JP5568968B2

JP5568968B2 - Lysing method of acid-fast bacterium

Info

Publication number: JP5568968B2
Application number: JP2009272061A
Authority: JP
Inventors: 圭一氏内
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 2009-11-30
Filing date: 2009-11-30
Publication date: 2014-08-13
Anticipated expiration: 2029-11-30
Also published as: JP2011110025A

Description

本発明は、結核菌に代表される抗酸菌を効率良く、しかも簡便な操作で安全かつ安価に溶菌する方法に関する。 The present invention relates to a method for lysing acid-fast bacteria typified by Mycobacterium tuberculosis efficiently and safely and inexpensively with a simple operation.

結核は、日本でも復活の兆しを見せている細菌性疾患であり、その診断方法の改良は、極めて重要である。結核の診断方法としては、近年、数週間もの時間のかかる培養検査に代わって、短時間で高精度の結果が得られる遺伝子検査が行われるようになっている。 Tuberculosis is a bacterial disease that is showing signs of rebirth in Japan, and improvement of its diagnostic method is extremely important. As a method for diagnosing tuberculosis, in recent years, a genetic test that can obtain highly accurate results in a short time has been carried out instead of a culture test that takes several weeks.

結核の遺伝子検査は、結核菌の遺伝子に特異的なプライマーを使用したＰＣＲにより、喀痰試料中の結核菌の存在を同定することによって行われる。遺伝子検査を行うには、前処理として、試料中の検査対象の菌細胞を溶菌（破壊）し、次いでその核酸を抽出することが必要である。 Tuberculosis genetic testing is performed by identifying the presence of M. tuberculosis in sputum samples by PCR using primers specific for the M. tuberculosis gene. In order to perform a genetic test, as a pretreatment, it is necessary to lyse (destroy) the bacterial cells to be tested in the sample and then extract the nucleic acid.

しかし、結核菌に代表される抗酸菌は、ミコール酸の脂質層を含む強固な細胞壁を持つため、大腸菌などの一般的な細菌と比較して溶菌が困難である。 However, acid-fast bacteria typified by Mycobacterium tuberculosis have a strong cell wall containing a lipid layer of mycolic acid, and are therefore difficult to lyse compared to general bacteria such as Escherichia coli.

抗酸菌の一般的な溶菌方法としては、特許文献１に記載のような超音波を使用した物理的細胞破壊方法が挙げられる。この方法は、抗酸菌を効率良く溶菌することができるが、超音波照射装置という高価な装置を必要とすると共に、超音波照射の際に試料が周囲に飛び散り、試料に含まれる菌により周囲環境が汚染される問題がある。また、超音波照射は、強度の制御が困難であり、菌細胞を破壊するのみならず、細胞中のゲノムＤＮＡまで切断してしまう場合もある。 As a general lysis method for acid-fast bacteria, there is a physical cell destruction method using ultrasonic waves as described in Patent Document 1. Although this method can efficiently lyse mycobacteria, it requires an expensive device called an ultrasonic irradiation device, and the sample scatters around when it is irradiated with ultrasonic waves. There is a problem of environmental pollution. Moreover, the intensity | strength control is difficult for ultrasonic irradiation, and it may not only destroy a fungal cell but may cut | disconnect to the genomic DNA in a cell.

一方、化学的細胞破壊による抗酸菌の溶菌方法としては、フェノールを溶菌剤として使用して菌細胞を破壊する方法が挙げられる。この方法も、抗酸菌を効率良く溶菌することができるが、操作が煩雑であり、専門的な知識を必要とするため、臨床の場にそぐわないという問題がある。また、この方法は、フェノールという毒物を使用するため、作業者の安全性に欠けるという問題もある。 On the other hand, as a method for lysing acid-fast bacteria by chemical cell destruction, a method of destroying bacterial cells using phenol as a lysing agent can be mentioned. Although this method can also efficiently lyse acid-fast bacteria, it has a problem that it is not suitable for clinical use because it is complicated and requires specialized knowledge. Moreover, since this method uses a poison called phenol, there is a problem that the safety of workers is lacking.

また、特許文献２には、溶菌剤など溶菌のための薬剤を用いることなしに、６０〜１００℃に加熱することのみによる抗酸菌の溶菌方法が開示されている。この方法では、抗酸菌の溶菌が可能であるものの、その溶菌効率は低く、実用的とは言えない。また、実施例では９４℃程度の高温加熱が必要であるとされており、このような高温で加熱すると、試料溶液が強く蒸発し、蒸気に混入した菌により周囲環境が汚染される問題もある。 Patent Document 2 discloses a method for lysis of acid-fast bacteria by heating to 60 to 100 ° C. without using a lysis agent such as a lysis agent. Although this method can lyse mycobacteria, its lysis efficiency is low and is not practical. Further, in the examples, it is said that heating at a high temperature of about 94 ° C. is necessary. When heated at such a high temperature, there is a problem that the sample solution evaporates strongly and the surrounding environment is contaminated by bacteria mixed in the vapor. .

