JP5585981B2 - Photoresponsive liposome and method for transporting substance using photoresponsive liposome - Google Patents
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Description
本発明は、光応答性のリポソームに関し、特に異種の光を照射することにより膜孔の開閉を可逆的に制御できるリポソームに関するものである。 The present invention relates to a photoresponsive liposome, and more particularly to a liposome capable of reversibly controlling the opening and closing of membrane pores by irradiating different kinds of light.
リポソームは、リン脂質等の脂質２分子膜によって形成され、数１０ｎｍ〜数１０μｍの粒径を有する微小なカプセルであり、その内部に様々な分子を封入可能な水相を有する。このリポソームは、生体適合性や生分解性にも優れていることから、内部の水相に薬剤や生理活性物質を封入することで所望量の薬物を体内の標的部位に選択的に運搬するドラックキャリアになり得る製剤として注目を集めている。 A liposome is a microcapsule formed by a lipid bimolecular film such as phospholipid and having a particle size of several tens of nm to several tens of μm, and has an aqueous phase in which various molecules can be enclosed. Since these liposomes are excellent in biocompatibility and biodegradability, a drug that selectively transports a desired amount of drug to a target site in the body by encapsulating a drug or bioactive substance in the internal aqueous phase. It is attracting attention as a preparation that can be a carrier.
これまでに、例えば、温度の感受性やｐＨの感受性を利用したリポソームが提案されている（例えば、特許文献１参照）。ここで、温度感受性リポソームとは、ある特定の温度において中に閉じ込めた薬物を放出するリポソームのことである。通常、ゲル−液晶間の相転移温度が利用され、これより高温になった液晶状態のリポソームは、その膜透過性が高まり、内包していた薬物を放出する。また、ｐＨ感受性リポソームとはｐＨにより脂質分子の会合状態が変化するリポソームのことである。ｐＨ感受性リポソームは、通常、ジオレオイルエタノールアミンを含み、弱酸性環境下において膜透過性が高まり内包していた薬物を放出する。 So far, for example, liposomes utilizing temperature sensitivity and pH sensitivity have been proposed (see, for example, Patent Document 1). Here, a temperature-sensitive liposome is a liposome that releases a drug trapped therein at a specific temperature. Usually, the phase transition temperature between the gel and the liquid crystal is utilized, and the liposome in the liquid crystal state having a higher temperature increases its membrane permeability and releases the encapsulated drug. The pH-sensitive liposome is a liposome in which the association state of lipid molecules changes with pH. The pH-sensitive liposome usually contains dioleoylethanolamine and releases a drug contained therein with increased membrane permeability in a weakly acidic environment.
ところで、近年、アゾベンゼン脂質を含有したリポソームの光制御に関する研究が行われており（非特許文献１〜４を参照）、ＵＶ（紫外線）光照射によるアゾベンゼン脂質の分子構造の変化が、膜の透過性を上げ、物質を放出させることが明らかになっている。例えば、非特許文献１又は２では、アゾベンゼン脂質含有リポソームにＵＶ光を照射させることで蛍光物質の漏れが促進されることが開示されている。また、非特許文献３では、アゾベンゼン脂質含有リポソームへのＵＶ光の照射によって膜透過率が５倍程度上昇することが示されている。非特許文献４では、ＵＶ光の照射によってアゾベンゼン脂質含有リポソームが崩壊し、物質が放出されることが開示されている。 By the way, in recent years, studies on the light control of liposomes containing azobenzene lipids have been conducted (see Non-Patent Documents 1 to 4). It has been shown to increase the properties and release substances. For example, Non-Patent Document 1 or 2 discloses that leakage of a fluorescent substance is promoted by irradiating azobenzene lipid-containing liposomes with UV light. Further, Non-Patent Document 3 shows that the membrane transmittance is increased about 5 times by irradiating azobenzene lipid-containing liposomes with UV light. Non-Patent Document 4 discloses that azobenzene lipid-containing liposomes are disrupted by UV light irradiation, and substances are released.
しかしながら、従来のアゾベンゼン脂質含有リポソームをドラックキャリアとして用いる場合には、以下のような問題が指摘されている。 However, when the conventional azobenzene lipid-containing liposome is used as a drug carrier, the following problems have been pointed out.
（１）リポソームに内包された物質（薬物）を生体内に放出させるにはＵＶ光の照射が要求されることになるが、ＵＶ光が生体に及ぼすダメージが懸念される。例えば、ＵＶ光はエネルギー密度が高く、細胞内のＤＮＡを切断してしまう等の恐れがある。 (1) In order to release the substance (drug) encapsulated in the liposome into the living body, irradiation with UV light is required. However, there is a concern that the UV light may damage the living body. For example, UV light has a high energy density, and may break DNA in cells.
（２）また、リポソーム膜内部に存在する物質の移動は膜内外の濃度勾配に左右されるため、リポソーム膜外部の溶液中の物質濃度が高い場合には、当該物質を膜の内部から外部へ放出することができない。 (2) Moreover, since the movement of the substance existing inside the liposome membrane depends on the concentration gradient inside and outside the membrane, when the substance concentration in the solution outside the liposome membrane is high, the substance is moved from the inside of the membrane to the outside. It cannot be released.
（３）リポソームからの物質放出時の制御についての報告例が多く、これらの報告例ではリポソームへの物質の封入についてはリポソーム作製時に限定されている。これは、従来技術においては、膜透過率の制御のみが可能であるため、物質封入の制御が非常に困難であったことが推測される。 (3) reported examples of control during substance release from the liposomes often, these reported cases are limited to liposomes during manufacturing For the encapsulation of materials into liposomes. This is presumed that, in the prior art, only the membrane permeability can be controlled, so that it is very difficult to control the substance encapsulation.
（４）また、物質放出にあたってＵＶ光を照射することによりリポソーム膜が破壊されてしまう報告例が多く、その膜を可逆的に復元できるものではない。 (4) Moreover, there are many reports that the liposome membrane is destroyed by irradiating UV light when releasing the substance, and the membrane cannot be reversibly restored.
本発明は、このような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、従来の光応答性リポソームが有する欠点を排除したリポソームを提供することを目的とする。すなわち、リポソーム膜を可逆的に光反応させることで、リポソームへの物質の封入とリポソームからの物質の放出を制御可能な光応答性リポソーム及びこれを利用した物質の運搬方法を提供することを目的とする。 The present invention has been proposed in view of such a conventional situation, and an object of the present invention is to provide a liposome that eliminates the disadvantages of conventional photoresponsive liposomes. That is, an object of the present invention is to provide a photoresponsive liposome capable of controlling the encapsulation of a substance in the liposome and the release of the substance from the liposome by reversibly photoreacting the liposome membrane, and a method for transporting the substance using the liposome. And
また、本発明は、生体に害を及ぼすことなく生体内の標的部位に物質を放出可能な光応答性リポソーム及びこれを利用した物質の運搬方法を提供することを目的とする。 Another object of the present invention is to provide a photoresponsive liposome capable of releasing a substance to a target site in the living body without causing harm to the living body and a method for transporting the substance using the liposome.
