JP5565455B2 - Microorganism detection method and apparatus - Google Patents
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Description
本発明は、メタノサルシナ属に代表される細胞壁の硬い微生物を検出できるメタノサルシナ等の微生物の検出方法及びその装置に関するものである。 The present invention relates to a method and apparatus for detecting microorganisms such as methanosarcina, which can detect microorganisms with a hard cell wall typified by the genus Methanosarcina.
廃水処理プラント、メタン発酵プラント、生ゴミ処理装置等の微生物を利用した装置においては、その中で有効に働く微生物の種類や存在量が性能に大きく影響を及ぼすと考えられている。 In devices using microorganisms such as a wastewater treatment plant, a methane fermentation plant, and a garbage treatment device, it is considered that the type and abundance of microorganisms that work effectively in the device greatly affect the performance.
そのため、そのモニタリングは重要であり、過去より顕微鏡観察が行われてきた。プラント中で働く微生物は、細菌やアーキア（微生物）が主であり、その大きさは大体１〜１０μｍであり、近年ではＦＩＳＨ法等による微生物の検出、定量法が応用されてきた。 Therefore, the monitoring is important, and microscopic observation has been performed since the past. Microorganisms working in the plant are mainly bacteria and archaea (microorganisms), and the size is about 1 to 10 μm. In recent years, detection and quantification methods of microorganisms by the FISH method have been applied.
例えば、メタン生成菌の１属であるメタノサルシナ属の微生物は酢酸やメタノールからメタンを生成するため、さまざまな廃水、産廃物においてキーとなって働いている場合が多い。そのため、定量ができるようになると、プラントの性能の向上や、トラブルの原因の追求等において主要なデータとなる。 For example, since the microorganisms of the genus Methanosarcina, which is a genus of methanogens, produce methane from acetic acid and methanol, they often work as a key in various wastewaters and industrial wastes. Therefore, once quantification is possible, it becomes the main data for improving the performance of the plant and pursuing the cause of trouble.
メタン発酵プラント等のサンプル中におけるこの菌の存在を確認するために、従来は、メタン生成菌の持つ補酵素Ｆ４２０の持つ青い自家蛍光を利用して蛍光顕微鏡下でメタン生成菌を可視化し、形態的にメタノサルシナに類似したものをメタノサルシナ属のメタン生成菌と仮定していた。 In order to confirm the presence of this bacterium in a sample such as a methane fermentation plant, conventionally, the blue autofluorescence of coenzyme F420 possessed by the methanogen is visualized under a fluorescence microscope. It was assumed that methanosarcina-like methanogens were similar to methanosarcina.
一方、ＦＩＳＨ法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；蛍光染色法）にて、例えばメタノサルシナ等の標的微生物を検出するプローブを用いてそれのみを可視化することも可能である（非特許文献１）。 On the other hand, it is also possible to visualize only this by using a probe for detecting a target microorganism such as methanosarcina by the FISH method (Fluorescence in situ hybridization) (Non-patent Document 1).
ところが、ＦＩＳＨ法の場合にはＣｙ３等の赤い蛍光色素が発光効率の高さから最も多く用いられているが、サンプル中の有機物が多く赤い背景光が高くなってしまう場合には、メタノサルシナのＦＩＳＨシグナルが埋もれてしまう。 However, in the case of the FISH method, red fluorescent dyes such as Cy3 are most often used because of their high luminous efficiency. However, if there is a lot of organic matter in the sample and the red background light becomes high, the FISH of methanosarcina The signal is buried.
それらの理由から、上記いずれの方法を使うにせよ標的微生物の検出や定量をしようとする際には人間が顕微鏡で観察し、手作業で計数していくことが確実であった。 For these reasons, it is certain that a human being observes with a microscope and counts manually when attempting to detect or quantify the target microorganism, regardless of which method is used.
