JP5579456B2 - L−システイン生産菌及びl−システインの製造法 - Google Patents
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Description
(1) L−システイン生産能を有し、かつ、システインデスルフヒドラーゼ活性が低下又は欠失するようにMalY 調節タンパク質をコードする遺伝子が改変されたエシェリヒア属細菌。
(2) MalY 調節タンパク質をコードする遺伝子が破壊された(1)のエシェリヒア属細菌。
(3) さらにL−システイン生合成系酵素活性が増強された(1)または(2)のエシェリヒア属細菌。
(4) L−システイン生合成系酵素がセリンアセチルトランスフェラーゼである(3)のエシェリヒア属細菌。
(5) セリンアセチルトランスフェラーゼがL−システインによるフィードバック阻害に非感受性のセリンアセチルトランスフェラーゼである(4)のエシェリヒア属細菌。
(6) エシェリヒア・コリである(1)〜(5)のいずれかのエシェリヒア属細菌。
(7) (1)〜(6)のいずれかのエシェリヒア属細菌を培地で培養し、L−システインを培地中に生成蓄積させ、該培地よりL−システインを採取する、L−システインの製造方法。
のであってもよい。
入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)より分譲を受けることができる(住所 12301 Parklawn Drive,Rockville Maryland 20852,United
States of America )。
本発明のエシェリヒア属細菌を得る方法について、以下に具体的に説明する。
エシェリヒア属細菌のCD活性が低下又は欠失するようにOASS-B又はMalY遺伝子を改変する方法としては、変異処理や遺伝子破壊などの方法を挙げることができる。変異処理法としては、例えば、エシェリヒア属細菌を紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(NTG)もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理し、OASS-B遺伝子又はMalY遺伝子に変異が導入されて、CD活性が低下した変異株を選択する方法が挙げられる。ただし、OASS-B活性又はMalY活性を確実に低下又は消失させるためには、OASS-B、又はMalYをコードする遺伝子を用いた遺伝子破壊によって改変することが好ましい。
。具体的には、例えば、OASS-Bをコードする遺伝子の内部を欠失し、正常に機能するOASS-Bを産生しないように改変したCysM遺伝子(欠失型CysM遺伝子)、又はMalYをコードする遺伝子の内部を欠失し、正常に機能するMalYを産生しないように改変したmalY遺伝子(欠失型malY遺伝子)を、図2に示したプライマーを用いたPCRにより取得することができる。なお、遺伝子破壊に使用するDNAは、必ずしも上記エシェリヒア・コリ由来のものである必要はなく、相同組換え可能なDNAである限り、他の生物由来のDNAや合成DNAを使用してもよい。具体的には、エシェリヒア・コリのcysM遺伝子又はmalY遺伝子の塩基配列と80
%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上のホモロジーを有するDNAを使用することができる。
ザンハイブリダイゼーション等により、染色体上に欠失型CysM遺伝子が残った株を選択することによって、CysM遺伝子が破壊された株を取得することができる。
号公報に詳細に記載されている。
本発明の細菌は、L−システイン生合成系酵素活性が増強されたものであってもよい。
L−システイン生合成系酵素活性の増強は、例えば、セリンアセチルトランスフェラーゼ(SAT)活性を増強することによって行うことができる。エシェリヒア属細菌細胞内のSAT活性の増強は、SATをコードする遺伝子のコピー数を高めることによって達成される。例えば、SATをコードする遺伝子断片を、エシェリヒア属細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換えDNAを作製し、これを宿主エシェリヒア属細菌に導入して形質転換すればよい。
ば温度感受性プラスミドを用いた遺伝子置換によっても行うことができる。
上記のようにして得られる本発明のエシェリヒア属細菌を好適な培地で培養し、該培養物中にL−システインを生産蓄積せしめ、該培養物からL−システインを採取することにより、L−システインを効率よく、かつ、安定に製造することができる。尚、本発明の方法により製造されるL−システインには、還元型のシステインに加えてシスチンも含まれる場合があるが、本発明の製造法の対象物にはシスチン又は還元型のシステイン及びシスチンの混合物も含まれる。
