JP5586064B2 - 抗h5亜型a型インフルエンザウイルスヘマグルチニンモノクローナル抗体 - Google Patents
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Description
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片のエピトープが配列番号2に示されるアミノ酸配列を基準として、
(1) 41〜60aa及び312〜322aaの領域、
(2) 61〜80aa及び290〜300aaの領域、又は
(3) 101〜113aa及び268〜278aaの領域
に存在する3種類のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片のうち、単一のH5亜型A型インフルエンザウイルスに同時に結合可能な2種類のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を用いるサンドイッチ法により検体中のH5亜型A型インフルエンザウイルスを測定することを含む、H5亜型A型インフルエンザウイルスの免疫測定方法を提供する。さらに、本発明は、H5亜型A型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンと抗原抗体反応し、その対応エピトープが、レセプターサブドメイン(但し、そのC末端11アミノ酸から成る領域を除く)中に存在せず、前記A型インフルエンザウイルスの中和活性を有さず、H1亜型〜H4亜型及びH6亜型〜H15亜型のヘマグルチニンとは実質的に交差反応しない抗H5亜型A型インフルエンザウイルスヘマグルチニンモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片であって、
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片のエピトープが配列番号2に示されるアミノ酸配列を基準として、
(1) 41〜60aa及び312〜322aaの領域、
(2) 61〜80aa及び290〜300aaの領域、又は
(3) 101〜113aa及び268〜278aaの領域
に存在する3種類のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片のうち、単一のH5亜型A型インフルエンザウイルスに同時に結合可能な2種類のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含む、H5亜型A型インフルエンザウイルスの免疫測定用キットを提供する。
(1) 41〜60aa及び312〜322aaの領域、
(2) 61〜80aa及び290〜300aaの領域、又は
(3) 101〜113aa及び268〜278aaの領域
に存在する。
対応エピトープが、配列番号2に示されるアミノ酸配列を基準として、
(1) 41〜60aa及び312〜322aaの領域、
(2) 61〜80aa及び290〜300aaの領域、又は
(3) 101〜113aa及び268〜278aaの領域
に存在する3種類のモノクローナル抗体のうちの2種類を用いて行なうと、感度及び特異性に特に優れた免疫測定が可能になり好ましい。
弱毒インフルエンザウイルス株A/duck/Hokkaido/Vac-1/04(H5N1)(Genbank accession No.:AB259712、配列番号49、50)感染発育鶏卵漿尿液液を27000rpm, 4℃, 1.5時間超遠心を行い、ウイルスをペレットとして回収した。ペレットはPBSで溶解した後、ショ糖勾配遠心分離法にてウイルス含有フラクションを回収した。再度、超遠心を行い、ショ糖を除き精製ウイルス溶液とした。精製ウイルスはホルマリン、或いはTritonX-100(商品名)による不活化を行い免疫、及びELISA、WB用抗原とした。ホルマリン処理は精製ウイルス溶液に終濃度0.2%になるようにホルマリンを加え、4℃で1週間静置することにより、TritonX-100(商品名)処理は細胞抽出用緩衝液 (0.05M Tris-HCl,pH8.0, 0.6M KCl, 0.5% Triton X-100(商品名)を精製ウイルス溶液に3倍量加えることによって行った。ウイルスの不活化の確認は不活化処理したウイルスを10日齢発育鶏卵に接種して2日間培養した後、ウイルス感染発育鶏卵漿尿液の赤血球凝集(HA)試験でHA価がないことによって確認した。
