JP5581690B2 - 厚み情報取得装置、厚み情報取得方法、厚み情報取得プログラム及び顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は厚み情報取得装置、厚み情報取得方法、厚み情報取得プログラム及び顕微鏡に関し、例えば生体サンプルを拡大して観察する分野に適用して好適なものである。

病理診では、組織切片などの生体サンプルはスライドガラスに固定され、染色過程及び封入過程を経てプレパラートとして作製される。一般に、プレパラートの保管期間が長期間となると、生体サンプルの劣化や退色等によりプレパラートに対する顕微鏡での視認性が悪くなる。また、プレパラートはそれを作製した病院等の施設以外の施設で鏡検されることもあるが、該プレパラートの受け渡しは一般に郵送であり、一定の時間を要する。

このような実情等に鑑み、生体サンプルを画像データとして保存する装置が提案されている（例えば特許文献１参照）。

特開２００９−１７５３３４公報

ところで生体サンプルは厚みを有するものである。このため、例えば、生体サンプルの厚み方向の全領域を撮像する場合、該生体サンプルに集光する光学レンズの被写体深度と生体サンプルの厚みに基づいて、厚み方向の撮像する枚数を決定する。

このような場合、撮像枚数に応じてデータ量と撮像時間が決定するという観点から、生体サンプルの厚みに関する情報（以下、これを厚み情報とも呼ぶ）を取得することが望まれる。

そこで、例えば、生体サンプルの厚み方向へ所定間隔ごとに光学レンズの焦点をずらしていき、それぞれの位置で生体サンプルの像を撮像して生体サンプルの有無を判断することにより、生体サンプルの厚み情報を取得する方法が考えられる。

この方法では、例えば光学レンズの被写体深度が１［μｍ］で、生体サンプルの厚み方向に１００［μｍ］を検索する場合、１００枚の撮像画像から生体サンプルの厚み情報を取得することになり、その検出精度は１［μｍ］単位となる。

一方、例えば光学レンズの被写体深度が２［μｍ］で、生体サンプルの厚み方向に１００［μｍ］を検索する場合、５０枚の撮像画像から生体サンプルの厚み情報を取得することになり、その検出精度は２［μｍ］単位となる。

従って、この方法では、被写体深度を浅くすれば検出精度は高くなるが処理時間が長くなり、被写体深度を深くすれば検出精度は低くなるが処理時間は短くなるといったように、検出時間を短時間にして検出精度を高くすることが困難である。

本発明は以上の点を考慮してなされたもので、サンプルの厚み情報を短時間で精度よく取得し得る厚み情報取得装置、厚み情報取得方法及び厚み情報取得プログラムを提案しようとするものである。

かかる課題を解決するため本発明においては、厚み情報取得装置であって、内部で発生した光が透過するサンプルの位相差像を取得する像取得部と、位相差像における一方の像の各画素に対する他方の像の相関分布を算出する算出部と、相関分布における相関が最大となる位置での曲率を算出し、該曲率の程度に応じてサンプルの厚みに関する情報を取得する厚み情報取得部とを有する。

また本発明においては、厚み情報取得方法であって、内部で発生した光が透過するサンプルの位相差像を取得する像取得ステップと、位相差像における一方の像の各画素に対する他方の像の相関分布を算出する算出ステップと、相関分布における相関が最大となる位置での曲率を算出し、該曲率の程度に応じてサンプルの厚みに関する情報を取得する厚み情報取得ステップとを有する。

さらに本発明においては、厚み情報取得プログラムであって、コンピュータに対して、内部で発生した光が透過するサンプルの位相差像を取得する像取得ステップと、位相差像における一方の像の各画素に対する他方の像の相関分布を算出する算出ステップと、相関分布における相関が最大となる位置での曲率を算出し、該曲率の程度に応じてサンプルの厚みに関する情報を取得する厚み情報取得ステップとを実行させる。

さらに本発明においては、顕微鏡であって、対物レンズから入射する光を直進又は反射させるミラーと、対物レンズに結像され、ミラーの直進側又は反射側の一方に投影される被写体像を撮像するための第１の撮像素子と、ミラーの直進側又は反射側の他方の後方に一対を単位として設けられ、対物レンズの被写体深度よりも広い被写体深度となる大きさとされる開口と、開口の後方にそれぞれ設けられ、ミラーの透過側又は反射側の他方に投影される被写体像の予定結像面に対して位相差像を形成するためのセパレータレンズと、予定結像面を撮像面として設けられる第２の撮像素子と、第２の撮像素子から、内部で発生した光が透過するサンプルの位相差像を取得する像取得部と、位相差像における一方の像の各画素に対する他方の像の相関分布を算出する算出部と、相関分布における相関が最大となる位置での曲率を算出し、該曲率の程度に応じてサンプルの厚みに関する情報を取得する厚み情報取得部とを有する。

これにより、取得した位相差像の基準像に対する相関分布を算出し、該相関分布における相関が最大となる位置での曲率の程度に応じてサンプルの厚み情報を取得するようにしたことにより、１つの位相差像から撮像範囲におけるサンプルの厚みを取得できると共に、サンプルの厚さを反映した相関分布に応じた厚み情報を取得することができる。