CD遺伝子の同定には、cysE欠損株であるエシェリヒア・コリJM39(F+ cysE51 tfr-8
)(Denk, D. and Bock, A., J. Gene. Microbiol, 133, 515-525(1987))を用いた。CD遺伝子破壊株として、JM39ΔtnaA, JM39ΔmetC, JM39ΔcysM, JM39ΔmalY, JM39ΔcysKの単独CD遺伝子破壊株、そして、二重CD遺伝子破壊株JM39ΔtnaAΔmetC、JM39ΔcysKΔcysM及び四重CD遺伝子破壊株JM39ΔtnaAΔmetCΔcysMΔmalY、五重CD遺伝子破壊株JM39ΔtnaAΔmetCΔcysKΔcysMΔmalYを作製した。システイン生産では、JM39とJM39ΔtnaA, JM39ΔmetC, JM39ΔcysM, JM39ΔmalYの単独CD遺伝子破壊株、そして四重CD遺伝子破壊株JM39ΔtnaAΔmetCΔmalYΔcysMの計6株において、シロイヌナズナ由来のSAT遺伝子含有プラスミドpEAS-m(FEMS Microbiol. Lett., 179 (1999) 453-459)を導入した株を用いた。
CDの同定には、E. coliの全遺伝子 (ORF) 4,388個を含むpCA24Nプラスミドライブラリー(4,388種類のプラスミドが48枚の96穴プレートの各ウェルに分注されている)を使用した。このプラスミドライブラリーは、pCA24Nというベクターのlacプロモーターの下流に4,388個存在すると推定されているE .coliのORF全てが各々連結されていて、その発現は、IPTGによって誘導されるものである。また、遺伝子破壊用には、プラスミドpEL3(K.A. Armstrong et. al., J. Mol. Biol. (1984) 175, 331-347)を用い、pEL3gdtnaA, pEL3gdmetC, pEL3gdcysM, pEL3gdcysK, pEL3gdmalYを構築して使用した。その構築は後記する。
E. coliの形質転換や一般的な培養には完全培地LBを、最小培地としてM9培地(Na2HPO4
6g/L、KH2PO4 3g/L、NaCl 0.5g/L、MgSO4・7H2O 0.25g/L、CaCl2・4H2O 0.015mg/L、グルコース 4g/L、チアミン・HCl 0.001g/L)を使用し、必要に応じてアンピシリン (Amp) を添加した。実験に応じて、10〜30mMのシステインを添加したLB液体培地を使用した。また、培養は特記しない場合37℃で行った。システインの生産培養は、C1(グルコース 30g/L、NH4Cl 10g/L、KH2PO4 2g/L、MgSO4・7H2O 1g/L、FeSO4・7H2O 10mg/L、MnCl2・4H2O 10
mg/L、CaCO3 20g/L) + チオ硫酸ナトリウム培地を用い、システイン定量のためのアッセイ培地も同じ組成の培地を用いた。
培養菌体からの細胞抽出液の調製は、超音波破砕によって行った。超音波破砕機その際に用いたBufferの組成は、[ [ 100 mM Tris-HCl (pH 8.6), 100 mM DTT ( (±)-Dithiothreitol ), 10 mM PLP ( Pyridoxal Phosphate ) ] ] である。
後述するCD活性染色によって、CDの同定や確認、CD遺伝子破壊株の構築を確認する等のために、細胞抽出液中のタンパク質を未変性状態のまま分離する必要があるためSDSを含まないNative-PAGEゲルを作製した。分離ゲル3枚分の組成は、12.5%ゲル [ Acrylamide/Bisacrylamide/amide (37 : 5 : 1) 6.4 ml, 1 M Tris-HCl (pH 8.7) 6.7 ml, dH2O 6.8 ml,
10% APS (Ammonium persulfate) 100 μl, TEMED (N, N, N, N'-Tetra-methyl-etylenediamine) 10 μl ]で、10%ゲル [ Acrylamide / Bisacrylamide / amide (37 : 5 : 1) 5.1 ml, 1 M Tris-HCl (pH 8.7) 6.7 ml, dH2O 8.1 ml, 10% APS 100 μl, TEMED 10 μl] である。また、濃縮ゲルは4.5%で、3枚分の組成は、[ Acrylamide / Bisacrylamide /amide (37 : 5 : 1) 0.7 ml, 1 M Tris-HCl (pH 6.8) 0.75 ml, dH2O 4.52 ml, 10% APS30 μl, TEMED 5 μl ]である。Native-PAGEは、ミニスラブ式電気泳動装置 (AEW-6500, ATTO社製)を用い、30 μg〜50 μgの細胞抽出液を2×Native-PAGE buffer と混合してゲルにアプライし、200 V, 20 mA/gelで、2時間から4時間泳動を行った。その際用いた泳動Bufferの1 L中の組成は、(L-Glycine 14.43 g, Tris 3.0 g) で、pH 8.6に調整した。
