JP5589274B2 - Immune inducer - Google Patents
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Description
本発明は、癌の治療及び/又は予防剤等として有用な新規な免疫誘導剤に関する。 The present invention relates to a novel immunity-inducing agent useful as a therapeutic and / or preventive agent for cancer.
癌は全死亡原因の第一位を占める疾患であり、現在行われている治療は手術療法を主体に放射線療法と化学療法を組み合わせたものである。近年の新しい手術法の開発や新たな抗癌剤の発見にも関わらず、一部の癌を除いて、癌の治療成績はあまり向上していないのが現状である。近年、分子生物学や癌免疫学の進歩で癌に反応する細胞障害性T細胞により認識される癌抗原や癌抗原をコードする遺伝子が同定されてき、抗原特異性免疫療法への期待が高まっている(非特許文献1を参照)。免疫療法においては、副作用を軽減するため、その抗原として認識されるペプチド又はタンパクは、正常細胞にはほとんど存在せず、癌細胞に特異的に存在していることが必要とされる。1991年、ベルギーLudwig研究所のBoonらは自己癌細胞株と癌反応性T細胞を用いたcDNA発現クローニング法によりCD8陽性T細胞が認識するヒトメラノーマ抗原MAGE1を単離した(非特許文献2を参照)。その後、癌患者の生体内で自己の癌に反応して産生される抗体が認識する腫瘍抗原を遺伝子の発現クローニングの手法を取り入れて同定する、SEREX(serological identifications of antigens by recombinant expression cloning)法が報告され(非特許文献3;特許文献1)、各種癌抗原が単離されてきた(非特許文献4−9を参照)。その一部をターゲットにして癌免疫療法の臨床試験が開始されている。 Cancer is the leading cause of all deaths, and the current treatment is a combination of radiation therapy and chemotherapy, mainly surgery. Despite the recent development of new surgical methods and the discovery of new anti-cancer drugs, the therapeutic results of cancer have not improved much except for some cancers. In recent years, advances in molecular biology and cancer immunology have identified cancer antigens recognized by cytotoxic T cells that respond to cancer and genes encoding cancer antigens, and expectations for antigen-specific immunotherapy have increased. (See Non-Patent Document 1). In immunotherapy, in order to reduce side effects, peptides or proteins that are recognized as antigens are hardly present in normal cells, and are required to be specifically present in cancer cells. In 1991, Boon et al., Ludwig Laboratories, Belgium, isolated human melanoma antigen MAGE1 recognized by CD8 positive T cells by cDNA expression cloning using autologous cancer cell lines and cancer reactive T cells (see Non-Patent Document 2). reference). Subsequently, the SEREX (serological identifications of antigens by recombinant expression cloning) method is used to identify tumor antigens recognized by antibodies produced in response to own cancer in the body of cancer patients by incorporating gene expression cloning techniques. It has been reported (Non-Patent Document 3; Patent Document 1), and various cancer antigens have been isolated (see Non-Patent Documents 4-9). Clinical trials of cancer immunotherapy have been started targeting a part of them.
一方、ヒトと同様、イヌやネコにも乳腺腫瘍、扁平上皮癌など多数の腫瘍が知られており、イヌやネコの疾病統計でも上位にランクされている。しかしながらイヌやネコの癌に対する有効な治療薬、予防薬および診断薬は現在のところ存在しない。大部分のイヌやネコの腫瘍は、進行して腫瘤が大きくなってから飼い主が気付くケースがほとんどで、来院して外科的手術により切除したり、人体薬(抗癌剤など)を投与しても、すでに手遅れで処置後まもなく死亡することが多い。このような現状の中で、イヌやネコに有効な癌の治療薬、予防薬および診断薬が入手可能になれば、イヌの癌に対する用途が開かれると期待される。 On the other hand, as in humans, dogs and cats are known to have a large number of tumors such as breast tumors and squamous cell carcinomas, and are ranked high in the disease statistics of dogs and cats. However, there are currently no effective therapeutic, prophylactic and diagnostic agents for canine and feline cancer. Most dogs and cat tumors are noticed by the owner after the tumor has progressed and the tumor has grown, and even if they come to the hospital and are removed by surgery or administered human drugs (such as anticancer drugs) Already too late to die soon after treatment. Under such circumstances, if cancer therapeutic agents, preventive agents and diagnostic agents effective for dogs and cats become available, it is expected that the use for canine cancer will be opened.
本発明の目的は、癌の治療及び/又は予防剤等として有用な新規な免疫誘導剤を提供することである。 An object of the present invention is to provide a novel immunity-inducing agent useful as a therapeutic and / or preventive agent for cancer.
本願発明者らは、鋭意研究の結果、イヌ精巣由来cDNAライブラリーと担癌犬の血清を用いたSEREX法により、担癌生体由来の血清中に存在する抗体と結合するタンパク質をコードするcDNAを取得し、そのcDNAを基にして、配列番号2で示されるアミノ酸配列を有するイヌカルメジンタンパクを作製した。また、取得した遺伝子のヒト相同性遺伝子を基にして、配列番号4で示されるアミノ酸配列を有するヒトカルメジンタンパクを作製した。そして、これらカルメジンタンパクを生体に投与することによって、生体内に免疫細胞を誘導することができること及び既に生じている腫瘍を退縮させることができることを見出し、本願発明を完成した。 As a result of diligent research, the inventors of the present application have obtained a cDNA encoding a protein that binds to an antibody present in serum derived from a cancer-bearing organism by the SEREX method using a dog testis-derived cDNA library and the serum of a cancer-bearing dog. Obtained and based on the cDNA, a canine carmedin protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 was prepared. Moreover, based on the human homologous gene of the acquired gene, the human calmedin protein which has an amino acid sequence shown by sequence number 4 was produced. The inventors have found that by administering these carmedin proteins to a living body, immune cells can be induced in the living body and that an existing tumor can be regressed, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明は、以下の(a)及び(b)のいずれかのポリペプチドであって免疫誘導活性を有するポリペプチド又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクターを有効成分として含有する癌の治療及び/又は予防剤を提供する:(a) 配列表の配列番号2又は4に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、(b) (a)のポリペプチドと89%以上の相同性を有するポリペプチド。 That is, the present invention includes a polypeptide having any of the following (a) and (b) having immunity-inducing activity or a polynucleotide encoding the polypeptide, and expressing the polypeptide in vivo: Provided is a cancer therapeutic and / or prophylactic agent containing a possible recombinant vector as an active ingredient: (a) a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4 in the sequence listing, (b) (a) polypeptides and 89% or more homology polypeptides have a.
本発明により、癌の治療及び/又は予防等に有用な新規な免疫誘導剤が提供された。下記実施例において具体的に示されるように、本発明で用いられるポリペプチドを担癌イヌに投与すると、該担癌イヌ体内において免疫細胞を誘導することができ、さらに、既に生じている癌を縮小もしくは退縮させることができる。従って、該ポリペプチドは癌の治療や予防に有用である。 According to the present invention, a novel immunity-inducing agent useful for cancer treatment and / or prevention has been provided. As specifically shown in the following Examples, when the polypeptide used in the present invention is administered to a cancer-bearing dog, immune cells can be induced in the cancer-bearing dog body, Can be reduced or retracted. Therefore, the polypeptide is useful for treating or preventing cancer.
本発明の免疫誘導剤に有効成分として含まれるポリペプチドとしては、以下のものが挙げられる。なお、本発明において、「ポリペプチド」とは、複数のアミノ酸がペプチド結合することによって形成される分子をいい、構成するアミノ酸数が多いポリペプチド分子のみならず、アミノ酸数が少ない低分子量の分子(オリゴペプチド)や、全長タンパク質も包含され、本発明では配列番号2又は4に示すアミノ酸配列を有するカルメジンの全長タンパク質も包含される。
(a) 配列表の配列番号2又は4に示されるアミノ酸配列を有し、免疫誘導活性を有するポリペプチド。
(b) (a)のポリペプチドと89%以上の相同性を有し、免疫誘導活性を有するポリペプチド。
Examples of the polypeptide contained as an active ingredient in the immunity-inducing agent of the present invention include the following. In the present invention, “polypeptide” refers to a molecule formed by peptide bonding of a plurality of amino acids, and not only a polypeptide molecule having a large number of amino acids but also a low molecular weight molecule having a small number of amino acids. (Oligopeptide) and full-length protein are also included. In the present invention, the full-length protein of carmedin having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4 is also included.
(a) possess an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4 in the Sequence Listing, the polypeptide having immunity-inducing activity.
(b) has a polypeptide 89% or more homology (a), the polypeptide having an immunity-inducing activity.
なお、本発明において、「アミノ酸配列を有する」とは、アミノ酸残基がそのような順序で配列しているという意味である。従って、例えば、「配列番号2で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド」とは、配列番号2に示されるMet His Phe Gln・・(中略)・・Val Arg Lys Gluのアミノ酸配列を持つ、610アミノ酸残基のサイズのポリペプチドを意味する。また、例えば、「配列番号2で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド」を「配列番号2のポリペプチド」と略記することがある。「塩基配列を有する」という表現についても同様である。 In the present invention, “having an amino acid sequence” means that amino acid residues are arranged in such an order. Thus, for example, “a polypeptide having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2” means 610 amino acids having the amino acid sequence of Met His Phe Gln ··· (Omitted) ·· Val Arg Lys Glu shown by SEQ ID NO: 2 By a residue size polypeptide is meant. In addition, for example, “polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2” may be abbreviated as “polypeptide of SEQ ID NO: 2”. The same applies to the expression “having a base sequence”.
ここで、「免疫誘導活性」とは、生体内でインターフェロン等のサイトカインを分泌する免疫細胞を誘導する能力を意味する。ポリペプチドが免疫誘導活性を有するか否かは、例えば公知のエリスポットアッセイ等を用いて確認することができる。具体的には、例えば下記実施例に記載されるように、免疫誘導活性を評価すべきポリペプチドを投与した生体から末梢血単核球等の細胞を得て、該細胞を該ポリペプチドと共存培養し、該細胞からのサイトカイン産生量を特異抗体を用いて測定することにより、該細胞中の免疫細胞数を測定することができるので、これにより免疫誘導活性を評価することができる。また、下記実施例に記載されるように、配列番号2又は4のアミノ酸配列を基に作製した組換えポリペプチドを担癌生体に投与すると、その免疫誘導活性により腫瘍を退縮させることもできる。よって、上記免疫誘導活性は、配列番号2又は4のポリペプチドを発現する癌細胞の増殖を抑制し又は癌組織(腫瘍)を縮小若しくは消滅させる能力(以下、「抗腫瘍活性」という)として評価することもできる。ポリペプチドの抗腫瘍活性は、例えば下記実施例に具体的に記載されるように、実際に該ポリペプチドを担癌生体に投与して腫瘍が縮小等されるか否かを調べることよって確認することができる。また、該ポリペプチドで刺激したT細胞(すなわち、該ポリペプチドを提示する抗原提示細胞と接触させたT細胞)が、生体外で腫瘍細胞に対して細胞障害活性を示すか否かを調べることによって、ポリペプチドの抗腫瘍活性を評価することもできる。T細胞と抗原提示細胞との接触は、後述するように、両者を液体培地中で共存培養することにより行なうことができる。細胞障害活性の測定は、例えばInt.J.Cancer,58:p317,1994に記載された51Crリリースアッセイと呼ばれる公知の方法により行なうことができる。ポリペプチドを癌の治療及び/又は予防用途に用いる場合には、特に限定されないが、抗腫瘍活性を指標として免疫誘導活性を評価することが好ましい。 Here, “immunity-inducing activity” means the ability to induce immune cells that secrete cytokines such as interferon in vivo. Whether or not the polypeptide has immunity-inducing activity can be confirmed using, for example, a known ELISPOT assay. Specifically, for example, as described in the Examples below, cells such as peripheral blood mononuclear cells are obtained from a living body administered with a polypeptide whose immunity-inducing activity is to be evaluated, and the cells coexist with the polypeptide. By culturing and measuring the amount of cytokine production from the cells using a specific antibody, the number of immune cells in the cells can be measured, whereby the immunity-inducing activity can be evaluated. In addition, as described in the Examples below, when a recombinant polypeptide prepared based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4 is administered to a cancer-bearing organism, the tumor can be regressed due to its immunity-inducing activity. Therefore, the immunity induction activity is evaluated as the ability to suppress the growth of cancer cells expressing the polypeptide of SEQ ID NO: 2 or 4 or to reduce or eliminate the cancer tissue (tumor) (hereinafter referred to as “antitumor activity”). You can also The antitumor activity of a polypeptide is confirmed, for example, by actually administering the polypeptide to a cancer-bearing organism and examining whether the tumor is reduced or the like, as specifically described in the Examples below. be able to. Also, examining whether T cells stimulated with the polypeptide (that is, T cells brought into contact with antigen-presenting cells presenting the polypeptide) exhibit cytotoxic activity against tumor cells in vitro. The antitumor activity of the polypeptide can also be evaluated. As will be described later, the T cell and the antigen-presenting cell can be contacted by co-culturing both in a liquid medium. The cytotoxic activity can be measured by a known method called a 51 Cr release assay described in, for example, Int. J. Cancer, 58: p317,1994. When the polypeptide is used for cancer treatment and / or prevention, it is not particularly limited, but it is preferable to evaluate immunity induction activity using antitumor activity as an index.