以上のように本発明によれば、取得した位相差像の基準像に対する相関分布を算出し、該相関分布における相関が最大となる位置での曲率の程度に応じてサンプルの厚み情報を取得するようにしたことにより、１つの位相差像から撮像範囲におけるサンプルの厚みを取得できると共に、サンプルの厚さを反映した相関分布に応じた厚み情報を取得することができ、かくして厚み情報を短時間で精度よく取得することができる。

顕微鏡の構成を示す概略図である。 組織切片の撮影対象像と位相差像を示す写真である。 統括制御部の機能的構成を示す概略図である。 検出窓及び検出範囲の設定を示す概略図である。 組織切片における検出面の位置を示す概略図である。 組織切片の厚みに応じた相関分布を示す概略図である。 相関値の分布及び相関値が最大となる位置での２次曲線を示す概略図である。 演算結果を示す概略図である。 厚み情報処理手順を示すフローチャートである。 一般的なステレオカメラを示す概略図である。

以下、発明を実施するための形態について説明する。なお、説明は以下の順序とする。
＜１．実施の形態＞
＜２．他の実施の形態＞

＜１．実施の形態＞
［１−１．顕微鏡の構成］
図１において、本一実施の形態による顕微鏡１を示す。この顕微鏡１は、プレパラートＰＲＴが配される板状のステージ１１を有する。

プレパラートＰＲＴは、血液等の結合組織、上皮組織又はそれらの双方の組織などの組織切片ＴＳを、所定の固定手法によりスライドガラスに固定し封入したものであり、該組織切片ＴＳには必要に応じて染色が施される。この染色には、ＨＥ（ヘマトキシリン・エオジン）染色、ギムザ染色又はパパニコロウ染色等に代表される一般染色と呼ばれる染色のみならず、ＦＩＳＨ(Fluorescence In-Situ Hybridization)や酵素抗体法等の特殊染色と呼ばれる染色が含まれる。

ステージ１１にはステージ駆動機構１２が設けられる。このステージ駆動機構１２は、ステージ面に対して平行となる方向（Ｘ軸−Ｙ軸方向）と、直交する方向（Ｚ軸方向）にステージ１１を駆動するものとされる。ちなみに、プレパラートＰＲＴが配される側のステージ面（以下、これをプレパラート配置面とも呼ぶ）には、一般に、プレパラートＰＲＴを定位置に抑止する抑止部（図示せず）が設けられる。

ステージ１１のプレパラート配置面とは逆の面側には光源１３が配される。光源１３は、一般染色が施された組織切片ＴＳを照明する光（以下、これを明視野照明光とも呼ぶ）と、特殊染色が施された組織切片ＴＳを照明する光（以下、これを暗視野照明光とも呼ぶ）とを切り換えて照射可能なものとされる。ただし、明視野照明光又は暗視野照射光のいずれか一方だけが照射可能なものであってもよい。光源１３とステージ１１との間には、プレパラート配置面における基準位置の法線を光軸とするコンデンサレンズ１４が配される。

ステージ１１のプレパラート配置面側には、ステージ面における基準位置の法線を光軸とする所定倍率の対物レンズ１５が配される。この対物レンズ１５の後方には、該対物レンズ１５の主結像面となる面を撮像面とする撮像素子１６が配される。

また顕微鏡１には、プレパラート配置面側における基準位置の法線上の対物レンズ１５と撮像素子１６との間にハーフミラー１７が設けられる。ハーフミラー１７は、対物レンズ１５から入射する光を透過光と反射光とに分割する。

フィールドレンズ１８は、ハーフミラー１７の例えば反射側に投影される対物レンズ１５の被写体像を後方（予定される結像面）にリレーする。このフィールドレンズ１８では、ハーフミラー１７で反射される被写体光が集められるため、視野周辺における明度の低下が抑制される。

絞りマスク１９は、フィールドレンズ１８の後方に配され、該フィールドレンズ１８の光軸と直交する面のうちその光軸を境界として対称となる位置に一対の開口１９Ａ、１９Ｂを有する。これら開口１９Ａ、１９Ｂの大きさは、対物レンズ１５の被写体深度よりもセパレータレンズ２０Ａ、２０Ｂの被写体深度が広くなるよう調整される。

絞りマスク１９は、これら開口１９Ａ、１９Ｂによって、フィールドレンズ１８から入射する被写体光束を分割する。分割光束は、被写体光束の結像面で交差し、該結像面の前後で位置関係が入れ換わる光束となる。

セパレータレンズ２０Ａ、２０Ｂは、一対の開口１９Ａ、１９Ｂの後方にそれぞれ個別に配される。このセパレータレンズ２０Ａ、２０Ｂは、対応する開口１９Ａ、１９Ｂによって分割される分割光束をアオリ結像（シフト）させ、フィールドレンズ１８によってリレーされる予定結像面に対して１組の被写体像（以下、これを位相差像とも呼ぶ）を形成する。

なお、セパレータレンズ２０Ａ、２０Ｂがフィールドレンズ１８の口径蝕（ケラレ）に掛かると、分割光束の一部が欠損する。このためセパレータレンズ２０Ａ、２０Ｂは、口径蝕に掛からないようフィールドレンズ１８の中央側に寄せて配置される。