さらに、本発明は、膜内外における物質の濃度勾配に依存せずに、物質の封入・放出が可能な光応答性リポソーム及びこれを利用した物質の運搬方法を提供することを目的とする。 Furthermore, an object of the present invention is to provide a photoresponsive liposome capable of enclosing and releasing a substance without depending on the concentration gradient of the substance inside and outside the membrane, and a method for transporting the substance using the same.
さらに、本発明は、リポソーム作製後のタイミングでも、膜内へ物質の封入が可能な光応答性リポソーム及びこれを利用した物質の運搬方法を提供することを目的とする。 Furthermore, an object of the present invention is to provide a photoresponsive liposome capable of enclosing a substance in the membrane even at the timing after the preparation of the liposome, and a method for transporting the substance using the liposome.
本願発明者らは、比較的低いゲル−液晶相転移温度を有したリン脂質（例えば、不飽和リン脂質）とアゾベンゼン脂質とを、所定の緩衝液中で混合した溶液中に小胞化したリポソームが形成されること、異種の光（例えば、ＵＶ光と緑光）の照射を制御することで膜孔が可逆的に生成・消滅されること、及び、さらに、この膜孔を介して、リポソームへの物質の封入とリポソームからの物質の放出とが可能になることを見出し、本発明を完成するに至った。 The inventors of the present application have disclosed liposomes in which vesicles are formed in a solution obtained by mixing a phospholipid having a relatively low gel-liquid crystal phase transition temperature (for example, an unsaturated phospholipid) and an azobenzene lipid in a predetermined buffer solution. It is formed, membrane pores are reversibly generated and extinguished by controlling the irradiation of different kinds of light (for example, UV light and green light), and further, via this membrane pore, liposomes are formed. The inventors have found that it is possible to enclose a substance and release the substance from the liposome, and have completed the present invention.
すなわち、本発明は、アゾベンゼン脂質と、リン脂質と、をトリス塩酸緩衝液中で分散させて生成された光応答性リポソームであって、
前記アゾベンゼン脂質は、ＫＡＯＮ１２（正式名称はＮ−［４−［４’−［Ｎ，Ｎ−ビス−［３−（Ｎ−リジルアミノ）プロピル］アミノカルボニル］フェニルアゾ］フェノキシアセチル］ジドデシルアミンであり、かつ、その疎水基の炭素数が１２である）であり、
前記リン脂質は、ＤＯＰＣ（ジオレオイルフォスフォコリン）又はＳＯＰＣ（ステアロイルオレオイルフォスフォコリン）であり、
前記アゾベンゼン脂質の濃度が３５％以上４３％未満となりかつその残余が前記リン脂質となるように、前記アゾベンゼン脂質と前記リン脂質とは配合され、
前記リン脂質は前記リポソームの使用温度より低いゲル−液晶相転移温度を有し、
前記リポソームは、異種の光が別々のタイミングで照射されることにより、膜上に膜孔を可逆的に形成又は消滅することを特徴とするものである。
That is, the present invention is a photoresponsive liposome produced by dispersing azobenzene lipid and phospholipid in Tris-HCl buffer,
The azobenzene lipid is KAON12 (official name is N- [4- [4 ′-[N, N-bis- [3- (N-lysylamino) propyl] aminocarbonyl] phenylazo] phenoxyacetyl] didodecylamine; And the hydrophobic group has 12 carbon atoms)
The phospholipid is DOPC (dioleoylphosphocholine) or SOPC (stearoyl oleoylphosphocholine),
The azobenzene lipid and the phospholipid are blended so that the concentration of the azobenzene lipid is 35% or more and less than 43% and the remainder is the phospholipid.
The phospholipid has a gel-liquid crystal phase transition temperature lower than the use temperature of the liposome;
The liposome is characterized by reversibly forming or extinguishing a membrane pore on the membrane by irradiating different kinds of light at different timings.
ここで、「脂質」とは、疎水基と親水基を含む分子のことである。また、「アゾベンゼン脂質」とは、疎水基と親水基とがアゾベンゼンにより結合した脂質のことである。 Here, the “lipid” is a molecule containing a hydrophobic group and a hydrophilic group. The “azobenzene lipid” is a lipid in which a hydrophobic group and a hydrophilic group are bound by azobenzene.
また、「リポソームの使用温度」とは、本発明のリポソームを生成若しくは光応答させる際のリポソーム温度、又はリポソームを利用して物質の運搬を行う際のリポソーム温度のことであり、通常、室温から体温程度の温度である。つまり、リン脂質は、リポソーム使用温度において液晶になるものが選択されている。 The “use temperature of the liposome” means the liposome temperature when the liposome of the present invention is produced or photoresponsive, or the liposome temperature when a substance is transported using the liposome, and usually from room temperature. The temperature is about the same as body temperature. That is, a phospholipid that is liquid crystal at the liposome use temperature is selected.
また、光応答性リポソームを利用した物質の運搬方法も本発明として提供される。すなわち、
第１の光を前記リポソームに照射し、前記膜上に存在する膜孔を消滅させて前記物質を前記膜内に封入する工程と、
前記リポソームを目標位置まで移動させる工程と、
前記第１の光とは異なる第２の光を前記リポソームに照射し、前記膜上に膜孔を形成させて前記物質を前記膜外へ放出する工程と、
を含み、かつ、
前記リポソームは、アゾベンゼン脂質と、前記リポソームの使用温度より低いゲル−液晶相転移温度を有したリン脂質と、をトリス塩酸緩衝液中で分散させて生成され、
前記アゾベンゼン脂質は、ＫＡＯＮ１２（正式名称はＮ−［４−［４’−［Ｎ，Ｎ−ビス−［３−（Ｎ−リジルアミノ）プロピル］アミノカルボニル］フェニルアゾ］フェノキシアセチル］ジドデシルアミンであり、かつ、その疎水基の炭素数が１２である）であり、
前記リン脂質は、ＤＯＰＣ（ジオレオイルフォスフォコリン）又はＳＯＰＣ（ステアロイルオレオイルフォスフォコリン）であり、
前記アゾベンゼン脂質の濃度が３５％以上４３％未満となりかつその残余が前記リン脂質となるように、前記アゾベンゼン脂質と前記リン脂質とは配合され、
前記膜孔の形成と消滅とが前記第１・第２の光の照射により可逆的に生じるものであり、
前記物質の運搬により、前記物質は人体に投与されないことを特徴とするものである。
Moreover, the delivery method of the substance using a photoresponsive liposome is also provided as this invention. That is,
Irradiating the liposome with first light, erasing membrane pores existing on the membrane, and enclosing the substance in the membrane;
Moving the liposome to a target position;
Irradiating the liposome with a second light different from the first light, forming a membrane pore on the membrane, and releasing the substance out of the membrane;
Including, and
The liposome is produced by dispersing azobenzene lipid and a phospholipid having a gel-liquid crystal phase transition temperature lower than the use temperature of the liposome in a Tris-HCl buffer.