このように、従来公知の抗酸菌の溶菌方法は、費用がかかったり、操作が煩雑であったり、安全性に欠けたり、溶菌効率が低かったりという問題を有し、いずれも満足できるものではなかった。 As described above, the conventionally known methods for lysing acid-fast bacteria are problematic in that they are expensive, complicated to operate, lack of safety, and have low lysis efficiency. There wasn't.

ＷＯ２００７／０９４５０６WO 2007/094506 特開平６−３１９５２７JP-A-6-319527

本発明は、かかる従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、その目的は、強固な細胞壁のために溶菌しにくい抗酸菌を効率良く、しかも簡便な操作で低コストかつ安全に溶菌することができる方法を提供することにある。 The present invention was devised in view of the current state of the prior art, and its purpose is to efficiently lyse acid-fast bacteria that are difficult to lyse due to a strong cell wall, and at low cost and safely by a simple operation. It is to provide a method that can.

本発明者は、上記目的を達成するために、まず、抗酸菌の溶菌のための溶菌剤として、従来使用されていないカオトロピック塩の効果を検討してみた。カオトロピック塩は、通常の細胞の溶菌には効果があるが、強固な細胞壁を持つ抗酸菌に対してはほとんど効果がなかった。そこで、本発明者は、カオトロピック塩の細胞溶菌効果を増大させるために適切な処理についてさらに検討した結果、特定の温度まで加熱したカオトロピック塩の溶液を使用すると、強固な細胞壁を持つ抗酸菌であっても容易に溶菌されることを見出した。 In order to achieve the above object, the present inventor first examined the effect of a chaotropic salt that has not been conventionally used as a lysis agent for lysis of acid-fast bacteria. Chaotropic salts are effective for lysis of normal cells, but have little effect on acid-fast bacteria having a strong cell wall. Therefore, the present inventor further examined a suitable treatment for increasing the cell lysis effect of chaotropic salt. As a result, when a solution of chaotropic salt heated to a specific temperature is used, the acid-fast bacteria having a strong cell wall can be obtained. Even if it exists, it discovered that it was easily lysed.

本発明は、上述の知見に基づいてなされたものであり、具体的には、４０〜９０℃の温度のカオトロピック塩の溶液によって抗酸菌を溶菌すること、及び前記カオトロピック塩の溶液のｐＨが４．５〜６．５であることを特徴とする抗酸菌の溶菌方法である。 The present invention has been made on the basis of the above-mentioned findings. Specifically, the acid-fast bacterium is lysed by a chaotropic salt solution at a temperature of 40 to 90 ° C. , and the pH of the chaotropic salt solution is It is a method of lysing acid-fast bacteria characterized by being 4.5 to 6.5 .

本発明の好ましい態様によれば、溶液中のカオトロピック塩の濃度は２〜６Ｍ（ｍｏｌ／Ｌ）であり、カオトロピック塩の溶液は０．１〜２．０Ｍ（ｍｏｌ／Ｌ）の濃度の酢酸塩をさらに含む。 According to a preferred embodiment of the present invention, the concentration of the chaotropic salt in the solution is 2~6M (mol / L), mosquito lyotropic salt solution of a concentration of 0.1~2.0M (mol / L) Further includes acetate.

本発明の方法は、抗酸菌の溶菌のために特定の温度に加熱されたカオトロピック塩の溶液を使用するので、従来溶菌が困難であった抗酸菌を効率良く溶菌することができる。また、本発明の方法は、特定の温度のカオトロピック塩の溶液で抗酸菌を処理するだけで行われるので、操作が簡便でコストがかからず、安全である。 Since the method of the present invention uses a solution of a chaotropic salt heated to a specific temperature for lysis of acid-fast bacteria, it can efficiently lyse acid-fast bacteria that have been difficult to lyse conventionally. Moreover, since the method of the present invention is carried out only by treating the acid-fast bacterium with a solution of a chaotropic salt at a specific temperature, the operation is simple, inexpensive and safe.

以下、本発明の抗酸菌の溶菌方法を詳細に説明する。
本発明の方法は、特定の温度まで高められたカオトロピック塩の溶液で抗酸菌を溶菌することを特徴とするものであり、取扱いが安全で操作が簡便であることを特徴とする。 Hereinafter, the method for lysing acid-fast bacteria of the present invention will be described in detail.
The method of the present invention is characterized in that the acid-fast bacterium is lysed with a solution of a chaotropic salt raised to a specific temperature, and is characterized by safe handling and easy operation.