撮像素子２１は、ラインセンサではなく、フィールドレンズ１８によってリレーされる被写体像の予定結像面を撮像面とするエリアセンサとされる。

ここで、対物レンズ１５の主結像面に配される撮像素子１６で撮像される明視野像（撮影対象像）と、該対物レンズ１５の予定結像面に配される撮像素子２１で撮像される位相差像との写真を図２に示す。この図２からも分かるように、撮像素子１６の撮像面（主結像面）に結像される明視野像は、セパレータレンズ２０Ａ、２０Ｂによって位相差像として撮像素子２１の撮像面（予定結像面）に結像される。

この顕微鏡１における制御系として、ステージ駆動機構１２にはステージ駆動制御部３１が、光源１３には照明制御部３２が、撮像素子１６には撮像制御部３３が、撮像素子２１には位相差像撮像制御部３４がデータ通信路を介して接続される。

これら制御系は、ＣＰＵ(Central Processing Unit)、ＲＯＭ(Read Only Memory)、ＣＰＵのワークメモリとなるＲＡＭ(Random Access Memory)及び演算回路などを含むコンピュータとされる。

ステージ駆動制御部３１は、ステージ駆動機構１２を駆動制御し、コンデンサレンズ１４によって集められる集光部分にプレパラートＰＲＴの組織切片ＴＳが割り当てられるようステージ面方向（Ｘ軸−Ｙ軸方向）にステージ１１を移動させる（走査させる）。

またステージ駆動制御部３１は、ステージ駆動機構１２を駆動制御し、集光部分に割り当てられる組織切片ＴＳの部位が対物レンズ１５の焦点に合うようステージ面の直交方向（Ｚ軸方向（つまり組織切片の奥行方向））にステージ１１を移動させる。

照明制御部３２は、明視野像を取得すべきモード（以下、これを明視野モードとも呼ぶ）又は暗視野像を取得すべきモード（以下、これを暗視野モードとも呼ぶ）に応じたパラメータを光源１３に設定し、該光源１３から照明光を照射させる。このパラメータは例えば照明光の強度や光源種類の選択などである。

なお、明視野モードにおける照射光は一般に可視光とされる。一方、暗視野モードにおける照射光は、特殊染色で用いられる蛍光マーカを励起する波長を含む光とされる。また暗視野モードでは蛍光マーカに対する背景部分はカットアウトされる。

光源１３から照明光が照射された場合、その照明光はコンデンサレンズ１４によって、ステージ１１におけるプレパラート配置面の基準位置に集められる。対物レンズ１５の結像面には、プレパラートＰＲＴにおける組織切片ＴＳのうち、コンデンサレンズ１４によって集光される集光部分の像が拡大されて結像され、その拡大像が対物レンズ１５によって撮像素子１６の撮像面に被写体像として結像される。またハーフミラー１７により反射された被写体像は、セパレータレンズ２０Ａ、２０Ｂによって位相差像として撮像素子２１の撮像面（予定結像面）に結像される。

撮像制御部３３は、明視野モード又は暗視野モードに応じたパラメータを撮像素子１６に設定し、該撮像素子１６の撮像面に結像される被写体像のデータを取得する。このパラメータは例えば露光の開始タイミング及び終了タイミングなどである。

位相差像撮像制御部３４は、明視野モード又は暗視野モードに応じたパラメータを撮像素子２１に設定し、該撮像素子２１の撮像面に結像される位相差像のデータを取得する。このパラメータは例えば露光の開始タイミング及び終了タイミングなどである。

ところでこの顕微鏡１には、該顕微鏡１の全体の制御を司る制御部（以下、これを統括制御部とも呼ぶ）３０があり、これはステージ駆動制御部３１、照明制御部３２、撮像制御部３３及び位相差像撮像制御部３４それぞれにデータ通信路を介して接続される。この統括制御部３０は、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、演算回路及びＨＤＤ（Hard Disc Drive）などを含むコンピュータとされる。

統括制御部３０は、明視野モード又は暗視野モードの開始命令を待ち受け、該開始命令を受けた場合、その開始命令に対応するモードで制御を開始すべき指令をステージ駆動制御部３１、照明制御部３２、撮像制御部３３及び位相差像撮像制御部３４に与える。

また統括制御部３０は、ステージ駆動制御部１２においてプレパラートＰＲＴの組織切片ＴＳ部位が割り当てられるたびに、撮像素子１６によって取得される組織切片ＴＳ部位における拡大像のデータを記憶媒体に記憶する。

そして統括制御部３０は、表示命令を待ち受け、該表示命令を受けた場合、その表示命令で指定される拡大像に対応するデータを記憶媒体から読み出し、これを表示命令の送出元に与える。

このようにこの顕微鏡１は、プレパラートＰＲＴの組織切片ＴＳを鏡検状態の画像として記憶することで、プレパラートＰＲＴ自体を保存する場合に比べて、固定や染色等の状態を劣化させることなく長期にわたって組織切片ＴＳに関する情報を保存できるようになされている。