配列表の配列番号2及び4にそれぞれ示されるアミノ酸配列は、イヌ精巣由来cDNAライブラリーと担癌犬の血清を用いたSEREX法により、担癌犬由来の血清中に特異的に存在する抗体と結合するポリペプチド及びそのヒト相同因子として単離された、カルメジン(Calmegin)タンパクのアミノ酸配列である(実施例1参照)。カルメジンは精細胞の分化時期に特異的に発現するタンパクとして同定され、in vitroでシャペロン活性を示す。精巣内のみで発現し、成熟***では消失するタンパク質であることから、精細胞分化に関与するタンパク質を折りたたむ機能を持つと考えられている(非特許文献10、井上直和・山口亮・伊川正人 蛋白質核酸酵素 vol.50 No.11 1405-1412)。しかし、該タンパクが癌に発現し、治療や予防に有用であるという報告はない。なお、イヌカルメジン遺伝子とヒトカルメジン遺伝子の相同性は、塩基配列で90%、アミノ酸配列で89%である。 The amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2 and 4, respectively, are antibodies that are specifically present in sera from cancer-bearing dogs by the SEREX method using canine testis-derived cDNA library and sera from cancer-bearing dogs. It is the amino acid sequence of the Calmegin protein isolated as a binding polypeptide and its human homologous factor (see Example 1). Carmedin has been identified as a protein that is specifically expressed during the differentiation stage of sperm cells and exhibits chaperone activity in vitro. Since it is a protein that is expressed only in the testis and disappears in mature sperm, it is considered to have a function of folding proteins involved in sperm cell differentiation (Non-Patent Document 10, Naokazu Inoue, Ryo Yamaguchi, Masato Igawa Protein nucleic acid enzyme vol.50 No.11 1405-1412). However, there is no report that the protein is expressed in cancer and is useful for treatment or prevention. The homology between the canine carmedin gene and the human carmedin gene is 90% for the base sequence and 89% for the amino acid sequence.
上記(a)のポリペプチドは、配列番号2又は4で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、免疫誘導活性を有するものである。なお、この分野で公知の通り、約7アミノ酸残基以上のポリペプチドであれば抗原性を発揮できる。従って、配列番号2又は4のアミノ酸配列中の連続する9アミノ酸残基以上のポリペプチドであれば、免疫誘導活性を有し得る。ただし、生体中で抗原物質に対して生産される抗体がポリクローナル抗体であることに鑑みれば、アミノ酸残基の数が多い方が、抗原物質上の種々の部位を認識する、より多くの種類の抗体を誘導できるので、ひいては免疫誘導活性を高めることができると考えられる。 The polypeptides of (a) is a polypeptide de having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4, and has an immunity-inducing activity. Na us, as is known in the art, the antigenic can exhibit if the polypeptide than about 7 amino acid residues. Therefore, if the contiguous nine amino acid residues or more polypeptides in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4, Ru can have an immunity-inducing activity. However, in view of the fact that an antibody produced against an antigenic substance in a living body is a polyclonal antibody, the larger the number of amino acid residues, the more types of antigens that recognize various sites on the antigenic substance. Since antibodies can be induced, immunity-inducing activity can be enhanced .
また、癌抗原ポリペプチドを投与することによる免疫誘導の原理として、ポリペプチドが抗原提示細胞に取り込まれ、その後該細胞内でペプチダーゼによる分解を受けてより小さな断片となり、該細胞の表面上に提示され、それを細胞障害性T細胞等が認識し、その抗原を提示している細胞を選択的に殺していくということが知られている。 In addition, as a principle of immunity induction by administering a cancer antigen polypeptide, the polypeptide is taken up by antigen-presenting cells and then decomposed by peptidase in the cells to become smaller fragments and presented on the surface of the cells It is known that cytotoxic T cells and the like recognize this and selectively kill cells presenting the antigen.
抗原提示細胞の表面上に提示されるポリペプチドのサイズは比較的小さく、アミノ酸数で7〜30程度である。従って、抗原提示細胞上に提示させるという観点からは、配列番号2又は4で示されるアミノ酸配列中の連続する9〜30程度のアミノ酸から成るものであれば十分である。これら比較的小さなサイズのポリペプチドは、抗原提示細胞内に取り込まれることなく、直接抗原提示細胞上の細胞表面に提示される場合もある。 The size of the polypeptide displayed on the surface of the antigen-presenting cell is relatively small, and is about 7 to 30 amino acids. Therefore, from the viewpoint of presentation on antigen presenting cells is sufficient as long as it consists of successive 9 to 30 about amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 2 or 4. These relatively small polypeptides may be presented directly on the cell surface on antigen-presenting cells without being taken up into antigen-presenting cells.
もっとも、上記した通り、抗原提示細胞に取り込まれたポリペプチドは、該細胞内のペプチダーゼによりランダムな位置で切断を受けて、種々のポリペプチド断片が生じ、これらのポリペプチド断片が抗原提示細胞表面上に提示されるので、配列番号2又は4の全長領域のように大きなサイズのポリペプチドを投与すれば、抗原提示細胞内での分解によって、抗原提示細胞を介する免疫誘導に有効なポリペプチド断片が必然的に生じる。従って、抗原提示細胞を介する免疫誘導にとっても、サイズの大きなポリペプチドを好ましく用いることができる。 However, as described above, polypeptides taken into antigen-presenting cells are cleaved at random positions by peptidases in the cells to produce various polypeptide fragments, and these polypeptide fragments are bound to the surface of the antigen-presenting cell. As shown above, when a polypeptide having a large size such as the full length region of SEQ ID NO: 2 or 4 is administered, the polypeptide fragment is effective for inducing immunity via antigen-presenting cells by degradation within the antigen-presenting cells. Inevitably occurs. Therefore, also for immune induction via antigen-presenting cells, Ru can be preferably used a large polypeptide size.
上記(b)のポリペプチドは、上記(a)のポリペプチドのうちの少数のアミノ酸残基が置換し、欠失し及び/又は挿入されたポリペプチドであって、元の配列と89%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは98%以上の相同性を有し、かつ、免疫誘導活性を有するポリペプチドである。一般に、タンパク質抗原において、該タンパク質のアミノ酸配列のうち少数のアミノ酸残基が置換され、欠失され又は挿入された場合であっても、元のタンパク質とほぼ同じ抗原性を有している場合があることは当業者において広く知られている。従って、上記(b)のポリペプチドも免疫誘導活性を発揮し得るので、本発明の免疫誘導剤の調製に用いることができる。また、上記(b)のポリペプチドは、配列番号2又は4で示されるアミノ酸配列のうち、1個ないし数個のアミノ酸残基が置換し、欠失し及び/又は挿入されたポリペプチドであることも好ましい。
The polypeptide (b) is a polypeptide in which a small number of amino acid residues in the polypeptide (a) are substituted, deleted and / or inserted, and is 89 % or more of the original sequence. The polypeptide has a homology of preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and still more preferably 98% or more, and has immunity-inducing activity. In general, a protein antigen may have almost the same antigenicity as the original protein even if a small number of amino acid residues in the amino acid sequence of the protein are substituted, deleted or inserted. It is well known to those skilled in the art. Therefore, since the polypeptide (b) can also exert immunity-inducing activity, it can be used for the preparation of the immunity-inducing agent of the present invention. The polypeptide (b) is a polypeptide in which one to several amino acid residues are substituted, deleted and / or inserted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4. It is also preferable.
ここで、アミノ酸配列の「相同性」とは、比較すべき2つのアミノ酸配列のアミノ酸残基ができるだけ多く一致するように両アミノ酸配列を整列させ、一致したアミノ酸残基数を全アミノ酸残基数で除したものを百分率で表したものである。上記整列の際には、必要に応じ、比較する2つの配列の一方又は双方に適宜ギャップを挿入する。このような配列の整列化は、例えばBLAST、FASTA、CLUSTAL W等の周知のプログラムを用いて行なうことができる。ギャップが挿入される場合、上記全アミノ酸残基数は、1つのギャップを1つのアミノ酸残基として数えた残基数となる。このようにして数えた全アミノ酸残基数が、比較する2つの配列間で異なる場合には、相同性(%)は、長い方の配列の全アミノ酸残基数で、一致したアミノ酸残基数を除して算出される。 Here, the “homology” of amino acid sequences means that both amino acid sequences are aligned so that the amino acid residues of the two amino acid sequences to be compared match as much as possible, and the number of matched amino acid residues is the total number of amino acid residues. The percentage divided by is expressed as a percentage. In the above alignment, a gap is appropriately inserted in one or both of the two sequences to be compared as necessary. Such sequence alignment can be performed using a known program such as BLAST, FASTA, CLUSTAL W, and the like. When gaps are inserted, the total number of amino acid residues is the number of residues obtained by counting one gap as one amino acid residue. When the total number of amino acid residues counted in this way is different between the two sequences to be compared, the homology (%) is the total number of amino acid residues in the longer sequence, and the number of amino acid residues matched. Is calculated by dividing.
なお、天然のタンパク質を構成する20種類のアミノ酸は、低極性側鎖を有する中性アミノ酸(Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro)、親水性側鎖を有する中性アミノ酸(Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr Cys)、酸性アミノ酸(Asp, Glu)、塩基性アミノ酸(Arg, Lys, His)、芳香族アミノ酸(Phe, Tyr, Trp)のように類似の性質を有するものにグループ分けでき、これらの間での置換であればポリペプチドの性質が変化しないことが多いことが知られている。従って、本発明の上記(a)のポリペプチド中のアミノ酸残基を置換する場合には、これらの各グループの間で置換することにより、免疫誘導活性を維持できる可能性が高くなる。 The 20 amino acids constituting the natural protein are neutral amino acids having low side chains (Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro), and neutral amino acids having hydrophilic side chains (Asn , Gln, Thr, Ser, Tyr Cys), acidic amino acids (Asp, Glu), basic amino acids (Arg, Lys, His), and aromatic amino acids (Phe, Tyr, Trp) It is known that the properties of a polypeptide often do not change as long as it can be grouped and the substitution between them. Therefore, when the amino acid residue in the polypeptide (a) of the present invention is substituted, the possibility that the immunity-inducing activity can be maintained is increased by substitution between these groups.
上記したポリペプチドは、例えば、Fmoc法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、tBoc法(t―ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法に従って合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して常法により合成することもできる。また、公知の遺伝子工学的手法を用いて、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製し、該ポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込んで宿主細胞に導入し、該宿主細胞中でポリペプチドを生産させることにより、目的とするポリペプチドを得ることができる。 The above-described polypeptide can be synthesized according to a chemical synthesis method such as Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) or tBoc method (t-butyloxycarbonyl method). Moreover, it can also synthesize | combine by a conventional method using various commercially available peptide synthesizers. In addition, using a known genetic engineering technique, a polynucleotide encoding the above polypeptide is prepared, the polynucleotide is incorporated into an expression vector and introduced into a host cell, and the polypeptide is produced in the host cell. Thus, the desired polypeptide can be obtained.
上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法や市販の核酸合成機を用いた常法により、容易に調製することができる。例えば、配列番号1の塩基配列を有するDNAは、イヌ染色体DNA又はcDNAライブラリーを鋳型として使用し、配列番号1に記載した塩基配列を増幅できるように設計した一対のプライマーを用いてPCRを行うことにより調製することができる。配列番号3の塩基配列を有するDNAであれば、上記鋳型としてヒト染色体DNA又はcDNAライブラリーを使用することで同様に調製できる。PCRの反応条件は適宜設定することができ、例えば、94℃で30秒間(変性)、55℃で30秒〜1分間(アニーリング)、72℃で2分間(伸長)からなる反応行程を1サイクルとして、例えば30サイクル行った後、72℃で7分間反応させる条件などを挙げることができるが、これに限定されない。また、本明細書中の配列表の配列番号1ないし4に示される塩基配列及びアミノ酸配列の情報に基づいて、適当なプローブやプライマーを調製し、それを用いてイヌやヒトなどのcDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、所望のDNAを単離することができる。cDNAライブラリーは、配列番号2又は4のタンパク質を発現している細胞、器官又は組織から作製することが好ましい。上記したプローブ又はプライマーの調製、cDNAライブラリーの構築、cDNAライブラリーのスクリーニング、ならびに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、モレキュラークロニング第2版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラバイオロジー等に記載された方法に準じて行うことができる。このようにして得られたDNAから、上記(a)のポリペプチドをコードするDNAを得ることができる。また、各アミノ酸をコードするコドンは公知であるから、特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの塩基配列は容易に特定することができる。従って、上記した(b)のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列も容易に特定することができるので、そのようなポリヌクレオチドも、市販の核酸合成機を用いて常法により容易に合成することができる。 The polynucleotide encoding the above-mentioned polypeptide can be easily prepared by a known genetic engineering technique or a conventional method using a commercially available nucleic acid synthesizer. For example, DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 1 is subjected to PCR using a canine chromosomal DNA or cDNA library as a template and a pair of primers designed to amplify the base sequence described in SEQ ID NO: 1. Can be prepared. Any DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 can be prepared in the same manner by using human chromosomal DNA or cDNA library as the template. PCR reaction conditions can be set as appropriate. For example, one cycle of a reaction step consisting of 94 ° C. for 30 seconds (denaturation), 55 ° C. for 30 seconds to 1 minute (annealing), and 72 ° C. for 2 minutes (extension) Examples of the conditions include, but are not limited to, conditions of reacting at 72 ° C. for 7 minutes after 30 cycles. In addition, appropriate probes and primers are prepared based on the nucleotide sequence and amino acid sequence information shown in SEQ ID NOs: 1 to 4 in the sequence listing in the present specification, and cDNA libraries such as dogs and humans are prepared using the probes and primers. The desired DNA can be isolated by screening for. The cDNA library is preferably prepared from cells, organs or tissues expressing the protein of SEQ ID NO: 2 or 4. Operations such as the preparation of the probe or primer, construction of the cDNA library, screening of the cDNA library, and cloning of the target gene are known to those skilled in the art. For example, Molecular Cloning 2nd Edition, Current Protocols, It can be carried out according to the method described in In-Molecular Biology and the like. From the DNA thus obtained, DNA encoding the polypeptide (a) can be obtained. In addition, since the codons encoding each amino acid are known, the base sequence of a polynucleotide encoding a specific amino acid sequence can be easily specified. Accordingly, since it is possible to easily identify the base sequence of a polynucleotide encoding a polypeptide de of the above (b), also such polynucleotides, easily synthesized by a conventional method using a commercially available nucleic acid synthesizer be able to.