樹立した抗体の特異性確認に使用するウイルス感染マディンダービーイヌ腎(Madin-Darby canine kidney, MDCK)細胞(入手先:北海道大学)、及びその細胞抽出液の作製は以下のように行った。蛍光抗体法(IF)用抗原はチャンバースライドにMDCK細胞をフルシートになるまで培養した後、各インフルエンザウイルスをトリプシン添加MEM(血清無添加)で最適に希釈し細胞に接種した。CO2 インキュベーターで35℃, 16時間培養し、その後、冷アセトンで細胞を固定し特異性確認用IF用スライドとした。
参考例1で作製した精製不活化インフルエンザウイルスA/duck/Hokkaido/Vac-1/04(H5N1)をマウスに免疫し、同マウスの後ろ肢リンパ球とミエローマ細胞を融合することにより作製した。すなわち、BALB/Cマウスに、フロイント完全アジュバントでエマルジョン化した精製不活化インフルエンザウイルスA/duck/Hokkaido/Vac-1/04(H5N1)を50〜100μg/マウスでフットパットに初回免疫を行い、2〜3週間後、アジュバントを含まないの精製不活化インフルエンザウイルスA/duck/Hokkaido/Vac-1/04(H5N1)を50〜100μg/マウスで追加免疫を行った。抗体価の確認は、TritonX100処理精製インフルエンザウイルスA/duck/Hokkaido/Vac-1/04(H5N1)抗原をコートした96ウェル ELISAプレートを用いた固相ELISA、及び同抗原によるWBで行った。抗体価の上昇が認められたマウスに精製不活化インフルエンザウイルスA/duck/Hokkaido/Vac-1/04(H5N1)25〜50μgをフットパットに免疫し、その3〜4日後、マウス下肢リンパ節からリンパ球を調製した。前もってRPMI-1640培地で培養していたマウスミエローマ細胞(P3U1)と脾細胞を1:2〜1:5の比率で混合し、ポリエチレングリコール(PEG;ベーリンガー社製)を用いて細胞融合を行った。融合した細胞はHAT培地に浮遊した後、96ウェル培養プレートに分注し、37℃ CO2インキュベーターで培養した。
IF法は以下のように行った。即ち、参考例2で作製した特異性確認用IF用スライドにモノクローナル抗体の培養上清または腹水(1% BSA in PBSTで希釈)を添加し室温, 1時間反応させた後、PBSで洗浄し蛍光色素標識抗マウス IgG(1% BSA in PBSTで1000倍希釈)と室温, 30分間反応させた。PBSで洗浄した後、グリセロールで封入し、蛍光顕微鏡で観察した。WBは参考例2で作製した抗原を用いて常法に従って行った。
Mab 26, 115及び136のN末側の認識部位を決定するために、564アミノ酸からなるインフルエンザH5N1株A/duck/Hokkaido/Vac-1/04(H5N1)のHA(配列番号2)を、PCR法にて、1〜564aa (A断片)、1〜514aa (B断片)、21〜514aa(C断片)、101〜500aa(D断片)、151〜500aa(E断片)および201〜500aa(F断片)の6断片を増幅した。各プライマーにはあらかじめ、BamHI、XbaI部位を付加していた。増幅断片をQIAGEN社のPCR Purification Kitで精製し、発現用プラスミドpW6AのNdeI-EcoRI部位にGSTを組込んだ発現用プラスミドpWG6AのBamHI、XbaI部位に挿入し、プラスミドpWGInf.H5N1-N-A,pWGInf.H5N1-N-B,pWGInf.H5N1-N-C, pWGInf.H5N1-N-D pWGInf.H5N1-N-Eおよび pWGInf.H5N1-N-Fを作製した。これらを用い大腸菌BL21(DE3)(Brookhaven National Laboratoryより入手)を形質転換させ、アンピシリン耐性の形質転換体大腸菌BL21(DE3)pWGInf.H5N1-N-A, BL21(DE3)pWGInf.H5N1-N-B,BL21(DE3)pWGInf.H5N1-N-C, BL21(DE3)pWGInf.H5N1-N-D,BL21(DE3)pWGInf.H5N1-N-E およびBL21(DE3)pWGInf.H5N1-N-Fを得た。