しかし、自家蛍光を用いた蛍光顕微鏡観察の場合には、形態で判断しなければならないため、経験が必要である。また、菌体自体が弱い赤い蛍光を発する場合があるため、ＦＩＳＨ法において確信を持って真のシグナルを見分けるためにも多くの労力が必要であり、定常的に行うには困難である場合が多い。またそのような分析においてはしばしば主観が入る恐れがある。 However, in the case of fluorescence microscope observation using autofluorescence, it is necessary to have experience because it must be determined by the form. In addition, since the cells themselves may emit weak red fluorescence, a lot of labor is required to identify the true signal with certainty in the FISH method, which may be difficult to perform on a regular basis. Many. In such analysis, there is often a risk of subjectivity.
近年、標的微生物に対して選択的蛍光染色を行う場合に、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスターゼ等の酵素反応やＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応；酵素を使って特定の遺伝子を増殖させる手法）を応用して蛍光強度を増殖させる手法が開発されてきた。 In recent years, when selective fluorescent staining is performed on a target microorganism, an enzyme reaction such as horseradish peroxidase (HRP) or alkaline phosphatase or PCR (polymerase chain reaction; a method of proliferating a specific gene using an enzyme) Techniques have been developed that apply to increase fluorescence intensity.
例えばＣＡＲＤ−ＦＩＳＨ法（非特許文献２）ではＨＲＰで標識したプローブを標的微生物内に結合させたあとに、ＨＲＰの基質となる過酸化水素とチラミン−蛍光色複合体とを加えることによって、チラミン−蛍光色素複合体がラジカル化され、細胞内のたんぱく質等に共有結合し、その結果、多数の蛍光色素が標的細胞内に沈着する。これによって、標的細胞の蛍光強度は通常のＦＩＳＨ法の数十倍以上になり、背景光と異なる色相の色素が、例え分子あたりの蛍光強度が弱くても十分実用可能になる。 For example, in the CARD-FISH method (Non-patent Document 2), after binding a probe labeled with HRP into a target microorganism, hydrogen peroxide as a substrate for HRP and a tyramine-fluorescent color complex are added to form tyramine. -The fluorescent dye complex is radicalized and covalently binds to intracellular proteins and the like, so that a large number of fluorescent dyes are deposited in the target cells. As a result, the fluorescence intensity of the target cell is several tens of times that of the normal FISH method, and a dye having a hue different from that of the background light can be sufficiently put into practical use even if the fluorescence intensity per molecule is weak.
この手法により、多くのグラム陰性細菌についてすでに適用され、明確な輝度の違いによる検出と背景光に埋没する問題との両方の解決が可能となっている。 This technique has already been applied to many gram-negative bacteria, and can solve both the distinct brightness difference detection and the problem of being buried in background light.
しかし、微生物によっては細胞壁が厚く、酵素等の高分子はそのままでは細胞内に浸透して行かない。 However, depending on the microorganism, the cell wall is thick, and polymers such as enzymes do not penetrate into the cell as they are.
例えば、アクチノバクテリアはペプチドグリカンからなる厚い細胞壁を持つため、ＣＡＲＤ−ＦＩＳＨを適用するためには、分子量約４０ｋＤａのＨＲＰで標識されたプローブを細胞内に透過させるために、サンプルに対してリゾチームとアクロモペプチダーゼの両方の処理を行い細胞壁をある程度分解する必要があることがわかっている。 For example, since actinobacteria have a thick cell wall composed of peptidoglycan, in order to apply CARD-FISH, a sample labeled with HRP having a molecular weight of about 40 kDa is allowed to permeate into the cell, and lysozyme and acrosome are applied to the sample. It has been found that the cell wall needs to be degraded to some extent by treating both mopeptidases.
しかしながら、細胞壁の構造が特殊であるために、一般に手に入る酵素の処理が通じない微生物もまだ多く存在する。たとえばメタノサルシナの細胞壁はメタノコンドロイチンやタンパクから構成されていて丈夫であるため、酵素等の高分子はそのままでは細胞内に浸透していかないことがわかっている。 However, because of the special structure of the cell wall, there are still many microorganisms that cannot handle commonly available enzymes. For example, since the cell wall of methanosarcina is composed of methanochondroitin and protein and is strong, it has been found that polymers such as enzymes do not penetrate into the cell as they are.
