7Cペプチド挿入物が存在することを確認した。ライブラリプライマーから生じたPCR産物をゲル精製して(Qiagen)、CsCl2精製fUSE5/SfiIにライゲーションして、エレクトロコンピテントMC1061細胞にエレクトロポレーションして、LB/ストレプトマイシン(100 μg/ml)/テトラサイクリン(40 μg/ml)寒天プレート上に播種した。ゲル電気泳動によってCX7C挿入物配列の存在を確認するために、単一のコロニーにfUSE5プライマーを用いてコロニーPCRを行った。陽性クローンをBig Dyeターミネーター(Perkin Elmer)を用いて配列決定した。
膵島および対照切片を1mM AEBSF、20 μg/mlアプロチニン、10 μg/mlロイペプチン、1mMエラスターゼ阻害剤I、0.1 mM TPCK、1nMペプスタチンAのpH 7.4のPBS溶液に入れて、十分な材料が収集されるまで48時間またはそれ未満凍結させた。切片を氷中で融解して、容量をpH 7.4のPBSによって200 μlに調節した。試料をK91 KanR(OD=0.22)1mlと共にRTで旋回装置上で2時間インキュベートした。各培養物をLB/Kan/Tet(0.2 μg/ml)1.2 mlに移して、RTの暗所で40分間インキュベートした。テトラサイクリンの濃度をそれぞれの培養物について40 μg/mlに増加して、培養物を攪拌しながら37℃で一晩インキュベートした。翌日、各培養物をLB/Kan/Tet寒天プレートに播種して、37℃の暗所で14時間インキュベートした。陽性クローンをコロニーPCRおよび自動配列決定のために採取した。
PALMを用いたインビボパニングの一般的スキームを、図26に示す。最初のインビボ選択ラウンド後、ファージをバルク増幅するか、または膵臓、腎臓、肺、および副腎からファージの単一のコロニーを増幅して、インビボスクリーニングのさらなるラウンドを行った。マウス膵臓からのバルク増幅およびコロニー増幅ファージはいずれも、選択ラウンドが増加するにつれて連続的な濃縮を示した(示していない)。3回の選択ラウンドの後、コロニー増幅したファージは、バルク増幅したファージよりほぼ1次数高い濃縮を示した(示していない)。
が含まれた。ファージ挿入物の増幅およびファージへのクローニングによって回収された膵ターゲティング配列には、
が含まれる。
Claims (15)
- 配列番号:47、および、配列番号:52〜54のいずれかより選択される脂肪組織ターゲティング配列を含む、大きさが10アミノ酸以下の単離ペプチド。
- 大きさが7アミノ酸以下の、請求項1記載の単離ペプチド。
- 分子に結合している、請求項1〜2のいずれか一項記載の単離ペプチド。
- 分子が、薬物、化学療法剤、放射性同位体、アポトーシス促進剤、抗血管新生剤、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、細胞毒性剤、ペプチド、タンパク質、抗生物質、抗体、抗体のFab断片、造影剤、生存因子、抗アポトーシス剤、ホルモンアンタゴニスト、又は抗原である、請求項3記載の単離ペプチド。
- アポトーシス促進剤が、グラミシジン、マガイニン、メリチン、デフェンシン(defensin)、セクロピン(cecropin)、(KLAKLAK)2(配列番号:1)、(KLAKKLA)2(配列番号:2)、(KAAKKAA)2(配列番号:3)、または(KLGKKLG)3(配列番号:4)である、請求項4記載の単離ペプチド。
- 高分子複合体に結合している、請求項1〜2のいずれか一項記載の単離ペプチド。
- 複合体が、ウイルス、バクテリオファージ、細菌、リポソーム、微粒子、磁性ビーズ、酵母細胞、哺乳動物細胞、又は細胞である、請求項6記載の単離ペプチド。
- 真核生物発現ベクターに結合している、請求項6記載の単離ペプチド。
- ベクターが遺伝子治療ベクターである、請求項8記載の単離ペプチド。
- 単離ペプチドが、配列番号:47、および、配列番号:52〜54のいずれかより選択される脂肪組織ターゲティング配列からなる、単離ペプチドと選択的に結合する抗体。
- 遺伝子治療ベクターであって、ここで、該遺伝子治療ベクターが、表面タンパク質の一部としてターゲティングペプチド配列を発現し、該ターゲティングペプチドが、配列番号:47、および、配列番号:52〜54のいずれかより選択される脂肪組織ターゲティング配列を含む、大きさが10アミノ酸以下のペプチドである、遺伝子治療ベクター。
- 疾患を治療するための薬学的組成物の調製における薬剤の使用であって、該薬剤を請求項1〜2のいずれか一項記載のペプチドに結合させて、脂肪組織へのターゲティング送達のための複合体を形成させる、使用。
- 薬剤が、造影剤、薬物、化学療法剤、放射性同位体、アポトーシス促進剤、抗血管新生剤、酵素、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、細胞毒性剤、ペプチド、タンパク質、抗生物質、抗体、抗体のFab断片、抗原、生存因子、抗アポトーシス剤、ホルモンアンタゴニスト、ウイルス、バクテリオファージ、細菌、リポソーム、微粒子、磁性ビーズ、微小装置、酵母細胞、哺乳動物細胞、細胞、又は発現ベクターである、請求項12記載の使用。
- 肥満の治療のための、請求項12記載の使用。
- アポトーシス促進剤が、グラミシジン、マガイニン、メリチン、デフェンシン、セクロピン、(KLAKLAK)2(配列番号:1)、(KLAKKLA)2(配列番号:2)、(KAAKKAA)2(配列番号:3)、または(KLGKKLG)3(配列番号:4)である、請求項13記載の使用。
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