3-1で作製した形質転換体を、50μg/mlのアンピシリンを含むLB培地2ml中37℃で培養した。予備培養にて600nmでODを0.6〜0.8にした後1mM IPTGを添加し発現誘導を行い、更に3時間培養した。1.5ml量の菌体培養液を5,000rpmで2分間遠心分離して菌体を集め、100μlの緩衝液(10mMトリス-塩酸、pH8.0、0.1M塩化ナトリウム、1mMEDTA)に懸濁し、15分間の超音波破砕により完全に菌体を破砕した。これを菌体試料とした。
次にインフルエンザH5N1の21〜400アミノ酸断片をさらに細分化した断片N1(21〜400aa)、N2(41〜400aa)、N3(61〜400aa)、N4(81〜400aa)、N5(101〜400aa)、N6(114〜400aa)、N7(127〜400aa)およびN8(139〜400aa)をPCR法で増幅した。増幅断片をQIAGEN社のPCR Purification Kitで精製し、昆虫細胞発現用プラスミドpBac-EGTs-6A(Invitrogen社製pFastBac1ベクターを改変)のBamHI-XbaI部位に挿入し、プラスミpBacInf.H5N1-N1, pBacInf.H5N1-N2, pBacInf.H5N1-N3, pBacInf.H5N1-N4, pBacInf.H5N1-N5, pBacInf.H5N1-N6, pBacInf.H5N1-N7および pBacInf.H5N1-N8を作製した。これらをBacmid作製用大腸菌DH10Bacに形質転換を行いBacmid-Inf.H5N1-N1, Bacmid-Inf.H5N1-N2, Bacmid-Inf.H5N1-N3, Bacmid-Inf.H5N1-N4, Bacmid-Inf.H5N1-N5, Bacmid-Inf.H5N1-N6, Bacmid-Inf.H5N1-N7および Bacmid-Inf.H5N1-N8を作製した。
3-3で作製した8種類のBacmidDNAを昆虫細胞Sf-21(Invitrogen社製)にトランスフェクションを行い組換えウイルスP1-N1, P1-N2, P1-N3, P1-N4, P1-N5, P1-N6, P1-N7および P1-N8を作製した。これらのP1の一部をSf21細胞へ感染させ27℃,4日間培養後、3000rpm 20分間遠心分離で培養上清を回収した。これをELISAの試料とした。
モノクローナル抗体26, 115および136のC末側の認識部位を決定するために、564アミノ酸からなるインフルエンザH5N1株
A/duck/Hokkaido/Vac-1/04(H5N1)のHA(配列番号2)を、PCR法にて、21〜400aa (A断片)、21〜333aa (B断片)、21〜266aa(C断片)、21〜200aa(D断片)および21〜133aa(E断片)5断片を増幅した。各プライマーにはあらかじめ、BamHI、XbaI部位を付加していた。増幅断片をQIAGEN社のPCR Purification Kitで精製し、発現用プラスミドpW6AのNdeI-EcoRI部位にGSTを組込んだ発現用プラスミドpWG6AのBamHI、XbaI部位に挿入し、プラスミドpWGInf.H5N1-C-A,pWGInf.H5N1-C-B,pWGInf.H5N1-C-C,pWGInf.H5N1-C-D およびpWGInf.H5N1-C-Eを作製した。これらを用い大腸菌BL21(DE3)(Brookhaven National Laboratoryより入手)を形質転換させ、アンピシリン耐性の形質転換体大腸菌BL21(DE3)pWGInf.H5N1-C-A,BL21(DE3)pWGInf.H5N1-C-B,BL21(DE3)pWGInf.H5N1-C-C,BL21(DE3)pWGInf.H5N1-C-D,BL21(DE3)pWGInf.H5N1-C-Eを得た。
3-5で作製した形質転換体を、50μg/mlのアンピシリンを含むLB培地2ml中37℃で培養した。予備培養にて600nmでODを0.6〜0.8にした後1mM IPTGを添加し発現誘導を行い、更に3時間培養した。1.5ml量の菌体培養液を5,000rpmで2分間遠心分離して菌体を集め、100μlの緩衝液(10mMトリス-塩酸、pH8.0、0.1M塩化ナトリウム、1mMEDTA)に懸濁し、15分間の超音波破砕により完全に菌体を破砕した。これを菌体試料とした。