CD活性を持つ酵素の存在を、特異的に視覚化し検出する方法としてCD活性染色法を用いた。1-5に記述したように細胞抽出液中のタンパク質を泳動分離後、CD活性染色液にゲルを浸し、室温で数時間から一晩、振とうしながら放置してCDのバンドを検出した。CD活性染色液の100 ml中の組成は、 [Tris 1.21 g, EDTA 0.372 g, L-Cysteine (システイン) 0.605 g, BiCl3 (塩化ビスマス)50 mg, 10 mM PLP 200 μl]で、pH 8.6である。CD活性染色は、Native-PAGEゲルで分離されたCDがゲル中の存在する場所で、その触媒反応によってCD活性染色液中に含まれるシステインをピルビン酸とアンモニア、H2Sに分解する。生成したH2Sは、同じくCD活性染色液中に含まれる塩化ビスマス (BiCl3)と反応し硫化ビスマス (Bi2S3)となって黒色バンドを呈するという原理を利用して行った。
各プラスミドが分注された48枚分の96穴プレートを、プレートナンバー1〜5、6〜10と言うように区切り、5プレート分毎の混合プラスミド液 (それぞれ480種類のプラスミドが含まれる)を9種類調製した。それぞれの混合プラスミド溶液を用い、JM39株を形質転換して、それぞれ約10,000コロニー分の形質転換体をグリセロールストックした。9種類のグリセロールストック溶液をLB + クロラムフェニコール (Cm) + 0.01 mM IPTG培地に添加して培養後、細胞抽出液を調製し、Native-PAGEに供したあとCD活性染色を行ってどの混合プラスミド溶液に目的のCDが存在するか検出した。目的のCDをコードする遺伝子が480種類に絞り込むことができたので、次に、96種類 まで絞り込む操作を行った。480種類のプラスミドを96種類ごとに分けた5つの混合プラスミド溶液を調製した。それぞれの混合プラスミド溶液でJM39株を形質転換し、形質転換体約6,000コロニー分をグリセロールストック後、培養してCD活性染色を行い目的のCDが存在する混合プラスミド溶液を確認した。目的のCDをコードする遺伝子を96種類にまで絞り込んだあと、さらに8種類に絞り込み、最後は、8種類のタンパク質をそれぞれ発現させてCD活性染色を行って目的のCDを同定した。
各CD遺伝子を破壊するために、温度感受性の複製開始点をもったプラスミドpEL3を用いて、5種類の破壊用プラスミド、pEL3gdtnaA , pEL3gdmetC ,pEL3gdcysM, pEL3gdcysK, pEL3gdmalYを構築した。これらの作製法を以下に示す。すなわち、E. coli JM39のゲノムを鋳型に、破壊したい各CD遺伝子の2箇所の領域で、300 bp〜700 bp のDNA断片をPCRによって増幅した。このDNA断片をそれぞれ相同領域DNA断片-AとBとする。用いたプライマーは、図2に記載した。相同領域DNA断片-Aの増幅には、各CD遺伝子破壊用プライマー1と2を用い、相同領域DNA断片-Bの増幅には3と4を用いた。プライマーのDNA配列内には制限酵素サイトが設計してあり、増幅した相同領域DNA断片の両末端には制限酵素サイトが付加される。A, B両断片に共通の制限酵素(KpnI、HindIII、又はEcoRI)で処理後、両断片をライゲーションさせて各CD遺伝子破壊用断片作成用の鋳型とした。各CD遺伝子破壊用プライマー1と4を用いてPCRにより各CD遺伝子破壊用断片を大量に調製した。破壊用断片とpEL3をBamHI制限酵素処理し、それぞれを連結させて各CD遺伝子破壊用プラスミドを構築した。構築の確認はDNAシーケンシングによって行った。
1-9のように構築した破壊用プラスミドを用いて、E. coli JM39株からCD遺伝子破壊株の構築を行った。まず、JM39に各破壊用プラスミドを導入し形質転換体を得た。温度感受性プラスミドpEL3の制限温度は42 ℃で、通常のE. coliの培養温度である37 ℃は制限温度以下であるが、念のために30 ℃で培養を行った。次に各形質転換体をLB + Amp培地で30 ℃、一晩培養後、培養液を103希釈し、200 μlの希釈液をLB + Ampプレートに塗り広げた。42 ℃で培養することにより、プラスミドが複製不可能になり、そのままの状態では形質転換体がAmpによって生育阻害を受け、コロニー形成できない条件にした。