The azobenzene lipid is KAON12 (official name is N- [4- [4 ′-[N, N-bis- [3- (N-lysylamino) propyl] aminocarbonyl] phenylazo] phenoxyacetyl] didodecylamine; And the hydrophobic group has 12 carbon atoms)
The phospholipid is DOPC (dioleoylphosphocholine) or SOPC (stearoyl oleoylphosphocholine),
The azobenzene lipid and the phospholipid are blended so that the concentration of the azobenzene lipid is 35% or more and less than 43% and the remainder is the phospholipid.
Formation and annihilation of the membrane hole are reversibly caused by the irradiation of the first and second light ,
The substance is not administered to the human body due to the transportation of the substance .
なお、本願発明者らによって現在までになされたアゾベンゼン脂質含有リポソームに関する研究成果として、非特許文献５〜７が挙げられるが、いずれもリポソーム形状の変化についての基礎的検討結果であり、物質の放出・封入、とりわけ、これを左右する膜孔の可逆的な開閉に関する知見を開示したものではない。 In addition, Non-Patent Documents 5 to 7 are mentioned as research results related to azobenzene lipid-containing liposomes made by the present inventors to date, all of which are basic examination results on changes in liposome shape and release of substances. -It does not disclose the knowledge about the encapsulation, especially the reversible opening and closing of the membrane pores that affect this.
本発明の光応答性リポソーム及びこれを利用した物質の運搬方法は、リポソーム膜上に膜孔を形成しこの膜孔を直接開閉できるため、膜内外の物質の濃度勾配に依らずに、物質（薬物）を放出することができる。 Since the photoresponsive liposome of the present invention and the method for transporting a substance using the liposome can form a membrane pore on the liposome membrane and directly open and close the membrane pore, the substance ( Drug).
また、本発明の光応答性リポソーム及びこれを利用した物質の運搬方法は、異種の光を照射することにより、膜孔の開閉を可逆的にコントロールできるので、リポソーム作製後においても物質を封入することができる。 In addition, the photoresponsive liposome of the present invention and the method of transporting a substance using the same can reversibly control the opening and closing of membrane pores by irradiating different kinds of light, so that the substance is encapsulated even after liposome preparation. be able to.
本発明のある態様に係る光応答性リポソーム及びこれを利用した物質の運搬方法は、生体内への標的部位に物質を放出させるためにリポソームに照射する光として緑光を使用するため、生体への害が無い。 Photoresponsive liposomes and delivery how the utilization substance the same according to an aspect of the present invention, in order to use the green light as the light to be irradiated to the liposome in order to release the substance at the target site into the living organism, the organism There is no harm.
なお、リポソームを反応させるために光を利用するが、光は大変効率的な伝達媒体であり、非接触的かつ非浸食的にエネルギーをリポソームへ注入でき、即効性がある。 Although light is used to react the liposomes, light is a very efficient transmission medium, and energy can be injected into the liposomes in a non-contact and non-erosive manner, which has an immediate effect.
以下、本発明を図面に示す実施の形態に基づき説明するが、本発明は、下記の具体的な実施形態に何等限定されるものではない。 Hereinafter, although the present invention is explained based on an embodiment shown in a drawing, the present invention is not limited to the following concrete embodiment at all.
本発明の光応答性リポソームは、アゾベンゼン脂質と、リン脂質と、をトリス塩酸緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）中で分散させて生成される。本発明のリポソームは、例えば、積層膜水和法によって生成することができる。具体的には、これらの脂質分子を溶解させたクロロホルム等の有機溶媒を乾燥させ、試験管の底に積層膜を作製しておき、トリス塩酸緩衝液を加え、積層していた２分子膜を分離・小胞化することで、本発明の光応答性リポソームが得られる。 The photoresponsive liposome of the present invention is produced by dispersing azobenzene lipid and phospholipid in Tris-HCl buffer (Tris-HCl). The liposome of the present invention can be produced, for example, by a laminated film hydration method. Specifically, an organic solvent such as chloroform in which these lipid molecules are dissolved is dried, a laminated film is prepared at the bottom of the test tube, a tris-HCl buffer is added, and the laminated bimolecular film is removed. The photoresponsive liposome of the present invention can be obtained by separation and vesicle formation.
ここで、アゾベンゼン脂質とは、疎水基と親水基とがアゾベンゼンにより結合した脂質であり、例えば、ＫＡＯＮ、ＲＡＯＮ、ＡＺＴＭＡ、Ｐａｚｏ ＰＣ、などが挙げられる。特に本発明のアゾベンゼン脂質は、光反応性の面からＫＡＯＮであることが好ましい。 Here, the azobenzene lipid is a lipid in which a hydrophobic group and a hydrophilic group are bonded by azobenzene, and examples thereof include KAON, RAON, AZTMA, and Pazo PC. In particular, the azobenzene lipid of the present invention is preferably KAON from the viewpoint of photoreactivity.
なお、ＫＡＯＮ（正式名称はＮ−［４−［４’−［Ｎ，Ｎ−ビス−［３−（Ｎ−リジルアミノ）プロピル］アミノカルボニル］フェニルアゾ］フェノキシアセチル］ジドデシルアミン）とは、本願発明者の一人である長崎によって初めて発見・作製されたアゾベンゼン脂質であり、疎水基の炭素数によってＫＡＯＮ８やＫＡＯＮ１２と呼ばれている。本発明の作用効果を有利に奏するには、ＫＡＯＮは３０％より大きく４５％未満の濃度を有することがさらに好ましい。なお、以下の実施例では、ＫＡＯＮ１２をアゾベンゼン脂質として採用した。 KAON (official name is N- [4- [4 ′-[N, N-bis- [3- (N-lysylamino) propyl] aminocarbonyl] phenylazo] phenoxyacetyl] didodecylamine) An azobenzene lipid first discovered and produced by Nagasaki, one of the scientists, and is called KAON8 or KAON12 depending on the carbon number of the hydrophobic group. In order to advantageously exhibit the effects of the present invention, it is more preferable that KAON has a concentration of more than 30% and less than 45%. In the following examples, KAON12 was employed as the azobenzene lipid.
また、ＲＡＯＮも、ＫＡＯＮと同様に本願発明者の一人である長崎によって初めて発見・作製されたアゾベンゼン脂質であり、ＫＡＯＮと類似の分子構造を有する。また、ＡＺＴＭＡの正式名称は、４−Ｂｕｔｙｌａｚｏｂｅｎｚｅｎｅ−４’−（ｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅであり、その脂質の詳細は非特許文献４に記載されている。また、Ｐａｚｏ ＰＣの正式名称は、１−Ｈｅｘａｄｅｃａｎｏｙｌ−２−（４’−ｎ−ｂｕｔｙｌｐｈｅｎｙｌ）ａｚｏ−４’’（ｇａｎｍａ−ｐｈｅｎｙｌｂｕｔｙｒｏｙｌ））−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅであり、その脂質の詳細は非特許文献１に記載されている。 RAON is also an azobenzene lipid first discovered and produced by Nagasaki, one of the inventors of the present application, like KAON, and has a molecular structure similar to KAON. The official name of AZTMA is 4-Butylazobenzone-4 '-(oxyethyl) trimethylammonium bromide, and the details of the lipid are described in Non-Patent Document 4. The official name of Pazo PC is 1-Hexadecanyl-2- (4′-n-butylphenyl) azo-4 ″ (ganma-phenylbutyroyl))-glycero-3-phosphocholine, and details of its lipids are non-patented. It is described in Document 1.