次にインフルエンザH5N1の267〜333aa断片をさらに細分化した断片C1(41〜333aa)、C2(41〜322aa)、C3(41〜311aa)、C4(41〜300aa)、C5(41〜289aa)、C6(41〜278aa)およびC7(41〜267aa)をPCR法で増幅した。増幅断片をQIAGEN社のPCR Purification Kitで精製し、昆虫細胞発現用プラスミドpBac-EGTs-6A(Invitrogen社製pFastBac1ベクターを改変)のBamHI-XbaI部位に挿入し、プラスミpBacInf.H5N1-C1, pBacInf.H5N1-C2, pBacInf.H5N1-C3, pBacInf.H5N1-C4, pBacInf.H5N1-C5, pBacInf.H5N1-C6およびpBacInf.H5N1-C7を作製した。これらをBacmid作製用大腸菌DH10Bacに形質転換を行いBacmid-Inf.H5N1-C1, Bacmid-Inf.H5N1-C2, Bacmid-Inf.H5N1-C3, Bacmid-Inf.H5N1-C4, Bacmid-Inf.H5N1-C5, Bacmid-Inf.H5N1-C6および Bacmid-Inf.H5N1-C7を作製した。
3-7で作製した7種類のBacmidDNAを昆虫細胞Sf-21(Invitrogen社製)にトランスフェクションを行い組換えウイルスP1-C1, P1-C2, P1-C3, P1-C4, P1-C5, P1-C6およびP1-C7を作製した。これらのP1の一部をSf21細胞へ感染させ27℃,4日間培養後、3000rpm 20分間遠心分離で培養上清を回収した。これをEnzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA法)の試料とした。
モノクローナル抗体IFH5-115、IFH5-136、IFH5-26のH5亜型A型インフルエンザウイルスに対する中和抗体活性の有無について試験した。インフルエンザウイルスはA/dk/Hokkaido/84/02(H5N3)及びA/PR/8/34(H1N1)を使用した。各モノクローナル抗体をイーグルMEM培地で2n希釈し、各抗体希釈液50μLを96ウェルプレートに添加した。A/dk/Hokkaido/84/02(H5N3)及びA/PR/8/34(H1N1)を200 TCID50/25μLになように希釈し、このウイルス希釈液を各抗体希釈ウエルに25μL添加した(蛋白質濃:0〜160μg/25μL)。室温で1hrインキュベートした(ウイルス-抗体混合液)。一方、MDCK細胞を予め10%牛胎児血清を含むイーグルMEM培地でコンフリエントに培養し、培養上清を除去し、イーグルMEM培地で1回洗浄したMDCK培養-48ウエルプレートに上記ウイルス-抗体混合液を75μL添加し、35℃で1hrインキュベートした。次に、各ウエルに0.0005% トリプシンを含むイーグルMEM培地を150μL添加し、35℃、5%炭酸ガス存在下で培養を開始した。培養3日目でウイルスの細胞障害の中和抗体活性による阻害を顕微鏡下で確認し、中和活性の有無を確認した。細胞障害が起きている場合には、ウイルス感染による細胞融合に起因する細胞の円形化が観察される。細胞障害が起きていない場合には、モノクローナル抗体が、該ウイルスの中和活性を有していると判断できる。
図6に示すように、巾5mm、長さ50mmのニトロセルロース膜(ミリポア社製)のマトリクス2の展開液吸収ゾーン5側の末端から15mmの位置に抗インフルエンザA型H5特異抗体(IFH5-26)を含む水溶液0.7μlをニトロセルロース膜に点着し乾燥させ、検出ゾーン6を作成した。更にマトリクス2の展開液吸収ゾーン5側の末端から12mmの位置に抗アルカリホスファターゼ抗体(ウサギ)を点着し乾燥させ、展開確認部10を作成した。次いで、マトリクスにIFH5-115抗体をアルカリホスファターゼで標識したアルカリホスファターゼ標識抗インフルエンザA型H5特異抗体(ALP- IFH5-115,10μg/ml)5μlを点着し乾燥させ、酵素標識試薬パッド4からなる標識試薬ゾーンを作成した。