［１−２．厚み情報取得処理］
統括制御部３０は、組織切片ＴＳの厚み情報を取得するプログラム（以下、これを厚み情報取得プログラムとも呼ぶ）がＨＤＤに格納されている。

統括制御部３０は、厚み情報取得プログラムを実行する指示を受けた場合、該厚み情報取得プログラムをＨＤＤに展開して厚み情報取得処理を実行する。

統括制御部３０は、厚み情報取得プログラムに従って、図３に示すように、位相差像取得部４１、相関分布算出部４２及び厚み情報取得部４３として機能する。

位相差像取得部４１は、ステージ駆動制御部３１を介して、プレパラートＰＲＴの組織切片ＴＳ部位が撮像範囲として割り当てられるようステージ面方向（Ｘ軸−Ｙ軸方向）にステージ１１を移動させる。また位相差像取得部４１は、組織切片ＴＳ部位が対物レンズ１５の焦点に合うようＺ軸方向にステージ１１を移動させる。

位相差像取得部４１は、照明制御部３２を介して、明視野モード又は暗視野モードに応じたパラメータを光源１３に設定し、該光源１３から照明光を照射させる。

位相差像取得部４１は、位相差像撮像制御部３４を介して、組織切片ＴＳ部位の拡大像が撮像素子２１に結像された位相差像のデータを取得する。

ここで顕微鏡１では、セパレータレンズ２０Ａ、２０Ｂの被写体深度がプレパラートＰＲＴに固定される組織切片ＴＳの厚みより十分に厚くなるよう、開口１９Ａ、１９Ｂが設定される。従って位相差像取得部４１は、組織切片ＴＳ部位における厚み方向の全体に合焦された状態の位相差像を取得する。

相関分布算出部４２は、図４に示すように、位相差像のうち基準とすべき一方の像（以下、これを基準像とも呼ぶ）ＳＧにおける各画素を順に注目対象の画素（以下、これを注目画素と呼ぶ）ＮＰとして選択する。

相関分布算出部４２は、所定の画素（例えば、注目画素ＮＰ）を中心として該画素周辺の輝度平均値を算出する際に用いられる画素群を抽出するため、所定の横幅ＷＸ及び縦幅ＷＹの比較窓ＣＷを設定する。

また相関分布算出部４２は、基準像ＳＧにおける注目画素ＮＰの位置と対応する比較像ＣＧの画素（以下、これを比較画素と呼ぶ）ＣＰを中心としてＸ軸方向の所定の検索範囲Ｄを設定する。

因みに、検索範囲Ｄは、基準像ＳＧの注目画素ＮＰに対する比較像ＣＧの視差を検出する範囲であり、最大でも１００［μｍ］未満の視差しか発生しないと仮定し、また視差が５［μｍ／ｐｉｘｅｌ］で検出される場合、比較画素ＣＰを中心としてＸ軸方向に±２０［ｐｉｘｅｌ］に設定される。

相関分布算出部４２は、正規化相関の演算式

により注目画素ＮＰに対する検出範囲Ｄ内における各画素の相関値Ｃを算出する。

ところで半透明で厚みのある組織切片ＴＳの像に対して正規化相関を算出する場合、該組織切片ＴＳの奥行方向（厚み方向）において明瞭な部分、すなわち明瞭に染色された部分が基準像ＳＧ及び比較像ＣＧにおいて明瞭な像として写るため、その明瞭な部分が正規化相関の検出対象となる。

従って例えば組織切片ＴＳがＨＥ染色されている場合、図５に示すように、正規化相関では、明瞭に染色された細胞核ＣＲを通る面（以下、これを検出面と呼ぶ）ＤＰが検出対象になる。

また組織切片ＴＳの奥行方向に複数の細胞核ＣＲが並ぶ場合、正規化相関では、基準像ＳＧ及び比較像ＣＧにより明瞭な特徴として写る奥行方向に並ぶ複数の細胞核ＣＲの重心が検出対象となるため、検出面ＤＰがその重心を通ることになる。

図６（Ａ）に示すように、組織切片ＴＳの奥行方向に細胞核ＣＲが１つのみ存在する位置（ｘ＝ｘ１）と、奥行方向に細胞核ＣＲが２つ存在する位置（ｘ＝ｘ２）では、基準像ＳＧ及び比較像ＣＧがそれぞれ図６（Ｂ）及び（Ｃ）に示すように撮像される。

ｘ＝ｘ１における正規化相関は、図６（Ｄ）に示すように、基準像ＳＧ及び比較像ＣＧに細胞核ＣＲが１つだけ写っているため、基準像ＳＧの細胞核ＣＲに対して比較像ＣＧの細胞核ＣＲが写る位置において相関値Ｃが高くなり、他の部分において相関値Ｃが低くなる。従ってこのような場合、検出範囲（−Ｄ／２〜Ｄ／２）の各画素に対する相関値Ｃの分布形状は、相関値Ｃが最大となる位置の前後で急激に変化する。