細胞壁を形成する物質は、植物ではセルロースで、これはグルコース（ブドウ糖）がいくつもつながって出来ている糖鎖であり、他にもリグニンやペクチンのようなものがある。 The substance that forms the cell wall is cellulose in plants, which is a sugar chain formed by connecting several glucoses (glucose), and there are other substances such as lignin and pectin.
それゆえリゾチームやタンパク分解酵素で処理したとしても、メタノサルシナに対してＣＡＲＤ−ＦＩＳＨが機能しない（一部のメタノサルシナしか光らない）ことが本発明者等の実験によってもわかっている。 Therefore, even when treated with lysozyme or a proteolytic enzyme, it has been found by experiments by the present inventors that CARD-FISH does not function on methanosarcina (only a part of methanosarcina shines).
メタノサルシナのみならず、メタノバクテリウム属等のアーキアの多くも、シュードムレインという、市販の酵素では分解できない物質を主成分とする細胞壁を持つため、ＣＡＲＤ−ＦＩＳＨ等による検出は難しい状況である。 Not only methanosarcina but also many archaea such as the genus Methanobacteria have a cell wall whose main component is pseudomulein, a substance that cannot be decomposed by a commercially available enzyme, so that detection by CARD-FISH or the like is difficult.
このシュードムレインと呼ばれる細胞壁は、メタン生成微生物に特徴的な細胞壁構造であり、その他にも、特殊な細胞壁を持つ微生物は多く存在し、それどころか多くの微生物の細胞壁成分はいまだ未知である状況であるため、今後多くの微生物についてＣＡＲＤ−ＦＩＳＨの適応が難しいことが明らかになってくる事は容易に予想できる。 The cell wall called pseudomurein is a cell wall structure that is characteristic of methanogenic microorganisms. In addition, there are many microorganisms with special cell walls, and on the contrary, the cell wall components of many microorganisms are still unknown. Therefore, it can be easily predicted that it will become difficult to adapt CARD-FISH for many microorganisms in the future.
また、現在酵素処理によってＣＡＲＤ−ＦＩＳＨ解析が可能な菌についても個々に異なる酵素や反応条件が異なる場合が考えられ、手法として煩雑になってくる。 In addition, bacteria that are currently capable of CARD-FISH analysis by enzyme treatment may have different enzymes and reaction conditions, which are complicated.
そのため何にでも対応できるユニバーサルな手法が必要とされている。 Therefore, a universal method that can handle anything is needed.
そこで、本発明の目的は、上記課題を解決し、メタノサルシナ属など、メタノコンドロイチンと呼ばれる市販の酵素で処理できない細胞壁を持つ微生物を、ＣＡＲＤ−ＦＩＳＨ法等を用いて検出することができる微生物の検出方法及びその装置を提供することにある。 Accordingly, an object of the present invention is to detect microorganisms that can solve the above-described problems and can detect microorganisms having cell walls that cannot be treated with a commercially available enzyme called methanochondroitin, such as Methanosarcina, using the CARD-FISH method or the like. It is to provide a method and apparatus thereof.