また、リン脂質には、膜生成の観点から、そのゲル−液晶相転移温度（凝固温度とも呼ばれる）がリポソームの使用温度より低いものが選択されている。リン脂質は、好ましくは、少なくとも１つの疎水基が二重結合を有した不飽和脂質であり、例えば、ジオレオイルフォスフォコリン（ＤＯＰＣ、ゲル−液晶相転移温度−２３℃）やステアロイルオレオイルフォスフォコリン（ＳＯＰＣ、ゲル−液晶相転移温度６℃）等が挙げられる。ここで、リポソームの使用温度とは、本発明のリポソームを生成若しくは光応答させ、又はこのリポソームを利用して物質の運搬を行う際のリポソーム温度のことであり、通常、室温から体温程度の温度である。つまり、リン脂質は、リポソーム使用温度において液晶になるものが選択されている。 In addition, from the viewpoint of film formation, a phospholipid having a gel-liquid crystal phase transition temperature (also called a coagulation temperature) lower than the use temperature of the liposome is selected. The phospholipid is preferably an unsaturated lipid in which at least one hydrophobic group has a double bond, such as dioleoylphosphocholine (DOPC, gel-liquid crystal phase transition temperature -23 ° C.) or stearoyl oleoyl. Phosphocholine (SOPC, gel-liquid crystal phase transition temperature 6 ° C.) and the like. Here, the operating temperature of the liposome refers to the liposome temperature when the liposome of the present invention is produced or photoresponsive, or when the substance is transported using the liposome, and is usually from room temperature to body temperature. It is. That is, a phospholipid that is liquid crystal at the liposome use temperature is selected.
また、異種の光を別々のタイミングで光応答性リポソームに照射することにより、膜上に膜孔が可逆的に形成又は消滅することを特徴とする。例えば、アゾベンゼン脂質がＫＡＯＮである場合、異種の光は緑光及び紫外光であることが好ましい。これにより、緑光をリポソームに照射することで膜上に膜孔を形成させたり、紫外光をリポソームに照射することでこの膜孔を消滅させたりすることができる。言い換えれば、上記光の照射によりＫＡＯＮがｃｉｓ体とｔｒａｎｓ体とのいずれかの状態をとりつつ、ＫＡＯＮを含んだリポソームも変形し、膜上に膜孔が形成・消滅するのである。なお、紫外光は３００ｎｍ〜４００ｎｍの波長を有する光であり、緑光は５００ｎｍ〜６００ｎｍの波長を有する光である。 In addition, it is characterized in that a membrane pore is reversibly formed or disappears on the membrane by irradiating the photoresponsive liposome with different kinds of light at different timings. For example, when the azobenzene lipid is KAON, the different kinds of light are preferably green light and ultraviolet light. Thereby, the membrane pore can be formed on the membrane by irradiating the liposome with green light, or the membrane pore can be eliminated by irradiating the liposome with ultraviolet light. In other words, the KAON takes either a cis body or a trans body by the light irradiation, and the liposome containing the KAON is also deformed, and a membrane pore is formed and disappears on the membrane. The ultraviolet light is light having a wavelength of 300 nm to 400 nm, and the green light is light having a wavelength of 500 nm to 600 nm.
また、リン脂質はその親水基が帯電（負に帯電）していないことが好ましい。親水基への帯電は膜構造全体を拘束させる力を生ずることがあり、光の照射によるリポソーム膜形状の変化が起きにくくなってしまう恐れがあるからである。 Moreover, it is preferable that the hydrophilic group of the phospholipid is not charged (negatively charged). This is because the charging to the hydrophilic group may cause a force that restrains the entire membrane structure, and the liposome membrane shape may not easily change due to light irradiation.
本発明の実施例として、リン脂質にＤＯＰＣ、アゾベンゼン脂質にＫＡＯＮ１２を用い、ＤＯＰＣとＫＡＯＮ１２とを４：３の割合で混合した脂質を濃度１０ｍＭ（ミリモーラー）のＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で分散させたリポソームを用意した。なお、ＤＯＰＣとＫＡＯＮ１２とを混合した全体の脂質の濃度は０．４ｍＭに設定した。 As an embodiment of the present invention, DOPC phospholipid, using KAON12 azobenzene lipids, DOPC and KAON12 and a 4: 3 ratio in mixed lipid concentration 10mM of (millimolar) Tris-HCl (pH7.4) Liposomes dispersed in were prepared. In addition, the density | concentration of the whole lipid which mixed DOPC and KAON12 was set to 0.4 mM.
なお、図１はＫＡＯＮ１２の分子構造および光照射による構造変化を示す。図１の左右に、ＫＡＯＮ１２のｔｒａｎｓ構造とｃｉｓ構造とを示し、紫外光（図中ＵＶ）と緑光（図中Ｇ）とを照射することにより、分子構造は可逆的に変化する。 FIG. 1 shows the molecular structure of KAON12 and the structural change due to light irradiation. The trans structure and cis structure of KAON12 are shown on the left and right of FIG. 1, and the molecular structure is reversibly changed by irradiating with ultraviolet light (UV in the figure) and green light (G in the figure).
図２は、緑光照射後のリポソーム膜（実施例）の観察画像と膜形状の構成割合とを示す。図２（ａ）〜（ｄ）の上段に、緑光を照射した後に生成された様々な膜形状のリポソームの観察画像を示し、下段に観察画像に対応する模式図を示す。具体的には、球状（ｓｐｈｅｒｅ、図２（ａ）参照）、膜面上にまず小さな膜孔が形成されたカップ状（ｃｕｐ１、図２（ｂ）参照）、膜面上の膜孔部分がさらに増加したカップ状（ｃｕｐ２、図２（ｃ）参照）、及び平板状（ｄｉｓｃ、図２（ｄ）参照）のリポソームが確認された。なお、リポソーム膜中心Ｏから延びた膜孔の中心線と、膜中心Ｏから膜孔の外周円まで延びた線と、で画定される角度をθとした場合、上記ｃｕｐ１はθがπ／２未満になる膜孔を有する膜形状であるのに対し、上記ｃｕｐ２はθがπ／２以上になる膜孔を有する膜形状である。 FIG. 2 shows an observed image of the liposome membrane ( Example) after green light irradiation and the composition ratio of the membrane shape. Observation images of liposomes having various film shapes generated after irradiation with green light are shown in the upper part of FIGS. 2A to 2D, and schematic diagrams corresponding to the observation images are shown in the lower part. Specifically, a spherical shape (sphere, see FIG. 2A), a cup shape in which a small membrane hole is first formed on the membrane surface (cup1, see FIG. 2B), and a membrane hole portion on the membrane surface is Further increased cup-shaped (cup2, see FIG. 2 (c)) and flat (disc, see FIG. 2 (d)) liposomes were confirmed. When the angle defined by the center line of the membrane pore extending from the liposome membrane center O and the line extending from the membrane center O to the outer circumference of the membrane pore is θ, θ is π / 2 in the cup1. The cup2 is a film shape having a film hole having θ of π / 2 or more, whereas the film shape has a film hole having a film hole of less than.
