JP5572464B2 - Confocal microscope - Google Patents

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Description

本発明は、観察試料に対し、三次元画像を作成する共焦点顕微鏡装置に関する。   The present invention relates to a confocal microscope apparatus that creates a three-dimensional image for an observation sample.

従来、レーザ光源から観察試料に集光して照射された光を、共焦点位置に配置されたピンホールを介して検出することにより、像の濃度情報を得る共焦点顕微鏡がある。このような共焦点顕微鏡においては、観察試料の平面方向に関しては、レーザ光を二次元走査することにより、平面画像を得ることができる。段差のある観察試料に関しては、レーザ光の光軸方向に照射の焦点位置を移動させることによって、観察を行うことができる。   2. Description of the Related Art Conventionally, there is a confocal microscope that obtains density information of an image by detecting light condensed and irradiated on an observation sample from a laser light source through a pinhole arranged at a confocal position. In such a confocal microscope, a planar image can be obtained by two-dimensionally scanning laser light in the planar direction of the observation sample. An observation sample with a step can be observed by moving the focal position of irradiation in the optical axis direction of the laser beam.

上記のような共焦点顕微鏡で三次元画像を作成する場合には、レーザ光の光軸方向に焦点位置を移動させながら、レーザ光を二次元走査してスライス画像を繰り返し取込む方法を用いている。しかし、このスライス画像の取込み開始から終了までの間、光軸方向に移動する際の測定ピッチを変更せずに一定速度で対物レンズを観察試料に対して相対移動させて三次元画像を作成しているため、測定には時間がある程度必要であり、特に高段差のある観察試料の測定には多くの測定時間を要する。そのため、高段差のある観察試料に対し、測定時間を短縮しつつ、特定の平面部分だけは正確に測定することが望まれている。   When creating a three-dimensional image with the confocal microscope as described above, a method is used in which the slice position is repeatedly captured by scanning the laser beam two-dimensionally while moving the focal position in the optical axis direction of the laser beam. Yes. However, the three-dimensional image is created by moving the objective lens relative to the observation sample at a constant speed without changing the measurement pitch when moving in the optical axis direction from the start to the end of taking this slice image. Therefore, a certain amount of time is required for measurement, and in particular, a lot of measurement time is required for measurement of an observation sample having a high level difference. For this reason, it is desired to accurately measure only a specific plane portion of an observation sample having a high step while reducing the measurement time.

このような問題を解決する方法として、スライス画像の取得開始前にプレスキャンにより得られた輝度データ中で、輝度が最大となるピーク位置から測定対象面を検出し、その検出範囲についての高さ測定を行うことが提案されている。なお、プレスキャンとは、観察試料面を一方向に１ラインのみスキャンを行いながら、対物レンズの位置をレーザの光軸方向に所定の速度で移動させて連続的な輝度データを取得することである（例えば、特許文献１参照）。   As a method for solving such a problem, the surface to be measured is detected from the peak position where the luminance is maximum in the luminance data obtained by pre-scanning before starting the acquisition of the slice image, and the height of the detection range is determined. It has been proposed to make measurements. Note that pre-scan refers to acquiring continuous luminance data by moving the position of the objective lens at a predetermined speed in the direction of the optical axis of the laser while scanning only one line of the observation sample surface in one direction. Yes (see, for example, Patent Document 1).

また、レーザ光軸方向の各取込み位置におけるスライス画像中の一定以上の輝度の画素数と、全スライス画像における所定条件に合致する画素数とに応じて、スライス画像の取得開始および終了を決定し、必要な範囲の三次元画像を自動的に得られるようにした共焦点顕微鏡が開示されている（例えば、特許文献２参照）。   In addition, the start and end of slice image acquisition are determined according to the number of pixels having a certain level or higher luminance in the slice image at each capture position in the laser optical axis direction and the number of pixels that match a predetermined condition in all slice images. A confocal microscope has been disclosed in which a three-dimensional image in a necessary range can be automatically obtained (see, for example, Patent Document 2).

特開２００２−３９７２２号公報JP 2002-39722 A 特開２００８−１３４３３９号公報JP 2008-134339 A

しかしながら、特許文献１に記載の共焦点顕微鏡装置においては、観察試料全体が一定の段差になっている場合には、プレスキャンを行うことで測定対象面を検出することは可能であるが、例えば、観察試料の平面上の一部分に段差があるなど、観察試料全体が一定段差ではない場合には、プレスキャンのライン上に測定対象面が含まれるか否かは不明である。   However, in the confocal microscope apparatus described in Patent Document 1, when the entire observation sample has a certain level difference, it is possible to detect the measurement target surface by performing a pre-scan. If the entire observation sample is not a constant step, such as a step on a part of the plane of the observation sample, it is unclear whether the measurement target surface is included on the prescan line.

上記問題に対し、プレスキャンを行うライン数を増やすことで測定対象平面の検出精度を向上させることは可能である。しかしながら、正確に検出できるとは言えず、測定範囲全体において一定の測定ピッチでスライス画像の取込みを行うことになり、測定時間を多く必要とする。また、プレスキャンのライン数の増加も、測定時間の増加に繋がってしまう。   For the above problem, it is possible to improve the detection accuracy of the measurement target plane by increasing the number of lines to be pre-scanned. However, it cannot be accurately detected, and slice images are captured at a constant measurement pitch over the entire measurement range, requiring a lot of measurement time. An increase in the number of pre-scan lines also leads to an increase in measurement time.

特許文献２に記載の共焦点顕微鏡においては、スライス画像の取得開始および終了を自動で規定することにより、不要な範囲のスライス画像を取得することにより測定時間が増大することは防止できる。しかしながら、高段差を有する試料であるような場合には段差全体を測定するため測定範囲が広くなることから、測定時間の短縮はあまり期待できない。   In the confocal microscope described in Patent Document 2, by automatically specifying the start and end of slice image acquisition, it is possible to prevent an increase in measurement time by acquiring slice images in an unnecessary range. However, in the case of a sample having a high level difference, the measurement range is widened because the entire level difference is measured, and therefore the measurement time cannot be expected to be shortened much.

上記課題に鑑み、本発明では、観察試料全体が一定の段差ではなく、特に高段差である場合においても、正確に測定対象平面を検出すると共に、測定時間の短縮が可能となる共焦点顕微鏡装置を提供することを目的とする。   In view of the above problems, in the present invention, a confocal microscope apparatus capable of accurately detecting a measurement target plane and shortening a measurement time even when the entire observation sample is not a constant step, but particularly a high step. The purpose is to provide.

本発明にかかる共焦点顕微鏡装置は、観察試料の観察面に光を集束して二次元走査するとともに、前記光の光軸方向に集束位置を移動しながら共焦点画像を取得する共焦点顕微鏡装置であって、前記観察試料を載置するステージと、前記光軸上に配置され、所定の倍率で前記光を前記観察面に集束する少なくとも１つの対物レンズと、前記観察試料の所望の前記観察面に前記光を集束させるために前記ステージと前記対物レンズとの距離を所定間隔で変化させる移動手段と、前記距離に応じて前記所定間隔を設定する測定条件設定手段と、前記測定条件設定手段が設定した前記所定間隔で前記距離を変化させるように前記移動手段を駆動制御する駆動制御手段と、前記観察面からの反射光を検出する光検出手段と、前記所定間隔で変化させた前記距離毎に前記観察面上に前記光を二次元走査することにより前記光検出手段が検出した検出信号に基づき複数の画素よりなる二次元画像を生成する二次元画像生成手段と、前記二次元画像生成手段で生成された複数の前記二次元画像を用いて三次元画像を生成する三次元画像生成手段と、を有し、前記測定条件設定手段は、前記距離の所定の上限および所定の下限と、前記距離の前記上限から下限までの所定距離範囲内において前記距離を変化させる第１の間隔と、前記第１の間隔より大きい第２の間隔とを少なくとも１組設定し、前記駆動制御手段は、前記所定距離範囲内では前記第１の間隔で前記距離を変化させ、前記所定距離範囲外では前記第２の間隔で前記距離を変化させるように前記移動手段を駆動制御することを特徴としている。 A confocal microscope apparatus according to the present invention condenses light on an observation surface of an observation sample and performs two-dimensional scanning, and acquires a confocal image while moving a focusing position in the optical axis direction of the light. A stage on which the observation sample is placed, at least one objective lens that is arranged on the optical axis and focuses the light on the observation surface at a predetermined magnification, and the desired observation of the observation sample. Moving means for changing the distance between the stage and the objective lens at a predetermined interval to focus the light on a surface; a measurement condition setting means for setting the predetermined interval according to the distance; and the measurement condition setting means The drive control means for driving and controlling the moving means so as to change the distance at the predetermined interval set by, the light detection means for detecting the reflected light from the observation surface, and changed at the predetermined interval Two-dimensional image generation means for generating a two-dimensional image composed of a plurality of pixels based on a detection signal detected by the light detection means by two-dimensionally scanning the light on the observation surface at each recording distance; have a, a three-dimensional image generation means for generating a three-dimensional image by using a plurality of the two-dimensional image generated by the image generating means, the measurement condition setting means, the predetermined upper limit and a predetermined lower limit of the distance And at least one set of a first interval for changing the distance within a predetermined distance range from the upper limit to the lower limit of the distance and a second interval larger than the first interval, and the drive control means , the within a predetermined distance range changing the distance in the first distance, said at predetermined distance range as characterized by driving and controlling the moving means to vary the distance in said second interval That.

前記対物レンズの倍率に応じた第１のレンズ依存間隔と第１のレンズ依存間隔より大きい第２のレンズ依存間隔とを保持する測定間隔記憶手段と、前記光軸上に配置された前記対物レンズの倍率を検出し、前記測定間隔記憶部から前記対物レンズの倍率に応じた前記第１のレンズ依存間隔と前記第２のレンズ依存間隔とを取得する測定間隔取得手段と、をさらに有し、前記測定条件設定手段は、前記測定間隔取得手段が取得した前記第１のレンズ依存間隔を前記第１の間隔として設定し、前記第２のレンズ依存間隔を前記第２の間隔として設定するようにしてもよい。   Measurement interval storage means for holding a first lens-dependent interval corresponding to the magnification of the objective lens and a second lens-dependent interval larger than the first lens-dependent interval; and the objective lens disposed on the optical axis Measurement interval acquisition means for detecting the magnification of the first lens dependent interval and the second lens dependent interval according to the magnification of the objective lens from the measurement interval storage unit, The measurement condition setting unit sets the first lens dependent interval acquired by the measurement interval acquisition unit as the first interval, and sets the second lens dependent interval as the second interval. May be.

前記測定条件設定手段は、前記距離の前記上限、前記下限、前記第１の間隔、および前記第２の間隔を設定するための画面を表示する設定画面表示手段、を有することもできる。前記設定画面表示手段で設定された前記上限、前記下限、前記第１の間隔、および前記第２の間隔を測定条件として記憶する測定条件記憶手段、をさらに備えるようにしてもよい。   The measurement condition setting means may include setting screen display means for displaying a screen for setting the upper limit, the lower limit, the first interval, and the second interval of the distance. You may make it further provide the measurement condition memory | storage means which memorize | stores the said upper limit, the said lower limit, the said 1st space | interval, and the said 2nd space | interval set by the said setting screen display means as a measurement condition.

前記測定条件設定手段は、前記測定条件記憶手段から前記測定条件を読込み、前記駆動制御手段は、読込んだ前記測定条件に応じて前記移動手段を駆動制御することが好ましい。前記測定条件設定手段は、各々が前記上限、前記下限、前記第１の間隔、および前記第２の間隔を含む複数の組み合わせが設定され、前記複数の組み合わせのうちの第１の組み合わせに含まれる前記上限から前記下限までの第１の所定距離範囲が、他の組み合わせに含まれる前記上限から前記下限までの他の所定距離範囲と少なくとも一部で重なっている場合、設定した測定範囲内において前記移動手段が同じ間隔で前記距離を変化させるように、前記第１の所定距離範囲と前記他の所定距離範囲を１つの前記測定範囲として設定してもよい。前記測定条件設定手段は、各々が前記上限、前記下限、前記第１の間隔、および前記第２の間隔を含む複数の組み合わせが設定され、前記複数の組み合わせのうちの第１の組み合わせに含まれる前記上限から前記下限までの第１の所定距離範囲が、他の組み合わせに含まれる前記上限から前記下限までの他の所定距離範囲と離れている場合であって、前記第１の所定距離範囲と前記他の所定距離範囲との間の距離が、前記ステージと前記対物レンズとの前記距離を変化させる前記間隔を、第１の前記所定距離範囲内と他の前記所定距離範囲内とで変化させる必要がないと判断される距離である場合、設定した測定範囲内において前記移動手段が同じ間隔で前記ステージと前記対物レンズとの前記距離を変化させるように、前記第１の所定距離範囲と前記他の所定距離範囲を１つの前記測定範囲として設定してもよい。 Preferably, the measurement condition setting unit reads the measurement condition from the measurement condition storage unit, and the drive control unit drives and controls the moving unit according to the read measurement condition. In the measurement condition setting means, a plurality of combinations each including the upper limit, the lower limit, the first interval, and the second interval are set, and are included in the first combination of the plurality of combinations. When the first predetermined distance range from the upper limit to the lower limit overlaps at least partly with another predetermined distance range from the upper limit to the lower limit included in another combination, within the set measurement range, the The first predetermined distance range and the other predetermined distance range may be set as one of the measurement ranges so that the moving means changes the distance at the same interval. In the measurement condition setting means, a plurality of combinations each including the upper limit, the lower limit, the first interval, and the second interval are set, and are included in the first combination of the plurality of combinations. The first predetermined distance range from the upper limit to the lower limit is separated from the other predetermined distance range from the upper limit to the lower limit included in another combination, and the first predetermined distance range The distance between the other predetermined distance range changes the distance for changing the distance between the stage and the objective lens between the first predetermined distance range and the other predetermined distance range. When the distance is determined to be unnecessary, the first predetermined distance is set such that the moving means changes the distance between the stage and the objective lens at the same interval within the set measurement range. Said another predetermined distance range and circumference may be set as one of the measurement range.

本発明にかかる共焦点顕微鏡装置は、観察試料の観察面に光を集束して二次元走査するとともに、前記光の光軸方向に集束位置を移動しながら共焦点画像を取得する共焦点顕微鏡装置であって、前記観察試料を載置するステージと、前記光軸上に配置され、所定の倍率で前記光を前記観察面に集束する少なくとも１つの対物レンズと、前記観察試料の所望の前記観察面に前記光を集束させるために前記ステージと前記対物レンズとの距離を所定間隔で変化させる移動手段と、前記距離に応じて前記所定間隔を設定する測定条件設定手段と、前記測定条件設定手段が設定した前記所定間隔で前記距離を変化させるように前記移動手段を駆動制御する駆動制御手段と、前記観察面からの反射光を検出する光検出手段と、前記所定間隔で変化させた前記距離毎に前記観察面上に前記光を二次元走査することにより前記光検出手段が検出した検出信号に基づき複数の画素よりなる二次元画像を生成する二次元画像生成手段と、前記二次元画像生成手段で生成された複数の前記二次元画像を用いて三次元画像を生成する三次元画像生成手段と、前記観察試料において、少なくとも一点の測定指示点を指定する測定指示点指定手段と、各々の前記測定指示点に前記光を集束させる場合の前記距離を少なくとも１つの合焦距離として計測する合焦距離計測手段と、を有し、前記測定条件設定手段は、少なくとも１つの前記合焦距離に応じて前記所定間隔を設定することを特徴とする。 A confocal microscope apparatus according to the present invention condenses light on an observation surface of an observation sample and performs two-dimensional scanning, and acquires a confocal image while moving a focusing position in the optical axis direction of the light. A stage on which the observation sample is placed, at least one objective lens that is arranged on the optical axis and focuses the light on the observation surface at a predetermined magnification, and the desired observation of the observation sample. Moving means for changing the distance between the stage and the objective lens at a predetermined interval to focus the light on a surface; a measurement condition setting means for setting the predetermined interval according to the distance; and the measurement condition setting means The drive control means for driving and controlling the moving means so as to change the distance at the predetermined interval set by, the light detection means for detecting the reflected light from the observation surface, and changed at the predetermined interval Two-dimensional image generation means for generating a two-dimensional image composed of a plurality of pixels based on a detection signal detected by the light detection means by two-dimensionally scanning the light on the observation surface at each recording distance; Three-dimensional image generation means for generating a three-dimensional image using a plurality of the two-dimensional images generated by the image generation means; a measurement instruction point specifying means for specifying at least one measurement instruction point in the observation sample; have a, a focusing distance measuring means for measuring the at least one focusing distance the distance when focusing the light in each said measurement instruction point, the measurement condition setting means, focusing at least one of said case you and sets the predetermined distance according to the distance.

前記測定条件設定手段は、前記距離の上限および下限と、前記距離の前記上限から下限までの所定距離範囲内において前記距離を変化させる第１の間隔と、前記第１の間隔より大きい第２の間隔とを少なくとも１組設定し、前記駆動制御手段は、前記所定距離範囲内では前記第１の間隔で前記距離を変化させ、前記所定距離範囲外では前記第２の間隔で前記距離を変化させるように前記移動手段を駆動制御するようにしてもよい。 The measurement condition setting means includes an upper limit and a lower limit of the distance , a first interval for changing the distance within a predetermined distance range from the upper limit to the lower limit of the distance, and a second interval larger than the first interval. At least one set of intervals is set, and the drive control means changes the distance at the first interval within the predetermined distance range, and changes the distance at the second interval outside the predetermined distance range. As described above, the moving means may be driven and controlled.