上記宿主細胞としては、上記ポリペプチドを発現可能な細胞であればいかなるものであってもよく、原核細胞の例としては大腸菌など、真核細胞の例としてはサル腎臓細胞COS 1、チャイニーズハムスター卵巣細胞CHO等の哺乳動物培養細胞、出芽酵母、***酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。 The host cell may be any cell that can express the polypeptide. Examples of prokaryotic cells include Escherichia coli, and examples of eukaryotic cells include monkey kidney cell COS 1 and Chinese hamster ovary. Examples include, but are not limited to, cultured mammalian cells such as cell CHO, budding yeast, fission yeast, silkworm cells, and Xenopus egg cells.
宿主細胞として原核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、原核細胞中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、DNAクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターを用いる。大腸菌用発現ベクターとしては、pUC系、pBluescriptII、pET発現システム、pGEX発現システムなどが例示できる。上記ポリペプチドをコードするDNAをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで原核宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、前記DNAがコードしているポリペプチドを原核宿主細胞中で発現させることができる。この際、該ポリペプチドを、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることもできる。 When a prokaryotic cell is used as a host cell, an expression vector having an origin, a promoter, a ribosome binding site, a DNA cloning site, a terminator and the like that can replicate in the prokaryotic cell is used as the expression vector. Examples of the expression vector for E. coli include pUC system, pBluescriptII, pET expression system, pGEX expression system and the like. When the DNA encoding the above polypeptide is incorporated into such an expression vector, a prokaryotic host cell is transformed with the vector, and the resulting transformant is cultured, the polypeptide encoded by the DNA is prokaryotic. It can be expressed in a host cell. In this case, the polypeptide can also be expressed as a fusion protein with another protein.
宿主細胞として真核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、プロモーター、スプライシング領域、ポリ(A)付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターを用いる。そのような発現ベクターとしては、pKA1、pCDM8、pSVK3、pMSG、pSVL、pBK-CMV、pBK-RSV、EBVベクター、pRS、pcDNA3、pMSG、pYES2等が例示できる。上記と同様に、上記ポリペプチドをコードするDNAをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで真核宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、前記DNAがコードしているポリペプチドを真核宿主細胞中で発現させることができる。発現ベクターとしてpIND/V5-His、pFLAG-CMV-2、pEGFP-N1、pEGFP-C1等を用いた場合には、Hisタグ、FLAGタグ、mycタグ、HAタグ、GFPなど各種タグを付加した融合タンパク質として、上記ポリペプチドを発現させることができる。 When a eukaryotic cell is used as a host cell, an expression vector for a eukaryotic cell having a promoter, a splicing region, a poly (A) addition site and the like is used as an expression vector. Examples of such expression vectors include pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV vector, pRS, pcDNA3, pMSG, pYES2, and the like. In the same manner as described above, a DNA encoding the above polypeptide is incorporated into such an expression vector, and after transforming a eukaryotic host cell with the vector, the resulting transformant is cultured, and the DNA encodes. Can be expressed in eukaryotic host cells. When pIND / V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1, etc. are used as an expression vector, fusion with various tags such as His tag, FLAG tag, myc tag, HA tag, GFP The polypeptide can be expressed as a protein.
発現ベクターの宿主細胞への導入は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、DEAEデキストラン法等の周知の方法を用いることができる。 For introducing the expression vector into the host cell, a well-known method such as electroporation, calcium phosphate method, liposome method, DEAE dextran method or the like can be used.
宿主細胞から目的のポリペプチドを単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒分別沈殿法、透析、遠心分離、限外ろ過、ゲルろ過、SDS-PAGE、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等が挙げられるが、これらに限定されない。 Isolation and purification of the polypeptide of interest from the host cell can be performed by combining known separation operations. For example, treatment with denaturing agents and surfactants such as urea, ultrasonic treatment, enzyme digestion, salting out and solvent fractional precipitation, dialysis, centrifugation, ultrafiltration, gel filtration, SDS-PAGE, isoelectric focusing, Examples include, but are not limited to, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, affinity chromatography, and reverse phase chromatography.
以上の方法によって得られるポリペプチドには、上述した通り、他の任意のタンパク質との融合タンパク質の形態にあるものも含まれる。例えば、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)やHisタグとの融合タンパク質などが例示できる。さらに、形質転換細胞で発現されたポリペプチドは、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。このような翻訳後修飾されたポリペプチドも、免疫誘導活性を有する限り、本発明の範囲に含まれる。この様な翻訳修飾としては、N末端メチオニンの脱離、N末端アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテアーゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化などが例示できる。 Polypeptides obtained by the above methods include those in the form of fusion proteins with other arbitrary proteins as described above. For example, glutathione-S-transferase (GST), a fusion protein with a His tag, and the like can be exemplified . Et al is a polypeptide expressed in transformed cells after translation may be subject to various modifications within the cell. Such post-translationally modified polypeptides are also included in the scope of the present invention as long as they have immunity-inducing activity. Examples of such translation modification include elimination of N-terminal methionine, N-terminal acetylation, sugar chain addition, limited degradation by intracellular protease, myristoylation, isoprenylation, phosphorylation, and the like.
下記実施例に具体的に記載される通り、上記した免疫誘導活性を有するポリペプチドを担癌生体に投与すると、既に生じている腫瘍を退縮させることができる。本発明の免疫誘導剤は、癌の治療及び/又は予防剤として用いられる。対象となる癌としては、配列番号2又は4のポリペプチドをコードする遺伝子を発現している癌であり、脳腫瘍、頭、首、肺、子宮又は食道の扁平上皮癌、メラノーマ、肺、乳または子宮の腺癌、腎癌、悪性混合腫瘍、肝細胞癌、基底細胞癌、勅細胞腫様歯肉腫、口腔内腫瘤、肛門周囲腺癌、肛門嚢腫瘤、肛門嚢アポクリン腺癌、セルトリ細胞腫、膣前庭癌、皮脂腺癌、皮脂腺上皮腫、脂腺腺腫、汗腺癌、鼻腔内腺癌、鼻腺癌、甲状腺癌、大腸癌、気管支腺癌、腺癌、腺管癌、乳腺癌、複合型乳腺癌、乳腺悪性混合腫瘍、乳管内乳頭状腺癌、線維肉腫、血管周皮腫、骨肉腫、軟骨肉腫、軟部組織肉腫、組織球肉腫、粘液肉腫、未分化肉腫、肺癌、肥満細胞腫、皮膚平滑筋腫、腹腔内平滑筋腫、平滑筋腫、慢性型リンパ球性白血病、リンパ腫、消化管型リンパ腫、消化器型リンパ腫、小〜中細胞型リンパ腫、副腎髄質腫瘍、顆粒膜細胞腫、褐色細胞腫、膀胱癌(移行上皮癌)、化膿性炎症、腹腔内肝臓腫瘍、肝臓癌、形質細胞腫、悪性血管外膜細胞腫、血管肉腫、肛門嚢腺癌、口腔癌、転移性悪性黒色腫、メラニン欠乏性悪性黒色腫、皮膚悪性黒色腫、悪性筋上皮腫、悪性精巣上皮腫、精細胞腫(セミノーマ)、大腸腺癌、胃腺癌、低グレード皮脂腺癌、耳垢腺癌、アポクリン腺癌、低分化型アポクリン汗腺癌、悪性線維性組織球腫、多発性骨髄腫、間葉系悪性腫瘍、脂肪肉腫、骨肉腫、起原不明の肉腫、軟部肉腫(紡錘形細胞腫瘍)、低分化肉腫、滑膜肉腫、血管肉腫、転移性悪性上皮腫瘍、管状乳腺腺癌、乳腺導管癌、炎症性乳癌、胚細胞腫、白血病、浸潤性毛包上皮腫、中細胞型リンパ腫、多中心型リンパ腫、骨肉腫(乳腺)、肥満細胞腫(Patnaik II型)、肥満細胞腫(Grade II)、平滑筋肉腫等を挙げることができるがこれらに限定されない。また、対象となる動物は、哺乳動物であり、特にヒト、イヌおよびネコが好ましい。 As specifically described in the following examples, when a polypeptide having the above-described immunity-inducing activity is administered to a cancer-bearing organism, a tumor that has already occurred can be regressed . The immunity-inducing agent of the present invention is used as a therapeutic and / or prophylactic agent for cancer . The target cancer is a cancer expressing a gene encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 2 or 4, and is a brain tumor, head, neck, lung, uterus or squamous cell carcinoma of the esophagus, melanoma, lung, breast or Uterine adenocarcinoma, renal cancer, malignant mixed tumor, hepatocellular carcinoma, basal cell carcinoma, pheochromocytoma-like gingival tumor, oral mass, perianal adenocarcinoma, anal cyst mass, anal sac apocrine adenocarcinoma, Sertoli cell tumor, Vaginal vestibular cancer, sebaceous gland cancer, sebaceous gland epithelioma, sebaceous gland adenoma, sweat gland cancer, intranasal adenocarcinoma, nasal gland cancer, thyroid cancer, colon cancer, bronchial adenocarcinoma, adenocarcinoma, ductal carcinoma, mammary carcinoma, combined mammary gland Cancer, malignant mixed mammary tumor, intraductal papillary adenocarcinoma, fibrosarcoma, hemangioperiosteum, osteosarcoma, chondrosarcoma, soft tissue sarcoma, histiocytic sarcoma, myxosarcoma, anaplastic sarcoma, lung cancer, mastocytoma, skin Leiomyoma, intraperitoneal leiomyoma, leiomyoma, chronic lymphocytic leukemia, lymphoma, Tubular lymphoma, gastrointestinal lymphoma, small to medium cell lymphoma, adrenal medullary tumor, granulosa cell tumor, pheochromocytoma, bladder cancer (transitional cell carcinoma), purulent inflammation, intraperitoneal liver tumor, liver cancer, Plasmacytoma, malignant adenocarcinoma, angiosarcoma, anal sac adenocarcinoma, oral cancer, metastatic malignant melanoma, melanin-deficient malignant melanoma, cutaneous malignant melanoma, malignant myoepitheloma, malignant testicular epithelioma, Seminoma, colon adenocarcinoma, gastric adenocarcinoma, low-grade sebaceous gland cancer, earwax adenocarcinoma, apocrine adenocarcinoma, poorly differentiated apocrine sweat gland carcinoma, malignant fibrous histiocytoma, multiple myeloma, mesenchymal malignant Tumor, liposarcoma, osteosarcoma, sarcoma of unknown origin, soft tissue sarcoma (spindle cell tumor), poorly differentiated sarcoma, synovial sarcoma, hemangiosarcoma, metastatic malignant epithelial tumor, tubular mammary adenocarcinoma, breast ductal carcinoma, inflammatory Breast cancer, germinoma, leukemia, invasive follicular epithelioma, medium cell Lymphoma, multicentric lymphoma, osteosarcoma (mammary gland), mastocytoma (Patnaik II type), mastocytoma (Grade II), there may be mentioned leiomyosarcoma, and the like. The target animal is a mammal, and humans, dogs and cats are particularly preferable.
本発明の免疫誘導剤の生体への投与経路は、経口投与でも非経口投与でもよいが、筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与等の非経口投与が好ましい。癌の治療目的で該免疫誘導剤を用いる場合には、抗癌作用を高めるため、下記実施例に記載するように、治療対象となる腫瘍の近傍の所属リンパ節に投与することもできる。投与量は、免疫誘導するのに有効な量であればよく、例えば癌の治療及び/又は予防に用いるのであれば、癌の治療及び/又は予防に有効な量であればよい。癌の治療及び/又は予防に有効な量は、腫瘍の大きさや症状等に応じて適宜選択されるが、通常、対象動物に対し1日当りの有効量として0.0001μg〜1000μg、好ましくは0.001μg〜1000μgであり、1回又は数回に分けて投与することができる。好ましくは、数回に分け、数日ないし数月おきに投与する。下記実施例に具体的に示されるとおり、本発明の免疫誘導剤は、既に形成されている腫瘍を退縮させることができる。従って、発生初期の少数の癌細胞にも抗癌作用を発揮し得るので、癌の発症前や癌の治療後に用いれば、癌の発症や再発を防止することができる。すなわち、本発明の免疫誘導剤は、癌の治療と予防の双方に有用である。 The administration route to the living body of the immunity-inducing agent of the present invention may be oral administration or parenteral administration, but parenteral administration such as intramuscular administration, subcutaneous administration, intravenous administration and intraarterial administration is preferred. When the immunity-inducing agent is used for the purpose of treating cancer, it can be administered to a regional lymph node in the vicinity of the tumor to be treated as described in the following examples in order to enhance the anticancer effect. The dose may be an amount effective for inducing immunity. For example, if it is used for the treatment and / or prevention of cancer, it may be an amount effective for the treatment and / or prevention of cancer. The effective amount for the treatment and / or prevention of cancer is appropriately selected according to the size and symptoms of the tumor, etc., but is usually 0.0001 μg to 1000 μg, preferably 0.001 μg It is 1000 μg and can be administered once or divided into several times. Preferably, it is divided into several times and administered every few days to several months. As specifically shown in the Examples below, the immunity-inducing agent of the present invention can regress tumors that have already formed. Therefore, since anticancer activity can be exerted on a small number of cancer cells at the early stage of development, onset and recurrence of cancer can be prevented if used before onset of cancer or after treatment of cancer. That is, the immunity-inducing agent of the present invention is useful for both treatment and prevention of cancer.