本発明の光応答性リポソームの好適な組成、濃度等のパラメータの影響を検討するために、以下の表１に示すような試験条件を設定し、リポソーム膜の形成及び光応答性の評価を行った。なお、表１には、評価結果も示している。 In order to study the influence of parameters such as the preferred composition and concentration of the photoresponsive liposome of the present invention, the test conditions shown in Table 1 below were set, and the formation of the liposome membrane and the evaluation of the photoresponsiveness were performed. It was. Table 1 also shows the evaluation results.
（ＫＡＯＮ濃度の検討）
次に、本発明の光応答現象に最適なＫＡＯＮ濃度を検討するために、２０％（比較例１）、３０％（比較例２）、３５％（実施例１）、４０％（実施例２）、及び４５％（比較例３）のＫＡＯＮ濃度を有したリポソームを用意した。それぞれの場合におけるリポソームは５００個以上のサンプルを用意した。
(Examination of KAON concentration)
Next, 20% (Comparative Example 1), 30% (Comparative Example 2), 35% (Example 1), and 40% (Example 2) are studied in order to examine the optimum KAON concentration for the photoresponse phenomenon of the present invention. And liposomes having a KAON concentration of 45% (Comparative Example 3). As for the liposome in each case, 500 or more samples were prepared.
図２（ｅ）は緑光照射後の各サンプルにて観察された膜形状の構成割合を示したものである。ＫＡＯＮ濃度が２０％及び３０％で作製されたリポソーム（比較例１及び２）は全て球状（ｓｐｈｅｒｅ）である一方、ＫＡＯＮ濃度が３５％（実施例１）及び４０％（実施例２）で作製されたリポソームでは、緑光照射によって、球状、カップ状及び平板状のリポソーム膜が確認された。なお、４０％のＫＡＯＮ濃度の方がカップ状及び平板状のリポソーム膜が比較的多く生成されていることが確認された。また、ＫＡＯＮ濃度が４５％（比較例３）では、比較になるような小胞化したリポソームは生成されず、膜が不均一に繋がった巨大な塊になったため、図２（ｅ）に示さなかった。 FIG. 2 (e) shows the composition ratio of the film shape observed in each sample after green light irradiation. Liposomes prepared with KAON concentrations of 20% and 30% (Comparative Examples 1 and 2) are all spheres, while prepared with KAON concentrations of 35% (Example 1) and 40% (Example 2). In the prepared liposome, spherical, cup-shaped and flat-shaped liposome membranes were confirmed by green light irradiation. In addition, it was confirmed that cup-shaped and flat-plate-like liposome membranes were produced in a relatively large amount at a KAON concentration of 40%. In addition, when the KAON concentration was 45% (Comparative Example 3), comparative vesicular liposomes were not formed, and the membrane was formed into a massive lump that was connected non-uniformly, so that it is not shown in FIG. 2 (e). It was.
（リン脂質の検討）
実施例１では本発明のリポソームを構成するリン脂質としてＤＯＰＣを用いたが、比較のため、ＤＯＰＣに代えて、疎水基の一方に二重結合を有する飽和・不飽和脂質であるステアロイルオレオイルフォスフォコリン（ＳＯＰＣ、実施例３）、疎水基の両方に二重結合を有する飽和脂質であるジバルミトイルフォスフォコリン（ＤＰＰＣ、比較例４）、親水基がマイナスに帯電した不飽和脂質であるジオレオイルフォスフォグリセロール（ＤＯＰＧ、比較例５）を用いてリポソームの作製を試みた（図３参照）。そして、リポソームが無事作製された場合には緑光又はＵＶ光の照射による光応答性を観察した。なお、表１に示すように、リン脂質以外の構成物質、混合比、その他のリポソーム作製条件は実施例１と同様である。
(Examination of phospholipids)
In Example 1, DOPC was used as the phospholipid constituting the liposome of the present invention. For comparison, instead of DOPC, stearoyl oleoylphos, which is a saturated / unsaturated lipid having a double bond in one of the hydrophobic groups, was used. Focoline (SOPC, Example 3), divalmitoylphosphocholine (DPPC, Comparative Example 4), which is a saturated lipid having double bonds in both hydrophobic groups, and an unsaturated lipid in which the hydrophilic group is negatively charged An attempt was made to prepare liposomes using dioleoylphosphoglycerol (DOPG, Comparative Example 5) (see FIG. 3). And when the liposome was produced successfully, the photoresponsiveness by irradiation of green light or UV light was observed. As shown in Table 1, the components other than phospholipids, the mixing ratio, and other liposome preparation conditions are the same as in Example 1.
この結果、ＳＯＰＣを含んだ実施例３においても、ＤＯＰＣを含んだ実施例１と同様、光照射によって膜形状が球状〜平板状の間を行ったり来たりする可逆的変化が確認された。しかしながら、ＤＰＰＣを含んだ比較例４においてはリポソームが全く作製されなかった。また、ＤＯＰＧを含んだ比較例５においてはリポソームが作製されたものの、これに光を照射しても膜形状を平板状に変化させることはできなかった。 As a result, also in Example 3 including SOPC, a reversible change in which the film shape changed between a spherical shape and a flat plate shape by light irradiation was confirmed as in Example 1 including DOPC. However, in Comparative Example 4 containing DPPC, no liposome was produced. Moreover, although the liposome was produced in the comparative example 5 containing DOPG, even if this was irradiated with light, the film | membrane shape was not able to be changed into flat form.
このような差異を生じた理由は、ＤＯＰＣもＳＯＰＣも、そのゲル−液晶相転移温度がそれぞれ−２３℃と−６℃と低温であるため、リポソーム使用温度である室温では液晶であり、リポソーム作製及び光照射の際に膜が形状変化し易い状況になっていることが推察される。 The reason for this difference is that the gel-liquid crystal phase transition temperatures of DOPC and SOPC are as low as -23 ° C and -6 ° C, respectively. In addition, it is inferred that the film tends to change its shape during light irradiation.