ここで、前記対物レンズの倍率に応じた第１のレンズ依存間隔と第２のレンズ依存間隔とを保持する測定間隔記憶手段と、前記光軸上に配置された前記対物レンズの倍率を検出し、前記測定間隔記憶部から前記対物レンズの倍率に応じた前記第１のレンズ依存間隔と前記第２のレンズ依存間隔とを取得する測定間隔取得手段と、をさらに有し、前記測定条件設定手段は、前記測定間隔取得手段が取得した前記第１のレンズ依存間隔を前記第１の間隔として設定し、前記第２のレンズ依存間隔を前記第２の間隔として設定することもできる。   Here, a measurement interval storage means for holding a first lens dependent interval and a second lens dependent interval according to the magnification of the objective lens, and the magnification of the objective lens arranged on the optical axis are detected. A measurement interval acquisition unit that acquires the first lens dependent interval and the second lens dependent interval according to the magnification of the objective lens from the measurement interval storage unit, and the measurement condition setting unit Can set the first lens-dependent interval acquired by the measurement interval acquisition means as the first interval, and set the second lens-dependent interval as the second interval.

前記観察面を表示する観察面表示手段と、前記観察面表示手段において、前記観察面上の少なくとも１点を特定する測定指示点特定手段と、をさらに有し、前記測定指示点指定手段は、前記測定指示点特定手段により特定された前記点を測定指示点として指定することが好ましい。ここで、前記測定指示点を記憶する測定指示点記憶手段、をさらに備えることもできる。前記合焦距離を記憶する合焦距離記憶手段、をさらに備えるようにしてもよい。   The observation surface display means for displaying the observation surface, and the observation surface display means further includes a measurement instruction point specifying means for specifying at least one point on the observation surface, the measurement instruction point specifying means, It is preferable that the point specified by the measurement instruction point specifying means is designated as a measurement instruction point. Here, it is possible to further include measurement instruction point storage means for storing the measurement instruction point. You may make it further provide the focusing distance memory | storage means to memorize | store the said focusing distance.

前記合焦距離を含む前記距離の範囲であって、合焦状態である範囲を合焦範囲として検出する合焦範囲検出手段、をさらに有し、前記測定条件設定手段は、前記合焦範囲の最大距離に所定距離を加えた距離を前記上限として設定し、前記合焦範囲の最大距離から所定距離を減じた距離を前記下限として設定することもできる。   A range of the distance including the in-focus distance, and a focus range detecting unit that detects a range in focus as the in-focus range; and the measurement condition setting unit includes: A distance obtained by adding a predetermined distance to a maximum distance may be set as the upper limit, and a distance obtained by subtracting the predetermined distance from the maximum distance in the focusing range may be set as the lower limit.

前記三次元画像生成手段が前記距離の上限から下限までの所定距離範囲であって前記三次元画像を生成可能な最低数の前記ニ次元画像を得るために必要な最低の前記所定距離範囲を最低距離範囲として記憶する最低距離範囲記憶手段、をさらに有し、前記測定条件設定手段は、設定された前記所定距離範囲が前記最低距離範囲記憶手段に記憶された前記最低距離範囲より小さい場合には、前記所定距離範囲を前記最低距離範囲に一致させるように、前記上限および前記下限を設定変更するようにしてもよい。前記測定条件設定手段は、各々が前記上限、前記下限、前記第１の間隔、および前記第２の間隔を含む複数の組み合わせが設定され、前記複数の組み合わせのうちの第１の組み合わせに含まれる前記上限から前記下限までの第１の所定距離範囲が、他の組み合わせに含まれる前記上限から前記下限までの他の所定距離範囲と少なくとも一部で重なっている場合、設定した測定範囲内において前記移動手段が同じ間隔で前記距離を変化させるように、前記第１の所定距離範囲と前記他の所定距離範囲を１つの前記測定範囲として設定してもよい。前記測定条件設定手段は、各々が前記上限、前記下限、前記第１の間隔、および前記第２の間隔を含む複数の組み合わせが設定され、前記複数の組み合わせのうちの第１の組み合わせに含まれる前記上限から前記下限までの第１の所定距離範囲が、他の組み合わせに含まれる前記上限から前記下限までの他の所定距離範囲と離れている場合であって、前記第１の所定距離範囲と前記他の所定距離範囲との間の距離が、前記ステージと前記対物レンズとの前記距離を変化させる前記間隔を、第１の前記所定距離範囲内と他の前記所定距離範囲内とで変化させる必要がないと判断される距離である場合、設定した測定範囲内において前記移動手段が同じ間隔で前記ステージと前記対物レンズとの前記距離を変化させるように、前記第１の所定距離範囲と前記他の所定距離範囲を１つの前記測定範囲として設定してもよい。 From the predetermined distance range minimum required to obtain the two-dimensional image of a predetermined distance range the minimum possible number of generating the three-dimensional image A from the upper limit of the three-dimensional image generating unit said distance to the lower limit Further comprising a minimum distance range storage means for storing as a distance range, wherein the measurement condition setting means is configured such that the set predetermined distance range is smaller than the minimum distance range stored in the minimum distance range storage means. The upper limit and the lower limit may be set and changed so that the predetermined distance range matches the minimum distance range. In the measurement condition setting means, a plurality of combinations each including the upper limit, the lower limit, the first interval, and the second interval are set, and are included in the first combination of the plurality of combinations. When the first predetermined distance range from the upper limit to the lower limit overlaps at least partly with another predetermined distance range from the upper limit to the lower limit included in another combination, within the set measurement range, the The first predetermined distance range and the other predetermined distance range may be set as one of the measurement ranges so that the moving means changes the distance at the same interval. In the measurement condition setting means, a plurality of combinations each including the upper limit, the lower limit, the first interval, and the second interval are set, and are included in the first combination of the plurality of combinations. The first predetermined distance range from the upper limit to the lower limit is separated from the other predetermined distance range from the upper limit to the lower limit included in another combination, and the first predetermined distance range The distance between the other predetermined distance range changes the distance for changing the distance between the stage and the objective lens between the first predetermined distance range and the other predetermined distance range. When the distance is determined to be unnecessary, the first predetermined distance is set such that the moving means changes the distance between the stage and the objective lens at the same interval within the set measurement range. Said another predetermined distance range and circumference may be set as one of the measurement range.

本発明にかかる共焦点顕微鏡装置は、観察試料の観察面に光を集束して二次元走査するとともに、前記光の光軸方向に集束位置を移動しながら共焦点画像を取得する共焦点顕微鏡装置であって、前記観察試料を載置するステージと、前記光軸上に配置され、所定の倍率で前記光を前記観察面に集束する少なくとも１つの対物レンズと、前記観察試料の所望の前記観察面に前記光を集束させるために前記ステージと前記対物レンズとの距離を所定間隔で変化させる移動手段と、前記距離に応じて前記所定間隔を設定する測定条件設定手段と、前記測定条件設定手段が設定した前記所定間隔で前記距離を変化させるように前記移動手段を駆動制御する駆動制御手段と、前記観察面からの反射光を検出する光検出手段と、前記所定間隔で変化させた前記距離毎に前記観察面上に前記光を二次元走査することにより前記光検出手段が検出した検出信号に基づき複数の画素よりなる二次元画像を生成する二次元画像生成手段と、前記二次元画像生成手段で生成された複数の前記二次元画像を用いて三次元画像を生成する三次元画像生成手段と、前記ニ次元画像を構成する各前記画素の輝度を所定の輝度しきい値と比較し、前記輝度しきい値以下の画素数を輝度しきい値以下画素数として計数する画素数計数手段、を有し、前記測定条件設定手段は、前記輝度しきい値以下画素数に応じて、前記距離を変化させる所定間隔を設定することを特徴する。 A confocal microscope apparatus according to the present invention condenses light on an observation surface of an observation sample and performs two-dimensional scanning, and acquires a confocal image while moving a focusing position in the optical axis direction of the light. A stage on which the observation sample is placed, at least one objective lens that is arranged on the optical axis and focuses the light on the observation surface at a predetermined magnification, and the desired observation of the observation sample. Moving means for changing the distance between the stage and the objective lens at a predetermined interval to focus the light on a surface; a measurement condition setting means for setting the predetermined interval according to the distance; and the measurement condition setting means The drive control means for driving and controlling the moving means so as to change the distance at the predetermined interval set by, the light detection means for detecting the reflected light from the observation surface, and changed at the predetermined interval Two-dimensional image generation means for generating a two-dimensional image composed of a plurality of pixels based on a detection signal detected by the light detection means by two-dimensionally scanning the light on the observation surface at each recording distance; A three-dimensional image generating unit that generates a three-dimensional image using a plurality of the two-dimensional images generated by the image generating unit, and compares the luminance of each pixel constituting the two- dimensional image with a predetermined luminance threshold value and, wherein the luminance threshold following pixel number counting means for counting the number of pixels as the luminance threshold value or less than the number of pixels, have a, the measurement condition setting means, in accordance with the luminance threshold value or less than the number of pixels, features to set the predetermined interval for changing the distance.

前記輝度しきい値以下画素数と所定の画素数しきい値とを比較する画素数比較手段、をさらに有し、前記測定条件設定手段は、前記画素数比較手段の比較結果に応じて、前記距離を変化させる所定間隔を設定することもできる。   A pixel number comparing means for comparing the number of pixels below the luminance threshold with a predetermined pixel number threshold; and the measurement condition setting means, according to the comparison result of the pixel number comparing means, A predetermined interval for changing the distance can also be set.

前記測定条件設定手段は、前記輝度しきい値以下画素数が前記画素数しきい値以下の場合には、前記距離を変化させる所定間隔を第１の間隔に設定し、前記輝度しきい値以下画素数が前記画素数しきい値より大きい場合には、前記所定間隔を第１の間隔より大きい第２の間隔に設定するようにしてもよい。
また、前記二次元走査は、変更可能な所定の間隔で行うこともできる。 The measurement condition setting means sets a predetermined interval for changing the distance as a first interval when the number of pixels equal to or less than the luminance threshold is equal to or smaller than the threshold for the number of pixels, and is equal to or smaller than the luminance threshold. If the number of pixels is greater than the pixel number threshold, the predetermined interval may be set to a second interval that is greater than the first interval.
Further, the two-dimensional scanning can be performed at a predetermined changeable interval.

本発明の共焦点顕微鏡装置によれば、正確に測定対象平面を検出すると共に、測定時間の短縮が可能となる。   According to the confocal microscope apparatus of the present invention, the measurement target plane can be accurately detected and the measurement time can be shortened.

本発明の第１の実施の形態による共焦点顕微鏡装置の構成を示す図。The figure which shows the structure of the confocal microscope apparatus by the 1st Embodiment of this invention. 第１の実施の形態によるコントローラの構成を示す図。The figure which shows the structure of the controller by 1st Embodiment. 第１の実施の形態による観察試料を示す斜視図。The perspective view which shows the observation sample by 1st Embodiment. 第１の実施の形態による共焦点顕微鏡装置を用いて三次元画像を生成する動作を示すフローチャート。The flowchart which shows the operation | movement which produces | generates a three-dimensional image using the confocal microscope apparatus by 1st Embodiment. 第１の実施の形態による共焦点顕微鏡装置を用いた三次元画像生成の際の測定条件設定画面の一例を示す図。The figure which shows an example of the measurement condition setting screen at the time of the three-dimensional image generation using the confocal microscope apparatus by 1st Embodiment. 第１の実施の形態による所定測定範囲の設定方法の一例を示す図。The figure which shows an example of the setting method of the predetermined measurement range by 1st Embodiment. 第１の実施の形態による所定測定範囲の設定方法の別の一例を示す図。The figure which shows another example of the setting method of the predetermined measurement range by 1st Embodiment. 第２の実施の形態によるコントローラの構成を示す図。The figure which shows the structure of the controller by 2nd Embodiment. 第２の実施の形態による共焦点顕微鏡装置を用いて三次元画像を生成する動作を示すフローチャート。The flowchart which shows the operation | movement which produces | generates a three-dimensional image using the confocal microscope apparatus by 2nd Embodiment. 第２の実施の形態による測定対象平面の設定方法の一例を示す図。The figure which shows an example of the setting method of the measuring object plane by 2nd Embodiment. 第２の実施の形態による所定測定範囲の設定方法の一例を示す図。The figure which shows an example of the setting method of the predetermined measurement range by 2nd Embodiment. 第２の実施の形態による所定測定範囲の設定方法の別の一例を示す図。The figure which shows another example of the setting method of the predetermined measurement range by 2nd Embodiment. 第２の実施の形態による所定測定範囲の設定方法の別の一例を示す図。The figure which shows another example of the setting method of the predetermined measurement range by 2nd Embodiment. 第２の実施の形態による所定測定範囲の設定方法の別の一例を示す図。The figure which shows another example of the setting method of the predetermined measurement range by 2nd Embodiment. 第３の実施の形態によるコントローラの構成を示す図。The figure which shows the structure of the controller by 3rd Embodiment. 第３の実施の形態による共焦点顕微鏡装置を用いて三次元画像を生成する動作を示すフローチャート。The flowchart which shows the operation | movement which produces | generates a three-dimensional image using the confocal microscope apparatus by 3rd Embodiment. 第３の実施の形態による輝度画像の一例を示す図。The figure which shows an example of the brightness | luminance image by 3rd Embodiment. 第３の実施の形態による輝度画像のヒストグラム。The brightness | luminance image histogram by 3rd Embodiment. 第３の実施の形態による最大輝度蓄積画像の一例を示す図。The figure which shows an example of the maximum brightness | luminance accumulation image by 3rd Embodiment. 第３の実施の形態による最大輝度蓄積画像のヒストグラム。The histogram of the maximum brightness | luminance accumulation image by 3rd Embodiment.

以下、図面を参照しながら、本発明の実施の形態による共焦点顕微鏡装置について説明する。なお本明細書において、共焦点顕微鏡装置１００の構成を示す図における対物レンズと観察試料との位置関係は、対物レンズ側を上、観察試料側を下という。また、観察試料に照射される光の光軸方向をＺ方向、Ｚ方向に垂直な平面の互いに直行する２方向をＸ方向およびＹ方向とする。   Hereinafter, a confocal microscope apparatus according to an embodiment of the present invention will be described with reference to the drawings. In the present specification, the positional relationship between the objective lens and the observation sample in the diagram showing the configuration of the confocal microscope apparatus 100 is that the objective lens side is up and the observation sample side is down. In addition, the optical axis direction of the light irradiated to the observation sample is defined as the Z direction, and two directions perpendicular to each other on a plane perpendicular to the Z direction are defined as an X direction and a Y direction.

（第１の実施の形態）
まず、第１の実施の形態による共焦点顕微鏡装置１００の構成について、図１および図２を参照しながら説明する。図１は、第１の実施の形態による共焦点顕微鏡装置１００の構成例を示す図である。図１に示すように、共焦点顕微鏡装置１００は、顕微鏡本体１および対物レンズ７、レボルバ１３、Ｚレボルバ１６、電動ＸＹステージ１４、コントローラ２、表示部３を有している。観察試料８は、電動ＸＹステージ１４上に載置されている。顕微鏡本体１には、共焦点画像を形成する共焦点光学系と、実画像をカラー観察するカラー観察光学系との両方が備えられている。共焦点光学系は、レーザ光源４、偏光ビームスプリッタ（以下、ＰＢＳという）５、二次元走査部６、４分の１波長板９、結像レンズ１０ａ、ピンホール１１、光検出器１２等を備えている。カラー観察光学系は、カラーカメラ１８、結像レンズ１０ｂ、ハーフミラー５２等を備えている。 (First embodiment)
First, the configuration of the confocal microscope apparatus 100 according to the first embodiment will be described with reference to FIGS. 1 and 2. FIG. 1 is a diagram illustrating a configuration example of a confocal microscope apparatus 100 according to the first embodiment. As shown in FIG. 1, the confocal microscope apparatus 100 includes a microscope main body 1, an objective lens 7, a revolver 13, a Z revolver 16, an electric XY stage 14, a controller 2, and a display unit 3. The observation sample 8 is placed on the electric XY stage 14. The microscope main body 1 includes both a confocal optical system that forms a confocal image and a color observation optical system that performs color observation of an actual image. The confocal optical system includes a laser light source 4, a polarizing beam splitter (hereinafter referred to as PBS) 5, a two-dimensional scanning unit 6, a quarter-wave plate 9, an imaging lens 10a, a pinhole 11, a photodetector 12, and the like. I have. The color observation optical system includes a color camera 18, an imaging lens 10b, a half mirror 52, and the like.

図１に示す共焦点顕微鏡１００において、レーザ光源４から出射した光は、ＰＢＳ５を透過した後、二次元走査部６に入射される。二次元走査部６は、入射された光を図示しない二次元スキャナなどにより所定ピッチで二次元に走査しつつ対物レンズ７へと導く。このとき、二次元走査部６は対物レンズ７の瞳と共役な位置に配置されている為、対物レンズ７の瞳へ入射した光は、集光となって観察試料８上を走査する。   In the confocal microscope 100 shown in FIG. 1, the light emitted from the laser light source 4 passes through the PBS 5 and then enters the two-dimensional scanning unit 6. The two-dimensional scanning unit 6 guides incident light to the objective lens 7 while scanning the incident light two-dimensionally at a predetermined pitch by a two-dimensional scanner (not shown). At this time, since the two-dimensional scanning unit 6 is disposed at a position conjugate with the pupil of the objective lens 7, the light incident on the pupil of the objective lens 7 is condensed to scan the observation sample 8.

