JP5569894B2 - 記憶能力の減退に対する被検化合物のスクリーニング方法 - Google Patents
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本実施形態のスクリーニング方法は、記憶能力の減退に対する被検化合物のスクリーニング方法であって、蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体となる第1の蛍光物質で標識されたカルモジュリンと、蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー受容体となる第2の蛍光物質で標識されたカルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼIVと、前記被検化合物と、を溶液中で接触させ、前記カルモジュリンがカルシウムイオンと結合した時に形成されるカルシウムイオン/カルモジュリン複合体と、前記カルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼIVとが相互作用した時の、前記第1の蛍光物質と、前記第2の蛍光物質との接近に基づく、前記第1の蛍光物質と前記第2の蛍光物質の蛍光共鳴エネルギー移動による蛍光値を測定し、測定された蛍光値と、前記被検化合物の非存在下で同様に測定した蛍光値とを比較するものである。
Energy Transfer:FRET)を起こす組み合わせである限り、その種類を問わない。
本実施形態のスクリーニング方法は、記憶能力の減退に対する被検化合物のスクリーニング方法であって、蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体となる第1の蛍光物質および蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー受容体となる第2の蛍光物質とで標識されたカルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼIVと、カルモジュリンと、前記被検化合物と、を溶液中で接触させ、前記カルモジュリンがカルシウムイオンと結合した時に形成されるカルシウムイオン/カルモジュリン複合体と、前記カルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼIVとが相互作用した時の、前記カルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼIVの立体構造が変化することに基づく、前記第1の蛍光物質と前記第2の蛍光物質の蛍光共鳴エネルギー移動による蛍光値を測定し、測定された蛍光値と、前記被検化合物の非存在下で同様に測定した蛍光値とを比較するものである。また、前記被検化合物存在下で、カルシウムイオン/カルモジュリンとは非依存的に、前記カルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼIVの立体構造が変化することに基づく、前記第1の蛍光物質と前記第2の蛍光物質の蛍光共鳴エネルギー移動による蛍光値を測定してもよい。
Energy Transfer:FRET)を起こす組み合わせである限り、その種類を問わない。
protein)、GFP(green fluorescent protein)、RFP(red fluorescent protein)、BFP(Blue fluorescent protein)、フルオロセイン(FITC)、ローダミン、Cy5、Cy5.5、テキサスレッド、アクリジンオレンジ、サイバーグリーン、Cy3等、ならびにこれらの誘導体を含む公知のあらゆる蛍光物質が挙げられる。
ヒト由来のCaMKIV cDNAのオープンリーディングフレームの5’末端側にTCC GGA GGC GGC配列を付加し、3’末端側にAGATCT配列を導入し、pEYFP-C1 Vector(クロンテック社)のBspEIとBglIIの制限酵素サイトに導入して、YFP-CaMKIV発現ベクターを構築した(図13)。
100μlのFBS free DMEM (Nissui社製, 05915)にYFP-αCaMKIV-CFP、あるいはYFP-CaMKIVとCFP-CaMの発現Vectorをそれぞれ2μgとPLUS(商標)Reagent (invitrogen社製, 11514-015)を2μl加え、15分間室温で放置した。その後Lipofectamine(商標)Reagent (invitrogen社製, 18324-012)を2μl加えた100μlのFBS free DMEMを加え、更に15分間室温で放置した後にFBS free DMEMを800μl加え、全量を5×105個のHela細胞を播種したDishに添加した。CO2インキュベーター (37℃, 5% CO2) で2時間培養した後に10% FBS contain DMEMを1ml加え、CO2インキュベーター (37℃, 5% CO2) で48時間培養した後にImagingを行った。
Transfectionから48時間後に培地をHBSS buffer (5mM KCl,0.4mM KH2PO4,137mM NaCl,4mM NaHCO3,0.3mM Na2HPO4,pH 7.4) 1.95mlに交換し、CO2インキュベーター (37℃, 5% CO2) で30分培養後にImagingを行った。細胞の観察には倒立顕微鏡IX70 (OLYMPUS社製) を用いた。YFPの励起用フィルターとして500AF25 (OMEGA OPTICAL社製) 、蛍光検出用のフィルターとして535DF25 (OMEGA OPTICAL社製) を用いた。また、CFPの励起用フィルターとして440DF21 (OMEGA OPTICAL社製) 、蛍光検出用のフィルターとして480DF30(OMEGA OPTICAL社製)を用いた。
(1)概要の説明
図2は、蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体となる第1の蛍光物質としてCFPを使用し、蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー受容体となる第2の蛍光物質としてYFPを使用した場合のスクリーニング方法の概要を説明した図である。