そのような培養条件下において、複製が止まったプラスミド上の各破壊用断片とJM39株の染色体に存在する相同領域で相同組換えを起こし、破壊用プラスミドの全長が染色体に組み込まれることでAmp耐性のコロニーを形成した破壊用プラスミド組み込み株をスクリーニングした。破壊用プラスミドの染色体への組み込みの確認は、図2に記載した各CD遺伝子破壊用プライマーのFWとRVを用いたPCRによって確認した。破壊用プラスミドの染色体組み込みを確認したコロニーをLB液体培地で培養し、再度相同組み替えを起こして破壊用断片だけが残り、プラスミド配列と目的遺伝子を欠落させる操作を行った。LB液体培地で、数度植え継いで培養し、LB寒天培地で200〜300コロニー形成するように培養液を希釈して塗り広げた。生育してきたコロニーをLBとLB + Amp寒天培地にレプリカし、Amp感受性コロニーを選び出した。そして、FWとRVプライマーを用いたコロニーPCRを行い破壊用断片だけが残ったCD遺伝子破壊株をスクリーニングした。
破壊株についてCD活性染色を行い、破壊遺伝子に由来するCD活性の消失を確認した。また、多重CD遺伝子破壊株の構築は、構築の完了したCD遺伝子破壊株に、続けて目的のCD遺伝子を破壊する操作を行うことを繰り返すことで行った。
細胞抽出液中の全CDの活性 (total CD活性)を、システインがCDによって分解され発生
する硫化水素 (H2S) の量を定量することで測定した。活性を測定したい菌株を、5 mlのLBおよびLB + 10mMシステイン培地で37 ℃一晩培養後、細胞抽出液を2-2-4のように調製した。活性測定bufferの組成は、[ 100mM Tris-HCl (pH 8.6), 100 μM DTT, 10 mM PLP, 2μM L-Cysteine ]で、活性測定buffer 1 mlに細胞抽出液10 mlを添加し、30 ℃で10分間反応させた。また、検量線用に水および0.1 mM, 0.2 mM, 2 mMのNa2Sをそれぞれ10 μl活性測定bufferに添加し、同様にインキュベートした。反応終了後、100 mlの20 mM N, N-ジメチル-P-フェニルジアミン硫酸塩 (in 7.2 N HCl)と同量の30 mM FeCl3 (in 1.2 N HCl)を添加し激しく混合後、暗所で15分間静置した。N, N-ジメチル-P-フェニルジアミン硫酸塩 は、塩酸酸性で酸化剤として塩化鉄を共存させると試料中の硫化物と反応してチアジン色素メチレンブルーを生じ緑青ないし青色を呈する。この反応を15分間で生じさせた
。15分の静置後、OD650を測定し1 μmolのH2Sを与える酵素量を1Uと定義し活性を算出した。
得られた各形質転換株を、C1 + チオ硫酸ナトリウム(チオ硫酸 15g/L)培地を20mL入れた坂口フラスコに接種し、37℃で培養し、24、48、72および96時間後の上清のL−システイン含量を定量した。L−システインの含量は、ロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)を用いるバイオアッセイ(Tsunoda, T. et al., Amino acids, 3, 7-13 (1961))により、還元型システイン及びシスチンの総量として測定した。
2-1. E. coli CDの存在の確認
E. coliに存在するCDを確認するために、JM39株の細胞抽出液を調製してNative-PAGEに供し、約2時間の泳動でタンパク質を分離後、活性染色を行った。その結果を図1に示す。CD活性を示す5本のバンドが検出できた。本実験により、E. coliにはCDが少なくとも5種類存在することがわかった。このうち、2つは、トリプトファナーゼ(TNase)、シスタチオニン−β−リアーゼ(CBL)であることがアミノ酸分析等によって明らかになっている(特開2003-169668号公報)。残りの3つを同定するために以下の実験を行った。
E. coliのゲノムには、4,388個の遺伝子(ORF)が存在すると推定されている。それら全ORFを個々にプラスミドに連結したE. coli全ORFライブラリーを使用して、1−7に記した手順でCDの同定を続けた。CD活性染色で未同定CDのバンドを検出することによって、未同定CDをコードしている遺伝子が連結されているプラスミドをまず、4,388種類から480種類に絞り込み、次に96種類、さらに8種類と絞り込んだ。最後に8種類のプラスミドをそれぞれ評価したところ、cysM遺伝子、cysK遺伝子及びmalY遺伝子がコードするタンパク質が未同定CDであることを突き止めることができた。E. coliのcysMは、O-acetyl L-serinesulfhydlase-B (OASS-B)をコードしていることが報告されている(J. Bacteriol. 172 (6), 3351-3357 (1990))。また、cysKはO-acetyl L-serinesulfhydlase-A (OASS-A)をコードしていることが報告されている(Mol. Microbiol. 2 (6), 777-783 (1988))。さらに、malYは、マルトース資化経路遺伝子群の調節因子であり、CBLとその立体構造が相似していて、C-Sリアーゼ反応を触媒することも見出されたタンパク質であるMalYをコードしていることが報告されている(EMBO J. 2000,Mar; 19(5): 831-842)。