本発明の方法の溶菌対象となる抗酸菌としては、例えば、鳥型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｖｉｕｍ）、エム・イントラセルラレエ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒａｅ）、エム・ゴルドネエ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、ヒト型結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、エム・カンサシイ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、エム・フォルツイツム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、エム・ケロネエ（Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ）、ウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、エム・スクロフラセウム（Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、パラ結核菌（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、チモテ菌（Ｍ．ｐｈｌｅｉ）、エム・マリヌム（Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ）、エム・シミエー（Ｍ．ｓｉｍｉａｅ）、エム・スクロフラセウム（Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、エム・スズルガイ（Ｍ．ｓｚｕｌｇａｉ）、らい菌（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）、エム・キセノピ（Ｍ．ｘｅｎｏｐｉ）、エム・ウルセランス（Ｍ．ｕｌｃｅｒａｎｓ）、鼠らい菌（Ｍ．ｌｅｐｒａｅｍｕｒｉｕｍ）、エム・フラベセンス（Ｍ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、エム・テレエ（Ｍ．ｔｅｒｒａｅ）、エム・ノンクロモジェニクム（Ｍ．ｎｏｎｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｕｍ）、エム・マルメンス（Ｍ．ｍａｌｍｏｅｎｓｅ）、エム・アシアティクム（Ｍ．ａｓｉａｔｉｃｕｍ）、エム・ヴァケエ（Ｍ．ｖａｃｃａｅ）、エム・ガストリ（Ｍ．ｇａｓｔｒｉ）、エム・トリビアル（Ｍ．ｔｒｉｖｉａｌｅ）、エム・ヘモフィラム（Ｍ．ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｍ）、エム・アフリカヌム（Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、エム・サーモレジスタブル（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｒｅｓｉｓｔａｂｌｅ）及びスメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）を挙げることができる。 Examples of mycobacteria to be lysed by the method of the present invention include Mycobacterium avium, M. intracellularellae, M. gordonae, and M. tuberculosis. (M. tuberculosis), M. kansasii, M. fortuitum, M. chelonae, M. bovis, M. scroflace. ), M. paratuberculosis, M. phlei, M. marinum, M. simiae, M. scroflacem (M. scro) ulaceum, M. szulgai, M. leprae, M. xenopi, M. ulcerans, M. lepraemurium, M. flavesens (M. flavescens), M. terrae, M. nonchromogenicum, M. malmoense, M. asiaticum, M. vaquee (M) Vaccae), M. gastri, M. triviale, M. haemophilum, M. africanum, M. Mention may be made of M. thermoresistable and M. smegmatis.

本発明の方法で使用されるカオトロピック塩は、タンパク質などの分子構造を不安定化する性質を持つ化学物質であり、生化学の分野において核酸抽出の際に細胞を溶解させる溶菌剤として使用される物質である。カオトロピック塩としては、従来公知のいかなるものも使用することができ、例えば、グアニジン塩、イソチアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、尿素、臭化ナトリウム、臭化カリウム、臭化カルシウム、臭化アンモニウム、過塩素酸ナトリウム、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、アンモニウムイソチオシアネート、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウムであることができる。これらの中でも、細胞溶解性と核酸回収効率の点からグアニジン塩が好ましい。グアニジン塩としては、塩酸グアニジン、グアニジンチオシアン酸塩（チオシアン酸グアニジン）、グアニジン硫酸塩、イソチオシアン酸グアニジンが挙げられ、これらの中でも、溶菌効率の点から塩酸グアニジンまたはグアニジンチオシアン酸塩が好ましい。これらの塩は、単独でも、複数組合わせて用いてもよい。 The chaotropic salt used in the method of the present invention is a chemical substance that has the property of destabilizing molecular structures such as proteins, and is used as a lysing agent for lysing cells during nucleic acid extraction in the field of biochemistry. It is a substance. Any conventionally known chaotropic salt can be used, such as guanidine salt, sodium isothiocyanate, sodium iodide, potassium iodide, urea, sodium bromide, potassium bromide, calcium bromide, bromide. It can be ammonium, sodium perchlorate, sodium thiocyanate, potassium thiocyanate, ammonium isothiocyanate, sodium chloride, potassium chloride, ammonium chloride. Among these, a guanidine salt is preferable in terms of cell solubility and nucleic acid recovery efficiency. Examples of the guanidine salt include guanidine hydrochloride, guanidine thiocyanate (guanidine thiocyanate), guanidine sulfate, and guanidine isothiocyanate. Among these, guanidine hydrochloride or guanidine thiocyanate is preferable from the viewpoint of lysis efficiency. These salts may be used alone or in combination.