観察試料８の表面で反射した光は、再び対物レンズ７から、１／４λ板９、二次元走査部６を介してＰＢＳ５に入射された後、ＰＢＳ５によって結像レンズ１０ａ側に反射され、結像レンズ１０ａによってピンホール１１上に集光される。そして、ピンホール１１上に集光した反射光のうち観察試料８上の集光点以外で反射された光がピンホール１１によりカットされ、ピンホール１１を通過した反射光だけが光検出器１２によって検出される。光検出器１２は、検出した反射光の輝度を電気信号に変換して、コントローラ２に出力する。なお、１／４λ板９は、入射された直線偏光を円偏光に変換する。   The light reflected from the surface of the observation sample 8 is again incident on the PBS 5 from the objective lens 7 via the ¼λ plate 9 and the two-dimensional scanning unit 6, and is then reflected by the PBS 5 toward the imaging lens 10 a side. The light is condensed on the pinhole 11 by the image lens 10a. Of the reflected light collected on the pinhole 11, the light reflected at a point other than the focal point on the observation sample 8 is cut by the pinhole 11, and only the reflected light passing through the pinhole 11 is detected by the photodetector 12. Detected by. The photodetector 12 converts the luminance of the detected reflected light into an electrical signal and outputs it to the controller 2. The quarter λ plate 9 converts the incident linearly polarized light into circularly polarized light.

一方、カラー観察光学系のＬＥＤ光源１７から出射した白色光は、ハーフミラー５２、５４および対物レンズ７を介して観察試料８を照明し、観察試料表面で反射された光が結像レンズ１０ｂにより集光され、カラーカメラ１８で検出される。   On the other hand, the white light emitted from the LED light source 17 of the color observation optical system illuminates the observation sample 8 via the half mirrors 52 and 54 and the objective lens 7, and the light reflected on the observation sample surface is reflected by the imaging lens 10b. The light is collected and detected by the color camera 18.

ここで、レボルバ１３は、複数の対物レンズ７を搭載可能である。複数の対物レンズ７は、レボルバ１３が回転することにより光軸上に挿入され、あるいは光軸上から脱出する。Ｚレボルバ１６は、光軸方向に対物レンズ７を移動させる。電動ＸＹステージ１４は、載置されている観察試料８をＸＹ方向に移動させることができる。   Here, the revolver 13 can be mounted with a plurality of objective lenses 7. The plurality of objective lenses 7 are inserted on the optical axis or escaped from the optical axis as the revolver 13 rotates. The Z revolver 16 moves the objective lens 7 in the optical axis direction. The electric XY stage 14 can move the observation sample 8 placed in the XY direction.

コントローラ２は、共焦点顕微鏡装置１００の動作を制御する制御装置である。コントローラ２は、中央演算処理装置（以下、ＣＰＵという）、データなどを記録するメモリ、外部からのデータ入力手段である入力装置、操作画面や観察画像等を表示部３に出力する出力装置、およびプログラムを記憶するための記憶装置と、を少なくとも備える。ただし、ＣＰＵ、メモリ、入力装置、出力装置、記憶装置については、一般的な構成であるため図１には図示しない。コントローラ２は、複数の対物レンズ７のうち所望の対物レンズ７を光軸上に配置させるように制御する。コントローラ２は、電動ＸＹステージ１４の移動も制御する。   The controller 2 is a control device that controls the operation of the confocal microscope apparatus 100. The controller 2 includes a central processing unit (hereinafter referred to as “CPU”), a memory that records data, an input device that is an external data input unit, an output device that outputs an operation screen, an observation image, and the like to the display unit 3, and A storage device for storing the program. However, the CPU, memory, input device, output device, and storage device are not shown in FIG. The controller 2 controls the desired objective lens 7 among the plurality of objective lenses 7 to be arranged on the optical axis. The controller 2 also controls the movement of the electric XY stage 14.

本実施の形態おいて、コントローラ２内の必要な処理部を図２に示す。コントローラ２は、測定条件情報指示部１９、測定ピッチ取得部２０、測定条件記憶部２１、およびＺ駆動制御部２２を有している。測定条件情報指示部１９は、表示部３に測定条件設定画面を表示するための指示を出力する。測定ピッチ取得部２０は、対物レンズ７毎の測定ピッチ、すなわち、二次元画像を取込む毎にＺレボルバ１６を移動させる、対物レンズ７の倍率に応じた距離を取得する。測定条件記憶部２１は、顕微鏡観察者が表示部３の顕微鏡操作画面で設定した測定条件情報を記憶する。Ｚ駆動制御部２２は、測定条件記憶部２１から測定範囲と測定ピッチの情報を得てＺレボルバ１６の駆動制御を行う。   In the present embodiment, a necessary processing unit in the controller 2 is shown in FIG. The controller 2 includes a measurement condition information instruction unit 19, a measurement pitch acquisition unit 20, a measurement condition storage unit 21, and a Z drive control unit 22. The measurement condition information instruction unit 19 outputs an instruction for displaying the measurement condition setting screen on the display unit 3. The measurement pitch acquisition unit 20 acquires a measurement pitch for each objective lens 7, that is, a distance according to the magnification of the objective lens 7 that moves the Z revolver 16 every time a two-dimensional image is captured. The measurement condition storage unit 21 stores measurement condition information set by the microscope observer on the microscope operation screen of the display unit 3. The Z drive control unit 22 obtains information on the measurement range and measurement pitch from the measurement condition storage unit 21 and performs drive control of the Z revolver 16.

共焦点顕微鏡１００での三次元画像の作成は、対物レンズ７をＺレボルバ１６で、対物レンズ７から出射される光の光軸方向（Ｚ方向）に相対移動させ、各Ｚ位置（以下、高さ位置ともいう）における二次元の共焦点画像(以下、スライス画像という)を順次取得し、取得した複数のスライス画像から、画素毎の最大輝度を抽出し蓄積していくことで行われる。また、この時のＺ位置の相対移動範囲を測定範囲、相対移動量を測定ピッチという。   The three-dimensional image is generated by the confocal microscope 100 by moving the objective lens 7 relative to the optical axis direction (Z direction) of the light emitted from the objective lens 7 with the Z revolver 16 to each Z position (hereinafter referred to as “high”). This is performed by sequentially acquiring a two-dimensional confocal image (hereinafter also referred to as a slice image) and extracting and accumulating the maximum luminance for each pixel from the acquired plurality of slice images. Further, the relative movement range of the Z position at this time is called a measurement range, and the relative movement amount is called a measurement pitch.

次に、本実施形態による共焦点顕微鏡装置１００で行う三次元画像作成の動作について、図１および図２の構成図、図３の観察試料例、図４のフローチャート、および表示部３に表示する観察操作画面の一部である図５の測定条件設定画面例を用いて説明する。   Next, the operation of creating a three-dimensional image performed by the confocal microscope apparatus 100 according to the present embodiment is displayed on the configuration diagram of FIGS. 1 and 2, the observation sample example of FIG. 3, the flowchart of FIG. 4, and the display unit 3. A description will be given using the measurement condition setting screen example of FIG. 5 which is a part of the observation operation screen.

ここで、図３に示すように、観察試料８は、互いに高さの異なる面Ａ、面Ｂ、面Ｃを有している。このような観察試料８に対し、まず、ステップ４０１では、観察者が観察操作画面の観察画像（図示せず）を確認しながらＺレボルバ１６を移動させて、観察試料８の面Ａが合焦となる際の、例えば電動ＸＹステージ１４に対する対物レンズ７の高さ位置を見つける。ここで、観察画像は、ＬＥＤ光源１７による画像でもよいし、レーザ光源４による輝度画像でもよい。そして、その位置よりもさらに観察試料８側（以下、下側という）にＺレボルバ１６を移動させて、観察試料８の面Ａが合焦ではなくなる位置へと移動する。   Here, as shown in FIG. 3, the observation sample 8 has a surface A, a surface B, and a surface C having different heights. First, in step 401, the observer moves the Z revolver 16 while confirming an observation image (not shown) on the observation operation screen, and the surface A of the observation sample 8 is focused. For example, the height position of the objective lens 7 with respect to the electric XY stage 14 is found. Here, the observation image may be an image by the LED light source 17 or a luminance image by the laser light source 4. Then, the Z revolver 16 is moved further to the observation sample 8 side (hereinafter referred to as the lower side) than the position, and moved to a position where the surface A of the observation sample 8 is not in focus.

ステップ４０２では、現在の高さ位置を観察試料８の面Ａの三次元画像作成時に必要な取込み測定範囲の下限位置として登録する処理を行う。すなわち、測定条件情報指示部１９により表示指示された、図５に示す測定条件設定画面８０の番号コンボボックス１０２において１番を選択し、測定範囲設定欄１０４の下限位置ボタン１０８を押す。下限位置ボタン１０８を押すと測定条件設定画面８０のリスト部１１６において、番号コンボボックス１０２で指定した登録番号行の下限位置部１２２−１に高さ情報が表示される。高さ情報は、図５のように、ある一定の位置を基準とした座標値のように表してもよいし、電動ＸＹステージ１４から例えばＺレボルバ１６までの距離などで表すようにしてもよい。また、一度登録した値を修正したい場合は、Ｚレボルバ１６を移動させて再度下限位置ボタン１０８を押すことで可能である。   In step 402, processing for registering the current height position as the lower limit position of the capture measurement range required when creating a three-dimensional image of the surface A of the observation sample 8 is performed. That is, the number 1 is selected in the number combo box 102 of the measurement condition setting screen 80 shown in FIG. 5 instructed to be displayed by the measurement condition information instruction unit 19, and the lower limit position button 108 in the measurement range setting field 104 is pressed. When the lower limit position button 108 is pressed, height information is displayed in the lower limit position section 122-1 of the registration number line designated in the number combo box 102 in the list section 116 of the measurement condition setting screen 80. The height information may be expressed as a coordinate value based on a certain position as shown in FIG. 5, or may be expressed as a distance from the electric XY stage 14 to, for example, the Z revolver 16. . If it is desired to correct the value once registered, it is possible to move the Z revolver 16 and press the lower limit position button 108 again.

ステップ４０３では、観察者が観察操作画面の観察画像を確認しながらＺレボルバ１６を移動させて、観察試料８の面Ａが合焦となる高さ位置を見つける。そして、その位置よりもさらに観察試料８と反対側（以下、上側という）にＺレボルバ１６を移動させて、観察試料面Ａが合焦ではなくなる位置へと移動する。   In step 403, the observer moves the Z revolver 16 while confirming the observation image on the observation operation screen, and finds the height position where the surface A of the observation sample 8 is in focus. Then, the Z revolver 16 is moved further to the side opposite to the observation sample 8 (hereinafter referred to as the upper side) from the position, and moved to a position where the observation sample surface A is not in focus.

ステップ４０４では、現在の高さ位置を観察試料８の面Ａの三次元画像作成時に必要な取込み測定範囲の上限位置として登録するため、図５に示す測定条件設定画面８０の番号コンボボックス１０２において１番を選択し、測定範囲設定欄１０４の上限位置ボタン１０６を押す。上限位置ボタン１０６を押すと測定条件設定画面８０のリスト部１１６において、番号コンボボックス１０２で指定した登録番号行の上限位置部１２０−１に高さ情報が表示される。上限位置に関しても、再度上限位置ボタン１０６を押すことで、下限位置同様に登録値を修正することが可能である。以下、観察試料８のある面（以下、測定平面という）に関して上記のように設定された上限位置から下限位置までを、所定測定範囲という。   In step 404, in order to register the current height position as the upper limit position of the capture measurement range required when creating the three-dimensional image of the surface A of the observation sample 8, in the number combo box 102 of the measurement condition setting screen 80 shown in FIG. No. 1 is selected and the upper limit position button 106 in the measurement range setting field 104 is pressed. When the upper limit position button 106 is pressed, height information is displayed in the upper limit position section 120-1 of the registered number line specified in the number combo box 102 in the list section 116 of the measurement condition setting screen 80. Regarding the upper limit position, the registered value can be corrected in the same manner as the lower limit position by pressing the upper limit position button 106 again. Hereinafter, the upper limit position to the lower limit position set as described above with respect to a certain surface of the observation sample 8 (hereinafter referred to as a measurement plane) is referred to as a predetermined measurement range.

ステップ４０５では、上記上限位置から下限位置までの所定測定範囲内でスライス画像を取込む際の高さ位置の間隔を測定ピッチとして設定する。ステップ４０２とステップ４０４で設定した所定測定範囲内のスライス画像取込み測定ピッチは、測定ピッチ設定欄１１０の測定範囲内ピッチ用テキストラベル１１２に表示される。表示される値は、レボルバ１３に複数搭載されている対物レンズ７のうち、光軸上に配置されている対物レンズ倍率に応じて、対物レンズ７毎に測定に必要なピッチを、測定範囲内ピッチとして測定ピッチ取得部２０から得て設定している。また、ステップ４０２とステップ４０４で設定した所定測定範囲外のスライス画像取込み測定ピッチを、測定範囲外ピッチとしてテキストボックス１１３に数値入力、またはスピンボタン１１４で数値の増減を行い設定する。   In step 405, the interval between the height positions when the slice images are captured within a predetermined measurement range from the upper limit position to the lower limit position is set as a measurement pitch. The slice image capture measurement pitch within the predetermined measurement range set in step 402 and step 404 is displayed on the text label 112 for pitch within measurement range in the measurement pitch setting field 110. The displayed value is based on the objective lens 7 mounted on the revolver 13 according to the objective lens magnification arranged on the optical axis, and the pitch required for measurement for each objective lens 7 is within the measurement range. The pitch is obtained from the measurement pitch acquisition unit 20 and set. Further, the slice image capture measurement pitch outside the predetermined measurement range set in step 402 and step 404 is set as a pitch outside the measurement range by inputting a numerical value in the text box 113 or increasing / decreasing the numerical value with the spin button 114.

ステップ４０６では、観察者がさらに複数の測定平面に関して上記と同様の登録をするかの判断を行う。判断がＹｅｓの場合には登録済みであり、ステップ４０７へ進む。図３の観察試料８では、登録の対象となる測定平面である面Ｂ、面Ｃが残っているため、まずは判断がＮｏとなり、再度ステップ４０１からステップ４０５の操作を繰返し行い、面Ｂ、面Ｃの上下限位置と測定ピッチとを設定し、測定条件を決定する。   In step 406, it is determined whether or not the observer performs registration similar to the above for a plurality of measurement planes. If the determination is Yes, it is already registered and the process proceeds to step 407. In the observation sample 8 of FIG. 3, since the surfaces B and C which are measurement planes to be registered remain, first, the determination is No, and the operation from step 401 to step 405 is repeated again, so that the surfaces B and The upper and lower limit positions of C and the measurement pitch are set, and the measurement conditions are determined.

上記のように複数個所の測定条件を登録する際には、前回登録したリスト番号行とは異なる番号に登録するため、番号コンボボックス１０２の指定番号を変更しておく。予め表示しているリスト行番号数以上に登録したい場合は、追加ボタン１２４を押すことで測定条件登録を増やすことができる。また、既に登録した測定条件を削除したい時は、削除したいリスト行番号を番号コンボボックス１０２で指定して、削除ボタン１２６を押せばよい。以上のように設定された測定条件情報は、測定条件記憶部２１に記憶される。   When registering measurement conditions at a plurality of locations as described above, the designated number in the number combo box 102 is changed in order to register at a number different from the previously registered list number line. If it is desired to register more than the number of list line numbers displayed in advance, the registration of measurement conditions can be increased by pressing the add button 124. If it is desired to delete a measurement condition that has already been registered, the list line number to be deleted may be specified in the number combo box 102 and the delete button 126 may be pressed. The measurement condition information set as described above is stored in the measurement condition storage unit 21.

ここで、複数登録した測定範囲が重なっている場合や近接している場合について、図６Ａ、および図６Ｂを参照しながら説明する。図６Ａは、面Ａに関する測定範囲の下限がＺ＝Ｚａ１、上限がＺ＝Ｚａ２、面Ｂに関する測定範囲の下限がＺ＝Ｚｂ１、上限がＺ＝Ｚｂ２であり、面Ａに関する所定測定範囲の上限が面Ｂに関する所定測定範囲の下限よりも上にあり、夫々の面に基づいて設定された所定測定範囲Ｓ１、Ｓ２が重なっている。この場合は、図６Ａに示したように、Ｚ＝Ｚａ１〜Ｚｂ２の１つの所定測定範囲Ｓ１２を設定する。   Here, a case where a plurality of registered measurement ranges are overlapped or close to each other will be described with reference to FIGS. 6A and 6B. In FIG. 6A, the lower limit of the measurement range for the surface A is Z = Za1, the upper limit is Z = Za2, the lower limit of the measurement range for the surface B is Z = Zb1, and the upper limit is Z = Zb2. Is above the lower limit of the predetermined measurement range for the surface B, and the predetermined measurement ranges S1 and S2 set based on the respective surfaces overlap. In this case, as shown in FIG. 6A, one predetermined measurement range S12 of Z = Za1 to Zb2 is set.