2−3で同定したOASS-B、OASS-A及びMalYがCDであることは、JM39株においてこれらの遺伝子を過剰発現させることにより確認できた。すなわち、各遺伝子を過剰発現させCD活性染色によってバンドを検出したところ、染色されるバンドがJM株に比べて濃くなり、各遺伝子がCD活性を有するタンパク質をコードすることがわかった。
E. coliに存在する 5つのCDを全て同定することができたので、各CD遺伝子破壊株の構築を行った。なお、JM39ΔtnaA JM39ΔmetC 株については特開2003-169668号公報にもその作製方法が開示されている。まず、1−8のような手順でtnaA, metC, cysM, cysK, malYそれぞれの破壊用プラスミド、pEL3gdtnaA , pEL3gdmetC ,pEL3gdcysM, pEL3gdcysK, pEL3gdmalYを構築し、JM39に導入して破壊の操作を行い、それぞれの単独破壊株を構築した。さらに、遺伝子破壊を繰り返してtnaA, metC, cysM, malY が破壊された4重破壊株JM39ΔtnaAΔmetCΔcysMΔmalYなどの多重破壊株についても作製した。遺伝子破壊の操作後、コロニーPCRによって増幅したDNA断片の鎖長から、遺伝子レベルで破壊の確認を行い、さらにCD活性染色によって各CDが目的通り破壊され活性を失っていることを確認した。
1−11の方法に従って、本研究で用いた全CD遺伝子破壊株のtotal CD活性を測定した。結果を表1に示す。その結果、まず、LB培地で培養した場合の各菌株のtotal CD活性を親株のJM39と比較すると、全ての破壊株で活性の低下が認められた。多重破壊株の活性をJM39の活性と比較すると、JM39ΔcysMΔcysKを除き顕著な活性の低下が認められた。また、その活性の低下は、各単独破壊株の活性低下と比較しても有意であった。JM39ΔcysMΔcysKの活性もそれぞれの単独破壊株の活性と比較すると低下していた。次に、システインを培地に添加して培養した場合のtotal CD活性を分析した。JM39ΔtnaA を除いたすべての株において、LB培地で培養した場合の活性と比較して顕著な活性の増加が認められた。
JM39とJM39ΔtnaA, JM39ΔmetC, JM39ΔcysM, JM39ΔmalYの単独CD遺伝子破壊株 を4株、そして四重CD遺伝子破壊株 JM39ΔtnaAΔmetCΔmalYΔcysMの計6株に、A. thaliana SAT-m プラスミド・pEAS-mを導入してシステイン生産に使用した。1-12の方法にしたがってシステインの生産培養を行い、システインの定量を行った。対照株及び各CD遺伝子破壊株のシステイン生産量を生育度 (Growth: OD562値)で割った値の経時変化を表2又は図3に示す。なお、生育度はJM39ΔtnaAについてはやや低下したが、その他の破壊株は対照株JM39とほとんど変わらなかった。
ることができなかった。
Claims (6)
- L−システイン生産能を有し、かつ、システインデスルフヒドラーゼ活性が低下又は欠失するようにMalY 調節タンパク質をコードする遺伝子が改変されたエシェリヒア属細菌を培地で培養し、L−システインを培地中に生成蓄積させ、該培地よりL−システインを採取する、L−システインの製造方法。
- 前記エシェリヒア属細菌は、MalY 調節タンパク質をコードする遺伝子が破壊されたエシェリヒア属細菌である、請求項1に記載のL−システインの製造方法。
- 前記エシェリヒア属細菌は、さらにL−システイン生合成系酵素活性が増強されたエシェリヒア属細菌である、請求項1または2に記載のL−システインの製造方法。
- L−システイン生合成系酵素がセリンアセチルトランスフェラーゼである請求項3に記載のL−システインの製造方法。
- セリンアセチルトランスフェラーゼがL−システインによるフィードバック阻害に非感受性のセリンアセチルトランスフェラーゼである、請求項4に記載のL−システインの製造方法。
- 前記エシェリヒア属細菌はエシェリヒア・コリである請求項1〜5のいずれか一項に記載のL−システインの製造方法。
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