本発明の免疫誘導剤は、ポリペプチドのみから成っていてもよいし、各投与形態に適した、薬理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤等の添加剤を適宜混合させて製剤することもできる。製剤方法及び使用可能な添加剤は、医薬製剤の分野において周知であり、いずれの方法及び添加剤をも用いることができる。添加剤の具体例としては、生理緩衝液のような希釈剤;砂糖、乳糖、コーンスターチ、リン酸カルシウム、ソルビトール、グリシン等のような賦形剤;シロップ、ゼラチン、アラビアゴム、ソルビトール、ポリビニルクロリド、トラガント等のような結合剤;ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、タルク、シリカ等の滑沢剤等が挙げられるが、これらに限定されない。製剤形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などの経口剤、吸入剤、注射剤、座剤、液剤などの非経口剤などを挙げることができる。これらの製剤は一般的に知られている製法によって作ることができる。 The immunity-inducing agent of the present invention may consist only of a polypeptide, or may be appropriately mixed with additives such as pharmacologically acceptable carriers, diluents and excipients suitable for each administration form. It can also be formulated. Formulation methods and usable additives are well known in the field of pharmaceutical formulations, and any method and additive can be used. Specific examples of additives include diluents such as physiological buffers; excipients such as sugar, lactose, corn starch, calcium phosphate, sorbitol, glycine; syrup, gelatin, gum arabic, sorbitol, polyvinyl chloride, tragacanth, etc. Binders such as magnesium stearate, polyethylene glycol, talc, silica and the like, but are not limited thereto. Examples of the dosage form include oral preparations such as tablets, capsules, granules, powders, and syrups, and parenteral preparations such as inhalants, injections, suppositories, and liquids. These preparations can be made by generally known production methods.
本発明の免疫誘導剤は、生体内での免疫学的応答を強化することができる免疫増強剤と組み合わせて用いることができる。免疫増強剤は、本発明の免疫誘導剤に含まれていてもよいし、別個の組成物として本発明の免疫誘導剤と併用して患者に投与してもよい。 The immunity-inducing agent of the present invention can be used in combination with an immunity enhancing agent that can enhance the immunological response in vivo. The immunopotentiator may be contained in the immunity-inducing agent of the present invention, or may be administered to a patient in combination with the immunity-inducing agent of the present invention as a separate composition.
上記免疫増強剤としては、例えばアジュバントを挙げることができる。アジュバントは、抗原の貯蔵所(細胞外またはマクロファージ内)を提供し、マクロファージを活性化し、かつ特定組のリンパ球を刺激することにより、免疫学的応答を強化し得るので、抗癌作用を高めることができる。従って、特に、本発明の免疫誘導剤を癌の治療及び/又は予防に用いる場合、免疫誘導剤は、有効成分たる上記ポリペプチドに加えてさらにアジュバントを含むことが好ましい。多数の種類のアジュバントが当業界で周知であり、いずれのアジュバントでも用いることができる。アジュバントの具体例としては、MPL(SmithKline Beecham)、サルモネラ属のSalmonella minnesota Re 595リポ多糖類の精製および酸加水分解後に得られる同類物;QS21(SmithKline Beecham)、Quillja saponaria抽出物から精製される純QA−21サポニン;PCT出願WO96/33739(SmithKline Beecham)に記載されたDQS21;QS−7、QS−17、QS−18およびQS−L1(ソ(So)、外10名、「モレキュルズ・アンド・セル(Molecules and cells)」、1997年、第7巻、p.178−186);フロイントの不完全アジュバント;フロイントの完全アジュバント;ビタミンE;モンタニド;ミョウバン;CpGオリゴヌクレオチド(例えば、クレイグ(Kreig)、外7名、「ネイチャー(Nature)」、第374巻、p.546−549)を参照);ポリIC及びその誘導体(ポリICLC等)ならびにスクアレンおよび/またはトコフェロールのような生分解性油から調製される種々の油中水エマルションが挙げられる。中でも、フロイントの不完全アジュバント、モンタニド、ポリIC及びその誘導体並びにCpGオリゴヌクレオチドが好ましい。上記アジュバントとポリペプチドの混合比は、典型的には約1:10〜10:1,好ましくは約1:5〜5:1、さらに好ましくは約1:1である。ただし、アジュバントは上記例示に限定されず、当業界で公知の上記以外のアジュバントも本発明の免疫誘導剤を投与する際に用いられ得る(例えば、ゴッディング(Goding)著,「モノクローナル・アンチボディーズ:プリンシプル・アンド・プラクティス(Monoclonal Antibodies:Principles and Practice)」、第2版、1986年を参照)。ポリペプチドおよびアジュバントの混合物またはエマルションの調製方法は、予防接種の当業者には周知である。 Examples of the immune enhancer include an adjuvant. Adjuvants provide a reservoir of antigen (extracellular or within macrophages), enhance immunological responses by activating macrophages and stimulating specific sets of lymphocytes, thus enhancing anticancer effects be able to. Therefore, in particular, when the immunity-inducing agent of the present invention is used for the treatment and / or prevention of cancer, it is preferable that the immunity-inducing agent further contains an adjuvant in addition to the above polypeptide as an active ingredient. Many types of adjuvants are well known in the art, and any adjuvant can be used. Specific examples of adjuvants include MPL (SmithKline Beecham), Salmonella minnesota Re 595 lipopolysaccharide of the genus Salmonella and the like obtained after acid hydrolysis; QS21 (SmithKline Beecham), pure purified from Quillja saponaria extract QA-21 saponin; DQS21 described in PCT application WO96 / 33739 (SmithKline Beecham); QS-7, QS-17, QS-18 and QS-L1 (So, 10 others, “Molecules and Molecules and cells, 1997, 7, p. 178-186); Freund's incomplete adjuvant; Freund's complete adjuvant; Vitamin E; Montanide; Alum; CpG oligonucleotide (eg, Kreig) , And 7 others, see “Nature”, Vol. 374, pages 546-549)); Poly IC Beauty derivatives thereof (poly ICLC, etc.) and various water-in-oil emulsion prepared from squalene and / or biodegradable oil such as tocopherol. Of these, Freund's incomplete adjuvant, montanide, poly IC and derivatives thereof, and CpG oligonucleotides are preferred. The mixing ratio of the adjuvant to the polypeptide is typically about 1:10 to 10: 1, preferably about 1: 5 to 5: 1, more preferably about 1: 1. However, the adjuvant is not limited to the above examples, and other adjuvants known in the art may be used when administering the immunity-inducing agent of the present invention (for example, by Goding, “Monoclonal antibodies: (See Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2nd edition, 1986). Methods for preparing polypeptide and adjuvant mixtures or emulsions are well known to those skilled in vaccination.
また、上記免疫増強剤としては、上記アジュバント以外にも、対象の免疫応答を刺激する因子を用いることもできる。例えば、リンパ球や抗原提示細胞を刺激する特性を有する各種サイトカインを免疫増強剤として本発明の免疫誘導剤と組み合わせて用いることができる。そのような免疫学的応答を増強可能な多数のサイトカインが当業者に公知であり、その例としては、ワクチンの防御作用を強化することが示されているインターロイキン−12(IL−12)、GM−CSF、IL−18、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンω、インターフェロンγおよびFlt3リガンドが挙げられるが、これらに限定されない。このような因子も上記免疫増強剤として用いることができ、本発明の免疫誘導剤に含ませて又は別個の組成物として本発明の免疫誘導剤と併用して患者に投与することができる。 In addition to the adjuvant, factors that stimulate the immune response of the subject can also be used as the immune enhancer. For example, various cytokines having the property of stimulating lymphocytes and antigen-presenting cells can be used in combination with the immune inducer of the present invention as an immune enhancer. Numerous cytokines capable of enhancing such immunological responses are known to those skilled in the art, such as interleukin-12 (IL-12), which has been shown to enhance the protective effects of vaccines, Examples include, but are not limited to, GM-CSF, IL-18, interferon α, interferon β, interferon ω, interferon γ, and Flt3 ligand. Such factors can also be used as the above-mentioned immunity enhancing agent, and can be administered to patients in the immunity-inducing agent of the present invention or in combination with the immunity-inducing agent of the present invention as a separate composition.
また、上記ポリペプチドと抗原提示細胞とをインビトロで接触させることにより、該ポリペプチドを抗原提示細胞に提示させることができる。すなわち、上記した(a)及び(b)のポリペプチドは、抗原提示細胞の処理剤として利用し得る。ここで、抗原提示細胞としては、MHCクラスI分子を保有する樹状細胞又はB細胞を好ましく用いることができる。種々のMHCクラスI分子が同定されており、周知である。ヒトにおけるMHC分子はHLAと呼ぶ。HLAクラスI分子としては、HLA-A、HLA-B、HLA-Cを挙げることができ、より具体的には、HLA-A1, HLA-A0201, HLA-A0204, HLA-A0205, HLA-A0206, HLA-A0207, HLA-A11, HLA-A24, HLA-A31, HLA-A6801, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B2705, HLA-B37, HLA-Cw0401, HLA-Cw0602などを挙げることができる。 In addition, the polypeptide can be presented to the antigen-presenting cell by contacting the polypeptide and the antigen-presenting cell in vitro. That is, the polypeptides (a) and ( b ) described above can be used as a treatment agent for antigen-presenting cells. Here, dendritic cells or B cells carrying MHC class I molecules can be preferably used as antigen-presenting cells. Various MHC class I molecules have been identified and are well known. MHC molecules in humans are called HLA. Examples of HLA class I molecules include HLA-A, HLA-B, and HLA-C. More specifically, HLA-A1, HLA-A0201, HLA-A0204, HLA-A0205, HLA-A0206, HLA-A0207, HLA-A11, HLA-A24, HLA-A31, HLA-A6801, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B2705, HLA-B37, HLA-Cw0401, HLA-Cw0602 and the like.
MHCクラスI分子を保有する樹状細胞又はB細胞は、周知の方法により末梢血から調製することができる。例えば、骨髄、臍帯血あるいは患者末梢血から、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)とIL-3(あるいはIL-4)を用いて樹状細胞を誘導し、その培養系に腫瘍関連ペプチドを加えることにより、腫瘍特異的な樹状細胞を誘導することができる。この樹状細胞を有効量投与することで、癌の治療に望ましい応答を誘導できる。用いる細胞は、健康人から提供された骨髄や臍帯血、患者本人の骨髄や末梢血等を用いることができるが、患者本来の自家細胞を使う場合は、安全性が高く、重篤な副作用を回避することも期待できる。末梢血または骨髄は新鮮試料、低温保存試料及び凍結保存試料のいずれでもよい。末梢血は、全血を培養してもよいし、白血球成分だけを分離して培養してもよいが、後者の方が効率的で好ましい。さらに白血球成分の中でも単核球を分離してもよい。また、骨髄や臍帯血を起源とする場合には、骨髄を構成する細胞全体を培養してもよいし、これから単核球を分離して培養してもよい。末梢血やその白血球成分、骨髄細胞には、樹状細胞の起源となる単核球、造血幹細胞又は未成熟樹状細胞やCD4陽性細胞等が含まれている。用いられるサイトカインは、安全性と生理活性が確認された特性のものであれば、天然型、あるいは遺伝子組み換え型等、その生産手法については問わないが、好ましくは医療用に用いられる品質が確保された標品が必要最低量で用いられる。添加するサイトカインの濃度は、樹状細胞が誘導される濃度であれば特に限定されず、通常サイトカインの合計濃度で10〜1000ng/mL程度が好ましく、さらに好ましくは20〜500ng/mL程度である。培養は、白血球の培養に通常用いられている周知の培地を用いて行うことができる。培養温度は白血球の増殖が可能であれば特に限定されないが、ヒトの体温である37℃程度が最も好ましい。また、培養中の気体環境は白血球の増殖が可能であれば特に限定されないが、5%CO2を通気することが好ましい。さらに培養期間は、必要数の細胞が誘導される期間であれば特に限定されないが、通常3日〜2週間の間で行われる。細胞の分離や培養に供される機器は、適宜適当なものを用いることができるが、医療用に安全性が確認され、かつ操作が安定して簡便であることが好ましい。特に細胞培養装置については、シャーレ、フラスコ、ボトル等の一般的容器に拘わらず、積層型容器や多段式容器、ローラーボトル、スピナー式ボトル、バッグ式培養器、中空糸カラム等も用いることができる。 Dendritic cells or B cells carrying MHC class I molecules can be prepared from peripheral blood by well-known methods. For example, dendritic cells are induced from bone marrow, umbilical cord blood, or patient peripheral blood using granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and IL-3 (or IL-4), and tumor-related peptides are introduced into the culture system. Can be added to induce tumor-specific dendritic cells. By administering an effective amount of this dendritic cell, a desired response for cancer treatment can be induced. The cells used can be bone marrow and umbilical cord blood provided by healthy people, the patient's own bone marrow and peripheral blood, etc., but when using the patient's own autologous cells, it is highly safe and has serious side effects. It can also be expected to avoid it. Peripheral blood or bone marrow may be a fresh sample, a cryopreserved sample, or a cryopreserved sample. As the peripheral blood, whole blood may be cultured, or only the leukocyte component may be separated and cultured, but the latter is more efficient and preferable. Furthermore, mononuclear cells may be separated among the leukocyte components. Moreover, when originating in bone marrow or umbilical cord blood, the whole cells constituting the bone marrow may be cultured, or mononuclear cells may be separated and cultured from this. Peripheral blood, its white blood cell components, and bone marrow cells include mononuclear cells, hematopoietic stem cells, immature dendritic cells, CD4 positive cells, and the like that are the origin of dendritic cells. As long as the cytokine used has a property that has been confirmed to be safe and physiologically active, it does not matter whether it is a natural type or a genetically engineered type, and its production method is preferably ensured. Are used in the minimum amount required. The concentration of the cytokine to be added is not particularly limited as long as it is a concentration at which dendritic cells are induced, and is usually preferably about 10 to 1000 ng / mL, more preferably about 20 to 500 ng / mL as the total concentration of cytokines. The culture can be performed using a well-known medium usually used for culturing leukocytes. The culture temperature is not particularly limited as long as leukocyte growth is possible, but is most preferably about 37 ° C. which is the human body temperature. Further, the gas environment during the culture is not particularly limited as long as leukocytes can be grown, but it is preferable to aerate 5% CO 2 . Further, the culture period is not particularly limited as long as a necessary number of cells are induced, but it is usually performed for 3 days to 2 weeks. As a device used for cell separation and culture, an appropriate device can be used as appropriate, but it is preferable that safety is confirmed for medical use and that the operation is stable and simple. In particular, for cell culture devices, stacked containers, multistage containers, roller bottles, spinner bottles, bag-type incubators, hollow fiber columns, etc. can be used regardless of general containers such as petri dishes, flasks, and bottles. .