カオトロピック塩は溶液状態で使用され、カオトロピック塩を水や緩衝液などの適当な溶媒に溶解することによって容易に溶液に調製することができる。 The chaotropic salt is used in a solution state, and can be easily prepared into a solution by dissolving the chaotropic salt in an appropriate solvent such as water or a buffer solution.

溶液中のカオトロピック塩の濃度は、２〜６Ｍ（ｍｏｌ／Ｌ）であることが好ましく、さらに好ましくは３〜５Ｍ（ｍｏｌ／Ｌ）である。溶液中のカオトロピック塩の濃度が上記下限未満では、抗酸菌細胞壁の溶解効率が低下するおそれがあり、また、上記上限を超えると、カオトロピック塩が析出するおそれがある。 The concentration of the chaotropic salt in the solution is preferably 2 to 6 M (mol / L), more preferably 3 to 5 M (mol / L). If the concentration of the chaotropic salt in the solution is less than the above lower limit, the dissolution efficiency of the acid-fast bacterium cell wall may be reduced, and if it exceeds the upper limit, the chaotropic salt may be precipitated.

カオトロピック塩の溶液のｐＨは、４．５〜６．５であることが好ましく、さらに好ましくは５．０〜６．０である。カオトロピック塩の溶液のｐＨが上記下限未満になるかまたは上記上限を超えると、後工程である核酸精製（分離抽出）時の核酸吸着効率が低下するおそれがある。 The pH of the chaotropic salt solution is preferably 4.5 to 6.5, more preferably 5.0 to 6.0. If the pH of the chaotropic salt solution is less than the above lower limit or exceeds the above upper limit, the nucleic acid adsorption efficiency during the subsequent nucleic acid purification (separation extraction) may be reduced.

カオトロピック塩の溶液のｐＨを上述の範囲に維持するためには、溶液に適当な緩衝剤を添加することが好ましい。かかる緩衝剤としては、例えば、酢酸塩を挙げることができる。酢酸塩の中でも、酢酸カリウム、酢酸ナトリウムなどの一価の金属の酢酸塩が特に効果的である。これらの酢酸塩の溶液中の濃度は、０．１〜２．０Ｍ（ｍｏｌ／Ｌ）であることが緩衝効果の点で好ましい。 In order to maintain the pH of the chaotropic salt solution in the above-mentioned range, it is preferable to add an appropriate buffer to the solution. Examples of such a buffer include acetate. Among the acetates, monovalent metal acetates such as potassium acetate and sodium acetate are particularly effective. The concentration of these acetates in the solution is preferably 0.1 to 2.0 M (mol / L) from the viewpoint of the buffer effect.

本発明の方法では、カオトロピック塩の溶液をそのまま常温で使用するのではなく、特定の温度に加熱して使用することが重要である。加熱温度は、４０〜９０℃であり、好ましくは５０〜７５℃である。加熱温度が上記下限未満では、カオトロピック塩の溶解効果が得られないおそれがあり、また、上記上限を超えると、液の蒸発が増加しカオトロピック塩の濃度変化が生じるおそれがある。 In the method of the present invention, it is important that the chaotropic salt solution is not used as it is at room temperature but is heated to a specific temperature. The heating temperature is 40 to 90 ° C, preferably 50 to 75 ° C. If the heating temperature is less than the lower limit, the effect of dissolving the chaotropic salt may not be obtained, and if the upper limit is exceeded, evaporation of the liquid may increase and the concentration of the chaotropic salt may change.

加熱方法としては、特に限定されないが、カオトロピック塩の溶液を適当なチューブに入れ、ヒートブロック、ウォーターバス、マイクロウェーブオーブン、エアーバス等の公知の加熱手段で加熱する方法が挙げられる。抗酸菌は、最初からカオトロピック塩の溶液に添加しておいてもよいし、カオトロピック塩の溶液が所定の温度に加熱されてから添加してもよい。遺伝子検査の前処理で使用する通常の液量では、カオトロピック塩の溶液は、ごく短時間で所定温度に加熱されるので、最初から抗酸菌をカオトロピック塩の溶液に添加しておく方が作業が簡略化できる。 Although it does not specifically limit as a heating method, The method of putting the solution of a chaotropic salt in a suitable tube, and heating with well-known heating means, such as a heat block, a water bath, a microwave oven, an air bath, is mentioned. The acid-fast bacterium may be added to the chaotropic salt solution from the beginning, or may be added after the chaotropic salt solution is heated to a predetermined temperature. In the normal volume used for genetic test pretreatment, the solution of chaotropic salt is heated to a predetermined temperature in a very short time, so it is better to add acid-fast bacteria to the solution of chaotropic salt from the beginning. Can be simplified.