一方、ＤＰＰＣはそのゲル−液晶相転移温度が４４℃であるため、室温ではゲルであり、リポソーム膜が形成されなかったと考えられる。また、ＤＯＰＧはそのゲル−液晶相転移温度が−１８℃であり、室温では液晶であるため、リポソームが作製され易い。しかしながら、親水基が負に帯電されているため、膜内に余分な力が生じ、膜形状の変化を制約していることが推察される。従って、ＫＡＯＮと組み合わせて本発明の光応答性リポソームを好適に作製するには、リン脂質がリポソーム使用温度（例えば、室温）で液晶であり、かつ、帯電していないことが要求されることが判明した。 On the other hand, since the gel-liquid crystal phase transition temperature of DPPC is 44 ° C., it is considered that the gel was a gel at room temperature and no liposome membrane was formed. Further, since DOPG has a gel-liquid crystal phase transition temperature of −18 ° C. and is a liquid crystal at room temperature, liposomes are easily produced. However, since the hydrophilic group is negatively charged, it is surmised that an extra force is generated in the film and restricts the change in the film shape. Therefore, in order to suitably produce the photoresponsive liposome of the present invention in combination with KAON, it is required that the phospholipid is liquid crystal at the liposome use temperature (for example, room temperature) and is not charged. found.
（緩衝液の検討）
次に、本発明の光応答現象に適した緩衝液を検討するために、実施例１で用いたＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）の他に、純水、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、及び、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）を用いてリポソームを作製した（表１の実施例４、比較例６及び７を参照）。その後、作製されたリポソームに光を照射して光応答性を観察した。
(Examination of buffer solution)
Next, in order to examine a buffer suitable for the photoresponse phenomenon of the present invention, in addition to Tris-HCl (pH 7.4) used in Example 1, pure water, Tris-HCl (pH 8.5), And the liposome was produced using HEPES (pH 7.4) (refer Example 4 of Table 1, and Comparative Examples 6 and 7). Thereafter, the prepared liposomes were irradiated with light to observe photoresponsiveness.
表１に示すように、実施例４のＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）も、実施例１のＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）と同様の光応答性が確認されたものの、比較例６の純水又は比較例７のＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）では平板状への膜形状の変化や膜孔の形成等の光応答性は確認されなかった。従って、本発明のリポソームを得るにはＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液が必須であるが、そのｐＨ濃度の範囲は特に限定されないことがわかった。 As shown in Table 1, Tris-HCl (pH 8.5) of Example 4 was also confirmed to have the same photoresponsiveness as Tris-HCl (pH 7.4) of Example 1, but the purity of Comparative Example 6 was In water or HEPES (pH 7.4) of Comparative Example 7, no photoresponsiveness such as a change in the shape of the membrane to a flat plate or the formation of membrane pores was confirmed. Therefore, it was found that a Tris-HCl buffer solution is essential to obtain the liposome of the present invention, but the pH concentration range is not particularly limited.
（光応答性リポソームを利用した物質の運搬）
図４は、実施例１の光応答性リポソームを用いて物質を封入・放出する様子を説明した図である。封入・放出用の物質として、φ０．５μｍ程度の寸法の蛍光性ポリスチレンビーズ（Ｆｌｕｏｒｅｓｂｒｉｔｅ ｍｕｌｕｔｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ， Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用い、光応答のため照射するＵＶ光の波長と緑光の波長とは、それぞれ、３６５ｎｍと５３２ｎｍとした。
(Transportation of substances using photoresponsive liposomes)
FIG. 4 is a diagram illustrating a state in which a substance is encapsulated and released using the photoresponsive liposome of Example 1. As a substance for encapsulation / release, fluorescent polystyrene beads having a size of about φ0.5 μm (Fluoresbrite multifluorescent microsphere, manufactured by Polyscience) are used, and the wavelengths of UV light and green light irradiated for photoresponse are respectively It was set to 365 nm and 532 nm.
図４の上段では、平板状のリポソームに紫外光（ＵＶ光）を照射すると、リポソーム膜は次第にカップ状から完全な球状に変化すること、及び、この膜形状の変化とともに膜付近に存在していたポリスチレンビーズも膜内に封入できたことが確認された。特に、カップ状のリポソーム膜上に存在する膜孔に注目すれば、ＵＶ光の照射を継続することにより膜孔は徐々に減少し、ひいては消滅することになる。なお、ＵＶ光の照射により、ＫＡＯＮの分子構造はｔｒａｎｓ構造からｃｉｓ構造へと変化する。 In the upper part of FIG. 4, when ultraviolet light (UV light) is irradiated to the plate-like liposome, the liposome membrane gradually changes from a cup shape to a perfect sphere, and the membrane shape changes and exists in the vicinity of the membrane. It was confirmed that polystyrene beads could be encapsulated in the membrane. In particular, if attention is paid to the membrane pores existing on the cup-shaped liposome membrane, the membrane pores gradually decrease and disappear as a result of continuing UV light irradiation. In addition, the UV light irradiation changes the molecular structure of KAON from the trans structure to the cis structure.
また、本発明のドラッグデリバリーへの適用を鑑みると、安全のため、ＵＶ光の光強度は小さい方が好ましい。現時点までの試験結果からは、３．７μＷ（マイクロワット）以上のＵＶ光で照射すれば本発明の光応答現象を起こすことが確認されている。 In view of application to the drug delivery of the present invention, it is preferable that the light intensity of the UV light is small for safety. From the test results up to the present time, it is confirmed that the photoresponse phenomenon of the present invention occurs when irradiated with UV light of 3.7 μW (microwatt) or more.
一方、図４の下段では、ポリスチレンビーズを膜内に封入した球状リポソームに緑光を照射していくと、先ず、膜上に小さな膜孔が形成され（上記ｃｕｐ１形状になり）、次いで膜孔が次第に拡大し（上記ｃｕｐ２形状になり）、最終的には膜が平板状になって、ポリスチレンビーズが放出される様子が確認された。なお、緑光の照射により、ＫＡＯＮの分子構造はｔｒａｎｓ構造からｃｉｓ構造へと変化する。 On the other hand, in the lower part of FIG. 4, when green light is irradiated onto spherical liposomes in which polystyrene beads are encapsulated in a membrane, first, a small membrane pore is formed on the membrane (the shape becomes cup1), and then the membrane pore is formed. It gradually expanded (becomes the cup2 shape), and finally the film became flat and it was confirmed that polystyrene beads were released. Note that the molecular structure of KAON changes from a trans structure to a cis structure by green light irradiation.
（リポソーム膜の縁に生じる張力の試算）
図５（ａ）は、ガラスプレートに付着した平板状のリポソーム膜を示した顕微鏡画像である。左側の画像はリポソーム膜に含まれるＫＡＯＮ１２がｔｒａｎｓ状態にある画像であり、右側の画像はリポソーム膜に含まれるＫＡＯＮ１２がｃｉｓ状態にある画像である。左右の画像を比較すると、ＫＡＯＮ１２がｔｒａｎｓ状態にある場合の方がリポソーム膜の縁が大きく揺らいでおり、膜縁の揺らぎに違いがあることが確認された。
(Estimation of tension generated at the edge of the liposome membrane)
FIG. 5A is a microscopic image showing a flat-plate-like liposome film attached to a glass plate. The left image is an image in which the KAON 12 included in the liposome membrane is in the trans state, and the right image is an image in which the KAON 12 included in the liposome membrane is in the cis state. When the left and right images were compared, it was confirmed that when the KAON 12 was in the trans state, the edge of the liposome membrane fluctuated more greatly, and there was a difference in the fluctuation of the membrane edge.