上記ポリペプチドと抗原提示細胞とをインビトロで接触させる方法自体は、周知の方法により行なうことができる。例えば、抗原提示細胞を、上記ポリペプチドを含む培養液中で培養することにより行なうことができる。培地中のペプチド濃度は、特に限定されないが、通常、1μg/mlないし100μg/ml程度、好ましくは5μg/mlないし20μg/ml程度である。培養時の細胞密度は特に限定されないが、通常、103細胞/mlから107細胞/ml程度、好ましくは5x104細胞/mlから5x106細胞/ml程度である。培養は、常法に従い、37℃、5%CO2雰囲気中で行なうことが好ましい。なお、抗原提示細胞が表面上に提示できるペプチドの長さは、通常、最大で30アミノ酸残基程度である。従って、特に限定されないが、抗原提示細胞とポリペプチドをインビトロで接触させる場合、該ポリペプチドをおよそ30アミノ酸残基以下の長さに調製してもよい。 The method of bringing the polypeptide into contact with the antigen-presenting cell in vitro can be performed by a well-known method. For example, it can be performed by culturing antigen-presenting cells in a culture solution containing the polypeptide. The peptide concentration in the medium is not particularly limited, but is usually about 1 μg / ml to 100 μg / ml, preferably about 5 μg / ml to 20 μg / ml. The cell density at the time of culture is not particularly limited, but is usually about 10 3 cells / ml to 10 7 cells / ml, preferably about 5 × 10 4 cells / ml to 5 × 10 6 cells / ml. Cultivation is preferably carried out in a 37 ° C., 5% CO 2 atmosphere according to a conventional method. The length of the peptide that can be presented on the surface by antigen-presenting cells is usually about 30 amino acid residues at the maximum. Therefore, although not particularly limited, when the antigen-presenting cell and the polypeptide are contacted in vitro, the polypeptide may be prepared to a length of about 30 amino acid residues or less.
上記したポリペプチドの共存下において抗原提示細胞を培養することにより、ペプチドが抗原提示細胞のMHC分子に取り込まれ、抗原提示細胞の表面に提示される。従って、上記ポリペプチドを用いて、該ポリペプチドとMHC分子の複合体を含む、単離抗原提示細胞を調製することができる。このような抗原提示細胞は、生体内又はインビトロにおいて、T細胞に対して該ポリペプチドを提示し、該ポリペプチドに特異的な細胞障害性T細胞を誘導し、増殖させることができる。 By culturing the antigen-presenting cells in the presence of the above-described polypeptide, the peptide is taken up by the MHC molecule of the antigen-presenting cell and presented on the surface of the antigen-presenting cell. Therefore, an isolated antigen-presenting cell containing a complex of the polypeptide and MHC molecule can be prepared using the polypeptide. Such antigen-presenting cells can present the polypeptide to T cells in vivo or in vitro, and induce and proliferate cytotoxic T cells specific for the polypeptide.
上記のようにして調製される、上記ポリペプチドとMHC分子の複合体とを含む抗原提示細胞を、T細胞とインビトロで接触させることにより、該ポリペプチドに特異的な細胞障害性T細胞を誘導し、増殖させることができる。これは、上記抗原提示細胞とT細胞とを液体培地中で共存培養することにより行なうことができる。例えば、抗原提示細胞を液体培地に懸濁して、マイクロプレートのウェル等の容器に入れ、これにT細胞を添加して培養することにより行なうことができる。共存培養時の抗原提示細胞とT細胞の混合比率は、特に限定されないが、通常、細胞数の比率で1:1〜1:100程度、好ましくは1:5〜1:20程度である。また、液体培地中に懸濁する抗原提示細胞の密度は、特に限定されないが、通常、100〜1000万細胞/ml程度、好ましくは10000〜100万細胞/ml程度である。共存培養は、常法に従い、37℃、5%CO2雰囲気中で行なうことが好ましい。培養時間は、特に限定されないが、通常、2日〜3週間、好ましくは4日〜2週間程度である。また、共存培養は、IL-2、IL-6、IL-7及びIL-12のようなインターロイキンの1種又は複数の存在下で行なうことが好ましい。この場合、IL-2及びIL-7の濃度は、通常、5U/mlから20U/ml程度、IL-6の濃度は通常、500U/mlから2000U/ml程度、IL-12の濃度は通常、5ng/mlから20ng/ml程度であるが、これらに限定されるものではない。上記の共存培養は、新鮮な抗原提示細胞を追加して1回ないし数回繰り返してもよい。例えば、共存培養後の培養上清を捨て、新鮮な抗原提示細胞の懸濁液を添加してさらに共存培養を行なうという操作を、1回ないし数回繰り返してもよい。各共存培養の条件は、上記と同様でよい。 Antigen-presenting cells containing the above-described polypeptide and MHC molecule complex prepared as described above are contacted with T cells in vitro to induce cytotoxic T cells specific for the polypeptide. And can be grown. This can be done by co-culturing the antigen-presenting cells and T cells in a liquid medium. For example, it can be carried out by suspending antigen-presenting cells in a liquid medium, placing them in a container such as a well of a microplate, adding T cells thereto, and culturing. The mixing ratio of antigen-presenting cells and T cells during co-culture is not particularly limited, but is usually about 1: 1 to 1: 100, preferably about 1: 5 to 1:20 in terms of the number of cells. The density of antigen-presenting cells suspended in the liquid medium is not particularly limited, but is usually about 1 to 10 million cells / ml, preferably about 10,000 to 1 million cells / ml. The coculture is preferably performed in a 37 ° C., 5% CO 2 atmosphere according to a conventional method. The culture time is not particularly limited, but is usually 2 days to 3 weeks, preferably about 4 days to 2 weeks. The coculture is preferably performed in the presence of one or more interleukins such as IL-2, IL-6, IL-7 and IL-12. In this case, the concentration of IL-2 and IL-7 is usually about 5 U / ml to about 20 U / ml, the concentration of IL-6 is usually about 500 U / ml to about 2000 U / ml, and the concentration of IL-12 is usually about Although it is about 5 ng / ml to 20 ng / ml, it is not limited to these. The above co-culture may be repeated once to several times by adding fresh antigen-presenting cells. For example, the operation of discarding the culture supernatant after co-culture, adding a fresh antigen-presenting cell suspension, and further co-culturing may be repeated once to several times. The conditions for each co-culture may be the same as described above.
上記の共存培養により、該ポリペプチドに特異的な細胞障害性T細胞が誘導され、増殖される。従って、上記ポリペプチドを用いて、該ポリペプチドとMHC分子の複合体を選択的に結合する、単離T細胞を調製することができる。 By the co-culture described above, cytotoxic T cells specific for the polypeptide are induced and proliferated. Therefore, an isolated T cell that selectively binds the complex of the polypeptide and the MHC molecule can be prepared using the polypeptide.
下記実施例に記載される通り、配列番号2及び4のカルメジンタンパクをコードする遺伝子は、それぞれイヌおよびヒトの癌細胞と精巣に特異的に発現している。従って、癌細胞においては、配列番号2又は4のカルメジンタンパクが正常細胞よりも有意に多く存在していると考えられる。癌細胞内に存在するカルメジンタンパクの一部が癌細胞表面上のMHC分子に提示され、上記のようにして調製した細胞障害性T細胞が生体内に投与されると、これを目印として細胞障害性T細胞が癌細胞を障害することができる。また、上記ポリペプチドを提示する抗原提示細胞は、生体内においても該ポリペプチドに特異的な細胞障害性T細胞を誘導し、増殖させることができるので、該抗原提示細胞を生体内に投与することによっても、癌細胞を障害することができる。すなわち、上記ポリペプチドを用いて調製された上記細胞障害性T細胞や上記抗原提示細胞もまた、本発明の免疫誘導剤と同様に、癌の治療及び/又は予防剤として有用である。 As described in the Examples below, the genes encoding the calmedin proteins of SEQ ID NOs: 2 and 4 are specifically expressed in canine and human cancer cells and testis, respectively. Therefore, it is considered that significantly more carmedin protein of SEQ ID NO: 2 or 4 is present in cancer cells than in normal cells. When a part of the carmedin protein present in the cancer cell is presented on the MHC molecule on the surface of the cancer cell and the cytotoxic T cell prepared as described above is administered in vivo, Damaged T cells can damage cancer cells. In addition, since the antigen-presenting cells presenting the polypeptide can induce and proliferate cytotoxic T cells specific for the polypeptide in vivo, the antigen-presenting cells are administered in vivo. In some cases, cancer cells can be damaged. That is, the cytotoxic T cell and the antigen-presenting cell prepared using the polypeptide are also useful as a cancer treatment and / or prevention agent, like the immunity-inducing agent of the present invention.
上記した単離抗原提示細胞や単離T細胞を生体に投与する場合には、これらの細胞を異物として攻撃する生体内での免疫応答を回避するために、治療を受ける患者から採取した抗原提示細胞又はT細胞を、上記のように上記(a)又は(b)のポリペプチドを用いて調製したものであることが好ましい。 When administering the above-mentioned isolated antigen-presenting cells or isolated T cells to a living body, in order to avoid in vivo immune responses that attack these cells as foreign bodies, antigen presentation collected from patients undergoing treatment Cells or T cells are preferably prepared using the polypeptide (a) or ( b ) as described above.
抗原提示細胞又は単離T細胞を有効成分として含む癌の治療及び/又は予防剤の投与経路は、静脈内投与や動脈内投与のような非経口投与が好ましい。また、投与量は、症状や投与目的等に応じて適宜選択されるが、通常1個〜10兆個、好ましくは100万個〜10億個であり、これを数日ないし数月に1回投与するのが好ましい。製剤は、例えば、細胞を生理緩衝食塩水に懸濁したもの等であってよく、他の抗癌剤やサイトカイン等と併用することもできる。また、製剤分野において周知の1又は2以上の添加剤を添加することもできる。 The administration route of the therapeutic and / or prophylactic agent for cancer containing antigen-presenting cells or isolated T cells as an active ingredient is preferably parenteral administration such as intravenous administration or intraarterial administration. The dose is appropriately selected according to symptoms, purpose of administration, etc., but is usually 1 to 10 trillion, preferably 1 million to 1 billion, and this is once every few days to several months. Administration is preferred. The preparation may be, for example, one in which cells are suspended in physiological buffer saline, and can be used in combination with other anticancer agents, cytokines, and the like. In addition, one or two or more additives well known in the pharmaceutical field can be added.
また、上記(a)又は(b)のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを対象動物の体内で発現させることによっても、該生体内で抗体生産や細胞障害性T細胞を誘導することができ、ポリペプチドを投与するのと同等の効果が得られる。すなわち、本発明の免疫誘導剤は、上記した(a)又は(b)のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクターを有効成分として含むものであってもよい。このような、抗原ポリペプチドを発現可能な組換えベクターは、遺伝子ワクチンとも呼ばれる。遺伝子ワクチンを製造するために用いるベクターは、対象動物細胞内(好ましくは哺乳動物細胞内)で発現可能なベクターであれば特に限定されず、プラスミドベクターでもウイルスベクターでもよく、遺伝子ワクチンの分野で公知のいかなるベクターを用いてもよい。なお、上記ポリペプチドをコードするDNAやRNA等のポリヌクレオチドは、上述した通り、常法により容易に調製することができる。また、ベクターへの該ポリヌクレオチドの組み込みは、当業者に周知の方法を用いて行なうことができる。
Further, by expressing a polynucleotide encoding the polypeptide of (a) or ( b ) in the body of the subject animal, antibody production and cytotoxic T cells can be induced in the living body, The same effect as that obtained by administering the peptide can be obtained. That is, the immunity-inducing agent of the present invention comprises a polynucleotide encoding the above-described polypeptide (a) or ( b ), and contains a recombinant vector capable of expressing the polypeptide in vivo as an active ingredient. There may be. Such a recombinant vector capable of expressing an antigen polypeptide is also called a gene vaccine. The vector used for producing the gene vaccine is not particularly limited as long as it can be expressed in the target animal cell (preferably in the mammalian cell), and may be a plasmid vector or a virus vector, and is known in the field of gene vaccines. Any of these vectors may be used. In addition, as described above, a polynucleotide such as DNA or RNA encoding the polypeptide can be easily prepared by a conventional method. In addition, the polynucleotide can be incorporated into a vector by a method well known to those skilled in the art.
遺伝子ワクチンの投与経路は、好ましくは筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与等の非経口投与経路であり、投与量は、抗原の種類等に応じて適宜選択することができるが、通常、体重1kg当たり、遺伝子ワクチンの重量で0.1μg〜100mg程度、好ましくは1μg〜10mg程度である。 The administration route of the gene vaccine is preferably a parenteral administration route such as intramuscular administration, subcutaneous administration, intravenous administration or intraarterial administration, and the dosage can be appropriately selected according to the type of antigen and the like. Usually, the weight of the genetic vaccine per kg body weight is about 0.1 μg to 100 mg, preferably about 1 μg to 10 mg.
ウイルスベクターによる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス等のRNAウイルスまたはDNAウイルスに、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込み、これを対象動物に感染させる方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス等を用いた方法が特に好ましい。 As a method using a viral vector, for example, a polynucleotide encoding the above polypeptide in RNA virus or DNA virus such as retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes virus, vaccinia virus, pox virus, poliovirus, Sindbis virus, etc. And a method for infecting a target animal with this. Of these, methods using retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, vaccinia viruses and the like are particularly preferred.