図６Ｂは、面Ａに関する所定測定範囲の上限Ｚ＝Ｚａ４と、面Ｂに関する所定測定範囲の下限Ｚ＝Ｚｂ３とが、距離Ｚ１離れている場合を示している。ここで、距離Ｚ１が測定ピッチを変える必要がないと判断される距離である場合には、図６Ｂに示したように、Ｚ＝Ｚａ３〜Ｚｂ４を１つの所定測定範囲Ｓ３４として設定する。このように２つの所定測定範囲を１つの測定範囲とみなし、無駄な測定ピッチの変更を防ぐようにしている。   FIG. 6B shows a case where the upper limit Z = Za4 of the predetermined measurement range related to the surface A and the lower limit Z = Zb3 of the predetermined measurement range related to the surface B are separated by a distance Z1. Here, when the distance Z1 is a distance that is determined not to require the measurement pitch to be changed, as shown in FIG. 6B, Z = Za3 to Zb4 are set as one predetermined measurement range S34. In this way, the two predetermined measurement ranges are regarded as one measurement range, so that useless change of the measurement pitch is prevented.

ステップ４０７では、測定条件記憶部２１に登録されている情報をＺ駆動制御部２２で得て、ステップ４０６までに登録した測定条件で、スライス画像の取込みを行う。取込み開始位置は、ステップ４０６までに登録している少なくとも１組の測定条件設定内で最も試料に近い側の下限位置（以下、最下限位置という）から開始し、まず、観察試料８の面Ａを対象とした所定測定範囲の取込みを行う。   In step 407, information registered in the measurement condition storage unit 21 is obtained by the Z drive control unit 22, and a slice image is captured under the measurement conditions registered up to step 406. The acquisition start position starts from the lower limit position closest to the sample (hereinafter referred to as the lowest limit position) within at least one set of measurement condition settings registered up to step 406. First, the surface A of the observation sample 8 The predetermined measurement range for the target is taken in.

ステップ４０８では、スライス画像の取込みを終了するかの判断を行う。終了判定は、スライス画像を取込んだ現在のＺレボルバ１６の高さ位置が、ステップ４０６までに登録している少なくとも１組の測定条件設定内で最も観察試料８から遠い側の上限位置（最上限位置という）以上かどうかで判断する。判断がＹｅｓの場合には、ステップ４０９へ進み、判断がＮｏの場合には、ステップ４１０へ進む。   In step 408, a determination is made as to whether or not the capture of the slice image is to end. The end determination is made by determining that the current height position of the Z revolver 16 in which the slice image has been captured is the upper limit position (the maximum position) farthest from the observation sample 8 within at least one set of measurement condition settings registered up to step 406. Judgment is made based on whether or not the upper limit position. If the determination is yes, the process proceeds to step 409, and if the determination is no, the process proceeds to step 410.

ステップ４１０は、ステップ４０８で現在のＺレボルバ１６の高さ位置が最上限位置未満である場合であり、現在のＺレボルバ１６の高さ位置が現在測定に用いようとしている測定条件設定内で登録した所定測定範囲内であるかの判定として、下限位置と比較する。現在の位置が下限位置より高く、判断がＹｅｓの場合には、ステップ４１１に進み、判断がＮｏの場合には、ステップ４１３に進む。   Step 410 is a case in which the current height position of the Z revolver 16 is less than the maximum upper limit position in step 408, and the current height position of the Z revolver 16 is registered within the measurement condition setting to be used for the current measurement. As a determination of whether or not it is within the predetermined measurement range, it is compared with the lower limit position. If the current position is higher than the lower limit position and the determination is Yes, the process proceeds to step 411. If the determination is No, the process proceeds to step 413.

ステップ４１１では、ステップ４１０の判定で現在のＺレボルバ１６の高さ位置が下限位置以上である場合であり、次に現在のＺレボルバ１６の高さ位置を現在用いようとしている測定条件設定内で登録した所定測定範囲の上限位置と比較する。判断がＹｅｓの場合には、ステップ４１２に進み、判断がＮｏの場合には、ステップ４１６に進む。   In step 411, the current height position of the Z revolver 16 is greater than or equal to the lower limit position in the determination in step 410, and the current height position of the Z revolver 16 is then used within the measurement condition setting that is currently being used. Compare with the registered upper limit position of the specified measurement range. If the determination is yes, the process proceeds to step 412, and if the determination is no, the process proceeds to step 416.

ステップ４１２では、現在のＺレボルバ１６の高さ位置が測定条件設定内で登録した測定範囲の上限位置以下であり、観察試料８の面Ａを対象とした所定測定範囲内であるため、登録した測定範囲内ピッチに変更し、ステップ４１４に進む。   In step 412, the current height position of the Z revolver 16 is equal to or lower than the upper limit position of the measurement range registered in the measurement condition setting, and is within the predetermined measurement range for the surface A of the observation sample 8. The pitch is changed to the measurement range pitch, and the process proceeds to step 414.

ステップ４１４では、現在設定している測定ピッチと設定されている測定範囲からＺレボルバ駆動速度を求める。
ステップ４１５では、ステップ４１４で求めたＺレボルバ駆動速度でＺレボルバ１６の高さ位置を上方へと移動させていく。そして、測定ピッチ分移動すると、再びステップ４０７へと進み、次のスライス画像取込みを行う。 In step 414, the Z revolver drive speed is obtained from the currently set measurement pitch and the set measurement range.
In step 415, the height position of the Z revolver 16 is moved upward at the Z revolver driving speed obtained in step 414. Then, after moving by the measurement pitch, the process proceeds to step 407 again, and the next slice image is captured.

ステップ４１０でＮｏの場合には、面Ａの所定測定範囲の下限よりも下であるため、所定測定範囲外となり、ピッチを粗くして測定範囲外ピッチとし、ステップ４１４へ進む。
以上のように取込みを続けて、観察試料８の面Ａを対象として登録した所定測定範囲の上限位置を超えた場合は、ステップ４１１の判定でＮｏとなりステップ４１６へと処理が進む。 In the case of No in step 410, since it is below the lower limit of the predetermined measurement range of the surface A, it is out of the predetermined measurement range, and the pitch is roughened to make the pitch out of the measurement range.
If the acquisition is continued as described above and the upper limit position of the predetermined measurement range registered with respect to the surface A of the observation sample 8 is exceeded, the determination in step 411 is No and the process proceeds to step 416.

ステップ４１６では、観察試料８の面Ａを対象とした測定範囲が終了したことを受けて、ステップ４１０とステップ４１１で判定条件の閾値となる下限位置と上限位置とを、観察試料８の次の面Ｂに対して登録した測定条件設定に更新し、ステップ４１３へと進む。   In step 416, in response to the end of the measurement range for the surface A of the observation sample 8, the lower limit position and the upper limit position that are the threshold values of the determination conditions in step 410 and step 411 are set to the next of the observation sample 8. The measurement condition setting registered for surface B is updated, and the process proceeds to step 413.

また、判定条件閾値更新後に観察試料８の面Ｂに対して登録した測定条件設定の下限位置より下方の位置にＺレボルバ１６があるときは、ステップ４１０の条件判定により、同様にステップ４１３へと進み、測定ピッチを測定範囲外ピッチに設定する。   Further, when the Z revolver 16 is located at a position below the lower limit position of the measurement condition setting registered with respect to the surface B of the observation sample 8 after the determination condition threshold is updated, the process proceeds to step 413 in the same manner by the condition determination in step 410. Go ahead and set the measurement pitch to a pitch outside the measurement range.

以上のように、Ｚレボルバ１６を上方へと移動させながらスライス画像の取込みを行い、測定条件設定画面で登録した測定範囲と現在のＺレボルバ１６の高さ位置とを比較しながら測定ピッチを変更していき、観察試料８の面Ｃに対する測定範囲の上限位置まで到達したとき、ステップ４０８で現在のＺレボルバ１６の高さ位置が最上限位置以上となり、ステップ４０９へと進む。ステップ４０９では、上記処理により取込んだ複数の輝度画像を用いて三次元画像の構築を行う。   As described above, the slice image is taken in while moving the Z revolver 16 upward, and the measurement pitch is changed while comparing the measurement range registered on the measurement condition setting screen with the current height position of the Z revolver 16. Then, when reaching the upper limit position of the measurement range with respect to the surface C of the observation sample 8, the current height position of the Z revolver 16 becomes equal to or higher than the upper limit position in step 408, and the process proceeds to step 409. In step 409, a 3D image is constructed using a plurality of luminance images captured by the above processing.

以上のように、第１の実施の形態による共焦点顕微鏡装置１００においては、観察試料８に存在する測定平面に応じて、測定範囲内ピッチで輝度画像の検出を行う所定測定範囲をあらかじめ設定する。複数の平面がある場合には、夫々に関して所定測定範囲を設定する。所定測定範囲内においては、対物レンズ７に応じた所定の間隔を測定ピッチ取得部２０で取得して測定範囲内ピッチとして用いる。所定測定範囲外においては、測定条件設定画面８０で設定した測定範囲外ピッチを用いる。ここで、測定範囲外ピッチは測定範囲内ピッチより粗く設定する。また、所定測定範囲の上限位置および下限位置、測定ピッチなどを測定条件記憶部２１に記憶しておく。   As described above, in the confocal microscope apparatus 100 according to the first embodiment, a predetermined measurement range for detecting a luminance image at a pitch within the measurement range is set in advance according to the measurement plane existing on the observation sample 8. . When there are a plurality of planes, a predetermined measurement range is set for each. Within the predetermined measurement range, a predetermined interval corresponding to the objective lens 7 is acquired by the measurement pitch acquisition unit 20 and used as the pitch within the measurement range. Outside the predetermined measurement range, the pitch outside the measurement range set on the measurement condition setting screen 80 is used. Here, the pitch outside the measurement range is set to be coarser than the pitch within the measurement range. Further, the upper limit position and lower limit position of the predetermined measurement range, the measurement pitch, and the like are stored in the measurement condition storage unit 21.

測定条件記憶部２１から設定情報を取得し、スライス画像の取込み毎にＺレボルバ１６の位置が所定測定範囲内であるかを比較しながら、その所定測定範囲に応じて測定ピッチに変更させて、Ｚ駆動制御部２２がＺレボルバの駆動制御を行う。ここで、複数の測定平面の夫々に応じた所定測定範囲が重なったり、近接したりしている場合には、１つの領域として同じ測定範囲内ピッチで輝度画像を取得するようにする。コントローラ２は、光検出器１２で得られた検出信号によりスライス画像を生成するとともに、得られたスライス画像から三次元画像を生成する。   The setting information is acquired from the measurement condition storage unit 21, and the Z revolver 16 is compared with the position within the predetermined measurement range every time a slice image is captured, and the measurement pitch is changed according to the predetermined measurement range. The Z drive control unit 22 performs drive control of the Z revolver. Here, when the predetermined measurement ranges corresponding to each of the plurality of measurement planes overlap or are close to each other, the luminance image is acquired with the same pitch within the measurement range as one region. The controller 2 generates a slice image based on the detection signal obtained by the photodetector 12, and also generates a three-dimensional image from the obtained slice image.

上記第１の実施の形態において、電動ＸＹステージ１４は、本発明のステージに相当し、Ｚレボルバ１６は、本発明の移動手段に相当し、測定条件情報記憶部２１は、測定条件記憶手段に相当し、Ｚ駆動制御部２２は、駆動制御手段に相当し、光検出部１３は、光検出手段に相当する。測定ピッチ取得部２０は、本発明の測定間隔取得手段に相当し、測定条件情報指示部１９は、測定条件設定手段および設定画面表示手段に相当する。また、コントローラ２は、本発明の二次元画像生成手段および三次元画像生成手段として機能する。   In the first embodiment, the electric XY stage 14 corresponds to the stage of the present invention, the Z revolver 16 corresponds to the moving means of the present invention, and the measurement condition information storage unit 21 is used as the measurement condition storage means. The Z drive control unit 22 corresponds to a drive control unit, and the light detection unit 13 corresponds to a light detection unit. The measurement pitch acquisition unit 20 corresponds to a measurement interval acquisition unit of the present invention, and the measurement condition information instruction unit 19 corresponds to a measurement condition setting unit and a setting screen display unit. The controller 2 functions as a two-dimensional image generation unit and a three-dimensional image generation unit of the present invention.

以上のように、第１の実施形態による共焦点顕微鏡装置によれば、顕微鏡観察者が観察操作画面に表示された観察画像を確認しながら、Ｚレボルバを操作し、観察試料において詳細にスライス画像の取り込みを行う測定平面近傍の所定測定範囲の上下限位置と、対象外の所定測定範囲外とを区別してそれぞれの測定ピッチを設定できるため、複数段差のある観察試料の対象平面の三次元画像を確実に作成することができ、かつ、スライス画像の取込み時間も短縮することができる。   As described above, according to the confocal microscope apparatus according to the first embodiment, the microscope observer operates the Z revolver while confirming the observation image displayed on the observation operation screen, and slices the observation sample in detail. Since the measurement pitch can be set by distinguishing the upper and lower limit positions of the predetermined measurement range in the vicinity of the measurement plane that captures and the outside of the predetermined measurement range outside the target, a three-dimensional image of the target plane of the observation sample with multiple steps Can be reliably generated, and the time for taking in the slice image can be shortened.

さらに、高段差の観察試料に対しては、測定範囲毎に測定ピッチを変更することができるため、スライス画像の取込み時間を短縮することができる。   Furthermore, since the measurement pitch can be changed for each measurement range for an observation sample having a high level difference, the slice image capture time can be shortened.

（第２の実施の形態）
以下、図７〜図９および図１０Ａ〜図１０Ｄを参照しながら、第２の実施の形態による共焦点顕微鏡装置について説明する。第１の実施の形態による共焦点顕微鏡装置１００と同様の構成および動作については、同一の符号を付し、詳細説明を省略する。 (Second Embodiment)
The confocal microscope apparatus according to the second embodiment will be described below with reference to FIGS. 7 to 9 and FIGS. 10A to 10D. The same configurations and operations as those of the confocal microscope apparatus 100 according to the first embodiment are denoted by the same reference numerals, and detailed description thereof is omitted.

本実施の形態による共焦点顕微鏡装置の構成の概略は図１で説明した共焦点顕微鏡装置１００と同様であるが、コントローラ２に代えて、図７に示すコントローラ２００を備える。   The outline of the configuration of the confocal microscope apparatus according to the present embodiment is the same as that of the confocal microscope apparatus 100 described with reference to FIG. 1, but includes a controller 200 shown in FIG.

図７に示すように、コントローラ２００は、測定平面指定部２３、測定平面記憶部２４、自動焦点検出部２５、指定平面高さ記憶部２６、測定範囲算出部２６、測定ピッチ取得部２８、測定条件設定部２９、およびＺ駆動制御部３０を有している。   As shown in FIG. 7, the controller 200 includes a measurement plane designation unit 23, a measurement plane storage unit 24, an automatic focus detection unit 25, a designated plane height storage unit 26, a measurement range calculation unit 26, a measurement pitch acquisition unit 28, and a measurement. It has a condition setting unit 29 and a Z drive control unit 30.

測定平面指定部２３は、表示部３に表示された観察試料８の画像において特定された点に基づき、測定対象とする平面を指定する。測定平面記憶部２４は、測定平面指定部２３において指定された測定平面の位置情報を記憶する。自動焦点検出部２５は、測定平面記憶部２４から測定平面として指定された平面の位置情報を読出し、指定された平面に対する合焦位置を検出する。指定平面高さ記億部２６は、自動焦点検出部２５で検出された、測定平面として指定された平面に対する合焦位置などの高さ情報を記憶する。   The measurement plane designating unit 23 designates a plane to be measured based on the points specified in the image of the observation sample 8 displayed on the display unit 3. The measurement plane storage unit 24 stores the position information of the measurement plane designated by the measurement plane designation unit 23. The automatic focus detection unit 25 reads the position information of the plane designated as the measurement plane from the measurement plane storage unit 24, and detects the in-focus position with respect to the designated plane. The designated plane height storage unit 26 stores height information such as a focus position with respect to the plane designated as the measurement plane detected by the automatic focus detection unit 25.

測定範囲算出部２７は、測定平面指定部２３において測定平面として指定された平面に対して、細かい測定ピッチで画像を取込む所定の測定範囲を算出する。測定ピッチ取得部２８は、測定範囲算出部２７で算出された所定の測定範囲において適用される測定範囲内ピッチと、それよりも粗い測定範囲外ピッチとを取得する。測定条件設定部２９は、上記所定の測定範囲を規定する上限、下限、適用される測定範囲内ピッチおよび測定範囲外ピッチを測定条件として設定する。Ｚ駆動制御部は、測定条件設定部２９で設定された測定条件に応じて、Ｚレボルバ１６を駆動制御する。   The measurement range calculation unit 27 calculates a predetermined measurement range in which an image is captured at a fine measurement pitch with respect to the plane designated as the measurement plane by the measurement plane designation unit 23. The measurement pitch acquisition unit 28 acquires a pitch within the measurement range applied in the predetermined measurement range calculated by the measurement range calculation unit 27 and a pitch outside the measurement range that is coarser than that. The measurement condition setting unit 29 sets an upper limit and a lower limit that define the predetermined measurement range, an applied pitch within the measurement range, and a pitch outside the measurement range as measurement conditions. The Z drive control unit drives and controls the Z revolver 16 in accordance with the measurement conditions set by the measurement condition setting unit 29.

共焦点顕微鏡での三次元画像の作成は、対物レンズ７をＺレボルバ１６でＺ方向に所定ピッチずつ移動させ、各Ｚ位置におけるスライス画像を順次取得し、取得した複数のスライス画像から、画素毎の最大輝度を抽出し蓄積していくことで行われる。   The creation of a three-dimensional image with a confocal microscope is performed by moving the objective lens 7 by a predetermined pitch in the Z direction by the Z revolver 16, sequentially acquiring slice images at each Z position, and for each pixel from the acquired slice images. This is done by extracting and accumulating the maximum brightness of.