抗酸菌の溶菌時間は、１〜１０分間であることが好ましく、さらに好ましくは３〜７分間である。抗酸菌の溶菌時間が上記下限未満では、カオトロピック塩の溶解効果が得られないおそれがあり、また、上記上限を超えると、カオトロピック塩中に存在するゲノムＤＮＡが分解するおそれがある。 The lysis time of the acid-fast bacterium is preferably 1 to 10 minutes, more preferably 3 to 7 minutes. If the lysis time of the acid-fast bacterium is less than the above lower limit, the effect of dissolving the chaotropic salt may not be obtained, and if it exceeds the upper limit, the genomic DNA present in the chaotropic salt may be degraded.

以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.

実施例１
（１）抗酸菌の準備
抗酸菌としては、ウシ型結核菌ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｏｖｉｓＢＣＧ株（以下、ＢＣＧ株と略す）を使用した。ＢＣＧ株を３％小川培地（日水製薬製）中で３５℃で２週間培養した後、抗酸菌培養用の液体培地であるＭｙｃｏＢｒｏｔｈ（極東製薬工業製）に接種し、３７℃で６日間さらに培養した。分散性の高い菌液を得るため、培養後の液体培地を孔径５μｍの親水性フィルターでろ過した後、濁度計でＯＤ６００を測定しながら、マクファーランド比濁法に従ってマクファーランド１の濃度に菌液を調整した。次に、液体培地中に既に遊離している核酸を除去するため、この菌液１．０ｍＬを１．５ｍＬのチューブに加え、遠心分離操作で菌体だけを沈殿させ、上清を取り除いて１．０ｍＬのリン酸緩衝液で菌体を再懸濁させた。 Example 1
(1) Preparation of acid-fast bacterium As the acid-fast bacterium, the Mycobacterium bovis BCG strain (hereinafter abbreviated as BCG strain) was used. The BCG strain was cultured in 3% Ogawa medium (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) at 35 ° C. for 2 weeks, then inoculated into MycoBroth (manufactured by Kyokuto Pharmaceutical Co., Ltd.), a liquid medium for acid-fast bacteria culture, and incubated at 37 ° C. for 6 days Further culture was performed. In order to obtain a highly dispersible bacterial solution, the cultured liquid medium was filtered with a hydrophilic filter having a pore size of 5 μm, and then the concentration of McFarland 1 was measured according to the McFarland turbidimetric method while measuring OD600 with a turbidimeter. The bacterial solution was adjusted. Next, in order to remove nucleic acid that has already been released in the liquid medium, 1.0 mL of this bacterial solution is added to a 1.5 mL tube, and only bacterial cells are precipitated by centrifugation, and the supernatant is removed to remove 1 The cells were resuspended with 0.0 mL of phosphate buffer.

（２）カオトロピック塩の溶液の調製
カオトロピック塩としてのグアニジンチオシアン酸及び緩衝剤としての酢酸カリウムを脱イオン水に溶解させ、緩衝剤を含有するカオトロピック塩の溶液を調製した。溶液中のグアニジンチオシアン酸の濃度は、５Ｍであり、酢酸カリウムの濃度は、０．８Ｍであり、溶液のｐＨは５．５であった。 (2) Preparation of solution of chaotropic salt Guanidine thiocyanic acid as a chaotropic salt and potassium acetate as a buffering agent were dissolved in deionized water to prepare a solution of a chaotropic salt containing a buffering agent. The concentration of guanidine thiocyanic acid in the solution was 5M, the concentration of potassium acetate was 0.8M, and the pH of the solution was 5.5.

（３）抗酸菌の溶菌
（２）で調製したカオトロピック塩の溶液５００μＬに、（１）で準備したマクファーランド１の菌液をリン酸緩衝液で１０００倍に希釈したものを混合した。混合液を１．５ｍＬのスクリュー付蓋のあるチューブに入れ、ヒートブロック上で６０℃で５分間加熱し、抗酸菌を溶菌した。 (3) Lysis of acid-fast bacteria 500 μL of the solution of chaotropic salt prepared in (2) was mixed with a solution of McFarland 1 prepared in (1) diluted 1000-fold with a phosphate buffer. The mixed solution was put into a 1.5 mL tube with a screw cap and heated on a heat block at 60 ° C. for 5 minutes to lyse acid-fast bacteria.