一方ｘ＝ｘ２では、基準像ＳＧにおいて２つの細胞核ＣＲがほぼ重なっているのに対して比較像ＣＧにおいては２つの細胞核ＣＲが若干ずれて撮像される。このような場合、基準像ＳＧの細胞核ＣＲが写る位置に対する相関値Ｃは、図６（Ｅ）に示すように、比較像ＣＧにおける２つの細胞核ＣＲの中間で最大となる。また２つの細胞核ＣＲが若干離れて写るために相関値Ｃが最大となる位置の前後でも相関値Ｃが高くなるため、各画素に対する相関値Ｃの分布形状は、相関値Ｃが最大となる位置の前後で緩やかに変化する。

因みに、実際の組織切片ＴＳの厚みは概ね数［μｍ］から２０［μｍ］程度であり、仮に視差が５［μｍ／ｐｉｘｅｌ］で検出される場合、視差が最大で４［ｐｉｘｅｌ］程度となる。従って、奥行方向に２つの細胞核ＣＲが離れて並んでいる場合であっても、各画素に対する相関値Ｃの分布形状は、２山波形のような変化特性は表れない。

相関分布算出部４２は、図７に示すように、（１）式により算出された相関値Ｃが最大となる点（Ｃ（ｋ_ｎ））とその前後の点（Ｃ（ｋ_ｎ−１）及びＣ（ｋ_ｎ＋１））を抽出する。

そして相関分布算出部４２は、抽出した３点（Ｃ（ｋ_ｎ−１）、Ｃ（ｋ_ｎ）、Ｃ（ｋ_ｎ＋１））を通る２次曲線ＬＦを次式

により算出する。因みに、「ａ」は２次の定数、すなわち曲率に相当し、「ｂ」は１次の定数を示し、「ｃ」は０次の定数を示す。

ここで相関値Ｃが最大となる位置（ｋ_ｍａｘ）は（２）式の極値となることから、相関分布算出部４２は、次式

を満たす次式

により（２）式の極値を算出する。相関分布算出部４２は、注目画素ＮＰに対応する比較画素ＣＰの中心から極値までの距離を該注目画素ＮＰの視差として算出する。

相関分布算出部４２は、注目画素ＮＰが選択されるたびに、（１）式、（２）式及び（４）式を用いて該注目画素ＮＰの視差を算出し、視差情報として取得する。

この視差は大きいほど組織切片ＴＳが対物レンズ１５側（前方）に位置し、これに対して小さいほど後方に位置する関係にある。したがって、基準像ＳＧの各画素に対する視差は、プレパラートＰＲＴにおける組織切片ＴＳのうち、撮影範囲（対物レンズ１５の結像面に映る領域）の凹凸状態を示す情報に相当するものとなる。

ところで（１）式により算出される相関値Ｃは、注目画素ＮＰに対して検索範囲Ｄ内の画素に対して計算されるので、画素単位の離散的な値をとる。従って（１）式により算出された相関値Ｃが最大となる画素を注目画素ＮＰに対応する位置として決定した場合、注目画素ＮＰに対する相関値Ｃが最大となる画素の距離（視差）が画素単位で検出されることになる。仮に視差が５［μｍ／ｐｉｘｅｌ］で検出される場合、注目画素ＮＰに対する相関値Ｃが最大となる画素の距離（視差）の検出間隔が５［μｍ］単位となる。

これに対して例えば２次曲線ＬＦの極値から注目画素ＮＰの視差を算出する場合、（１）式の正規化相関により注目画素ＮＰの視差を算出する場合と比して、検出精度が約１００倍となり、より精度よく視差を算出することができる。

因みに視差が５［μｍ／ｐｉｘｅｌ］で検出される場合、２次曲線ＬＦの極値から注目画素ＮＰの視差を算出すると、注目画素ＮＰに対する視差の検出間隔が０．０５［μｍ］程度となる。

次に厚み情報取得部４３は、（２）式における曲率ａを次式

により算出する。

ここで、上述したように、組織切片ＴＳの厚みに応じて相関値Ｃが最大となる位置での曲率が変化する。従って相関値Ｃが最大となる位置での曲率ａは、組織切片ＴＳの厚みを反映するものである。

そこで厚み情報取得部４３は、相関値Ｃが最大となる点（Ｃ（ｋ_ｎ））とその前後の点（Ｃ（ｋ_ｎ−１）及びＣ（ｋ_ｎ＋１））を通る２次曲線ＬＦは必ず２次の定数（曲率ａ）が負の値をとることから、基準像ＳＧにおける注目画素ＮＰの厚み係数θを次式

により算出する。

厚み情報取得部４３は、注目画素ＮＰが選択されるたびに、（５）式及び（６）式を用いて該注目画素ＮＰの厚み係数θを算出し、基準像ＳＧの各画素に対する厚み係数θを厚み情報として取得する。

この厚み係数θは、組織切片ＴＳが厚いほど小さくなり、該組織切片ＴＳが薄くなるほど大きくなる。

ここで図８（Ａ）に示すようなＸ軸方向の所定の２箇所で折れ重なった組織切片ＴＳの位相差像と、該位相差像に対して算出されたデフォーカスマップ、ｙ＝ｙ_ｎにおけるデフォーカス量変化及び厚み係数マップを図８（Ｂ）に示す。