次に、本実施の形態による共焦点顕微鏡装置の三次元画像作成の動作について、図２の観察試料例、図７の構成図、図８のフローチャート、および表示部３に表示される観察操作画面の一部である図９の観察画像表示画面例を参照しながら説明する。   Next, regarding the operation of creating the three-dimensional image of the confocal microscope apparatus according to the present embodiment, the observation sample example in FIG. 2, the configuration diagram in FIG. 7, the flowchart in FIG. 8, and the observation operation screen displayed on the display unit 3 This will be described with reference to an example of the observation image display screen in FIG.

まず、ステップ８０１では、観察者が例えば図３に示したような形状の観察試料８上で測定対象となる平面部分を指定する。図９は、表示部３に表示された観察試料８の観察画像９０を示す図である。図９に示すように、観察試料８は、面Ａ、面Ｂおよび面Ｃを有している。このとき、観察者は、測定対象にしたい面上の一点を指定することにより、測定面を指定する。すなわち、測定平面指定部２３は、例えば、図７には図示していないマウスなどの入力装置により、観察画像９０の面Ａ上の指定点８Ａ、面Ｂ上の指定点８Ｂ、面Ｃ上の指定点８Ｃを特定するように入力させ、面Ａ、面Ｂおよび面Ｃを指定する。測定平面記憶部２４は、指定された指定点Ａ、指定点Ｂ、指定点Ｃの指定位置情報を記憶する。   First, in step 801, the observer designates a plane portion to be measured on the observation sample 8 having a shape as shown in FIG. FIG. 9 is a diagram showing an observation image 90 of the observation sample 8 displayed on the display unit 3. As shown in FIG. 9, the observation sample 8 has a surface A, a surface B, and a surface C. At this time, the observer designates the measurement surface by designating one point on the surface to be measured. That is, the measurement plane designating unit 23 uses, for example, a mouse or other input device (not shown in FIG. 7) to designate the designated point 8A on the surface A, the designated point 8B on the surface B, and the surface C on the surface C. Input is made so as to specify the designated point 8C, and the surface A, the surface B, and the surface C are designated. The measurement plane storage unit 24 stores specified position information of the specified point A, the specified point B, and the specified point C.

なお、このように、指定平面を指定する際には、ＬＥＤ光源１７によるカラー観察画像が好ましい。輝度画像では合焦箇所部のみの輝度表示となるため、試料全体像を把握しにくいためである。   In this way, when designating the designated plane, a color observation image by the LED light source 17 is preferable. This is because in the luminance image, only the in-focus portion is displayed, so it is difficult to grasp the entire sample image.

ステップ８０２では、測定平面記憶部２４で記憶している指定位置情報を、自動焦点検出処理部２５へと渡し、指定位置において自動焦点検出処理を行う。自動焦点検出処理部２５では、カラー画像に対してコントラスト値の算出、輝度値の算出を実行し、これら信号処理結果に基づいて焦点位置かどうかを判定する。このとき焦点位置で無いならば、自動焦点検出処理部２５は、Ｚ駆動制御部３０に指示して信号処理結果から焦点位置と判定できる位置にＺレボルバ１６を介して対物レンズ７を移動させる。自動焦点検出処理の流れは公知の技術であるため詳細な説明は省略する。ここで、指定点Ａの自動焦点検出対象範囲９２は、図９の指定点Ａの外側に示す矩形領域であり、自動焦点検出範囲９２の中心位置が指定点Ａとなる。   In step 802, the designated position information stored in the measurement plane storage unit 24 is passed to the automatic focus detection processing unit 25, and an automatic focus detection process is performed at the designated position. The automatic focus detection processing unit 25 calculates the contrast value and the brightness value for the color image, and determines whether or not the focus position is based on the signal processing results. If it is not the focal position at this time, the automatic focus detection processing unit 25 instructs the Z drive control unit 30 to move the objective lens 7 via the Z revolver 16 to a position where the focal position can be determined from the signal processing result. Since the flow of the automatic focus detection process is a known technique, a detailed description thereof will be omitted. Here, the automatic focus detection target range 92 at the designated point A is a rectangular area shown outside the designated point A in FIG. 9, and the center position of the automatic focus detection range 92 is the designated point A.

ステップ８０３では、自動焦点検出処理部２５が、自動焦点検出処理により観察試料８の面Ａ、面Ｂ、面Ｃがそれぞれ合焦となる対物レンズ７の高さ位置と、自動焦点検出処理の信号処理結果から、各測定平面の合焦位置に基づき、合焦位置の上下位置にある非合焦となる高さ位置を算出する。指定平面高さ記億部２６は、取得したそれぞれの高さ情報を記憶する。非合焦となる高さ位置は、指定点に対する自動検出対象範囲で取得した高さデータから算出できる。本実施の形態においては、自動焦点検出処理により検出された合焦位置の上下位置にある非合焦となる高さ位置を、それぞれ上限位置および下限位置という。また、上限位置から下限位置までの範囲を合焦範囲という。   In step 803, the automatic focus detection processing unit 25 detects the height position of the objective lens 7 where the surface A, the surface B, and the surface C of the observation sample 8 are in focus by the automatic focus detection processing, and the signal for the automatic focus detection processing. From the processing result, the height position that is out of focus at the vertical position of the focus position is calculated based on the focus position of each measurement plane. The designated plane height storage unit 26 stores the acquired height information. The out-of-focus height position can be calculated from the height data acquired in the automatic detection target range with respect to the specified point. In the present embodiment, the height positions that are out of focus at the upper and lower positions of the focus position detected by the automatic focus detection process are referred to as the upper limit position and the lower limit position, respectively. A range from the upper limit position to the lower limit position is referred to as a focusing range.

ステップ８０４では、指定平面高さ記憶部２６にて記憶した高さ情報を得て、測定範囲算出部２７により観察試料８の面Ａ、面Ｂ、面Ｃのそれぞれの測定平面部の三次元画像を作成するために必要な所定測定範囲を算出する。   In step 804, the height information stored in the designated plane height storage unit 26 is obtained, and the three-dimensional image of each measurement plane part of the surface A, surface B, and surface C of the observation sample 8 is obtained by the measurement range calculation unit 27. Calculate a predetermined measurement range necessary to create

ここで、所定測定範囲の求め方を、図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃ、図１０Ｄを参照しながら説明する。図１０Ａに示すように、指定平面高さ記憶部２６から得た面Ａに関する高さ情報から、Ｚ＝ＺＡａ〜ＺＡｂ間は、自動焦点処理で求めた面Ａに関する合焦範囲ＰＡ１である。この合焦範囲ＰＡ１に、予め任意に設定してある測定距離ｑを加えたＺ＝ＺＡｃ〜ＺＡｄ間を合焦範囲ＰＡ２とする。同様に、指定平面高さ記憶部２６から得た面Ｂに関する高さ情報から、Ｚ＝ＺＢａ〜ＺＢｂ間は、自動焦点処理で求めた範囲（図示せず）である。この範囲に、予め任意に設定してある測定距離を加えたＺ＝ＺＢｃ〜ＺＢｄ間を合焦範囲ＰＢ１とする。ここで、隣り合う合焦範囲ＰＡ２−ＰＢ１間を非合焦範囲Ｒとして区別する。この場合、所定測定範囲は、範囲ＰＡ２と、範囲ＰＢ１であり、この測定範囲では、測定範囲内ピッチで画像検出を行う。非合焦範囲Ｒでは、測定範囲外ピッチで画像検出を行う。   Here, how to obtain the predetermined measurement range will be described with reference to FIGS. 10A, 10B, 10C, and 10D. As shown in FIG. 10A, from the height information related to the surface A obtained from the designated plane height storage unit 26, the area between Z = ZAa and ZAb is the focusing range PA1 related to the surface A obtained by the automatic focus processing. A range between Z = ZAc and ZAd obtained by adding a measurement distance q arbitrarily set in advance to the focusing range PA1 is set as a focusing range PA2. Similarly, from the height information regarding the surface B obtained from the designated plane height storage unit 26, the range between Z = ZBa and ZBb is a range (not shown) obtained by automatic focus processing. The range between Z = ZBc and ZBd, which is obtained by adding a measurement distance arbitrarily set in advance to this range, is defined as a focusing range PB1. Here, the adjacent in-focus range PA2-PB1 is distinguished as the out-of-focus range R. In this case, the predetermined measurement ranges are a range PA2 and a range PB1, and image detection is performed at a pitch within the measurement range in this measurement range. In the out-of-focus range R, image detection is performed at a pitch outside the measurement range.

また、図１０Ｂには、図１０Ａで求めた合焦範囲ＰＡ２が、対物倍率毎に予め設定されている測定ピッチから算出した、三次元画像を生成するために最低限必要な最小測定範囲よりも小さい場合は、その最小測定範囲を合焦範囲ＳＡ１（Ｚ＝ＺＡｅ〜ＺＡｆ）とする。   In FIG. 10B, the focusing range PA2 obtained in FIG. 10A is smaller than the minimum measurement range necessary for generating a three-dimensional image calculated from the measurement pitch set in advance for each objective magnification. In the case of being small, the minimum measurement range is set as a focusing range SA1 (Z = ZAe to ZAf).

さらに、図１０Ｃは、面Ａに関する合焦範囲の下限がＺ＝ＺＡｃ、上限がＺ＝ＺＡｄ、面Ｂの合焦範囲の下限がＺ＝ＺＢｃ、上限がＺ＝ＺＢｄであり、面Ａの合焦範囲の上限が面Ｂの合焦範囲の下限よりも上にあり、夫々の面に基づいて設定された合焦範囲ＰＡ５と合焦範囲ＰＢ５とが重なっている。この場合は、図１０Ｃに示したように、Ｚ＝ＺＡｃ〜ＺＢｄを１つの所定測定範囲ＳＡＢ５に設定する。   Further, FIG. 10C shows that the lower limit of the focusing range for surface A is Z = ZAc, the upper limit is Z = ZAd, the lower limit of the focusing range for surface B is Z = ZBc, and the upper limit is Z = ZBd. The upper limit of the focus range is above the lower limit of the focus range of the surface B, and the focus range PA5 and the focus range PB5 set based on each surface overlap. In this case, as shown in FIG. 10C, Z = ZAc to ZBd is set to one predetermined measurement range SAB5.

図１０Ｄは、面Ａの合焦範囲の上限Ｚ＝ＺＡｄと、面Ｂの合焦範囲の下限Ｚ＝ＺＢｃとが、距離Ｚ２離れている場合を示している。ここで、距離Ｚ２が測定ピッチを変える必要がないと判断される距離の場合には、図１０Ｄに示したように、Ｚ＝ＺＡｃ〜ＺＢｄを１つの所定測定範囲ＳＡＢ６として設定する。このように２つの所定測定範囲を１つの測定範囲とみなし、無駄な測定ピッチの変更を防ぐようにしている。   FIG. 10D shows a case where the upper limit Z = ZAd of the focusing range of the surface A and the lower limit Z = ZBc of the focusing range of the surface B are separated by a distance Z2. Here, when the distance Z2 is determined to be a distance for which it is not necessary to change the measurement pitch, as shown in FIG. 10D, Z = ZAc to ZBd are set as one predetermined measurement range SAB6. In this way, the two predetermined measurement ranges are regarded as one measurement range, so that useless change of the measurement pitch is prevented.

次に、測定ピッチ取得部２８において、レボルバ１３に搭載されている複数の対物レンズ７のうち、光軸上に搭載されている対物レンズ７の対物倍率情報から、対物倍率毎に予め設定されている測定範囲内ピッチ（細かい測定ピッチ）と、測定範囲外ピッチ（粗い測定ピッチ）を取得する。そして、図１０Ａ、図１０Ｂのようにして求めた測定範囲情報と、測定ピッチ取得部２８により取得した測定ピッチ情報から、合焦範囲ＰＡ２、合焦範囲ＰＢ１または合焦範囲ＳＡ１では細かい測定ピッチを、非合焦範囲Ｒでは粗い測定ピッチが選択されるように、測定ピッチ取得部２９で測定範囲と測定ピッチの組み合わせを決定する。   Next, in the measurement pitch acquisition unit 28, the objective pitch is preset for each objective magnification from the objective magnification information of the objective lens 7 mounted on the optical axis among the plurality of objective lenses 7 mounted on the revolver 13. The pitch within the measurement range (fine measurement pitch) and the pitch outside the measurement range (coarse measurement pitch) are acquired. Then, from the measurement range information obtained as shown in FIGS. 10A and 10B and the measurement pitch information acquired by the measurement pitch acquisition unit 28, a fine measurement pitch is obtained in the focus range PA2, the focus range PB1, or the focus range SA1. In the out-of-focus range R, the measurement pitch acquisition unit 29 determines a combination of the measurement range and the measurement pitch so that a coarse measurement pitch is selected.

また、図１０Ｃに示すように観察試料８の面Ａの合焦範囲と、面Ｂの合焦範囲が一部重なる時や、図１０Ｄに示すように非合焦範囲が任意に設定できる距離以内であれば、観察試料８の面Ａの合焦範囲の下限位置から面Ｂの合焦範囲の上限位置までの範囲を一組の所定測定範囲とすることで、無駄な測定ピッチの変更を減らすことができる。   10C, when the in-focus range of the surface A of the observation sample 8 partially overlaps the in-focus range of the surface B, or within a distance where the out-of-focus range can be arbitrarily set as shown in FIG. 10D. If so, the range from the lower limit position of the focusing range of the surface A of the observation sample 8 to the upper limit position of the focusing range of the surface B is set as a set of predetermined measurement ranges, thereby reducing unnecessary changes in the measurement pitch. be able to.

ステップ８０５では、測定ピッチ取得部２９から測定条件情報を得て、Ｚ駆動制御部３０によりＺレボルバ１６を駆動制御し、設定された測定条件内の最下限位置である、面Ａを対象とした所定測定範囲の下限位置から輝度画像の取込みを開始する。   In step 805, the measurement condition information is obtained from the measurement pitch acquisition unit 29, the Z drive control unit 30 drives and controls the Z revolver 16, and the surface A that is the lowest limit position within the set measurement conditions is targeted. The capturing of the luminance image is started from the lower limit position of the predetermined measurement range.

ステップ８０６では、スライス画像の取込みを終了するかの判断を行う。終了判定は、ステップ８０４で求めた測定範囲の最上限位置を高さ閾値として、スライス画像の取込み毎に現在のＺレボルバ１６の高さ位置が、その高さ閾値以上か否かで判断する。本実施の形態による観察試料８では面Ｃが含まれる合焦範囲の上限位置が高さ閾値となる。判定がＹｅｓのときには、スライス画像の取り込みを終了し、ステップ８０７へ進む。判定がＮｏの時には、ステップ８０８へ進む。   In step 806, it is determined whether or not the slice image capture is to be terminated. The end determination is made based on whether or not the current height position of the Z revolver 16 is greater than or equal to the height threshold value every time a slice image is taken, with the maximum upper limit position of the measurement range obtained in step 804 as a height threshold value. In the observation sample 8 according to the present embodiment, the upper limit position of the focusing range including the plane C is the height threshold value. When the determination is Yes, the capturing of the slice image is terminated, and the process proceeds to Step 807. If the determination is no, the process proceeds to step 808.

ステップ８０８では、ステップ８０６において現在のＺレボルバ１６の高さ位置が高さ閾値以下であるときであり、現在のＺレボルバ１６の高さ位置がステップ８０４で求めた所定測定範囲内であるかを判定する。本実施の形態による観察試料８では観察試料８の面Ａ、面Ｂ、面Ｃに基づいて定められた所定測定範囲内であるかを判定することになる。判定がＹｅｓの場合には、ステップ８０９に進む。判定がＮｏの場合には、ステップ８１０に進む。   In step 808, the current height position of the Z revolver 16 is equal to or lower than the height threshold value in step 806, and whether the current height position of the Z revolver 16 is within the predetermined measurement range obtained in step 804. judge. In the observation sample 8 according to the present embodiment, it is determined whether it is within a predetermined measurement range determined based on the surface A, the surface B, and the surface C of the observation sample 8. If the determination is Yes, the process proceeds to step 809. If the determination is no, the process proceeds to step 810.

ステップ８０９では、ステップ８０８において所定測定範囲内であるため、測定ピッチを細かい値である測定範囲内ピッチに変更し、ステップ８１１に進む。
ステップ８１０は、ステップ８０８において所定測定範囲外であるため、測定ピッチを粗い値である測定範囲外ピッチに変更し、ステップ８１１に進む。ステップ８１１では、前段処理のステップ８０９、またはステップ８１２にて決定した測定ピッチと、それぞれの測定ピッチに応じた測定範囲からＺレボルバ１６の駆動速度を求める。 In step 809, since it is within the predetermined measurement range in step 808, the measurement pitch is changed to a fine value within the measurement range, and the process proceeds to step 811.
Since step 810 is outside the predetermined measurement range in step 808, the measurement pitch is changed to a coarse pitch outside the measurement range, and the process proceeds to step 811. In step 811, the driving speed of the Z revolver 16 is obtained from the measurement pitch determined in step 809 or 812 of the pre-processing and the measurement range corresponding to each measurement pitch.