その他の方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法(DNAワクチン法)、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にDNAワクチン法、リポソーム法が好ましい。 Examples of other methods include a method in which an expression plasmid is directly administered into muscle (DNA vaccine method), a liposome method, a lipofectin method, a microinjection method, a calcium phosphate method, an electroporation method, and the like. The method is preferred.
本発明で用いられる上記ポリペプチドをコードする遺伝子を実際に医薬として作用させるには、遺伝子を直接体内に導入するin vivo方法、および対象動物からある種の細胞を採取し体外で遺伝子を該細胞に導入しその細胞を体内に戻すex vivo方法がある(日経サイエンス,1994年4月,p20−45、月刊薬事,1994年,第36巻,第1号,p.23−48、実験医学増刊,1994年,第12巻,第15号、およびこれらの引用文献等)。in vivo方法がより好ましい。 In order to cause the gene encoding the above-mentioned polypeptide used in the present invention to actually act as a medicine, an in vivo method in which the gene is directly introduced into the body, and a certain type of cell is collected from the target animal and the gene is extracted outside the body. There is an ex vivo method that introduces the cells into the body and returns the cells to the body (Nikkei Science, April 1994, p20-45, Monthly Pharmaceutical Affairs, 1994, Vol. 36, No. 1, p.23-48, Experimental Medicine Special Issue) 1994, Vol. 12, No. 15, and references cited therein). In vivo methods are more preferred.
in vivo方法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、筋肉内などに投与することが出来る。in vivo方法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一般的には、有効成分である本発明の上記ペプチドをコードするDNAを含有する注射剤等とされ、必要に応じて、慣用の担体を加えてもよい。また、該DNAを含有するリポソームまたは膜融合リポソーム(センダイウイルス(HVJ)−リポソーム等)においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。 When administered by an in vivo method, it can be administered by an appropriate route according to the disease, symptom or the like for the purpose of treatment. For example, it can be administered intravenously, artery, subcutaneously, intramuscularly. When administered by an in vivo method, for example, it can be in the form of a pharmaceutical preparation such as a solution, but is generally an injection containing a DNA encoding the above-mentioned peptide of the present invention, which is an active ingredient. Depending on the case, customary carriers may be added. In addition, the liposome or membrane-fused liposome (Sendai virus (HVJ) -liposome etc.) containing the DNA can be in the form of a liposome preparation such as a suspension, a freezing agent, a centrifugal concentrated freezing agent and the like.
なお、本発明において、「配列番号1に示される塩基配列」と言った場合には、配列番号1に実際に示されている塩基配列の他、これと相補的な配列も包含する。従って、「配列番号1に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド」と言った場合には、配列番号1に実際に示されている塩基配列を有する一本鎖ポリヌクレオチド、その相補的な塩基配列を有する一本鎖ポリヌクレオチド、及びこれらから成る二本鎖ポリヌクレオチドが包含される。本発明で用いられるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製する場合には、適宜いずれかの塩基配列を選択することとなるが、当業者であれば容易にその選択をすることができる。 In the present invention, the term “base sequence shown in SEQ ID NO: 1” includes the base sequence actually shown in SEQ ID NO: 1 as well as a complementary sequence thereto. Therefore, when saying “polynucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1”, the single-stranded polynucleotide having the base sequence actually shown in SEQ ID NO: 1, its complementary base sequence Single-stranded polynucleotides having and double-stranded polynucleotides comprising these are included. When preparing a polynucleotide encoding the polypeptide used in the present invention, any base sequence is appropriately selected, but those skilled in the art can easily select it.
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples.
実施例1:SEREX法による新規癌抗原タンパクの取得
(1)cDNAライブラリの作製
健常な犬の精巣組織から酸−グアニジウム−フェノール−クロロフォルム法(Acid guanidium-Phenol-Chloroform法)により全RNAを抽出し、Oligotex-dT30 mRNA purification Kit(宝酒造社製)を用いてキット添付のプロトコールに従ってポリA RNAを精製した。
Example 1: Acquisition of novel cancer antigen protein by SEREX method (1) Preparation of cDNA library Total RNA was extracted from the testis tissue of a healthy dog by the acid-guanidium-phenol-chloroform method (Acid guanidium-Phenol-Chloroform method). PolyA RNA was purified using Oligotex-dT30 mRNA purification Kit (Takara Shuzo) according to the protocol attached to the kit.
この得られたmRNA(5μg)を用いてイヌ精巣cDNAファージライブラリを合成した。cDNAファージライブラリの作製にはcDNA Synthesis Kit,ZAP-cDNA Synthesis Kit,ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit(STRATAGENE社製)を用い、キット添付のプロトコールに従ってライブラリを作製した。作製したcDNAファージライブラリのサイズは1.3×106pfu/mlであった。 A dog testis cDNA phage library was synthesized using the obtained mRNA (5 μg). The cDNA phage library was prepared using cDNA Synthesis Kit, ZAP-cDNA Synthesis Kit, and ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit (manufactured by STRATAGENE) according to the protocol attached to the kit. The size of the prepared cDNA phage library was 1.3 × 10 6 pfu / ml.
(2)血清によるcDNAライブラリのスクリーニング
上記作製したイヌ精巣由来cDNAファージライブラリを用いて、イムノスクリーニングを行った。具体的にはΦ90×15mmのNZYアガロースプレートに2340 クローンとなるように宿主大腸菌(XL1-Blue MRF')に感染させ、42℃、3〜4時間培養し、溶菌斑(プラーク)を作らせ、IPTG(イソプロピル−β−D−チオガラクトシド)を浸透させたニトロセルロースメンブレン(Hybond C Extra: GE Healthecare Bio-Science社製)でプレートを37℃で4時間覆うことによりタンパク質を誘導・発現させ、メンブレンにタンパク質を転写した。その後メンブレンを回収し0.5%脱脂粉乳を含むTBS(10mM Tris-HCl,150mM NaCl pH7.5)に浸し4℃で一晩振盪することによって非特異反応を抑制した。このフィルターを500倍希釈した患犬血清と室温で2〜3時間反応させた。
(2) Screening of cDNA library with serum Immunoscreening was performed using the canine testis-derived cDNA phage library prepared above. Specifically, Φ90 × 15 mm NZY agarose plate was infected with host E. coli (XL1-Blue MRF ′) so as to become 2340 clones, cultured at 42 ° C. for 3 to 4 hours, and lysed plaques were made. The protein is induced and expressed by covering the plate with a nitrocellulose membrane (Hybond C Extra: GE Healthecare Bio-Science) impregnated with IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) at 37 ° C. for 4 hours. Transcribed protein. Thereafter, the membrane was recovered, immersed in TBS (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl pH 7.5) containing 0.5% nonfat dry milk, and shaken at 4 ° C. overnight to suppress nonspecific reaction. This filter was allowed to react with the serum of a patient dog diluted 500 times at room temperature for 2 to 3 hours.
上記患犬血清としては、肛門近位腫瘍の患犬より採取した血清を用いた。これらの血清は−80℃で保存し、使用直前に前処理を行った。血清の前処理方法は、以下の方法による。すなわち、外来遺伝子を挿入していないλ ZAP Express ファージを宿主大腸菌(XL1-BLue MRF')に感染させた後、NZYプレート培地上で37℃、一晩培養した。次いで0.5M NaClを含む0.2M NaHCO3 pH8.3のバッファーをプレートに加え、4℃で15時間静置後、上清を大腸菌/ファージ抽出液として回収した。次に、回収した大腸菌/ファージ抽出液をNHS-カラム (GE Healthecare Bio-Science社製)に通液して、大腸菌・ファージ由来のタンパク質を固定化した。このタンパク固定化カラムに患犬血清を通液・反応させ、大腸菌およびファージに吸着する抗体を血清から取り除いた。カラムを素通りした血清画分は、0.5%脱脂粉乳を含むTBSにて500倍希釈し、これをイムノスクリーニング材料とした。 Serum collected from dogs with proximal anus tumor was used as the above-mentioned serum of dogs. These sera were stored at −80 ° C. and pretreated immediately before use. The serum pretreatment method is as follows. That is, λ ZAP Express phage into which no foreign gene was inserted was infected with host E. coli (XL1-BLue MRF ′), and then cultured overnight at 37 ° C. on NZY plate medium. Next, 0.2 M NaHCO 3 pH 8.3 buffer containing 0.5 M NaCl was added to the plate, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. for 15 hours, and then the supernatant was recovered as an E. coli / phage extract. Next, the recovered E. coli / phage extract was passed through an NHS-column (GE Healthecare Bio-Science) to immobilize the E. coli / phage derived protein. Serum dog serum was passed through this protein-immobilized column and reacted, and antibodies adsorbed to E. coli and phage were removed from the serum. The serum fraction passed through the column was diluted 500 times with TBS containing 0.5% nonfat dry milk, and this was used as an immunoscreening material.
かかる処理血清と上記融合タンパク質をブロットしたメンブレンをTBS―T(0.05% Tween20/TBS)にて4回洗浄を行った後、二次抗体として0.5%脱脂粉乳を含むTBSにて5000倍希釈を行ったヤギ抗イヌIgG(Goat anti Dog IgG-h+I HRP conjugated: BETHYL Laboratories社製)を、室温1時間反応させ、NBT/BCIP反応液(Roche社製)を用いた酵素発色反応により検出し、発色反応陽性部位に一致するコロニーをΦ90×15mmのNZYアガロースプレート上から採取し、SM緩衝液(100mM NaCl、10mM MgClSO4、50mM Tris-HCl、0.01% ゼラチン pH7.5)500μlに溶解させた。発色反応陽性コロニーが単一化するまで上記と同様の方法で、二次、三次スクリーニングを繰り返し、血清中のIgGと反応する30940個のファージクローンをスクリーニングして、1個の陽性クローンを単離した。 The membrane on which the treated serum and the fusion protein were blotted was washed 4 times with TBS-T (0.05% Tween20 / TBS), and then diluted 5000 times with TBS containing 0.5% nonfat dry milk as a secondary antibody. Goat anti dog IgG-h + I HRP conjugated: manufactured by BETHYL Laboratories was reacted for 1 hour at room temperature and detected by enzyme color reaction using NBT / BCIP reaction solution (Roche) Then, colonies that coincide with the positive color reaction site were collected from a Φ90 × 15 mm NZY agarose plate and dissolved in 500 μl of SM buffer (100 mM NaCl, 10 mM MgClSO 4 , 50 mM Tris-HCl, 0.01% gelatin pH 7.5). It was. Repeat the secondary and tertiary screening in the same way as above until the chromogenic positive colonies are unified, screen 30940 phage clones that react with IgG in serum, and isolate one positive clone did.
(3)単離抗原遺伝子の相同性検索
上記方法により単離した1個の陽性クローンを塩基配列解析に供するため、ファージベクターからプラスミドベクターに転換する操作を行った。具体的には宿主大腸菌(XL1-Blue MRF')を吸光度OD600が1.0となるよう調製した溶液200μlと、精製したファージ溶液100μlさらにExAssist helper phage (STRATAGENE社製)1μlを混合した後37℃で15分間反応後、LB培地を3ml添加し37℃で2.5〜3時間培養を行い、直ちに70℃の水浴にて20分間保温した後、4℃、1000×g、15分間遠心を行い上清をファージミド溶液として回収した。次いでファージミド宿主大腸菌(SOLR)を吸光度OD600が1.0となるよう調製した溶液200μlと、精製したファージ溶液10μlを混合した後37℃で15分間反応させ、50μlをアンピシリン(終濃度50μg/ml)含有LB寒天培地に播き37℃一晩培養した。トランスフォームしたSOLRのシングルコロニーを採取し、アンピシリン(終濃度50μg/ml)含有LB培地37℃にて培養後、QIAGEN plasmid Miniprep Kit(キアゲン社製)を使って目的のインサートを持つプラスミドDNAを精製した。
(3) Homology search of isolated antigen gene In order to use one positive clone isolated by the above method for base sequence analysis, an operation of converting a phage vector into a plasmid vector was performed. Specifically, 200 μl of a host E. coli (XL1-Blue MRF ′) prepared to have an absorbance OD 600 of 1.0 is mixed with 100 μl of a purified phage solution and 1 μl of ExAssist helper phage (manufactured by STRATAGENE). After reaction at 15 ° C. for 15 minutes, 3 ml of LB medium was added, cultured at 37 ° C. for 2.5 to 3 hours, immediately incubated in a 70 ° C. water bath for 20 minutes, and then centrifuged at 4 ° C., 1000 × g for 15 minutes. The supernatant was collected as a phagemid solution. Next, 200 μl of a phagemid host Escherichia coli (SOLR) solution having an absorbance OD 600 of 1.0 was mixed with 10 μl of the purified phage solution and reacted at 37 ° C. for 15 minutes, and 50 μl was treated with ampicillin (final concentration 50 μg / ml). ) Seeded on LB agar medium and cultured overnight at 37 ° C. A single colony of transformed SOLR is collected and cultured at 37 ° C in LB medium containing ampicillin (final concentration 50 µg / ml), and then the plasmid DNA having the target insert is purified using the QIAGEN plasmid Miniprep Kit (Qiagen). did.
精製したプラスミドは、配列番号5に記載のT3プライマーと配列番号6に記載のT7プライマーを用いて、プライマーウォーキング法によるインサート全長配列の解析を行った。このシークエンス解析により配列番号1に記載の遺伝子配列を取得した。この遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列を用いて、相同性検索プログラムBLASTサーチ(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)を行い既知遺伝子との相同性検索を行った結果、得られた遺伝子はカルメジン(calmegin)遺伝子であることが判明した。イヌカルメジンのヒト相同因子は、ヒトカルメジン(相同性:塩基配列90%、アミノ酸配列89%)であった。ヒトカルメジンの塩基配列を配列番号3に、アミノ酸配列を配列番号4に示す。 The purified plasmid was analyzed for the full-length insert sequence by the primer walking method using the T3 primer shown in SEQ ID NO: 5 and the T7 primer shown in SEQ ID NO: 6. By this sequence analysis, the gene sequence described in SEQ ID NO: 1 was obtained. Using the base sequence and amino acid sequence of this gene, a homology search program BLAST search (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) was performed, and homology search with a known gene was performed. The obtained gene was found to be a calmegin gene. The human homologous factor of canine carmedin was human carmedin (homology: base sequence 90%, amino acid sequence 89%). The base sequence of human carmedin is shown in SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence thereof is shown in SEQ ID NO: 4.