（４）核酸の分離抽出
次に、混合液を室温まで冷却し、溶菌により混合液中に溶出した抗酸菌の核酸を、モノリス構造体を使用して分離抽出した。具体的には、ジーエルサイエンス製のモノリスチップ「ＭｏｎｏＴｉｐＣ１８」のチップ形状と同じ２５０μＬチップ内にモノリス構造体（細孔径３０μｍ、切断面積３．１４平方ｍｍ、厚さ１ｍｍ）を溶着したものをテルモ製の１ｍＬシリンジに装着し、冷却後の混合液を１００μＬ／秒の速度で１０回吸引および吐出し、混合液中の抗酸菌の核酸をモノリスチップ中のモノリス構造体に吸着させた。混合液を完全に出し切った後に、洗浄液５００μＬの入ったチューブにモノリスチップを移動させ、洗浄液を１００μＬ／秒の速度で３回吸引および吐出して洗浄した。この洗浄工程をもう一度繰り返した。最後に溶出液１００μＬの入ったチューブにモノリスチップを移動させ、溶出液を１００μＬ／秒の速度で５回吸引および吐出して、モノリスチップ中のモノリス構造体に吸着した抗酸菌の核酸を溶出した。溶出効率の低下を抑えるため、吸引および吐出の間は、チップ内のモノリス構造体に空気が接触しないように注意した。なお、洗浄液としては、７０％エタノール中の０．８Ｍ酢酸カリウム溶液を使用し、溶出液としては、１０ｍＭ水酸化カリウム水溶液を使用した。 (4) Separation and extraction of nucleic acid Next, the mixed solution was cooled to room temperature, and acid-fast bacterium nucleic acid eluted in the mixed solution by lysis was separated and extracted using a monolith structure. More specifically, a monolith structure (pore diameter 30 μm, cutting area 3.14 square mm, thickness 1 mm) is welded in the same 250 μL chip shape as the monolith chip “Mono Tip C18” manufactured by GL Sciences. It was attached to a Terumo 1 mL syringe, and the mixed solution after cooling was sucked and discharged 10 times at a rate of 100 μL / second, and the acid-fast bacterium nucleic acid in the mixed solution was adsorbed to the monolith structure in the monolith chip. After the mixture was completely discharged, the monolith chip was moved to a tube containing 500 μL of cleaning solution, and the cleaning solution was suctioned and discharged three times at a rate of 100 μL / second for cleaning. This washing process was repeated once more. Finally, the monolith chip is transferred to a tube containing 100 μL of eluate, and the eluate is aspirated and discharged 5 times at a speed of 100 μL / sec to elute the acid-fast bacterium nucleic acid adsorbed on the monolith structure in the monolith chip. did. In order to suppress a decrease in elution efficiency, care was taken so that air did not contact the monolith structure in the chip during suction and discharge. Note that a 0.8 M potassium acetate solution in 70% ethanol was used as the washing solution, and a 10 mM potassium hydroxide aqueous solution was used as the eluent.

（５）リアルタイムＰＣＲによる、抗酸菌遺伝子の検出及び定量
次に、（４）で得た核酸溶出液を対象として、リアルタイムＰＣＲにより抗酸菌遺伝子の検出及び定量を行った。ＰＣＲの試薬組成、並びにＰＣＲ条件は、以下に示す通りであった。 (5) Detection and quantification of acid-fast bacterium genes by real-time PCR Next, the acid-fast bacterium genes were detected and quantified by real-time PCR for the nucleic acid eluate obtained in (4). The PCR reagent composition and PCR conditions were as shown below.

試薬組成：
オリゴ１２５０ｎＭ、
オリゴ２１５００ｎＭ、
オリゴ３（５’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識されている）２５０ｎＭ、
×１０緩衝液１μＬ、
ｄＮＴＰ０．２ｍＭ、
ＭｇＳＯ_４４ｍＭ、
ＫＯＤｐｌｕｓＤＮＡポリメラーゼ０．２Ｕ、
溶出液１μＬ
（ミリＱ水で全量を１０μＬに調整する）
（オリゴ１〜オリゴ３の配列は、配列表の配列番号１〜３に示される通りである。） Reagent composition:
Oligo 1 250 nM,
Oligo 2 1500 nM,
Oligo 3 (5 ′ end labeled with BODIPY-FL) 250 nM,
× 10 buffer 1 μL,
dNTP 0.2 mM,
MgSO ₄ 4 mM,
KOD plus DNA polymerase 0.2U,
Eluate 1μL
(Adjust the total volume to 10 μL with Milli-Q water)
(The sequences of oligo 1 to oligo 3 are as shown in SEQ ID NOs: 1 to 3 in the sequence listing.)