図５（ｂ）は、膜縁の揺らぎを定量的に分析するために用意したリポソーム膜の模式図である。膜縁の状態は、膜の重心Ｏから膜縁までの距離つまり半径ｒが、膜縁を一周する間（つまり、角度φが０から２πまで変化する間）にどの程度変化したかを測定することで把握することが可能になる。 FIG. 5B is a schematic diagram of a liposome membrane prepared for quantitatively analyzing the fluctuation of the membrane edge. The state of the film edge is measured by how much the distance from the center of gravity O of the film to the film edge, that is, the radius r, changes during one round of the film edge (that is, while the angle φ changes from 0 to 2π). It becomes possible to grasp it.
図５（ｃ）は、リポソーム膜縁（外周）に沿って実測した膜の半径ｒを示す。実線はＫＡＯＮ１２がｃｉｓ状態のときの測定結果であり、破線はｔｒａｎｓ状態のときの測定結果である。この図より、ｃｉｓ状態では半径ｒが５．２５〜５．８μｍの狭い範囲内で振れているのに対し、ｔｒａｎ状態では半径ｒが４．２５〜６．２５μｍの広い範囲内で振れていることが確認された。つまり、ｔｒａｎ状態ではｃｉｓ状態よりも膜縁が３倍程度大きな振幅で揺らいでいることが確認された。 FIG.5 (c) shows the radius r of the film | membrane measured along the liposome membrane edge (outer periphery). The solid line is the measurement result when the KAON 12 is in the cis state, and the broken line is the measurement result when in the trans state. From this figure, in the cis state, the radius r swings within a narrow range of 5.25 to 5.8 μm, whereas in the tran state, the radius r swings within a wide range of 4.25 to 6.25 μm. It was confirmed. That is, it was confirmed that in the tran state, the film edge fluctuates with an amplitude about three times larger than that in the cis state.
図６（ａ）は、膜縁揺らぎを構成する各波の大きさを示す図であり、具体的には図５（ｃ）にプロットされた各データ（φ，ｒ）を次式に従ってフーリエ変換したグラフである。 FIG. 6A is a diagram showing the magnitude of each wave constituting the film edge fluctuation. Specifically, each data (φ, r) plotted in FIG. 5C is Fourier transformed according to the following equation. It is a graph.
ここで、ｋは波数、つまり揺らぎ中の各波の成分であり、図６（ａ）のグラフ横軸のパラメータとして使用されている。また、ａｋ，ｂｋはそれぞれフーリエ係数であり、グラフ縦軸の（ａｋ ２＋ｂｋ ２）１／２は各波の大きさを示す。 Here, k is the wave number, that is, the component of each wave during fluctuation, and is used as a parameter on the horizontal axis of the graph in FIG. Further, ak and bk are Fourier coefficients, respectively, and (a k 2 + b k 2 ) 1/2 on the vertical axis of the graph indicates the magnitude of each wave.
図６（ｂ）は、図６（ａ）のグラフ軸をｌｏｇスケールに変換したグラフである。このグラフから、ｔｒａｎｓ状態及びｃｉｓ状態ともにプロットデータから直線的な近似線が描け、その近似直線の勾配が得られることが分かる。一方、キャピラリ・セオリーと呼ばれる次式により、波数ｋとフーリエ係数ａｋ，ｂｋとは以下の関係を有することが理論的に知られている。 FIG. 6B is a graph obtained by converting the graph axis of FIG. 6A to a log scale. From this graph, it can be seen that in both the trans state and the cis state, a linear approximate line can be drawn from the plot data, and the gradient of the approximate line can be obtained. On the other hand, it is theoretically known that the wave number k and the Fourier coefficients a k and b k have the following relationship according to the following equation called capillary theory.
ここで、ｒ０は膜の平均半径、Ｔは温度、ｋＢはボルツマン係数である。この式の左辺と右辺の括弧部は、それぞれ、図６（ｂ）の縦軸パラメータと横軸パラメータとに対応する。従って、図６（ｂ）の近似直線の勾配からｔｒａｎｓ状態又はｃｉｓ状態における膜面の張力σ（つまり、膜を閉じる力）を求めることができる。 Here, r0 is the average radius of the film, T is the temperature, and k B is the Boltzmann coefficient. The parentheses on the left and right sides of this equation correspond to the vertical axis parameter and the horizontal axis parameter in FIG. 6B, respectively. Therefore, the tension σ (that is, the force for closing the film) of the film surface in the trans state or the cis state can be obtained from the gradient of the approximate straight line in FIG.
上述の半径ｒ及び張力σは、リポソーム膜の１サンプルにつき測定・導出が可能であり、図６（ｃ）は３０個のサンプルから導出された張力σを統計的に示した結果である。この図６（ｃ）より、ｃｉｓ状態における張力σは、ｔｒａｎｓ状態における張力σよりも比較的大きな値を持って分散していることが確認された。また、平均値を計算すると、ｃｉｓ状態の張力σａｖは１．２ｐＮ（ｐＮ＝Ｎ×１０−１２）であるのに対し、ｔｒａｎｓ状態の張力σａｖは０．１８ｐＮであった。以上の検討結果より、ｃｉｓ状態の膜の方がｔｒａｎｓ状態の膜よりも膜を閉じる力が約１０倍大きいことが推察される。 The above-mentioned radius r and tension σ can be measured and derived for one sample of the liposome membrane, and FIG. 6C shows the result of statistically showing the tension σ derived from 30 samples. From FIG. 6C, it was confirmed that the tension σ in the cis state was dispersed with a relatively large value than the tension σ in the trans state. When the average value was calculated, the tension σ av in the cis state was 1.2 pN (pN = N × 10 −12 ), whereas the tension σ av in the trans state was 0.18 pN. From the above examination results, it is presumed that the film in the cis state has about 10 times larger force for closing the film than the film in the trans state.
以上の説明より、アゾベンゼン脂質と、リン脂質と、をトリス塩酸緩衝液中で分散させることで光応答性リポソームを生成することができる。リン脂質はリポソーム使用温度より低いゲル−液晶相転移温度を有するものを選択しておく。また、この光応答性リポソームに異種の光を別々のタイミングで照射することにより、膜形状が平板状から球状の間を可逆的変化させたり、その可逆的変化の際に膜上に膜孔が可逆的に形成又は消滅させたりすることが可能である。さらに、この独特な光応答性を利用すれば、ある地点でリポソーム内に薬物等の物質を包摂し、目標地点まで運搬し、リポソーム外へ放出することができる。 From the above description, photoresponsive liposomes can be generated by dispersing azobenzene lipid and phospholipid in Tris-HCl buffer. A phospholipid having a gel-liquid crystal phase transition temperature lower than the liposome use temperature is selected. In addition, by irradiating the photoresponsive liposome with different kinds of light at different timings, the membrane shape can be reversibly changed between a flat shape and a spherical shape, or membrane pores can be formed on the membrane during the reversible change. It can be reversibly formed or extinguished. Furthermore, if this unique photoresponsiveness is utilized, a substance such as a drug can be included in the liposome at a certain point, transported to the target point, and released to the outside of the liposome.