ステップ８１２では、ステップ８１１で求めたＺレボルバ駆動速度でＺレボルバ１６の高さ位置を上方へと移動させていく。そして、再びステップ８０５へと進み次のスライス画像取込みを行う。   In step 812, the height position of the Z revolver 16 is moved upward at the Z revolver driving speed obtained in step 811. Then, the process proceeds to step 805 again to capture the next slice image.

以上のように取込みを続けて、ステップ８０６で現在のＺレボルバ１６の高さ位置が高さ閾値以上、すなわち、本実施の形態による観察試料８では面Ｃが含まれる合焦範囲の上限位置となる場合に、スライス画像の取込みを終了し、ステップ８０７へ進み、三次元画像の構築を行う。   In step 806, the current height position of the Z revolver 16 is equal to or higher than the height threshold, that is, the upper limit position of the focusing range including the surface C in the observation sample 8 according to the present embodiment. In such a case, the capturing of the slice image is terminated, and the process proceeds to Step 807 to construct a three-dimensional image.

以上のように、第２の実施の形態による共焦点顕微鏡装置においては、観察画面９０上で観察試料８の測定対象とする平面を測定平面指定部２３により観察者が指定する。指定された平面に対し、測定平面記憶部２４が測定対象とする平面の位置情報を記憶し、平面の位置情報に応じて、自動焦点検出処理部２５が、平面に対する合焦位置を検出し、指定平面高さ記億部２６に記憶する。測定範囲算出部２７は、検出された合焦位置に基づいて所定測定範囲を算出する。測定条件設定部２９は、算出された所定測定範囲を設定するとともに、測定ピッチ取得部２０が取得した測定範囲内ピッチおよび測定範囲外ピッチを設定する。所定測定範囲内においては、測定範囲内ピッチを用い、所定測定範囲外における測定範囲外ピッチは、測定範囲内ピッチよりも大きく設定する。この測定条件によりＺ駆動制御部２２が、Ｚレボルバ１６を駆動制御し、スライス画像を取込み、三次元画像を生成する。   As described above, in the confocal microscope apparatus according to the second embodiment, the measurement plane designating unit 23 designates the plane to be measured on the observation sample 8 on the observation screen 90. For the specified plane, the measurement plane storage unit 24 stores the position information of the plane to be measured, and according to the position information of the plane, the automatic focus detection processing unit 25 detects the in-focus position with respect to the plane, This is stored in the designated plane height storage unit 26. The measurement range calculation unit 27 calculates a predetermined measurement range based on the detected focus position. The measurement condition setting unit 29 sets the calculated predetermined measurement range, and sets the pitch within the measurement range and the pitch outside the measurement range acquired by the measurement pitch acquisition unit 20. Within the predetermined measurement range, the pitch within the measurement range is used, and the pitch outside the measurement range outside the predetermined measurement range is set larger than the pitch within the measurement range. Under this measurement condition, the Z drive control unit 22 controls the drive of the Z revolver 16, takes a slice image, and generates a three-dimensional image.

また、複数の平面の夫々に応じた所定測定範囲が重なったり、近接したりしている場合には、１つの領域として同じ測定範囲内ピッチで輝度画像を取得するようにする。さらに、指定平面高さ記憶部２６から、測定平面が合焦位置となる高さ情報、例えば合焦位置ＺＡ０、ＺＢ０を取得し、合焦位置となる高さを中心位置として、その位置から上下に予め設定してある任意距離ｑ分加えた測定範囲を、合焦範囲と隣り合う合焦範囲との間の測定範囲を非合焦範囲Ｒ１と区別する。   Further, when the predetermined measurement ranges corresponding to each of the plurality of planes are overlapped or close to each other, the luminance image is acquired with the same measurement range pitch as one region. Further, the height information at which the measurement plane becomes the in-focus position, for example, the in-focus positions ZA0 and ZB0, is acquired from the designated plane height storage unit 26, and the height that becomes the in-focus position is set as the center position, and the vertical position from that position The measurement range between the in-focus range and the adjacent in-focus range is distinguished from the out-of-focus range R1.

上記第２の実施の形態において、測定平面指定部２３は本発明の測定指示点指定手段に相当し、測定平面記憶部２４は測定指示記憶手段に相当し、自動焦点検出処理部２５は合焦距離計測手段に相当し、指定平面高さ記億部２６は合焦距離記憶手段に相当する。また、測定範囲算出部２７の一部は合焦範囲検出手段に相当し、測定範囲算出部２７の別の一部は最低距離範囲記憶手段に相当し、測定ピッチ取得部２８は測定間隔記憶手段、および測定間隔取得手段に相当する。さらに、例えば不図示のマウスは、測定指示点特定手段に相当する。   In the second embodiment, the measurement plane designation unit 23 corresponds to a measurement instruction point designation unit of the present invention, the measurement plane storage unit 24 corresponds to a measurement instruction storage unit, and the automatic focus detection processing unit 25 is in focus. The designated plane height storage unit 26 corresponds to the distance measurement unit, and corresponds to the in-focus distance storage unit. A part of the measurement range calculation unit 27 corresponds to a focusing range detection unit, another part of the measurement range calculation unit 27 corresponds to a minimum distance range storage unit, and the measurement pitch acquisition unit 28 includes a measurement interval storage unit. , And measurement interval acquisition means. Further, for example, a mouse (not shown) corresponds to a measurement instruction point specifying unit.

以上説明したように、第２の実施の形態によれば第１の実施の形態と同様に、観察試料の測定対象平面の所定測定範囲と、所定測定範囲外を区別してそれぞれの測定ピッチを設定できるため、複数段差のある観察試料の対象平面の三次元画像を作成することができ、かつ、スライス画像の取込み時間も短縮することができる。さらに、第１の実施形態で行っていた所定測定範囲と測定ピッチの設定が、観察画像上で測定指示点を指定するだけで自動的に設定されるため、取込み開始前の設定時間も短縮できる。   As described above, according to the second embodiment, similarly to the first embodiment, the respective measurement pitches are set by distinguishing between the predetermined measurement range of the measurement target plane of the observation sample and the outside of the predetermined measurement range. Therefore, it is possible to create a three-dimensional image of the target plane of the observation sample having a plurality of steps, and to shorten the time for acquiring the slice image. Furthermore, since the setting of the predetermined measurement range and the measurement pitch performed in the first embodiment is automatically set only by specifying the measurement instruction point on the observation image, the setting time before the start of acquisition can be shortened. .

また、複数段差のある観察試料に対して測定対象平面の三次元画像を得られる。さらに、高段差の観察試料に対しても、測定ピッチを変更しながらスライス画像の取得を行うため測定時間の短縮できる。   In addition, a three-dimensional image of the measurement target plane can be obtained for an observation sample having a plurality of steps. Furthermore, since the slice image is acquired while changing the measurement pitch even for the observation sample having a high step, the measurement time can be shortened.

（第３の実施の形態）
以下、図１１、図１２、図１３Ａ、図１３Ｂを参照しながら、第３の実施の形態による共焦点顕微鏡装置について説明する。第１の実施の形態または第２の実施の形態による共焦点顕微鏡装置１００と同様の構成および動作については、同一の符号を付し、詳細説明を省略する。 (Third embodiment)
Hereinafter, a confocal microscope apparatus according to a third embodiment will be described with reference to FIGS. 11, 12, 13A, and 13B. The same configurations and operations as those of the confocal microscope apparatus 100 according to the first embodiment or the second embodiment are denoted by the same reference numerals, and detailed description thereof is omitted.

本実施の形態による共焦点顕微鏡装置の構成の概略は、図１で説明した共焦点顕微鏡装置１００と同様であるが、コントローラ２に代えて、図１１に示すコントローラ３００を備える。また、観察試料８に存在する測定平面に応じて所定測定範囲を設定し、その所定測定範囲においては、スライス画像を取込むための測定ピッチを測定範囲内ピッチに設定し、所定測定範囲以外では、測定範囲内ピッチよりも粗い、測定範囲外ピッチに設定することは、第１の実施の形態および第２の実施の形態による共焦点顕微鏡装置と同様である。   The outline of the configuration of the confocal microscope apparatus according to the present embodiment is the same as that of the confocal microscope apparatus 100 described with reference to FIG. 1, but includes a controller 300 shown in FIG. In addition, a predetermined measurement range is set according to the measurement plane existing in the observation sample 8, and in the predetermined measurement range, the measurement pitch for taking the slice image is set to the pitch within the measurement range. Setting the pitch outside the measurement range, which is coarser than the pitch within the measurement range, is the same as in the confocal microscope apparatus according to the first embodiment and the second embodiment.

コントローラ３００は、計数部３１、測定ピッチ取得部３２、測定条件設定部３３、Ｚ駆動制御部２２を備えている。計数部３１は、取込まれたスライス画像の各画素の輝度について、所定条件を満たす画素数を計数する。測定ピッチ取得部３２は、対物レンズ７の倍率に応じた測定範囲内ピッチ、測定範囲外ピッチを取得する。測定条件設定部２９は、測定ピッチや測定の終了条件など、所定の測定条件を設定する。Ｚ駆動制御部２２は、測定条件設定部２９の設定に基づき、Ｚレボルバ１６を駆動制御する。   The controller 300 includes a counting unit 31, a measurement pitch acquisition unit 32, a measurement condition setting unit 33, and a Z drive control unit 22. The counting unit 31 counts the number of pixels that satisfy a predetermined condition for the luminance of each pixel of the captured slice image. The measurement pitch acquisition unit 32 acquires the pitch within the measurement range and the pitch outside the measurement range according to the magnification of the objective lens 7. The measurement condition setting unit 29 sets predetermined measurement conditions such as a measurement pitch and a measurement end condition. The Z drive control unit 22 drives and controls the Z revolver 16 based on the setting of the measurement condition setting unit 29.

共焦点顕微鏡での三次元画像の作成は、対物レンズ７をＺレボルバ１６でＺ方向に所定ピッチずつ移動させ、各Ｚ位置におけるスライス画像を順次取得し、取得した複数のスライス画像から、画像毎の最大輝度を抽出し蓄積していくことで行われる。   The creation of a three-dimensional image with a confocal microscope is performed by moving the objective lens 7 by a predetermined pitch in the Z direction by the Z revolver 16 to sequentially acquire slice images at each Z position, and from the acquired plurality of slice images, for each image. This is done by extracting and accumulating the maximum brightness of.

次に、本実施の形態における三次元画像作成の動作について、図１１の構成図と、図１２のフローチャートとを用いて説明する。ステップ９０１では、スライス画像の取込み開始前に、ステップ９０９や、ステップ９１１での条件判断の閾値となる基準画素数、すなわち後述の第１基準輝度値Ｌ１、第２基準輝度値Ｌ２、第１基準画素数Ｌ１、第２基準画素数Ｌ２等を、図１１には図示していない動作メモリ部に記憶する。また、自動取込みに必要な、例えば対物レンズ７の倍率に応じた測定ピッチなど、各種パラメータも動作メモリ部に記憶している。   Next, the operation of creating a three-dimensional image in the present embodiment will be described using the configuration diagram of FIG. 11 and the flowchart of FIG. In step 901, before starting the capture of the slice image, the number of reference pixels serving as a threshold for condition determination in step 909 and step 911, that is, a first reference luminance value L1, a second reference luminance value L2, and a first reference, which will be described later. The pixel number L1, the second reference pixel number L2, and the like are stored in an operation memory unit not shown in FIG. Various parameters necessary for automatic capture, such as a measurement pitch corresponding to the magnification of the objective lens 7, are also stored in the operation memory unit.

ステップ９０２では、現在のＺレボルバ１６の高さ位置における輝度画像(スライス画像)の取込みを行う。ステップ９０３では、スライス画像毎に各画素で最大輝度値を蓄積した画像を作成する。この最大輝度蓄積画像は、最終的な自動取込みの終了判定を行うために使用する。ステップ９０４では、ステップ９０２で取得した、例えば、図１３Ａの輝度画像３０１のような輝度画像と、ステップ９０３で作成した、例えば、図１４Ａの最大輝度蓄積画像３１２のような最大輝度蓄積画像に対し、図１３Ｂ、図１４Ｂに示すような横軸に輝度値、縦軸に画素数のヒストグラムをそれぞれ作成する。   In step 902, a luminance image (slice image) at the current height position of the Z revolver 16 is captured. In step 903, an image in which the maximum luminance value is accumulated at each pixel is created for each slice image. This maximum luminance accumulated image is used for determining the final end of automatic capture. In step 904, the luminance image obtained in step 902, such as the luminance image 301 in FIG. 13A, and the maximum luminance accumulated image created in step 903, such as the maximum luminance accumulated image 312 in FIG. 13B and FIG. 14B, a histogram of the luminance value is created on the horizontal axis and the number of pixels is plotted on the vertical axis.

ステップ９０５では、計数部３１が、予め設定されている所定の第１基準輝度値Ｌ１を動作メモリ部から得て、ステップ９０４で作成した輝度画像ヒストグラムに対し、図１３Ｂに示すような、第１基準輝度値Ｌ１以下となる計数範囲Ｔ１にある画素数を計数し、輝度頻度ＬＮとする。ステップ９０６では、計数部３１が、予め設定している所定の第２基準輝度値Ｌ２を動作メモリ部から得て、ステップ９０４で作成した最大輝度蓄積画像ヒストグラムに対し、図１４Ｂに示すような、第２基準輝度値Ｌ２以上となる計数範囲Ｔ２にある画素数を計数し、最大輝度蓄積頻度ＬＭＸとする。   In step 905, the counting unit 31 obtains a predetermined first reference luminance value L1 that is set in advance from the operation memory unit, and performs the first as shown in FIG. 13B on the luminance image histogram created in step 904. The number of pixels in the counting range T1 that is equal to or less than the reference luminance value L1 is counted and is set as the luminance frequency LN. In step 906, the counting unit 31 obtains a predetermined second reference luminance value L2 set in advance from the operation memory unit, and the maximum luminance accumulated image histogram created in step 904 is as shown in FIG. The number of pixels in the counting range T2 that is equal to or greater than the second reference luminance value L2 is counted to obtain the maximum luminance accumulation frequency LMX.

ステップ９０７では、ステップ９０５で求めた輝度頻度ＬＮが、動作メモリ部に記憶している第１基準画素数Ｌ１以下であるかを判断する。ステップ９０７の判定がＮｏであれば、ステップ９１１に進む。判定がＹｅｓの場合には、ステップ９０８に進む。   In step 907, it is determined whether the luminance frequency LN obtained in step 905 is equal to or less than the first reference pixel number L1 stored in the operation memory unit. If the determination in step 907 is No, the process proceeds to step 911. If the determination is Yes, the process proceeds to step 908.

ステップ９０８は、ステップ９０７において、輝度頻度ＬＮが第１基準画素数Ｌ１を超えている場合、すなわち、第１基準輝度値Ｌ１以下の画素数が、第１基準画素数Ｌ１より多い場合である。このとき、このスライス画像を得た高さ位置は所定測定範囲外と判定し、測定条件設定部３３で測定ピッチを測定範囲外ピッチ（粗い測定ピッチ）に設定し、ステップ９０９に進む。   Step 908 is a case where the luminance frequency LN exceeds the first reference pixel number L1 in Step 907, that is, the number of pixels equal to or less than the first reference luminance value L1 is greater than the first reference pixel number L1. At this time, the height position at which this slice image is obtained is determined to be outside the predetermined measurement range, the measurement condition setting unit 33 sets the measurement pitch to a pitch outside the measurement range (coarse measurement pitch), and the process proceeds to step 909.

ステップ９０７で判定がＮｏの場合、すなわち、輝度頻度ＬＮが第１基準画素数Ｌ１以下の画素数が、第１基準画素数Ｌ１以下である場合、現在の高さ位置を所定測定範囲内と判断し、測定条件設定部３３で測定ピッチを測定範囲内ピッチ（細かい測定ピッチ）に設定し、ステップ９１２へ進む。   If the determination in step 907 is No, that is, if the luminance frequency LN is equal to or less than the first reference pixel number L1, the current height position is determined to be within the predetermined measurement range. The measurement condition setting unit 33 sets the measurement pitch to a pitch within the measurement range (fine measurement pitch), and the process proceeds to step 912.

なお、ここで、設定する測定ピッチは、測定ピッチ取得部３２により、レボルバ１３に搭載されている複数の対物レンズ７のうち、光軸上に搭載されている対物レンズの対物倍率情報から、対物倍率毎に予め設定されている測定範囲内ピッチと、測定範囲外ピッチとを取得した値である。   Here, the measurement pitch to be set is determined by the measurement pitch acquisition unit 32 based on the objective magnification information of the objective lens mounted on the optical axis among the plurality of objective lenses 7 mounted on the revolver 13. It is a value obtained by acquiring a pitch within the measurement range and a pitch outside the measurement range that are set in advance for each magnification.

上記のように輝度頻度ＬＮと第１基準画素数Ｌ１とを比較することで、取込んだスライス画像が、観察試料８の所定測定範囲かどうかの判断を行っている。スライス画像内の第１基準輝度値Ｌ１以下の画素数である輝度頻度ＬＮが第１基準画素数Ｌ１を超えるということは、例えば図１３Ａの輝度画像３０１のように、該スライス画像全体がほぼ低輝度値であることを意味しており、共焦点画像の特徴を考慮すれば、該スライス画像を取込んだ高さ位置の観察試料８の測定平面以外の箇所に焦点位置があると判断できる。   By comparing the luminance frequency LN and the first reference pixel number L1 as described above, it is determined whether or not the captured slice image is within the predetermined measurement range of the observation sample 8. The fact that the luminance frequency LN, which is the number of pixels less than or equal to the first reference luminance value L1 in the slice image, exceeds the first reference pixel number L1, for example, as in the luminance image 301 of FIG. This means that it is a luminance value, and considering the features of the confocal image, it can be determined that the focal position is at a location other than the measurement plane of the observation sample 8 at the height position where the slice image is captured.