図８（Ｂ）におけるデフォーカスマップは、基準像ＳＧの各画素に対する（４）式を用いて算出された視差を、所定位置からの距離に応じて色付けして示したものであり、色が濃くなるにつれＺ軸方向（手前側）に検出面があることを示す。図８（Ｂ）におけるｙ＝ｙ_ｎにおけるデフォーカス量変化は、ｙ＝ｙ_ｎにおけるＸ軸に沿った視差を示したものである。図８（Ｂ）における厚み係数マップは、基準像ＳＧの各画素に対する（６）式により算出された厚み係数θを示したものであり、色が濃くなるにつれて厚み係数θが小さくなることを示す。

図８（Ｂ）からも分かるように、組織切片ＴＳが折り重なっている位置では該組織切片ＴＳが厚いため、検出面が手前側に移動していると共に、厚み係数θも小さな値となる。

このように顕微鏡１は、（４）式及び（６）式を用いることで、位相差像における基準像ＳＧの各画素での視差（デフォーカス量）及び厚み係数θを、１枚の位相差像から取得することができる。

因みに図８（Ｂ）において、デフォーカスマップでの外側の黒色の部分は、エラーにより視差が算出されなかった領域であり、厚み係数マップにおいても対応する部分はエラーにより厚み係数θは算出されていない。

統括制御部３０は、視差情報に基づいて、検出面に対する対物レンズ１５の焦点を合わせるべき位置（以下、これを合焦位置とも呼ぶ）を決定する。

統括制御部３０は、合焦位置をステージ駆動制御部３１に与え、該ステージ駆動制御部３１によって、合焦位置に対する対物レンズ１５の焦点の移動量が計算されステージ１１が移動される。

また統括制御部３０は、厚み情報に基づいた、例えば撮像範囲における組織切片ＴＳの厚みに応じて、対物レンズ１５の被写体深度に納まる複数の層（以下、これを撮影層とも呼ぶ）を決定する。

統括制御部３０は、撮影層をステージ駆動制御部３１に与え、該ステージ駆動制御部３１によって、撮影層のそれぞれに対する対物レンズ１５の焦点の移動量が計算されステージ１１が移動される。

統括制御部３０は、ステージ駆動制御部３１によって撮影層のそれぞれに対物レンズ１５の焦点が移動されるたびに、撮像制御部３３を介して組織切片ＴＳ部位を撮像する。

従って統括制御部３０は、厚み情報に基づいて撮影範囲における撮像枚数を決定するので、その位置での組織切片ＴＳが厚い場合には撮像枚数を増やし、薄い場合には撮像枚数を減らす。これにより統括制御部３０は、組織切片ＴＳの厚みに応じて該組織切片ＴＳを取りこぼすことなく、かつ不必要に多く撮像することない最適な撮像枚数を決定することができるので、撮像時間を高速化することができると共に、データ量を圧縮することができる。

［１−３．厚み情報取得処理手順］
次に、上述した厚み情報取得処理の手順について、図９に示すフローチャートに従って説明する。

実際上、統括制御部３０は、ルーチンＲＴ１の開始ステップから入って次のステップＳＰ１へ移る。ステップＳＰ１において統括制御部３０は、撮像素子２１により撮像された位相差像を位相差撮像制御部３４を介して取得し、次のステップＳＰ２に移る。

ステップＳＰ２において統括制御部３０は、位相差像から、基準像ＳＧの各画素に対する相関値Ｃを（１）式を用いて算出し、次のステップＳＰ３に移る。

ステップＳＰ３において統括制御部３０は、（１）式により算出された相関値Ｃが最大となる点（Ｃ（ｋ_ｎ））とその前後の点（Ｃ（ｋ_ｎ−１）及びＣ（ｋ_ｎ＋１））を抽出し、次のステップＳＰ４に移る。

ステップＳＰ４において統括制御部３０は、抽出した３点を通る２次曲線ＬＦ（（２）式）を算出し、ステップＳＰ５に移る。ステップＳＰ５において統括制御部３０は、２次曲線ＬＦの極値を（４）式を用いて算出し、該極値を視差情報として取得し、次のステップＳＰ６に移る。

ステップＳＰ６において統括制御部３０は、２次曲線ＬＦの曲率ａを（５）式を用いて算出し、次のステップＳＰ７に移る。ステップＳＰ７において統括制御部３０は、２次曲線ＬＦの曲率ａから、厚み係数θを（６）式を用いて算出し、該厚み係数θを厚み情報として取得し、次のステップに移って処理を終了する。

［１−４．動作及び効果］
以上の構成において、顕微鏡１は、撮像素子２１により撮像された組織切片ＴＳの位相差像における基準像ＳＧの各画素に対する比較像ＣＧの検出範囲Ｄの相関値Ｃを算出し、該相関値Ｃの分布状態に基づいて組織切片ＴＳの厚み情報を取得する。

これにより顕微鏡１は、例えばＨＥ染色された組織切片ＴＳの場合、奥行方向に存在する染色された組織に応じた厚み情報を、１つの位相差像、すなわち１回の撮像で取得できる。従って顕微鏡１は、組織切片ＴＳの厚み情報を短時間で取得することができる。