図3は、カルモジュリンとCaMKIVとの結合を指標にして、細胞内あるいは試験管内においてスクリーニングを実施するための蛍光物質を融合したタンパク質群の構造を示す図である。図3(A)はCFPとカルモジュリン(CaM)をコードする遺伝子、図3(B)はYFPとCaMKIVをコードする遺伝子を示す。
図4は、上記(2)で得られたタンパク質を用いてCaMKIVの活性を検出する原理を説明するための図である。CFP-CaMとYFP-CaMKIVが相互作用していない状態では、CFPを励起する波長の光を照射するとCFPからの発光波長が検出されるが、両者が相互作用した状態では、CFPを励起する波長の光を照射するとCFPからの発光がYFPに吸収される蛍光共鳴エネルギー移動が起こり、YFPからの発光波長が検出されるようになる。
(1)蛍光物質の標識
図8は、発現ベクターを細胞に導入して融合タンパク質群発現細胞を得るために使用する融合タンパク質をコードする遺伝子を示す図であり、YFP、CaMKIVとCFPをコードする遺伝子を示す。
図9は、上記(1)で得られたタンパク質を用いてCaMKIVの活性を検出する原理を説明するための図である。YFP-CaMKIV-CFPが構造変化していない状態では、CFPとYFPとの距離が近いため、CFPを励起する波長の光を照射するとCFPからの発光がYFPに吸収される蛍光共鳴エネルギー移動が起こり、YFPからの発光波長が検出される。一方、CaMKIVが活性化型となり、YFP-CaMKIV-CFPの構造変化が起こると、CFPとYFPの間の距離が長くなるため、CFPを励起する波長の光を照射するとCFPからの発光波長が強く検出されるようになる。
Claims (2)
- 蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体となる第1の蛍光物質で標識されたカルモジュリンと、
蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー受容体となる第2の蛍光物質で標識されたカルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼIVと、
前記被検化合物と、を溶液中で接触させ、
前記カルモジュリンがカルシウムイオンと結合した時に形成されるカルシウムイオン/カルモジュリン複合体と、前記カルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼIVとが相互作用した時の、前記第1の蛍光物質と、前記第2の蛍光物質との接近に基づく、前記第1の蛍光物質と前記第2の蛍光物質の蛍光共鳴エネルギー移動による蛍光値を測定し、
測定された蛍光値と、前記被検化合物の非存在下で同様に測定した蛍光値とを比較することを特徴とする、
記憶能力の減退に対する被検化合物のスクリーニング方法であって、
前記蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体となる第1の蛍光物質で標識されたカルモジュリンのアミノ酸配列が、配列番号:1において、N末端側からアミノ酸配列番号が1〜239番がCFP、240〜241が連結部位、242〜390番がカルモジュリンであり、
前記蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー受容体となる第2の蛍光物質で標識されたカルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼIVのアミノ酸配列が、配列番号:2において、N末端側からアミノ酸配列番号が1〜239番がYFP、240〜243番が連結部位、244〜716番がカルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼIVである、
記憶能力の減退に対する被検化合物のスクリーニング方法。 - 蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体となる第1の蛍光物質および蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー受容体となる第2の蛍光物質とで標識されたカルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼIVと、
カルモジュリンと、
前記被検化合物と、を溶液中で接触させ、
前記カルモジュリンがカルシウムイオンと結合した時に形成されるカルシウムイオン/カルモジュリン複合体と、前記カルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼIVとが相互作用した時の、前記カルモジュリン依存性キナーゼIVの立体構造が変化することに基づく、前記第1の蛍光物質と前記第2の蛍光物質の蛍光共鳴エネルギー移動による蛍光値を測定し、
測定された蛍光値と、前記被検化合物の非存在下で同様に測定した蛍光値とを比較することを特徴とする、
記憶能力の減退に対する被検化合物のスクリーニング方法であって、
前記蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体となる第1の蛍光物質および蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー受容体となる第2の蛍光物質とで標識されたカルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼIVのアミノ酸配列が、配列番号:3において、N末端側からアミノ酸配列番号が1〜239番がYFP、240〜243番が連結部位、244〜716番がカルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼIV、717〜718番が連結部位、719〜963番がCFPである、
記憶能力の減退に対する被検化合物のスクリーニング方法。
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