(4)各組織での発現解析
上記方法により得られた遺伝子に対しイヌおよびヒトの正常組織および各種細胞株における発現をRT-PCR(Reverse Transcription-PCR)法により調べた。逆転写反応は以下の通り行なった。すなわち、各組織50−100mgおよび各細胞株5−10×106個の細胞からTRIZOL試薬(invitrogen社製)を用いて添付のプロトコールに従い全RNAを抽出した。この全RNAを用いてSuperscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR(invitrogen社製)により添付のプロトコールに従いcDNAを合成した。ヒト正常組織(脳、海馬、精巣、結腸、胎盤)のcDNAは、ジーンプールcDNA(invitrogen社製)、QUICK-Clone cDNA(クロンテック社製)およびLarge-Insert cDNA Library(クロンテック社製)を用いた。PCR反応は、取得した遺伝子特異的なプライマー(配列番号7および8に記載)を用いて以下の通り行った。すなわち、逆転写反応により調製したサンプル0.25μl、上記プライマーを各2μM、0.2mM各dNTP、0.65UのExTaqポリメラーゼ(宝酒造社製)となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を25μlとし、Thermal Cycler(BIO RAD社製)を用いて、94℃―30秒、55℃―30秒、72℃―1分のサイクルを30回繰り返して行った。なお、上記遺伝子特異的プライマーは、配列番号1の塩基配列(イヌカルメジン遺伝子)中の755番〜1318番および配列番号3の塩基配列(ヒトカルメジン遺伝子)中の795番〜1358番塩基の領域を増幅するものであり、該プライマーを用いてイヌカルメジン遺伝子及びヒトカルメジン遺伝子のいずれの発現も調べることができるものであった。比較対照のため、GAPDH特異的なプライマー(配列番号9および10に記載)も同時に用いた。その結果、図1に示すように、イヌカルメジン遺伝子は、健常なイヌ組織では精巣に強い発現が見られ、一方イヌ腫瘍細胞株で強い発現が見られた。ヒトカルメジン遺伝子の発現も、イヌカルメジン遺伝子と同様、ヒト正常組織で発現が確認できたのは精巣のみだったが、ヒト癌細胞では脳腫瘍、白血病、食道癌で発現が検出され、ヒトカルメジン遺伝子も精巣と癌細胞に特異的に発現していることが確認された。
(4) Expression analysis in each tissue Expressions in normal tissues and various cell lines of dogs and humans were examined by RT-PCR (Reverse Transcription-PCR) for the genes obtained by the above method. The reverse transcription reaction was performed as follows. That is, total RNA was extracted from 50-100 mg of each tissue and 5-10 × 10 6 cells of each cell line using TRIZOL reagent (manufactured by Invitrogen) according to the attached protocol. Using this total RNA, cDNA was synthesized by Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR (manufactured by Invitrogen) according to the attached protocol. Gene pool cDNA (manufactured by Invitrogen), QUICK-Clone cDNA (manufactured by Clontech), and Large-Insert cDNA Library (manufactured by Clontech) were used as cDNAs for normal human tissues (brain, hippocampus, testis, colon, placenta). . The PCR reaction was performed as follows using the obtained gene-specific primers (described in SEQ ID NOs: 7 and 8). That is, 0.25 μl of the sample prepared by the reverse transcription reaction, 2 μM each of the above primers, 0.2 mM of each dNTP, 0.65 U of ExTaq polymerase (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), each reagent and attached buffer were added, and the total amount was 25 μl. Then, using a thermal cycler (manufactured by BIO RAD), a cycle of 94 ° C.-30 seconds, 55 ° C.-30 seconds, 72 ° C.-1 minutes was repeated 30 times. The gene-specific primer amplifies the region of nucleotides 755 to 1318 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 (canine calmedin gene) and nucleotides 795 to 1358 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 (human carmedin gene). Thus, the expression of both the canine carmedin gene and the human carmedin gene could be examined using the primer. For comparison, GAPDH specific primers (described in SEQ ID NOs: 9 and 10) were also used at the same time. As a result, as shown in FIG. 1, the canine carmedin gene was strongly expressed in the testis in healthy dog tissues, whereas it was strongly expressed in canine tumor cell lines. Similar to the canine calmedin gene, the expression of the human carmedin gene was confirmed only in the testis in normal human tissues, but in human cancer cells, expression was detected in brain tumors, leukemia, and esophageal cancer, and the human carmedin gene was also detected in the testis and cancer. It was confirmed that it was expressed specifically in cells.
なお、図1中、縦軸の参照番号1は、カルメジン遺伝子の発現パターンを、参照番号2は、比較対照であるGAPDH遺伝子の発現パターンを示す。 In FIG. 1, the reference number 1 on the vertical axis indicates the expression pattern of the calmedin gene, and the reference number 2 indicates the expression pattern of the GAPDH gene as a comparative control.
実施例2:イヌおよびヒトカルメジンタンパクの作製
(1)組換えタンパク質の作製
実施例1で取得した配列番号1の遺伝子を基に、以下の方法にて組換えタンパク質を作製した。PCRは、実施例1で得られたファージミド溶液より調製し配列解析に供したベクターを1μl、BamHIおよびEcoRI制限酵素切断配列を含む2種類のプライマー(配列番号11および12に記載)を各0.4μM、0.2mM dNTP、1.25UのPrimeSTAR HSポリメラーゼ(宝酒造社製)となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を50μlとし、Thermal Cycler (BIO RAD社製)を用いて、98℃―10秒、55℃―15秒、72℃―2分のサイクルを30回繰り返すことにより行った。なお、上記2種類のプライマーは、配列番号2のアミノ酸配列全長をコードする領域を増幅するものであった。PCR後、増幅されたDNAを1%アガロースゲルにて電気泳動し、QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製)を用いて約1.9kbpのDNA断片を精製した。
Example 2: Production of canine and human carmedin proteins (1) Production of recombinant protein Based on the gene of SEQ ID NO: 1 obtained in Example 1, a recombinant protein was produced by the following method. For PCR, 1 μl of a vector prepared from the phagemid solution obtained in Example 1 and subjected to sequence analysis, 2 types of primers (described in SEQ ID NOs: 11 and 12) containing BamHI and EcoRI restriction enzyme cleavage sequences were each set to 0. Reagents and attached buffer were added to give 4 μM, 0.2 mM dNTP, 1.25 U PrimeSTAR HS polymerase (Takara Shuzo) to a total volume of 50 μl, and 98 ° C.-10 using Thermal Cycler (BIO RAD). Second, 55 ° C.-15 seconds, 72 ° C.-2 minutes was repeated 30 times. The two types of primers were those that amplify the region encoding the entire amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. After PCR, the amplified DNA was electrophoresed on a 1% agarose gel, and a DNA fragment of about 1.9 kbp was purified using QIAquick Gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN).
精製したDNA断片をクローニングベクターpCR-Blunt(invitrogen社製)にライゲーションした。これを大腸菌に形質転換後プラスミドを回収し、増幅された遺伝子断片が目的配列と一致することをシークエンスで確認した。目的配列と一致したプラスミドをBamHIおよびEcoRI制限酵素で処理し、QIAquick Gel Extraction Kitで精製後、目的遺伝子配列を、BamHI、EcoRI制限酵素で処理した大腸菌用発現ベクターpET30a(Novagen社製)に挿入した。このベクターの使用によりHisタグ融合型の組換えタンパク質が産生できる。このプラスミドを発現用大腸菌BL21(DE3)に形質転換し、1mM IPTGによる発現誘導を行うことで目的タンパク質を大腸菌内で発現させた。 The purified DNA fragment was ligated to the cloning vector pCR-Blunt (manufactured by Invitrogen). After transforming this into E. coli, the plasmid was recovered, and it was confirmed by sequencing that the amplified gene fragment matched the target sequence. A plasmid corresponding to the target sequence was treated with BamHI and EcoRI restriction enzymes, purified with QIAquick Gel Extraction Kit, and then inserted into the expression vector pET30a (Novagen) treated with BamHI and EcoRI restriction enzymes. . By using this vector, a His-tagged recombinant protein can be produced. This plasmid was transformed into E. coli BL21 (DE3) for expression, and the target protein was expressed in E. coli by inducing expression with 1 mM IPTG.
また、配列番号3の遺伝子を基に、以下の方法にてヒト相同遺伝子の組換えタンパク質を作製した。PCRは、実施例1で作製した各種組織・細胞cDNAよりRT-PCR法による発現が確認できたcDNAを1μl、EcoRIおよびXhoI制限酵素切断配列を含む2種類のプライマー(配列番号13および14に記載)を各0.4μM、0.2mM dNTP、1.25UのPrimeSTAR HSポリメラーゼ(宝酒造社製)となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を50μlとし、Thermal Cycler (BIO RAD社製)を用いて、98℃―10秒、55℃―15秒、72℃―2分のサイクルを30回繰り返すことにより行った。なお、上記2種類のプライマーは、配列番号4のアミノ酸配列全長をコードする領域を増幅するものであった。PCR後、増幅されたDNAを1%アガロースゲルにて電気泳動し、QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製)を用いて約1.9kbpのDNA断片を精製した。 Further, based on the gene of SEQ ID NO: 3, a recombinant protein of human homologous gene was prepared by the following method. For PCR, 1 μl of cDNA confirmed to be expressed by RT-PCR method from various tissue / cell cDNA prepared in Example 1 and two primers containing EcoRI and XhoI restriction enzyme cleavage sequences (described in SEQ ID NOs: 13 and 14). ) Each 0.4 μM, 0.2 mM dNTP, 1.25 U PrimeSTAR HS polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.), each reagent and attached buffer are added to make a total volume of 50 μl, and Thermal Cycler (BIO RAD) A cycle of 10 ° C.-10 seconds, 55 ° C.-15 seconds, 72 ° C.-2 minutes was repeated 30 times. The two types of primers were those that amplify the region encoding the entire amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. After PCR, the amplified DNA was electrophoresed on a 1% agarose gel, and a DNA fragment of about 1.9 kbp was purified using QIAquick Gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN).
精製したDNA断片をクローニングベクターpCR-Blunt(invitrogen社製)にライゲーションした。これを大腸菌に形質転換後プラスミドを回収し、増幅された遺伝子断片が目的配列と一致することをシークエンスで確認した。目的配列と一致したプラスミドをEcoRIおよびXhoI制限酵素で処理し、QIAquick Gel Extraction Kitで精製後、目的遺伝子配列を、EcoRI、XhoI制限酵素で処理した大腸菌用発現ベクターpET30a(Novagen社製)に挿入した。このベクターの使用によりHisタグ融合型の組換えタンパク質が産生できる。このプラスミドを発現用大腸菌BL21(DE3)に形質転換し、1mM IPTGによる発現誘導を行うことで目的タンパク質を大腸菌内で発現させた The purified DNA fragment was ligated to the cloning vector pCR-Blunt (manufactured by Invitrogen). After transforming this into E. coli, the plasmid was recovered, and it was confirmed by sequencing that the amplified gene fragment matched the target sequence. A plasmid corresponding to the target sequence was treated with EcoRI and XhoI restriction enzymes, purified with the QIAquick Gel Extraction Kit, and then inserted into the expression vector pET30a (Novagen) treated with EcoRI and XhoI restriction enzymes. . By using this vector, a His-tagged recombinant protein can be produced. This plasmid was transformed into expression Escherichia coli BL21 (DE3), and the target protein was expressed in Escherichia coli by inducing expression with 1 mM IPTG.
(2)組換えタンパク質の精製
上記で得られた、配列番号1および配列番号3を発現するそれぞれの組換え大腸菌を30 μg/mL カナマイシン含有LB培地にて600nmでの吸光度が0.7付近になるまで37℃で培養後、イソプロピル-β-D-1-チオガラクトピラノシド終濃度が1 mMとなるよう添加し、さらに37℃で4時間培養した。その後4800rpmで10分間遠心し集菌した。この菌体塊をリン酸緩衝化生理食塩水に懸濁し、さらに4800rpmで10分間遠心し菌体の洗浄を行った。
(2) Purification of recombinant protein Recombinant Escherichia coli expressing SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3 obtained as described above was absorbed in an LB medium containing 30 μg / mL kanamycin until the absorbance at 600 nm reached around 0.7. After culturing at 37 ° C., isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside was added to a final concentration of 1 mM, and further cultured at 37 ° C. for 4 hours. Thereafter, the cells were collected by centrifugation at 4800 rpm for 10 minutes. The cell mass was suspended in phosphate buffered physiological saline, and further centrifuged at 4800 rpm for 10 minutes to wash the cell.
得られた菌体塊を20mMリン酸緩衝液(pH7.0)に懸濁し、氷上にて超音波破砕を行った。大腸菌超音波破砕液を6000rpmで20分間遠心分離し、得られた上清を可溶性画分、沈殿物を不溶性画分とした。 The obtained cell mass was suspended in 20 mM phosphate buffer (pH 7.0), and ultrasonically crushed on ice. The E. coli sonication solution was centrifuged at 6000 rpm for 20 minutes, and the resulting supernatant was used as a soluble fraction and the precipitate was used as an insoluble fraction.