また顕微鏡１は、染色された組織の分布を反映した厚み情報を取得することができるので、精度よく厚み情報を取得することができる。

この顕微鏡１は、組織切片ＴＳの奥行方向へ光学レンズの焦点をずらして該組織切片ＴＳの厚み情報を取得する場合と比して、離散的な値をとることないため、精度よく厚み情報を取得することができる。

ところで一般的なステレオカメラでは、図１０に示すように、一方のカメラで撮像することができる物体（障害物）でも、他方のカメラでは手前にある物体（障害物）の陰になって撮像することができない場合がある。

このような場合、一方のカメラで撮像された像と、他方のカメラで撮像された像とで異なる像が写り、これら像を用いて相関を算出したとしても精度よく相関が取れない。また一般的なステレオカメラでは、該ステレオカメラから物体（障害物）までの距離（視差）は取得できるものの、物体（障害物）の厚み情報を取得することができない。

これに対して顕微鏡１では、組織切片ＴＳが半透明であるため、位相差像における基準像ＳＧと比較像ＣＧには同一の対象が写るので相関が精度よく取れ、また組織切片ＴＳの厚み情報も取得できる。

また顕微鏡１は、正規化相関によって得られた相関値Ｃが最大となる点とその前後の点を通る２次曲線ＬＦを算出し、その２次曲線ＬＦの曲率ａに応じた厚み情報を取得するようにした。

従って顕微鏡１は、２次曲線ＬＦを算出したことにより相関値Ｃの分解能が高くなり、その分解能が高い２次曲線ＬＦの曲率ａに応じた厚み情報を取得するので、より精度よく厚み情報を取得することができる。

以上の構成によれば、取得した位相差像の基準像に対する相関分布を算出し、該相関分布に応じて組織切片ＴＳの厚み情報を取得するようにした。これにより、１つの位相差像から組織切片ＴＳの厚み情報が取得でき、またサンプルの厚み方向の分布を反映した厚み情報を取得することができ、かくして厚み情報を短時間で精度よく取得することができる。

＜２．他の実施の形態＞
上述の実施の形態においては、組織切片ＴＳがサンプルとされた。しかしながらサンプルはこの実施の形態に限定されるものではない。例えば生物に関するサンプル（生体サンプル）として細胞や染色体等が適応されてもよい。但しサンプルは、可視光を透過する半透明なものであるか、蛍光染色された生体サンプルのように、サンプル内で発生した光が該サンプル内を透過するものである。

上述の実施の形態においては、２枚のセパレータレンズ２０Ａ、２０Ｂが用いられた。しかしながらセパレータレンズ２０の数はこの実施の形態に限定されるものではない。１対のセパレータレンズ２０Ａ、２０Ｂを単位（組）として、複数枚のセパレータレンズ２０を用いることができる。なおこの場合、絞りマスク１９に対して各組のセパレータレンズ２０に対応する開口を設けることを要する。

上述した実施の形態においては、撮像素子２１により撮像された位相差像のデータを取得するようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、位相差像のデータを、例えばインターネットを介して取得したり、所定の記憶媒体を介して取得するようにしてもよい。

上述した実施の形態においては、ＨＥ染色が施された組織切片ＴＳの厚み情報を取得するようにした場合について述べた。この場合、（１）式により相関値Ｃが算出される際、明瞭に染色された組織が検出対象になる。本発明はこれに限らず、例えば細胞膜が明瞭に染色された組織切片ＴＳにおいて該細胞膜を検出対象として相関値Ｃを算出するようにしてもよい。すなわち、染色の種類を選択的に決定することにより、検出対象を選択的に決定することができる。

上述した実施の形態においては、変曲点の前後で曲率が一致する２次曲線ＬＦの曲率ａを用いて厚み情報を取得するようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、正規化相関により得られた相関値Ｃを通る他の近似曲線を算出し、該近似曲線における極値の前後でそれぞれ独立した曲率を算出し、該曲率に応じて検出面の前方向及び後方向の厚み情報をそれぞれ独立に取得するようにしてもよい。

上述した実施の形態においては、正規化相関により得られた相関値Ｃが最大となる点及びその前後の点を通る２次曲線ＬＦの曲率ａに応じた厚み情報を取得するようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、正規化相関により得られた点を他の近似曲線で補間し、その曲率に応じた厚み情報を取得するようにしてもよい。

上述した実施の形態においては、相関演算として正規化相関を用いるようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、相関演算としてＳＡＤ（Sum of Absolute Difference）、ＳＳＤ（Sum of Squared Difference）などの相関演算を用いるようにしてもよい。

上述した実施の形態においては、厚み情報に基づいて撮像範囲における撮像層を決定し、該撮像層ごとに組織切片像を撮像するようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、厚み情報に基づいて、撮像範囲における組織切片ＴＳの厚みを算出し、該組織切片ＴＳの全てが収まるように、対物レンズ１５の被写体深度を調節して、１枚の組織切片像を撮像するようにしてもよい。

上述した実施の形態においては、所定倍率の対物レンズ１５が１つ設けられている場合について述べた。本発明はこれに限らず、倍率の異なる複数の対物レンズが設けられ、複数の対物レンズのなかからレンズ切換機構又は手動により選択するようにしてもよい。