実施例5の図6と同様に、巾5mm、長さ50mmのニトロセルロース膜(ミリポア社製)のマトリクス2の展開液吸収ゾーン5側の末端から15mmの位置に抗インフルエンザA型H5特異抗体(IFH5-136)を含む水溶液0.7μLをニトロセルロース膜に点着し乾燥させ、検出ゾーン6を作成した。更にマトリクス2の展開液吸収ゾーン5側の末端から12mmの位置に抗アルカリホスファターゼ抗体(ウサギ)を点着し乾燥させ、展開液確認部10を作成した。次いで、マトリクスにIFH5-115抗体をアルカリホスファターゼで標識したアルカリホスファターゼ標識抗インフルエンザA型H5特異抗体(ALP- IFH5-115,10μg/mL)5μLを点着し乾燥させ、酵素標識試薬パッド4からなる標識試薬ゾーンを作成した。
実施例5の図6と同様に、巾5mm、長さ50mmのニトロセルロース膜(ミリポア社製)のマトリクス2の展開液吸収ゾーン5側の末端から15mmの位置に抗インフルエンザA型H5特異抗体(IFH5-136)を含む水溶液0.7μLをニトロセルロース膜に点着し乾燥させ、検出ゾーン6を作成した。更にマトリクス2の展開液吸収ゾーン5側の末端から12mmの位置に抗アルカリホスファターゼ抗体(ウサギ)を点着し乾燥させ、展開液確認部10を作成した。次いで、マトリクスにIFH5-26抗体をアルカリホスファターゼで標識したアルカリホスファターゼ標識抗インフルエンザA型H5特異抗体(ALP- IFH5-26,10μg/mL)を5μLを点着し乾燥させ、酵素標識試薬パッド4からなる標識試薬ゾーンを作成した。
前記実施例5、6及び7で製造したインフルエンザA型H5免疫測定(イムノクロマト)器具1、2及び3(本発明測定器具)を使用し各種インフウレンザA型ウイルス亜型検体を使用して免疫測定器具のインフルエンザAウイルス亜型(H1-15)に対する反応特異性を試験した。使用したインフルエンザA型ウイルス亜型検体は各ウイルスを孵化鶏卵で培養し回収した赤血球凝集価(HA価)既知の漿尿液を使用した(表4参照)。各漿尿液は試料希釈液(界面活性剤を含むトリス緩衝液(pH8.0))で10倍希釈し、その30μLを検体点着ゾーン8に表3に滴下した後、変形部材に設けた押し込み部12を下方に加圧して変形させて、変形部材に付設された突起部13によって展開液パッド3を展開液槽11に挿入して展開液を展開液パッド3に供給して測定を開始した。測定開始15分後、対象試薬ゾーン10の発色によって展開液の展開を確認した後、検出ゾーン6の発色を目視で測定した。その結果を表7に示す。本免疫測定器具は何れもインフルエンザA型ウイルスH5亜型を特異的に検出し他のインフルエンザA型ウイルス亜型(H1-4及びH6-15)とは反応しないことが確認された。
図9に示すように、巾5mm、長さ50mmのニトロセルロース膜(ミリポア社製)のマトリクス2の展開液吸収ゾーン5側の末端から16mmと13.5mmの位置にそれぞれ参考例2で製造した抗H5亜型A型インフルエンザウイルスヘマグルチニンH5特異抗体(IFH5-26)および抗インフルエンザA型ウイルス抗体(FVA2-11)(文献:Gui-Rong BAI et.al.:Improvement of a Rapid Diagnosis Kit to Detect Either Influenza A or B Virus Infection. J.Vet.Med.Sci.68(1);1-6,2006)を含む水溶液0.7μLをニトロセルロース膜にそれぞれ点着し乾燥させ、検出ゾーン6a及び6bを作成した。更にマトリクス2の展開液吸収ゾーン5側の末端から11mmの位置に抗アルカリホスファターゼ抗体(ウサギ)を点着し乾燥させ、展開確認部10を作成した。次いで、マトリクスに参考例1で製造したアルカリホスファターゼ標識抗インフルエンザA型ウイルス抗体(5μg/mL)とアルカリホスファターゼ標識抗インフルエンザA型H5特異抗体(ALP- IFH5-115(10μg/mL)との混合水溶液5μLを点着し乾燥させ、酵素標識試薬パッド4からなる標識試薬ゾーンを作成した。