可溶性画分をイオン交換カラム(担体 SP Sepharose(商標)Fast Flow(GE Health Care社)、カラム容量5mL、平衡化緩衝液 20mMリン酸緩衝液(pH7.0))に添加した。カラム容量の10倍量の20mMリン酸緩衝液(pH7.0)にて洗浄を行った後、0.3M-1.0M 塩化ナトリウム含有20mMリン酸緩衝液(pH7.0)にて塩の段階的濃度勾配により溶出を行った。各溶出画分はカラム容量の6倍量ずつ採取した。 The soluble fraction was added to an ion exchange column (carrier SP Sepharose ™ Fast Flow (GE Health Care), column volume 5 mL, equilibration buffer 20 mM phosphate buffer (pH 7.0)). After washing with 20 mM phosphate buffer (pH 7.0) 10 times the column volume, stepped salt concentration with 20 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.3M-1.0M sodium chloride Elution was performed with a gradient. Each elution fraction was collected by 6 times the column volume.
この溶出画分のうち0.3M塩化ナトリウム含有20mMリン酸緩衝液(pH7.0)の画分、1番目から6番目と、1.0M塩化ナトリウム含有20mMリン酸緩衝液(pH7.0)の画分の1番目の画分を合わせて、2次カラムによりさらに精製操作を行った。 Of this elution fraction, the fraction of 20 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.3 M sodium chloride, the first to the sixth, and the fraction of 20 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 1.0 M sodium chloride The first fractions were combined and further purified using a secondary column.
2次カラムはカラム担体Bio gel HT Type II(BioRad社)、カラム容量5mLを用いた。カラム容量の10倍の0.3M塩化ナトリウム含有20mMリン酸緩衝液(pH7.0)にて平衡化を行った後、上記溶出画分を添加した。カラム容量の10倍量の0.3M塩化ナトリウム含有20mMリン酸緩衝液(pH7.0)と0.1Mリン酸緩衝液(pH7.0)にて、カラム未吸着画分の洗浄を行った後、0.2Mリン酸緩衝液(pH7.0)にて溶出を行い精製画分とし、以降この精製画分を投与試験用の材料とした。なお、溶出画分中の目的タンパク質は、定法に従って行ったクマシー染色によって確認した。このうち、イヌカルメジンタンパクを図2に示す。 As the secondary column, a column carrier Bio gel HT Type II (BioRad) and a column volume of 5 mL were used. After equilibration with 20 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.3 M sodium chloride 10 times the column volume, the elution fraction was added. After washing the non-adsorbed fraction with 20 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.1 M sodium chloride in 10 times the column volume and 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0), 0.2 Elution was carried out with M phosphate buffer (pH 7.0) to obtain a purified fraction, and this purified fraction was subsequently used as a material for administration tests. The target protein in the eluted fraction was confirmed by Coomassie staining performed according to a conventional method. Of these, canine carmedin protein is shown in FIG.
上記方法によって得られた精製標品のうち200μlを1mlの反応緩衝液(20mM Tris-HCl, 50mM NaCl, 2mM CaCl2 pH7.4)に分注を行った後、エンテロキナーゼ(Novagen社製)2μl添加した後、室温にて一晩静置・反応を行い、Hisタグを切断し、Enterokinase Cleavage Capture Kit(Novagen社製)を用いてその添付プロトコールに従って精製を行った。次に、上記方法によって得られた精製標品1.2mlを、限外ろ過NANOSEP 10K OMEGA(PALL社製)を用いて、生理用リン酸緩衝液(日水製薬社製)置換した後、HTタフリンアクロディスク0.22μm(PALL社製)にて無菌ろ過を行い、これを以下の実験に用いた。 200 μl of the purified sample obtained by the above method was dispensed into 1 ml of reaction buffer (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl 2 pH 7.4), and then enterokinase (Novagen) 2 μl After the addition, the mixture was allowed to stand and react overnight at room temperature, the His tag was cleaved, and purification was performed using the Enterokinase Cleavage Capture Kit (Novagen) according to the attached protocol. Next, 1.2 ml of the purified sample obtained by the above method was replaced with a physiological phosphate buffer (manufactured by Nissui Pharmaceutical) using ultrafiltration NANOSEP 10K OMEGA (manufactured by PALL), and then HT tough Sterile filtration was performed with 0.22 μm Linacrodisc (manufactured by PALL), and this was used in the following experiments.
実施例3:組換えタンパク質の担癌患犬に対する投与試験
(1)抗腫瘍評価
表皮に腫瘤を持つ担癌患犬2頭(乳腺腫瘍2頭)に対して、上記で精製した2種類の組換えタンパクの抗腫瘍効果の評価を行った。
Example 3: Administration test of recombinant protein to cancer-bearing dogs (1) Anti-tumor evaluation Two kinds of groups purified as described above for two dogs with cancer on the epidermis (2 breast tumors) The antitumor effect of the replacement protein was evaluated.
上記の通り精製した組換えイヌカルメジンおよびヒトカルメジンタンパク各々100μg(0.5ml)に等量の不完全フロイントアジュバント(和光純薬社製)を混合して癌治療剤とし、これを初回投与、3日後および7日後に腫瘍近傍の所属リンパ節に計3回投与を行った。その結果、癌治療剤投与時点で、それぞれ大きさが約45mm3及び78mm3であった腫瘤が、癌治療剤初回投与から10日後にはそれぞれ27mm3及び46mm3に、20日後にはそれぞれ15mm3及び26mm3に、30日後にはそれぞれ7mm3及び15mm3まで縮小した。 Recombinant canine carmedin and human carmedin protein purified as described above were mixed with 100 μg (0.5 ml) each of equal amounts of incomplete Freund's adjuvant (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to make a cancer therapeutic agent, which was initially administered 3 days later And 7 days later, the administration was performed 3 times to the regional lymph nodes near the tumor. As a result, cancer therapeutic agent at the time of administration, the size of about 45 mm 3 and 78mm 3 in which was mass respectively, the each of the 10 days after the first administration of the therapeutic agent 27 mm 3 and 46 mm 3, respectively, after 20 days 15mm 3 and 26 mm 3, after 30 days was reduced respectively to 7 mm 3 and 15 mm 3.
また、悪性黒色種の患犬に対して、上記イヌカルメジンタンパク100μg(0.5ml)に、0.5mlの不完全フロイントアジュバントを混合したものを上記と同様にして計3回投与した。また同時にイヌインターロイキン12を100μgづつ皮下投与した。その結果、癌治療剤投与時点で、大きさが約38mm3であった腫瘤が、癌治療剤初回投与から21日後には完全に退縮した。 In addition, a mixture of 100 μg (0.5 ml) of the above canine calmedin protein and 0.5 ml of incomplete Freund's adjuvant was administered to malignant black dogs in the same manner as described above three times. At the same time, 100 μg of canine interleukin 12 was subcutaneously administered. As a result, a tumor that had a size of about 38 mm 3 at the time of administration of the cancer therapeutic agent was completely regressed 21 days after the initial administration of the cancer therapeutic agent.
(2)免疫誘導能評価
上記(1)での投与試験で抗腫瘍効果が得られた患犬の血液を、癌治療剤投与前並びに初回投与から10日後及び30日後の各時点で採取し、常法に従って末梢血単核球を分離し、それを用いたIFNγのエリスポットアッセイ法により、投与した各組換えタンパクについて免疫誘導能の評価を行った。
(2) Evaluation of immunity induction ability The blood of the patient dog from which the antitumor effect was obtained in the administration test in (1) above was collected before administration of the cancer therapeutic agent and at 10 and 30 days after the initial administration, Peripheral blood mononuclear cells were isolated according to a conventional method, and the immunity-inducing ability of each administered recombinant protein was evaluated by an IFNγ ELISPOT assay using the same.
ミリポア社製の96穴プレート(MultiScreen-IP, MAIPS4510)に70%エタノールを100μl/穴づつ添加し、5分間静置し吸引除去後、滅菌水で洗浄し、200mM Sodium Bicarbonate(pH8.2)を300μl/穴添加し5分間静置後、吸引除去しプレートを洗浄した。次に200mM Sodium Bicarbonateに添加した抗イヌインターフェロンγモノクローナル抗体(R&D社製、clone142529, MAB781)を0.5μg/穴づつ添加し、37℃で一晩インキュベートし、一次抗体を固相化した。一次抗体を吸引除去後、ブロッキング溶液(1%BSA-5%スクロース-200mM Sodium Bicarbonate(pH8.2))を300μl/穴づつ添加し4℃にて一晩インキュベートしてプレートをブロッキングした。ブロッキング溶液を吸引除去後、10%牛胎児血清を含むRPMI培地(Invitrogen社製)を300μl/穴づつ添加して5分間静置し培地を吸引除去した。その後、10%牛胎児血清を含むRPMI培地に懸濁した各々のイヌ末梢血単核球を5x105細胞/穴づつプレートに添加し、これにそれぞれの投与に用いたイヌカルメジンもしくはヒトカルメジンタンパクを10μl/穴づつ添加し、37℃、5%CO2の条件下で24時間培養することにより、末梢血単核球中に存在し得る免疫細胞からインターフェロンγを産生させた。培養後、培地を除去し、洗浄液(0.1%Tween20-200mM Sodium Bicarbonate(pH8.2))を用いてウエルを6回洗浄した。上記ブロッキング溶液にて1000倍に希釈したラビット抗イヌポリクローナル抗体をそれぞれのウエルに100μlづつ添加し4℃にて一晩インキュベートした。上記洗浄液で3回ウエルを洗浄した後、上記ブロッキング溶液にて1000倍に希釈したHRP標識抗ラビット抗体をそれぞれのウエルに100μlづつ添加し、37℃で2時間反応させた。上記洗浄液で3回ウエルを洗浄した後、コニカイムノステイン(コニカ社製)にて発色させ、ウエルを水洗して反応を停止させた。反応停止後、メンブレンを乾燥させ、ウエルを画像化し、スポット形成細胞(SFC)をKSエリスポット・コンパクトシステム(Carl Zeiss、ドイツ)により計数した。 Add 100 μl / well of 70% ethanol to a 96-well plate (MultiScreen-IP, MAIPS4510) manufactured by Millipore, leave it for 5 minutes, remove by suction, wash with sterile water, and wash with 200 mM Sodium Bicarbonate (pH 8.2). After adding 300 μl / well and allowing to stand for 5 minutes, the plate was washed by suction removal. Next, 0.5 μg / well of anti-canine interferon γ monoclonal antibody (R & D, clone 142529, MAB781) added to 200 mM Sodium Bicarbonate was added and incubated overnight at 37 ° C. to immobilize the primary antibody. After the primary antibody was removed by suction, 300 μl / well of blocking solution (1% BSA-5% sucrose-200 mM Sodium Bicarbonate (pH 8.2)) was added and incubated overnight at 4 ° C. to block the plate. After removing the blocking solution by suction, 300 μl / well of RPMI medium (Invitrogen) containing 10% fetal calf serum was added and allowed to stand for 5 minutes to remove the medium by suction. After that, each canine peripheral blood mononuclear cell suspended in RPMI medium containing 10% fetal calf serum was added to the plate at 5x10 5 cells / well, and the canine calmedin or human carmedin protein used for each administration was added to this plate. By adding 10 μl / well and culturing under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 for 24 hours, interferon γ was produced from immune cells that could be present in peripheral blood mononuclear cells. After culturing, the medium was removed, and the wells were washed 6 times with a washing solution (0.1% Tween 20-200 mM Sodium Bicarbonate (pH 8.2)). Rabbit anti-dog polyclonal antibody diluted 1000-fold with the blocking solution was added to each well in an amount of 100 μl and incubated overnight at 4 ° C. After washing the wells with the washing solution three times, 100 μl of HRP-labeled anti-rabbit antibody diluted 1000 times with the blocking solution was added to each well and reacted at 37 ° C. for 2 hours. After washing the well three times with the above washing solution, color was developed with Konica Immunostain (manufactured by Konica), and the well was washed with water to stop the reaction. After stopping the reaction, the membrane was dried, the wells were imaged, and spot-forming cells (SFC) were counted with a KS ELISPOT compact system (Carl Zeiss, Germany).
その結果、イヌカルメジンタンパクおよびヒトカルメジンタンパクどちらを投与した患犬においても、投与前の末梢血単核球ではスポットが検出されなかった。一方、イヌカルメジンを投与した患犬においては、投与10日後および30日後の末梢血単核球でそれぞれ15個、45個のスポットが検出された。また、ヒトカルメジンを投与した患犬においては、投与10日後および30日後の末梢血単核球でそれぞれ12個、39個のスポットが検出された。 As a result, no spots were detected in peripheral blood mononuclear cells before administration in dogs treated with either canine calmedin protein or human calmedin protein. On the other hand, in the dogs to which canine carmedin was administered, 15 spots and 45 spots were detected in peripheral blood mononuclear cells 10 days and 30 days after administration, respectively. In the dogs to which human carmedin was administered, 12 spots and 39 spots were detected in peripheral blood mononuclear cells 10 days and 30 days after administration, respectively.
以上の結果から、いずれの投与患犬においても、投与した組換えタンパクに特異的に反応してインターフェロンγを産生する免疫細胞が誘導されていることが確認でき、これらの免疫細胞を中心とした免疫反応により、上記(1)に示す抗腫瘍効果が発揮されたものと考えられる。 From the above results, it can be confirmed that in any administration dog, immune cells producing interferon γ reacting specifically with the administered recombinant protein are induced. It is considered that the antitumor effect shown in (1) above was exerted by the immune reaction.
Claims (6)
(a) 配列表の配列番号2又は4に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
(b) (a)のポリペプチドと89%以上の相同性を有するポリペプチド。 A recombinant vector which is a polypeptide of any of the following (a) and (b) and has a immunity-inducing activity or a polynucleotide encoding the polypeptide and which can express the polypeptide in vivo: A therapeutic and / or prophylactic agent for cancer contained as an active ingredient.
(a) A polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4 in the sequence listing.
(b) (a) polypeptide and 89% or more homology polypeptides have a.
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