ＰＣＲ条件：
熱変性：９４℃・２分、９８℃・０秒、アニーリング：６０℃・５秒（蛍光検出）、５０サイクル PCR conditions:
Thermal denaturation: 94 ° C for 2 minutes, 98 ° C for 0 seconds, annealing: 60 ° C for 5 seconds (fluorescence detection), 50 cycles

上記試薬組成は、ＢＣＧ株を特異的に検出できるプライマーとプローブの組み合わせである。陽性コントロールとして、ＢＣＧ株からフェノール・クロロホルム法で抽出したゲノムＤＮＡを１０ｍＭトリス緩衝液で１μＬ中に１０００コピー含むように希釈したものを使用した。リアルタイムＰＣＲは、増幅産物とプローブがハイブリダイゼーションするとプローブに標識された蛍光色素の蛍光が消光することに基づいてサンプル中の特定の核酸配列を検出するものである。核酸の増幅及び検出には、ロシュ・ダイアグノスティック社製ライトサイクラー（登録商標）を使用した。測定モードは、５３０ｎｍを利用し、得られたリアルタイム検出データを利用して、アニーリング時のＱＰｒｏｂｅ消光率を算出した。さらに、消光率２％に達したサイクル数を求めて、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩを用いたリアルタイム定量ＰＣＲ法と同様にして解析を行った。抗酸菌の核酸の回収効率は、加熱なしの時の検出を１とした相対値で算出した。結果を表１に示す。 The reagent composition is a combination of a primer and a probe that can specifically detect the BCG strain. As a positive control, genomic DNA extracted from the BCG strain by the phenol / chloroform method was diluted with 10 mM Tris buffer so as to contain 1000 copies in 1 μL. Real-time PCR detects a specific nucleic acid sequence in a sample based on the fact that the fluorescence of the fluorescent dye labeled on the probe is quenched when the amplification product and the probe are hybridized. A light cycler (registered trademark) manufactured by Roche Diagnostics was used for amplification and detection of nucleic acid. As the measurement mode, 530 nm was used, and the obtained QProbe extinction ratio was calculated using the obtained real-time detection data. Furthermore, the number of cycles that reached a quenching rate of 2% was determined and analyzed in the same manner as the real-time quantitative PCR method using SYBR Green I. The nucleic acid recovery efficiency of the acid-fast bacterium was calculated as a relative value with the detection without heating being 1. The results are shown in Table 1.

実施例２
（３）の抗酸菌の溶菌時の加熱温度を７０℃に変更した以外は、実施例１と同様にして、抗酸菌の核酸の回収効率を算出した。結果を表１に示す。 Example 2
The nucleic acid recovery efficiency of acid-fast bacteria was calculated in the same manner as in Example 1 except that the heating temperature at the time of lysis of acid-fast bacteria in (3) was changed to 70 ° C. The results are shown in Table 1.

実施例３
（３）の抗酸菌の溶菌時の加熱温度を８０℃に変更した以外は、実施例１と同様にして、抗酸菌の核酸の回収効率を算出した。結果を表１に示す。 Example 3
The recovery efficiency of the acid-fast bacterium's nucleic acid was calculated in the same manner as in Example 1 except that the heating temperature during lysis of the acid-fast bacterium of (3) was changed to 80 ° C. The results are shown in Table 1.

実施例４
（３）の抗酸菌の溶菌時の加熱温度を９０℃に変更した以外は、実施例１と同様にして、抗酸菌の核酸の回収効率を算出した。結果を表１に示す。 Example 4
The nucleic acid recovery efficiency of acid-fast bacteria was calculated in the same manner as in Example 1 except that the heating temperature during lysis of acid-fast bacteria in (3) was changed to 90 ° C. The results are shown in Table 1.

実施例５
カオトロピック塩としてグアニジンチオシアン酸の代わりに塩酸グアニジンを使用した以外は、実施例２と同様にして、抗酸菌の核酸の回収効率を算出した。結果を表１に示す。 Example 5
The nucleic acid recovery efficiency of acid-fast bacteria was calculated in the same manner as in Example 2 except that guanidine hydrochloride was used in place of guanidine thiocyanate as a chaotropic salt. The results are shown in Table 1.

実施例６
（３）の抗酸菌の溶菌時の処理時間を１０分に変更した以外は、実施例１と同様にして、抗酸菌の核酸の回収効率を算出した。結果を表１に示す。 Example 6
The nucleic acid recovery efficiency of acid-fast bacilli was calculated in the same manner as in Example 1 except that the treatment time at the time of lysis of acid-fast bacilli in (3) was changed to 10 minutes. The results are shown in Table 1.