実施例9で製造した作成したインフルエンザA型ウイルス及びA型H5ウイルス同時免疫測定器具4(本発明測定器具)の検体添加ゾーン8に表7又は8に記載されたインフルエンザA型ウイルスの亜型試料(試料希釈液として、界面活性剤を含むトリス緩衝液(pH8.0)を使用)各30μLを添加した後、変形部材に設けた押し込み部12を下方に加圧して変形させて、変形部材に付設された突起部13によって展開液パッド3を展開液槽11に挿入して展開液を展開液パッド3に供給して測定を開始した。測定開始15分後、展開確認部10の発色によって展開液の展開を確認した後、検出ゾーン6a及び6bの発色を目視で測定した。
Claims (5)
- H5亜型A型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンと抗原抗体反応し、その対応エピトープが、レセプターサブドメイン(但し、そのC末端11アミノ酸から成る領域を除く)中に存在せず、前記A型インフルエンザウイルスの中和活性を有さず、H1亜型〜H4亜型及びH6亜型〜H15亜型のヘマグルチニンとは実質的に交差反応しない抗H5亜型A型インフルエンザウイルスヘマグルチニンモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片とH5亜型A型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンとの抗原抗体反応を利用した免疫測定により検体中のH5亜型A型インフルエンザウイルスを測定することを含む、H5亜型A型インフルエンザウイルスの免疫測定方法であって、
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片のエピトープが配列番号2に示されるアミノ酸配列を基準として、
(1) 41〜60aa及び312〜322aaの領域、
(2) 61〜80aa及び290〜300aaの領域、又は
(3) 101〜113aa及び268〜278aaの領域
に存在する3種類のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片のうち、単一のH5亜型A型インフルエンザウイルスに同時に結合可能な2種類のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を用いるサンドイッチ法により検体中のH5亜型A型インフルエンザウイルスを測定することを含む、H5亜型A型インフルエンザウイルスの免疫測定方法。 - イムノクロマトグラフィーによる請求項1記載の方法。
- H5亜型A型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンと抗原抗体反応し、その対応エピトープが、レセプターサブドメイン(但し、そのC末端11アミノ酸から成る領域を除く)中に存在せず、前記A型インフルエンザウイルスの中和活性を有さず、H1亜型〜H4亜型及びH6亜型〜H15亜型のヘマグルチニンとは実質的に交差反応しない抗H5亜型A型インフルエンザウイルスヘマグルチニンモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片であって、
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片のエピトープが配列番号2に示されるアミノ酸配列を基準として、
(1) 41〜60aa及び312〜322aaの領域、
(2) 61〜80aa及び290〜300aaの領域、又は
(3) 101〜113aa及び268〜278aaの領域
に存在する3種類のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片のうち、単一のH5亜型A型インフルエンザウイルスに同時に結合可能な2種類のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含む、H5亜型A型インフルエンザウイルスの免疫測定用キット。 - 前記2種類のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片のうちの一方が固相に固定化され、他方が標識されている請求項3記載のキット。
- 前記固相がイムノクロマトグラフィー用の固相である請求項4記載のキット。
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