また、本発明のある態様は、物質放出を誘引する光に人体に安全な緑光を採用するため、物質放出に人体に有害なＵＶ光を提案していた従来技術に比して、大変好ましい。特に、本発明のリポソームをドラッグデリバリーのキャリアとして利用する場合、物質の放出は通常体内であるから、安全な光を使用できる本発明は大変有望である。 Also, an aspect of the present invention is very preferable to the prior art in which UV light that is harmful to the human body for substance release is proposed because green light that is safe for the human body is adopted as the light that induces the substance release. In particular, when the liposome of the present invention is used as a carrier for drug delivery, since the substance is usually released in the body, the present invention that can use safe light is very promising.
なお、本発明のある態様においては、物質封入の誘引光にＵＶ光を使用するが、本発明のリポソームを体内に注入する前に、つまり体外で、物質封入処理を行えば安全であり、安全面からも不都合は生じない。また、太陽光によるＵＶ光照射量の強さを調節することで、リポソームの膜形状や膜孔の大きさ、物質の包摂・放出量を制御することも可能である。 In some embodiments of the present invention, UV light is used as the attracting light for encapsulating the substance. However, before the liposome of the present invention is injected into the body, ie, outside the body, it is safe and safe. There is no inconvenience from the aspect. It is also possible to control the liposome membrane shape, membrane pore size, and inclusion / release amount of the substance by adjusting the intensity of UV light irradiation by sunlight.
また、リポソーム膜作製時に膜内に物質を封入させておく必要はなく、必要に応じて、適宜、光を照射することで、物質を運搬に必要な数だけリポソーム膜内に封入させることができる。 In addition, it is not necessary to enclose a substance in the membrane at the time of preparing the liposome membrane, and it is possible to encapsulate the substance in the liposome membrane as many as necessary for transportation by appropriately irradiating light as necessary. .
本発明の光応答性リポソームは、安全かつ効率的に薬物の封入・放出できるため、特にドラック・デリバリー・システム（ＤＤＳ）の中核を成すドラックキャリアとして大変有望である。本発明の光応答性リポソームは、さらに化粧品としても利用できる等、産業上の利用可能性が高い。 Since the photoresponsive liposome of the present invention can safely and efficiently encapsulate and release a drug, it is particularly promising as a drug carrier that forms the core of a drug delivery system (DDS). The photoresponsive liposome of the present invention has high industrial applicability, such as being usable as a cosmetic product.
Claims (11)
前記アゾベンゼン脂質は、ＫＡＯＮ１２（正式名称はＮ−［４−［４’−［Ｎ，Ｎ−ビス−［３−（Ｎ−リジルアミノ）プロピル］アミノカルボニル］フェニルアゾ］フェノキシアセチル］ジドデシルアミンであり、かつ、その疎水基の炭素数が１２である）であり、
前記リン脂質は、ＤＯＰＣ（ジオレオイルフォスフォコリン）又はＳＯＰＣ（ステアロイルオレオイルフォスフォコリン）であり、
前記アゾベンゼン脂質の濃度が３５％以上４３％未満となりかつその残余が前記リン脂質となるように、前記アゾベンゼン脂質と前記リン脂質とは配合され、
前記リン脂質は前記リポソームの使用温度より低いゲル−液晶相転移温度を有し、
前記リポソームは、異種の光が別々のタイミングで照射されることにより、膜上に膜孔を可逆的に形成又は消滅することを特徴とする光応答性リポソーム。 A photoresponsive liposome produced by dispersing azobenzene lipid and phospholipid in Tris-HCl buffer,
The azobenzene lipid is KAON12 (official name is N- [4- [4 ′-[N, N-bis- [3- (N-lysylamino) propyl] aminocarbonyl] phenylazo] phenoxyacetyl] didodecylamine; And the hydrophobic group has 12 carbon atoms)
The phospholipid is DOPC (dioleoylphosphocholine) or SOPC (stearoyl oleoylphosphocholine),
The azobenzene lipid and the phospholipid are blended so that the concentration of the azobenzene lipid is 35% or more and less than 43% and the remainder is the phospholipid.
The phospholipid has a gel-liquid crystal phase transition temperature lower than the use temperature of the liposome;
The said liposome is a photoresponsive liposome characterized by reversibly forming or extinguishing a membrane pore on the membrane when different kinds of light are irradiated at different timings.
第１の光を前記リポソームに照射し、前記膜上に存在する膜孔を消滅させて前記物質を前記膜内に封入する工程と、
前記リポソームを目標位置まで移動させる工程と、
前記第１の光とは異なる第２の光を前記リポソームに照射し、前記膜上に膜孔を形成させて前記物質を前記膜外へ放出する工程と、
を含み、かつ、
前記リポソームは、アゾベンゼン脂質と、前記リポソームの使用温度より低いゲル−液晶相転移温度を有したリン脂質と、をトリス塩酸緩衝液中で分散させて生成され、
前記アゾベンゼン脂質は、ＫＡＯＮ１２（正式名称はＮ−［４−［４’−［Ｎ，Ｎ−ビス−［３−（Ｎ−リジルアミノ）プロピル］アミノカルボニル］フェニルアゾ］フェノキシアセチル］ジドデシルアミンであり、かつ、その疎水基の炭素数が１２である）であり、
前記リン脂質は、ＤＯＰＣ（ジオレオイルフォスフォコリン）又はＳＯＰＣ（ステアロイルオレオイルフォスフォコリン）であり、
前記アゾベンゼン脂質の濃度が３５％以上４３％未満となりかつその残余が前記リン脂質となるように、前記アゾベンゼン脂質と前記リン脂質とは配合され、
前記膜孔の形成と消滅とが前記第１・第２の光の照射により可逆的に生じるものであり、
前記物質の運搬により、前記物質は人体に投与されないことを特徴とする物質の運搬方法。 A method for transporting substances using photoresponsive liposomes,
Irradiating the liposome with first light, erasing membrane pores existing on the membrane, and enclosing the substance in the membrane;
Moving the liposome to a target position;
Irradiating the liposome with a second light different from the first light, forming a membrane pore on the membrane, and releasing the substance out of the membrane;
Including, and
The liposome is produced by dispersing azobenzene lipid and a phospholipid having a gel-liquid crystal phase transition temperature lower than the use temperature of the liposome in a Tris-HCl buffer.
The azobenzene lipid is KAON12 (official name is N- [4- [4 ′-[N, N-bis- [3- (N-lysylamino) propyl] aminocarbonyl] phenylazo] phenoxyacetyl] didodecylamine; And the hydrophobic group has 12 carbon atoms)
The phospholipid is DOPC (dioleoylphosphocholine) or SOPC (stearoyl oleoylphosphocholine),
The azobenzene lipid and the phospholipid are blended so that the concentration of the azobenzene lipid is 35% or more and less than 43% and the remainder is the phospholipid.
Formation and annihilation of the membrane hole are reversibly caused by the irradiation of the first and second light ,
A method for transporting a substance , wherein the substance is not administered to a human body by transporting the substance.
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