上述した実施の形態においては、対物レンズ１５から入射する光をハーフミラー１７により透過光と反射光とに分割し、撮像素子１６及び２１にそれぞれ透過光と反射光を導くようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、ハーフミラー１７の代わりにミラー及びミラーアップ機構が設けるようにしてもよい。

この場合、撮像素子２１に位相差像を結像する際には、ミラーを対物レンズ１５と撮像素子１６との間の光路上に配置し、ミラーで反射した反射光を撮像素子２１に導く。一方、撮像素子１６に被写体像を結像する際には、ミラーアップ機構によりミラーを対物レンズ１５と撮像素子１６との間の光路から外して対物レンズ１５からの光を撮像素子１６に導く。

上述した実施の形態においては、統括制御部３０がＨＤＤに格納されている厚み情報取得処理プログラムに従い、上述した厚み情報取得処理を行うようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、厚み情報取得処理プログラムがＲＯＭに格納されていてもよく、また記憶媒体からインストールしたり、インターネットからダウンロードした厚み情報取得処理プログラムに従って上述した厚み情報取得処理を行うようにしても良い。またその他種々のルートによってインストールした厚み情報取得処理ログラムに従って上述した厚み情報取得処理を行うようにしても良い。

上述した実施の形態においては、像取得部として位相差像取得部４１、算出部として相対状態算出部４２、厚み情報取得部として厚み情報取得部４３が設けられるようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、その他種々の構成でなる像取得部、算出部、厚み情報取得部を設けるようにしても良い。

本発明は、生物実験、医薬の創製又は患者の経過観察などのバイオ産業上において利用可能である。

１……顕微鏡、１１……ステージ、１２……ステージ駆動機構、１３……光源、１４……コンデンサレンズ、１５……対物レンズ、１６、２１……撮像素子、１７……ハーフミラー、１８……フィールドレンズ、１９……絞りマスク、１９Ａ，１９Ｂ……開口、２０Ａ、２０Ｂ……セパレータレンズ、３０……統括制御部、３１……ステージ駆動制御部、３２……照明制御部、３３……撮像制御部、３４……位相差像撮像制御部、４１……位相差像取得部、４２……相関分布算出部、４３……厚み情報取得部、ＣＧ……比較像、ＰＲＴ……プレパラート、ＳＧ……基準像。

Claims (6)

1. 内部で発生した光が透過するサンプルの位相差像を取得する像取得部と、
   上記位相差像における一方の像の各画素に対する他方の像の相関分布を算出する算出部と、
   上記相関分布における相関が最大となる位置での曲率を算出し、該曲率の程度に応じて上記サンプルの厚みに関する情報を取得する厚み情報取得部と
   を有する厚み情報取得装置。
2. 上記厚み情報取得部は、
   上記位相差像における上記画素の整列方向に関し、上記相関分布における相関が最大となる位置の前後での曲率をそれぞれ算出し、該曲率に応じた該相関値が最大となる位置の前後の厚みに関する情報を別々に算出する
   請求項１に記載の厚み情報取得装置。
3. 上記位相差像は、生体サンプルの像である
   請求項１又は２に記載の厚み情報取得装置。
4. 内部で発生した光が透過するサンプルの位相差像を取得する像取得ステップと、
   上記位相差像における一方の像の各画素に対する他方の像の相関分布を算出する算出ステップと、
   上記相関分布における相関が最大となる位置での曲率を算出し、該曲率の程度に応じて上記サンプルの厚みに関する情報を取得する厚み情報取得ステップと
   を有する厚み情報取得方法。
5. コンピュータに対して、
   内部で発生した光が透過するサンプルの位相差像を取得する像取得ステップと、
   上記位相差像における一方の像の各画素に対する他方の像の相関分布を算出する算出ステップと、
   上記相関分布における相関が最大となる位置での曲率を算出し、該曲率の程度に応じて上記サンプルの厚みに関する情報を取得する厚み情報取得ステップと
   を実行させる厚み情報取得プログラム。
6. 対物レンズから入射する光を直進又は反射させるミラーと、
   上記対物レンズに結像され、上記ミラーの直進側又は反射側の一方に投影される被写体像を撮像するための第１の撮像素子と、
   上記ミラーの直進側又は反射側の他方の後方に一対を単位として設けられ、上記対物レンズの被写体深度よりも広い被写体深度となる大きさとされる開口と、
   上記開口の後方にそれぞれ設けられ、上記ミラーの直進側又は反射側の他方に投影される被写体像の予定結像面に対して位相差像を形成するためのセパレータレンズと、
   上記予定結像面を撮像面として設けられる第２の撮像素子と、
   上記第２の撮像素子から、内部で発生した光が透過するサンプルの位相差像を取得する像取得部と、
   上記位相差像における一方の像の各画素に対する他方の像の相関分布を算出する算出部と、
   上記相関分布における相関が最大となる位置での曲率を算出し、該曲率の程度に応じて上記サンプルの厚みに関する情報を取得する厚み情報取得部と
   を有する顕微鏡。