ステップ９０９では、ステップ９０６において求めた最大輝度蓄積頻度ＬＭＸが第２基準画素数Ｌ２を超えているかを比較し、取込みを終了するかの判断を行っている。このように、最大輝度蓄積頻度ＬＭＸと第２基準画素数Ｌ２とを比較し、計数範囲Ｔ２にある画素数を計数することで、全画素内で、観察試料８の測定対象となる測定平面の高さ情報が取得できた画素数がどれだけ検出されたかを判断している。ここで、最大輝度蓄積頻度ＬＭＸが第２基準画素数Ｌ２を超えるということは、例えば図１４Ａの最大輝度蓄積画像３１２のように、観察試料８上のいくつかの測定平面に焦点位置がある状態が検出されたと考えられる。ここで、第２基準画素数Ｌ２の値は、取込み時間に応じて変動する閾値であり、ステップ９０７の条件を満足している時間に応じて、第２基準画素数Ｌ２値を減少させることで、取込みが終了できなくなることを防いでいる。判断がＮｏの場合には、さらにスライス画像の取り込みを継続するため、ステップ９１２に進む。   In step 909, it is compared whether the maximum luminance accumulation frequency LMX obtained in step 906 exceeds the second reference pixel number L2, and a determination is made as to whether or not to end the capture. In this way, by comparing the maximum luminance accumulation frequency LMX and the second reference pixel number L2, and counting the number of pixels in the counting range T2, the measurement plane to be measured of the observation sample 8 is measured in all pixels. It is determined how many pixels from which height information has been acquired have been detected. Here, the fact that the maximum luminance accumulation frequency LMX exceeds the second reference pixel number L2 means that, for example, the maximum luminance accumulation image 312 in FIG. Is considered to have been detected. Here, the value of the second reference pixel number L2 is a threshold that varies according to the capture time, and the second reference pixel number L2 value is decreased by the time that satisfies the condition of Step 907. This prevents the ingestion from ending. If the determination is No, the process proceeds to step 912 in order to continue capturing the slice image.

ステップ９１２では、ステップ９０８、またはステップ９１１で設定した測定ピッチを測定ピッチ取得部２０から得る。また、レボルバ１３に搭載されている複数の対物レンズ７のうち、光軸上に搭載されている対物レンズ７の対物倍率情報から、対物倍率毎に予め設定されている基本測定範囲、すなわち、対物レンズ７の倍率に依存するとともに、合焦範囲を含み、しかも三次元画像の生成が可能なように設けられる所定測定範囲を動作メモリ部から得て、Ｚ駆動制御部３４によりＺレボルバ１６の駆動速度を求め、ステップ１３へ進む。   In step 912, the measurement pitch set in step 908 or 911 is obtained from the measurement pitch acquisition unit 20. Further, out of a plurality of objective lenses 7 mounted on the revolver 13, a basic measurement range that is set in advance for each objective magnification, that is, an objective based on objective magnification information of the objective lens 7 mounted on the optical axis. A predetermined measurement range that is dependent on the magnification of the lens 7 and includes a focusing range and that can generate a three-dimensional image is obtained from the operation memory unit, and the Z drive control unit 34 drives the Z revolver 16. Determine the speed and go to step 13.

ステップ９１３では、ステップ９１２で求めたＺレボルバ駆動速度でＺレボルバ１６の高さ位置を観察試料８から離れる上方へと移動させていく。そして、再びステップ９０２へと進み次のスライス画像取込みを行う。   In step 913, the height position of the Z revolver 16 is moved upward away from the observation sample 8 at the Z revolver driving speed obtained in step 912. Then, the process proceeds again to step 902 and the next slice image is captured.

以上のように取込みを続けて、ステップ９０９にて最大輝度蓄積頻度ＬＭＸが第２基準画素数Ｌ２を超えた場合に、取込みを終了しステップ９１０へと進む。ステップ９１０では、三次元画像の構築を行い、処理を終了する。   The capturing is continued as described above, and when the maximum luminance accumulation frequency LMX exceeds the second reference pixel number L2 in step 909, the capturing is terminated and the process proceeds to step 910. In step 910, a three-dimensional image is constructed, and the process ends.

第３の実施の形態において、計数部３１が、本発明の画素数係数手段に相当し、測定条件設定部３３が、画素数比較手段に相当する。
以上説明したように、第３の実施の形態による共焦点顕微鏡装置によれば、計数部３１は、ある高さ位置で取込んだスライス画像における、各画素の輝度が第１基準輝度値Ｌ１以下の画素数を輝度頻度ＬＮとして求める。輝度頻度ＬＮが、第１基準画素数Ｌ１以下の場合には、測定条件設定部３３は、現在の高さ位置を所定測定範囲外と判定し、測定ピッチを測定範囲外ピッチに設定する。輝度頻度ＬＮが、第１基準画素数Ｌ１を超えた場合には、現在の高さ位置が所定測定範囲内と判定し、測定ピッチを測定範囲内ピッチに設定する。 In the third embodiment, the counting unit 31 corresponds to a pixel number coefficient unit of the present invention, and the measurement condition setting unit 33 corresponds to a pixel number comparison unit.
As described above, according to the confocal microscope apparatus according to the third embodiment, the counting unit 31 has the luminance of each pixel in the slice image captured at a certain height position equal to or less than the first reference luminance value L1. Is obtained as the luminance frequency LN. When the luminance frequency LN is equal to or less than the first reference pixel number L1, the measurement condition setting unit 33 determines that the current height position is out of the predetermined measurement range, and sets the measurement pitch to a pitch outside the measurement range. When the luminance frequency LN exceeds the first reference pixel number L1, it is determined that the current height position is within the predetermined measurement range, and the measurement pitch is set to the measurement range pitch.

一方、各画素毎に最大輝度を蓄積した、最大輝度蓄積画像を作成し、最大輝度が第２基準輝度値Ｌ２を超える画素数を最大輝度蓄積頻度ＬＭＸとして算出する。最大輝度蓄積頻度ＬＭＸが、測定時間に応じて定められた第２基準画素数Ｌ２を越える際には、すべての測定対象面を検出したと判定し、処理を終了する。   On the other hand, a maximum luminance accumulation image in which the maximum luminance is accumulated for each pixel is created, and the number of pixels whose maximum luminance exceeds the second reference luminance value L2 is calculated as the maximum luminance accumulation frequency LMX. When the maximum luminance accumulation frequency LMX exceeds the second reference pixel number L2 determined according to the measurement time, it is determined that all measurement target surfaces have been detected, and the process ends.

第３の実施の形態において、計数部３１は、本発明の画素数計数手段に相当し、測定条件設定部３３は、画素数比較手段に相当する。
以上のように、第３の実施の形態による共焦点顕微鏡装置によれば、第１の実施の形態および第２の実施の形態と同様に、観察試料の測定対象平面に応じた所定測定範囲と、対象外の所定測定範囲外を区別してそれぞれの測定ピッチを設定できるため、複数段差のある観察試料の対象平面の三次元画像を作成することができ、かつ、スライス画像の取込み時間も短縮することができる。 In the third embodiment, the counting unit 31 corresponds to a pixel number counting unit of the present invention, and the measurement condition setting unit 33 corresponds to a pixel number comparing unit.
As described above, according to the confocal microscope apparatus according to the third embodiment, similarly to the first embodiment and the second embodiment, the predetermined measurement range corresponding to the measurement target plane of the observation sample is Since each measurement pitch can be set by distinguishing outside the predetermined measurement range outside the target, it is possible to create a three-dimensional image of the target plane of the observation sample having a plurality of steps, and to shorten the time for capturing the slice image be able to.

さらに、第１の実施の形態で行っていた測定範囲と測定ピッチの設定を観察者に行わせることもなく、第２の実施の形態で行っていた測定対象平面を観察画像上で指定するといった操作もなく、自動的に取込みを行うことができるため、画像取込み開始前の測定条件設定時間や、所定測定範囲検出時間をより短縮でき、かつ複数段差のある観察試料に対して測定対象平面の三次元画像を得られる。さらに、高段差の観察試料に対しても、測定ピッチを変更しながらスライス画像の取得を行うため測定時間の短縮できる。   Furthermore, the measurement range and the measurement pitch set in the first embodiment are not set by the observer, and the measurement target plane set in the second embodiment is designated on the observation image. Since it is possible to automatically capture without operation, the measurement condition setting time before the start of image capture and the predetermined measurement range detection time can be further shortened, and the measurement target plane can be measured for an observation sample with multiple steps. A three-dimensional image can be obtained. Furthermore, since the slice image is acquired while changing the measurement pitch even for the observation sample having a high step, the measurement time can be shortened.

（変形例）
ここで、上記第１から第３の実施の形態の変形例について説明する。上記実施の形態と同様の部分については詳細説明を省略する。本変形例は、第１から第３の実施の形態において、測定範囲外ピッチを用いる際に、図１で説明した共焦点顕微鏡装置１００における二次元走査部６において、観察試料に照射されるレーザ光を二次元に走査する間隔を、ＸＹ方向のどちらか一方、または両方向に間引いて取込む。このようにすることで、画像サイズが小さくなり、取得する画像データ量を減らすことができ、かつ取込み時間が短縮できる。 (Modification)
Here, modified examples of the first to third embodiments will be described. Detailed description of the same parts as those in the above embodiment will be omitted. In this modification, in the first to third embodiments, the laser irradiated to the observation sample in the two-dimensional scanning unit 6 in the confocal microscope apparatus 100 described in FIG. The interval at which light is scanned two-dimensionally is taken in either or both of the XY directions. By doing so, the image size is reduced, the amount of image data to be acquired can be reduced, and the capture time can be shortened.

なお、本発明は、以上に述べた実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内で種々の構成または実施形態を採用することができる。例えば、顕微鏡本体１の光学的構成については、共焦点顕微鏡であれば、例えば、ＬＥＤ光源による観察光学系を備えない例など、他の構成でもよい。   The present invention is not limited to the embodiments described above, and various configurations or embodiments can be adopted without departing from the gist of the present invention. For example, the optical configuration of the microscope body 1 may be other configurations such as an example in which an observation optical system using an LED light source is not provided as long as it is a confocal microscope.

上記実施の形態および変形例においては、観察試料８に対し対物レンズ７など光学系を移動させて距離を変化させていたが、観察試料８と対物レンズ７との少なくとも一方を移動させるようにすればよい。   In the above-described embodiment and modification, the optical system such as the objective lens 7 is moved with respect to the observation sample 8 to change the distance, but at least one of the observation sample 8 and the objective lens 7 is moved. That's fine.

１ 顕微鏡本体
２ コントローラ
３ 表示部
４ レーザ光源
５ 偏光ビームスプリッタ
６ 二次元走査部
７ 対物レンズ
８ 観察試料
１０ａ、１０ｂ 結像レンズ
１１ ピンホール
１３ レボルバ
１６ Ｚレボルバ
１２ 光検出器
１９ 測定条件情報指定部
２０ 測定ピッチ取得部
２１ 測定条件記憶部
２２ Ｚ駆動制御部 DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Microscope main body 2 Controller 3 Display part 4 Laser light source 5 Polarization beam splitter 6 Two-dimensional scanning part 7 Objective lens 8 Observation sample 10a, 10b Imaging lens 11 Pinhole 13 Revolver 16 Z revolver 12 Photo detector 19 Measurement condition information designation part 20 Measurement pitch acquisition unit 21 Measurement condition storage unit 22 Z drive control unit

Claims (21)

