JP5582628B2 - creCをコードする遺伝子の機能が欠損した調味料の製造に利用可能な麹菌及びその利用 - Google Patents
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(1)配列番号1に示される塩基配列からなるcreCをコードする遺伝子の機能のみを欠損させることにより、プロテアーゼ、アミラーゼ及びキシラナーゼの各酵素活性が当該遺伝子の機能が欠損していない親株に比べて向上したアスペルギルス・オリーゼ(Aspergillus oryzae)。
(2)creCをコードする遺伝子機能の欠損が、配列番号1に示される塩基配列における1若しくは数個の塩基の欠失、置換若しくは付加によりもたらされる、上記(1)記載のアスペルギルス・オリーゼ(Aspergilluls oryzae)。
(3)上記(1)に記載のアスペルギルス・オリーゼを用いて製麹することを特徴とする麹の製造法。
(4)上記(1)に記載のアスペルギルス・オリーゼを用いて麹を調製し、その麹を用いて常法により仕込みし、発酵、熟成せしめることを特徴とする調味料の製造法。
(1)相同組換えによるcreC遺伝子欠損株の作成
creC遺伝子欠損株を作成するための親株として、硫酸(硫黄源)を資化することのできない栄養要求性株である麹菌アスペルギルス・オリーゼΔligD株を用いた。なお、ΔligD株は、公知文献(Fungal Genet Biol.45(2008)、878−889)に従い、アスペルギルス・オリーゼRIB40株(寄託番号:ATCC42149)を元に作成された株である。また、マーカー遺伝子としては、硫酸(硫黄源)を資化する機能をもつアスペルギルス・ニドランスsC遺伝子(Mol Gen Genet.1995 May 20;247(4):423−429.)を用いた。
直径8cmのプラスチックシャーレに麹汁培地を作成し、creC遺伝子欠損株、および対照株として親株ΔligDとをそれぞれプレートの中央に播種した。30℃で24時間おきにコロニーの直径を測定した。その結果、親株であるΔligD株、creC遺伝子欠損株間で生育に差がないことが明らかとなった(図2)。
直径8cmのプラスチックシャーレにハローアッセイ用の培地(ミルクプレート、デンプンプレート)を作成し、creC遺伝子欠損株、および対照株として親株ΔligDをプレートの中央に播種し、形成されるハローの大きさを測定した。その結果、creC遺伝子欠損株は親株に比べ大きなハローを形成したことから、プロテアーゼ活性、アミラーゼ活性が向上していることが示唆された(図3)。
グルコース2%、亜硝酸ナトリウム0.3%、リン酸2カリウム0.1%、硫酸マグネシウム0.5%、塩化カリウム0.5%、硫酸鉄0.001%、ミルクカゼイン0.1%、トレースエレメント0.1%、寒天1.5%
グルコース2%、亜硝酸ナトリウム0.3%、リン酸2カリウム0.1%、硫酸マグネシウム0.5%、塩化カリウム0.5%、硫酸鉄0.001%、デンプン0.1%、トレースエレメント0.1%、寒天1.5%
脱脂大豆5gに8mlの滅菌蒸留水を散水し、5gの割砕小麦を加えてよく攪拌し、40分オートクレーブ処理を行った原料を醤油原料培地とした。該醤油原料培地1g当たり、胞子数が106個となるように、creC遺伝子欠損株、および対照株として親株ΔligDの胞子をそれぞれ散布し、よく攪拌して、28℃で48時間程度培養した。培養の結果、creC遺伝子欠損株と親株との間に生育の差は認められなかった。
アミラーゼ活性測定は以下の手順で行った。
酵素液1mlに50mM MaclLvaine緩衝液(pH5.0)を1ml加え、1%デンプン水溶液を2ml加え、30℃で30分反応を行った。その後、0.5規定酢酸10ml、0.0003規定ヨウ素溶液10mlを加え、分光光度計で700nmの吸光度を測定した。ヨウ素青色呈色を10%低下せしめる酵素量を1unitとして酵素活性を計算した。その結果、creC遺伝子欠損株は親株ΔligDに比べてアミラーゼ活性が有意に高かった(図5)。
キシラナーゼ活性測定は以下の手順で行った。
0.5%キシラン水溶液160μlに40μlの酵素液を加え、40℃で60分程度反応を行った後、DNS試薬400μlを加え、5分間沸騰させた後に、2.4mlの純水を加え、よく混合した後、分光光度計で500nmの吸光度を測定した。同様の方法でキシロース標準液を用いて検量線を作成し、1分間に1μgのキシロースを遊離させる酵素量を1unitとして酵素活性を計算した。その結果、creC遺伝子欠損株は親株ΔligDに比べてプロテアーゼ活性が有意に高かった(図6)。
4.5%水酸化ナトリウム水溶液300mlに、1%3,5−ジニトロサリチル酸水溶液880mlと、ロッシェル塩255gを添加した。この溶液に、10%水酸化ナトリウム水溶液22mlにフェノール10gを混合し、100mlにフィルアップした溶液69mlに炭酸水素ナトリウム6.9gを溶解せしめたものを加え、2日以上室温に遮光保存したものを使用した。
脱脂大豆5kgに7Lの水を加え1時間混合後、高圧蒸煮缶にて蒸煮圧力4kg/cm2で10分蒸煮を行った。この蒸煮脱脂大豆に、加熱変性後割砕した小麦5.2kgを加え、種麹と共に混合し、製麹を行った。なお、種麹としては実施例1で得られたcreC遺伝子欠損株を用い、対照としてその親株を使用した。
らの試験は全てP1レベル閉鎖系で行った。得られた諸味等を分析した結果、creC遺伝子欠損株を用いた場合には、親株と比較して窒素利用率が高く、かつ醤油粕が少ないことが明らかとなった。
Claims (4)
- 配列番号1に示される塩基配列からなるcreCをコードする遺伝子の機能のみを欠損させることにより、プロテアーゼ、アミラーゼ及びキシラナーゼの各酵素活性が当該遺伝子の機能が欠損していない親株に比べて向上したアスペルギルス・オリーゼ(Aspergillus oryzae)。
- creCをコードする遺伝子機能の欠損が、配列番号1に示される塩基配列における1若しくは数個の塩基の欠失、置換若しくは付加によりもたらされる、請求項1記載のアスペルギルス・オリーゼ(Aspergilluls oryzae)。
- 請求項1に記載のアスペルギルス・オリーゼを用いて製麹することを特徴とする麹の製造法。
- 請求項1に記載のアスペルギルス・オリーゼを用いて麹を調製し、その麹を用いて常法により仕込みし、発酵、熟成せしめることを特徴とする調味料の製造法。
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