実施例７
（３）の抗酸菌の溶菌時の処理時間を２分に変更した以外は、実施例１と同様にして、抗酸菌の核酸の回収効率を算出した。結果を表１に示す。 Example 7
The nucleic acid recovery efficiency of acid-fast bacilli was calculated in the same manner as in Example 1 except that the treatment time during lysis of acid-fast bacilli in (3) was changed to 2 minutes. The results are shown in Table 1.

比較例１
（３）の抗酸菌の溶菌時に溶液の加熱を行わず、常温（２５℃）で処理した以外は、実施例２と同様にして、抗酸菌の核酸の回収効率を算出した。結果を表１に示す。 Comparative Example 1
The recovery efficiency of acid-fast bacterium nucleic acids was calculated in the same manner as in Example 2 except that the solution was not heated during lysis of acid-fast bacterium (3) and treated at room temperature (25 ° C.). The results are shown in Table 1.

比較例２
カオトロピック塩の溶液の代わりにミリＱ水を使用した。ミリＱ水中で抗酸菌を７０℃で５分間加熱した後、モノリス構造体による核酸の分離抽出の直前にグアニジンチオシアン酸を実施例２と同じ濃度になるように追加した。それ以外は、実施例２と同様にして、抗酸菌の核酸の回収効率を算出した。結果を表１に示す。 Comparative Example 2
MilliQ water was used in place of the chaotropic salt solution. After heating the acid-fast bacterium in MilliQ water at 70 ° C. for 5 minutes, guanidine thiocyanic acid was added to the same concentration as in Example 2 immediately before the separation and extraction of the nucleic acid by the monolith structure. Other than that was carried out similarly to Example 2, and calculated | required the acid collection efficiency of the acid-fast bacterium. The results are shown in Table 1.

表１から、４０〜９０℃の温度のカオトロピック塩の溶液で処理された実施例１〜７では、常温の溶液で処理された比較例１、及びカオトロピック塩の溶液を使用しなかった比較例２と比較して、核酸の回収効率が顕著に高いことが理解できる。従って、本発明によれば、特定の温度に加熱されたカオトロピック塩の溶液で処理することにより、抗酸菌を効率的に溶菌することができることが明らかである。 From Table 1, in Examples 1 to 7 treated with a solution of chaotropic salt at a temperature of 40 to 90 ° C., Comparative Example 1 treated with a solution at room temperature and Comparative Example 2 not using a solution of chaotropic salt It can be understood that the nucleic acid recovery efficiency is remarkably higher than Therefore, according to the present invention, it is clear that acid-fast bacteria can be efficiently lysed by treatment with a solution of a chaotropic salt heated to a specific temperature.

本発明の方法は、強固な細胞壁のために溶菌が困難であった抗酸菌を効率良く、しかも簡便な操作で低コストかつ安全に溶菌することができるので、結核菌の遺伝子検査の前処理などに極めて有用である。 The method of the present invention can efficiently lyse mycobacteria that have been difficult to lyse due to a strong cell wall, and can be lysed at low cost and safely by a simple operation. It is extremely useful for such as.

配列番号１は、実施例でオリゴ１として記載した設計されたポリヌクレオチドの配列である。
配列番号２は、実施例でオリゴ２として記載した設計されたポリヌクレオチドの配列である。
配列番号３は、実施例でオリゴ３として記載した設計されたポリヌクレオチドの配列である。 SEQ ID NO: 1 is the designed polynucleotide sequence described as Oligo 1 in the Examples.
SEQ ID NO: 2 is the designed polynucleotide sequence described as Oligo 2 in the Examples.
SEQ ID NO: 3 is the sequence of the designed polynucleotide described as Oligo 3 in the Examples.

Claims

４０〜９０℃の温度のカオトロピック塩の溶液によって抗酸菌を溶菌すること、及び前記カオトロピック塩の溶液のｐＨが４．５〜６．５であることを特徴とする抗酸菌の溶菌方法。 A method for lysing acid-fast bacteria, comprising lysing acid-fast bacteria with a solution of chaotropic salt at a temperature of 40 to 90 ° C. , and a pH of the solution of chaotropic salt being 4.5 to 6.5 .

溶液中のカオトロピック塩の濃度が２〜６Ｍであることを特徴とする請求項１に記載の方法。 The method according to claim 1, wherein the concentration of chaotropic salt in the solution is 2-6M.

カオトロピック塩の溶液が０．１〜２．０Ｍの濃度の酢酸塩をさらに含むことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。 The method according to claim 1 or 2 , wherein the solution of chaotropic salt further comprises acetate at a concentration of 0.1 to 2.0M.