観察試料の観察面に光を集束して二次元走査するとともに、前記光の光軸方向に集束位置を移動しながら共焦点画像を取得する共焦点顕微鏡装置であって、
前記観察試料を載置するステージと、
前記光軸上に配置され、所定の倍率で前記光を前記観察面に集束する少なくとも１つの対物レンズと、
前記観察試料の所望の前記観察面に前記光を集束させるために前記ステージと前記対物レンズとの距離を所定間隔で変化させる移動手段と、
前記距離に応じて前記所定間隔を設定する測定条件設定手段と、
前記測定条件設定手段が設定した前記所定間隔で前記距離を変化させるように前記移動手段を駆動制御する駆動制御手段と、
前記観察面からの反射光を検出する光検出手段と、
前記所定間隔で変化させた前記距離毎に前記観察面上に前記光を二次元走査することにより前記光検出手段が検出した検出信号に基づき複数の画素よりなる二次元画像を生成する二次元画像生成手段と、
前記二次元画像生成手段で生成された複数の前記二次元画像を用いて三次元画像を生成する三次元画像生成手段と、
を有し、
前記測定条件設定手段は、
前記距離の所定の上限および所定の下限と、前記距離の前記上限から下限までの所定距離範囲内において前記距離を変化させる第１の間隔と、前記第１の間隔より大きい第２の間隔とを少なくとも１組設定し、
前記駆動制御手段は、
前記所定距離範囲内では前記第１の間隔で前記距離を変化させ、前記所定距離範囲外では前記第２の間隔で前記距離を変化させるように前記移動手段を駆動制御することを特徴とする共焦点顕微鏡装置。 A confocal microscope apparatus that focuses light on an observation surface of an observation sample and performs two-dimensional scanning, and acquires a confocal image while moving a focusing position in the optical axis direction of the light,
A stage on which the observation sample is placed;
At least one objective lens disposed on the optical axis and focusing the light onto the observation surface at a predetermined magnification;
Moving means for changing the distance between the stage and the objective lens at a predetermined interval in order to focus the light on the desired observation surface of the observation sample;
Measurement condition setting means for setting the predetermined interval according to the distance;
Drive control means for drivingly controlling the moving means so as to change the distance at the predetermined interval set by the measurement condition setting means;
Light detection means for detecting reflected light from the observation surface;
A two-dimensional image that generates a two-dimensional image composed of a plurality of pixels based on a detection signal detected by the light detection means by two-dimensionally scanning the light on the observation surface at each distance changed at the predetermined interval. Generating means;
3D image generation means for generating a 3D image using the plurality of 2D images generated by the 2D image generation means;
Have
The measurement condition setting means includes
A predetermined upper limit and a predetermined lower limit of the distance; a first interval for changing the distance within a predetermined distance range from the upper limit to the lower limit of the distance; and a second interval larger than the first interval. Set at least one set,
The drive control means includes
Wherein within a predetermined distance range changing the distance in the first distance, said at predetermined distance range you and drives controlling the moving means to vary the distance in said second interval Confocal microscope device. 前記対物レンズの倍率に応じた第１のレンズ依存間隔と第１のレンズ依存間隔より大きい第２のレンズ依存間隔とを保持する測定間隔記憶手段と、
前記光軸上に配置された前記対物レンズの倍率を検出し、前記測定間隔記憶部から前記対物レンズの倍率に応じた前記第１のレンズ依存間隔と前記第２のレンズ依存間隔とを取得する測定間隔取得手段と、
をさらに有し、
前記測定条件設定手段は、
前記測定間隔取得手段が取得した前記第１のレンズ依存間隔を前記第１の間隔として設定し、前記第２のレンズ依存間隔を前記第２の間隔として設定することを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡装置。 Measurement interval storage means for holding a first lens-dependent interval corresponding to the magnification of the objective lens and a second lens-dependent interval larger than the first lens-dependent interval;
The magnification of the objective lens arranged on the optical axis is detected, and the first lens dependent interval and the second lens dependent interval corresponding to the magnification of the objective lens are acquired from the measurement interval storage unit. A measurement interval acquisition means;
Further comprising
The measurement condition setting means includes
Setting the first lens-dependent interval the measuring interval obtaining unit obtains, as the first distance, the second lens depends spacing to claim 1, characterized in that to set as the second distance The confocal microscope apparatus described. 前記測定条件設定手段は、
前記距離の前記上限、前記下限、前記第１の間隔、および前記第２の間隔を設定するための画面を表示する設定画面表示手段、
を有することを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡装置。 The measurement condition setting means includes
Setting screen display means for displaying a screen for setting the upper limit, the lower limit, the first interval, and the second interval of the distance;
The confocal microscope apparatus according to claim 1 , wherein 前記設定画面表示手段で設定された前記上限、前記下限、前記第１の間隔、および前記第２の間隔を測定条件として記憶する測定条件記憶手段、
をさらに備えることを特徴とする請求項３に記載の共焦点顕微鏡装置。 Measurement condition storage means for storing the upper limit, the lower limit, the first interval, and the second interval set by the setting screen display unit as measurement conditions;
The confocal microscope apparatus according to claim 3 , further comprising: 前記測定条件設定手段は、前記測定条件記憶手段から前記測定条件を読込み、
前記駆動制御手段は、読込んだ前記測定条件に応じて前記移動手段を駆動制御することを特徴とする請求項４に記載の共焦点顕微鏡装置。 The measurement condition setting means reads the measurement condition from the measurement condition storage means,
The confocal microscope apparatus according to claim 4 , wherein the drive control unit drives and controls the moving unit in accordance with the read measurement condition. 前記測定条件設定手段は、The measurement condition setting means includes
各々が前記上限、前記下限、前記第１の間隔、および前記第２の間隔を含む複数の組み合わせが設定され、前記複数の組み合わせのうちの第１の組み合わせに含まれる前記上限から前記下限までの第１の所定距離範囲が、他の組み合わせに含まれる前記上限から前記下限までの他の所定距離範囲と少なくとも一部で重なっている場合、A plurality of combinations each including the upper limit, the lower limit, the first interval, and the second interval are set, and from the upper limit to the lower limit included in the first combination of the plurality of combinations When the first predetermined distance range overlaps at least partly with another predetermined distance range from the upper limit to the lower limit included in another combination,
設定した測定範囲内において前記移動手段が同じ間隔で前記距離を変化させるように、前記第１の所定距離範囲と前記他の所定距離範囲を１つの前記測定範囲として設定することを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡装置。The first predetermined distance range and the other predetermined distance range are set as one measurement range so that the moving means changes the distance at the same interval within the set measurement range. Item 2. The confocal microscope apparatus according to Item 1. 前記測定条件設定手段は、The measurement condition setting means includes
各々が前記上限、前記下限、前記第１の間隔、および前記第２の間隔を含む複数の組み合わせが設定され、前記複数の組み合わせのうちの第１の組み合わせに含まれる前記上限から前記下限までの第１の所定距離範囲が、他の組み合わせに含まれる前記上限から前記下限までの他の所定距離範囲と離れている場合であって、前記第１の所定距離範囲と前記他の所定距離範囲との間の距離が、前記ステージと前記対物レンズとの前記距離を変化させる前記間隔を、第１の前記所定距離範囲内と他の前記所定距離範囲内とで変化させる必要がないと判断される距離である場合、A plurality of combinations each including the upper limit, the lower limit, the first interval, and the second interval are set, and from the upper limit to the lower limit included in the first combination of the plurality of combinations The first predetermined distance range is separated from other predetermined distance ranges from the upper limit to the lower limit included in other combinations, and the first predetermined distance range and the other predetermined distance range are The distance between the stage and the objective lens is determined not to need to be changed between the first predetermined distance range and another predetermined distance range. If distance
設定した測定範囲内において前記移動手段が同じ間隔で前記ステージと前記対物レンズとの前記距離を変化させるように、前記第１の所定距離範囲と前記他の所定距離範囲を１つの前記測定範囲として設定することを特徴とする請求項１記載の共焦点顕微鏡装置。The first predetermined distance range and the other predetermined distance range are defined as one measurement range so that the moving means changes the distance between the stage and the objective lens at the same interval within the set measurement range. The confocal microscope apparatus according to claim 1, wherein the confocal microscope apparatus is set. 観察試料の観察面に光を集束して二次元走査するとともに、前記光の光軸方向に集束位置を移動しながら共焦点画像を取得する共焦点顕微鏡装置であって、
前記観察試料を載置するステージと、
前記光軸上に配置され、所定の倍率で前記光を前記観察面に集束する少なくとも１つの対物レンズと、
前記観察試料の所望の前記観察面に前記光を集束させるために前記ステージと前記対物レンズとの距離を所定間隔で変化させる移動手段と、
前記距離に応じて前記所定間隔を設定する測定条件設定手段と、
前記測定条件設定手段が設定した前記所定間隔で前記距離を変化させるように前記移動手段を駆動制御する駆動制御手段と、
前記観察面からの反射光を検出する光検出手段と、
前記所定間隔で変化させた前記距離毎に前記観察面上に前記光を二次元走査することにより前記光検出手段が検出した検出信号に基づき複数の画素よりなる二次元画像を生成する二次元画像生成手段と、
前記二次元画像生成手段で生成された複数の前記二次元画像を用いて三次元画像を生成する三次元画像生成手段と、
前記観察試料において、少なくとも一点の測定指示点を指定する測定指示点指定手段と、
各々の前記測定指示点に前記光を集束させる場合の前記距離を少なくとも１つの合焦距離として計測する合焦距離計測手段と、
を有し、
前記測定条件設定手段は、
少なくとも１つの前記合焦距離に応じて前記所定間隔を設定することを特徴とする共焦点顕微鏡装置。 A confocal microscope apparatus that focuses light on an observation surface of an observation sample and performs two-dimensional scanning, and acquires a confocal image while moving a focusing position in the optical axis direction of the light,
A stage on which the observation sample is placed;
At least one objective lens disposed on the optical axis and focusing the light onto the observation surface at a predetermined magnification;
Moving means for changing the distance between the stage and the objective lens at a predetermined interval in order to focus the light on the desired observation surface of the observation sample;
Measurement condition setting means for setting the predetermined interval according to the distance;
Drive control means for drivingly controlling the moving means so as to change the distance at the predetermined interval set by the measurement condition setting means;
Light detection means for detecting reflected light from the observation surface;
A two-dimensional image that generates a two-dimensional image composed of a plurality of pixels based on a detection signal detected by the light detection means by two-dimensionally scanning the light on the observation surface at each distance changed at the predetermined interval. Generating means;
3D image generation means for generating a 3D image using the plurality of 2D images generated by the 2D image generation means;
In the observation sample, a measurement instruction point specifying means for specifying at least one measurement instruction point;
Focusing distance measuring means for measuring the distance when the light is focused on each of the measurement instruction points as at least one focusing distance;
I have a,
The measurement condition setting means includes
At least confocal microscope and sets the predetermined distance in response to one of said focusing distance. 前記測定条件設定手段は、
前記距離の上限および下限と、前記距離の前記上限から下限までの所定距離範囲内において前記距離を変化させる第１の間隔と、前記第１の間隔より大きい第２の間隔とを少なくとも１組設定し、
前記駆動制御手段は、
前記所定距離範囲内では前記第１の間隔で前記距離を変化させ、前記所定距離範囲外では前記第２の間隔で前記距離を変化させるように前記移動手段を駆動制御することを特徴とする請求項８に記載の共焦点顕微鏡装置。 The measurement condition setting means includes
At least one set of an upper limit and a lower limit of the distance , a first interval for changing the distance within a predetermined distance range from the upper limit to the lower limit of the distance, and a second interval larger than the first interval is set. And
The drive control means includes
The driving means is controlled to change the distance at the first interval within the predetermined distance range and to change the distance at the second interval outside the predetermined distance range. Item 9. The confocal microscope apparatus according to Item 8 . 前記対物レンズの倍率に応じた第１のレンズ依存間隔と第２のレンズ依存間隔とを保持する測定間隔記憶手段と、
前記光軸上に配置された前記対物レンズの倍率を検出し、前記測定間隔記憶部から前記対物レンズの倍率に応じた前記第１のレンズ依存間隔と前記第２のレンズ依存間隔とを取得する測定間隔取得手段と、
をさらに有し、
前記測定条件設定手段は、
前記測定間隔取得手段が取得した前記第１のレンズ依存間隔を前記第１の間隔として設定し、前記第２のレンズ依存間隔を前記第２の間隔として設定することを特徴とする請求項８または請求項９に記載の共焦点顕微鏡装置。 A measurement interval storage means for holding a first lens dependent interval and a second lens dependent interval according to the magnification of the objective lens;
The magnification of the objective lens arranged on the optical axis is detected, and the first lens dependent interval and the second lens dependent interval corresponding to the magnification of the objective lens are acquired from the measurement interval storage unit. A measurement interval acquisition means;
Further comprising
The measurement condition setting means includes
Wherein setting the measuring interval obtaining unit obtains the first lens dependent intervals as said first distance, claim 8 wherein the second lens depends interval and sets as the second interval or The confocal microscope apparatus according to claim 9 . 前記観察面を表示する観察面表示手段と、
前記観察面表示手段において、前記観察面上の少なくとも１点を特定する測定指示点特定手段と、
をさらに有し、
前記測定指示点指定手段は、前記測定指示点特定手段により特定された前記点を測定指示点として指定することを特徴とする請求項８から請求項１０のいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡装置。 Observation surface display means for displaying the observation surface;
In the observation surface display means, a measurement instruction point specifying means for specifying at least one point on the observation surface;
Further comprising
The confocal microscope according to any one of claims 8 to 10 , wherein the measurement instruction point designating unit designates the point specified by the measurement instruction point specifying unit as a measurement instruction point. apparatus. 前記測定指示点を記憶する測定指示点記憶手段、
をさらに備えることを特徴とする請求項８から請求項１１に記載の共焦点顕微鏡装置。 A measurement instruction point storage means for storing the measurement instruction point;
Confocal microscopy apparatus as claimed in claim 11 claim 8, further comprising a. 前記合焦距離を記憶する合焦距離記憶手段、
をさらに備えることを特徴とする請求項８から請求項１２のいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡装置。 A focusing distance storage means for storing the focusing distance;
The confocal microscope apparatus according to any one of claims 8 to 12 , further comprising: 前記合焦距離を含む前記距離の範囲であって、合焦状態である範囲を合焦範囲として検出する合焦範囲検出手段、
をさらに有し、
前記測定条件設定手段は、
前記合焦範囲の最大距離に所定距離を加えた距離を前記上限として設定し、
前記合焦範囲の最大距離から所定距離を減じた距離を前記下限として設定することを特徴とする請求項９に記載の共焦点顕微鏡装置。 A range of the distance including the in-focus distance, and a focus range detecting unit that detects a range in focus as a focus range;
Further comprising
The measurement condition setting means includes
A distance obtained by adding a predetermined distance to the maximum distance of the focusing range is set as the upper limit,
The confocal microscope apparatus according to claim 9 , wherein a distance obtained by subtracting a predetermined distance from a maximum distance of the focusing range is set as the lower limit. 前記三次元画像生成手段が前記距離の上限から下限までの所定距離範囲であって前記三次元画像を生成可能な最低数の前記ニ次元画像を得るために必要な最低の前記所定距離範囲を最低距離範囲として記憶する最低距離範囲記憶手段、
をさらに有し、
前記測定条件設定手段は、
設定された前記所定距離範囲が前記最低距離範囲記憶手段に記憶された前記最低距離範囲より小さい場合には、前記所定距離範囲を前記最低距離範囲に一致させるように、前記上限および前記下限を設定変更することを特徴とする請求項８から請求項１４のいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡装置。 From the predetermined distance range minimum required to obtain the two-dimensional image of a predetermined distance range the minimum possible number of generating the three-dimensional image A from the upper limit of the three-dimensional image generating unit said distance to the lower limit Minimum distance range storage means for storing as a distance range;
Further comprising
The measurement condition setting means includes
If the set predetermined distance range is smaller than the minimum distance range stored in the minimum distance range storage means, the upper limit and the lower limit are set so that the predetermined distance range matches the minimum distance range. The confocal microscope apparatus according to any one of claims 8 to 14 , wherein the confocal microscope apparatus is changed. 前記測定条件設定手段は、The measurement condition setting means includes
各々が前記上限、前記下限、前記第１の間隔、および前記第２の間隔を含む複数の組み合わせが設定され、前記複数の組み合わせのうちの第１の組み合わせに含まれる前記上限から前記下限までの第１の所定距離範囲が、他の組み合わせに含まれる前記上限から前記下限までの他の所定距離範囲と少なくとも一部で重なっている場合、A plurality of combinations each including the upper limit, the lower limit, the first interval, and the second interval are set, and from the upper limit to the lower limit included in the first combination of the plurality of combinations When the first predetermined distance range overlaps at least partly with another predetermined distance range from the upper limit to the lower limit included in another combination,
設定した測定範囲内において前記移動手段が同じ間隔で前記距離を変化させるように、前記第１の所定距離範囲と前記他の所定距離範囲を１つの前記測定範囲として設定することを特徴とする請求項９に記載の共焦点顕微鏡装置。The first predetermined distance range and the other predetermined distance range are set as one measurement range so that the moving means changes the distance at the same interval within the set measurement range. Item 10. The confocal microscope apparatus according to Item 9. 前記測定条件設定手段は、The measurement condition setting means includes
各々が前記上限、前記下限、前記第１の間隔、および前記第２の間隔を含む複数の組み合わせが設定され、前記複数の組み合わせのうちの第１の組み合わせに含まれる前記上限から前記下限までの第１の所定距離範囲が、他の組み合わせに含まれる前記上限から前記下限までの他の所定距離範囲と離れている場合であって、前記第１の所定距離範囲と前記他の所定距離範囲との間の距離が、前記ステージと前記対物レンズとの前記距離を変化させる前記間隔を、第１の前記所定距離範囲内と他の前記所定距離範囲内とで変化させる必要がないと判断される距離である場合、A plurality of combinations each including the upper limit, the lower limit, the first interval, and the second interval are set, and from the upper limit to the lower limit included in the first combination of the plurality of combinations The first predetermined distance range is separated from other predetermined distance ranges from the upper limit to the lower limit included in other combinations, and the first predetermined distance range and the other predetermined distance range are The distance between the stage and the objective lens is determined not to need to be changed between the first predetermined distance range and another predetermined distance range. If distance
設定した測定範囲内において前記移動手段が同じ間隔で前記ステージと前記対物レンズとの前記距離を変化させるように、前記第１の所定距離範囲と前記他の所定距離範囲を１つの前記測定範囲として設定することを特徴とする請求項９記載の共焦点顕微鏡装置。The first predetermined distance range and the other predetermined distance range are defined as one measurement range so that the moving means changes the distance between the stage and the objective lens at the same interval within the set measurement range. The confocal microscope apparatus according to claim 9, wherein the confocal microscope apparatus is set. 観察試料の観察面に光を集束して二次元走査するとともに、前記光の光軸方向に集束位置を移動しながら共焦点画像を取得する共焦点顕微鏡装置であって、
前記観察試料を載置するステージと、
前記光軸上に配置され、所定の倍率で前記光を前記観察面に集束する少なくとも１つの対物レンズと、
前記観察試料の所望の前記観察面に前記光を集束させるために前記ステージと前記対物レンズとの距離を所定間隔で変化させる移動手段と、
前記距離に応じて前記所定間隔を設定する測定条件設定手段と、
前記測定条件設定手段が設定した前記所定間隔で前記距離を変化させるように前記移動手段を駆動制御する駆動制御手段と、
前記観察面からの反射光を検出する光検出手段と、
前記所定間隔で変化させた前記距離毎に前記観察面上に前記光を二次元走査することにより前記光検出手段が検出した検出信号に基づき複数の画素よりなる二次元画像を生成する二次元画像生成手段と、
前記二次元画像生成手段で生成された複数の前記二次元画像を用いて三次元画像を生成する三次元画像生成手段と、
前記ニ次元画像を構成する各前記画素の輝度を所定の輝度しきい値と比較し、前記輝度しきい値以下の画素数を輝度しきい値以下画素数として計数する画素数計数手段、
を有し、
前記測定条件設定手段は、
前記輝度しきい値以下画素数に応じて、前記距離を変化させる所定間隔を設定することを特徴とする共焦点顕微鏡装置。 A confocal microscope apparatus that focuses light on an observation surface of an observation sample and performs two-dimensional scanning, and acquires a confocal image while moving a focusing position in the optical axis direction of the light,
A stage on which the observation sample is placed;
At least one objective lens disposed on the optical axis and focusing the light onto the observation surface at a predetermined magnification;
Moving means for changing the distance between the stage and the objective lens at a predetermined interval in order to focus the light on the desired observation surface of the observation sample;
Measurement condition setting means for setting the predetermined interval according to the distance;
Drive control means for drivingly controlling the moving means so as to change the distance at the predetermined interval set by the measurement condition setting means;
Light detection means for detecting reflected light from the observation surface;
A two-dimensional image that generates a two-dimensional image composed of a plurality of pixels based on a detection signal detected by the light detection means by two-dimensionally scanning the light on the observation surface at each distance changed at the predetermined interval. Generating means;
3D image generation means for generating a 3D image using the plurality of 2D images generated by the 2D image generation means;
A pixel number counting means for comparing the luminance of each of the pixels constituting the two- dimensional image with a predetermined luminance threshold and counting the number of pixels equal to or lower than the luminance threshold as the number of pixels equal to or lower than the luminance threshold;
I have a,
The measurement condition setting means includes
The brightness threshold below according to the number of pixels, a confocal microscope apparatus you and sets a predetermined interval for changing the distance. 前記輝度しきい値以下画素数と所定の画素数しきい値とを比較する画素数比較手段、
をさらに有し、
前記測定条件設定手段は、
前記画素数比較手段の比較結果に応じて、前記距離を変化させる所定間隔を設定することを特徴とする請求項１８に記載の共焦点顕微鏡装置。 A pixel number comparison means for comparing the number of pixels below the luminance threshold with a predetermined pixel number threshold;
Further comprising
The measurement condition setting means includes
The confocal microscope apparatus according to claim 18 , wherein a predetermined interval for changing the distance is set according to a comparison result of the pixel number comparison unit. 前記測定条件設定手段は、
前記輝度しきい値以下画素数が前記画素数しきい値以下の場合には、前記距離を変化させる所定間隔を第１の間隔に設定し、
前記輝度しきい値以下画素数が前記画素数しきい値より大きい場合には、前記所定間隔を第１の間隔より大きい第２の間隔に設定することを特徴とする請求項１９に記載の共焦点顕微鏡装置。 The measurement condition setting means includes
When the number of pixels equal to or less than the luminance threshold is equal to or less than the threshold number of pixels, a predetermined interval for changing the distance is set as a first interval,
The common interval according to claim 19 , wherein when the number of pixels equal to or less than the luminance threshold is larger than the pixel number threshold, the predetermined interval is set to a second interval larger than the first interval. Focus microscope device. 前記二次元走査は、変更可能な所定の間隔で行うことを特徴とする請求項１から請求項２０のいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡装置。 The confocal microscope apparatus according to any one of claims 1 to 20 , wherein the two-dimensional scanning is performed at a predetermined changeable interval.
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