上記目的を達成するために請求項１の発明は、細胞壁を持つ微生物を検出する方法において、前記微生物を化学固定した後、フィルターでろ過して微生物をフィルター上に固定し、そのフィルター上の微生物をフィルターごと挟んで微生物にせん断力を付与してその細胞壁に、ＦＩＳＨ法のプローブおよびタンパク質分解酵素のいずれか一方または双方が透過できる隙間を形成し、しかる後ＦＩＳＨ法により蛍光染色させて前記微生物を定量することを特徴とする微生物の検出方法である。
The invention of
請求項２の発明は、前記微生物の細胞壁に隙間を形成した後、微生物にタンパク分解酵素を加え、しかる後ＦＩＳＨ法により蛍光染色させて微生物を定量する請求項１記載の微生物の検出方法である。
The invention according to
請求項３の発明は、シュードムレイン又はメタノコンドロイチンを主成分とする細胞壁を持つ微生物が含まれたサンプルをパラホルムアルデヒド水溶液につけて化学固定を行った後、分散化処理を行い、これをフィルターでろ過して微生物をフィルター上に固定し、寒天で表面をカバーしてフィルターサンプルとし、そのフィルターサンプルを挟んで微生物にせん断力を付与してその細胞壁に、ＦＩＳＨ法のプローブおよびタンパク質分解酵素のいずれか一方または双方が透過できる隙間を形成し、しかる後、ハイブリダイゼーションを行って微生物を定量する請求項１記載の微生物の検出方法である。
A third aspect of the present invention, after chemical fixing a sample containing the microorganism having a cell wall composed mainly of shoe Dom rain or methanolate chondroitin dipped in paraformaldehyde solution, carry out a diversification process, which Filter the sample with a filter to fix the microorganisms on the filter, cover the surface with agar to make a filter sample, and apply shear force to the microorganisms with the filter sample sandwiched between them, FISH probe and proteolysis The microorganism detection method according to
請求項４の発明は、細胞壁を持つ微生物が含まれたサンプルをパラホルムアルデヒド水溶液につけて化学固定を行った後、分散化処理を行い、これをフィルターでろ過して微生物をフィルター上に固定し、寒天で表面をカバーしてフィルターサンプルとし、そのフィルターサンプル中の微生物をＦＩＳＨ法により検出する装置において、前記フィルターサンプルをせん断力付加装置で挟んで、前記フィルターサンプル上の微生物にせん断力を付与してその細胞壁に、ＦＩＳＨ法のプローブおよびタンパク質分解酵素のいずれか一方または双方が透過できる隙間を形成することを特徴とする微生物の検出装置である。 A fourth aspect of the present invention, a sample containing the microorganism having a cell wall after chemical fixing immersed in paraformaldehyde solution, carry out a diversification process, which was filtered through a filter of microorganisms on the filter fixed, and a filter samples cover the surface with agar, in an apparatus for detecting microorganisms in the filter samples by FISH method, across the filter samples at a shear force applying device, shear forces microorganisms on the filter sample Is provided, and a gap through which either or both of the FISH probe and the proteolytic enzyme can permeate is formed in the cell wall.
請求項５の発明は、せん断力付加装置は、先の広いピンセットからなり、前記フィルターサンプルを１ｋｇ／ｃｍ2の圧力をかけながら横方向に位置をずらしながらせん断力を付与する請求項４記載の微生物の検出装置である。 The invention of claim 5, the shearing force applying device, made from a wide tipped tweezers of claim 4, wherein imparting shear force while shifting the position in the lateral direction while applying a pressure of 1 kg / cm 2 of the filter sample This is a microorganism detection device.
請求項６の発明は、せん断力付加装置は、前記フィルターサンプルを上下から所定の圧力で挟む一対の金属片と、その金属片のいずれか一方にその金属片を横方向にずらす力を与えるハンマーとからなる請求項４記載の微生物の検出装置である。 The invention of claim 6, shearing force applying device provides a pair of metal pieces sandwiching the filter samples from above and below a predetermined pressure, the force of shifting the metal strip to one of the metal pieces in the transverse direction hammer The microorganism detection apparatus according to claim 4, comprising:
本発明によれば、シュードムレインなどからなる硬い細胞壁を持つ微生物でもＣＡＲＤ−ＦＩＳＨ法により検出できるという優れた効果を発揮するものである。 According to the present invention, an excellent effect is exhibited that even a microorganism having a hard cell wall such as pseudomulein can be detected by the CARD-FISH method.
以下、本発明の好適な一実施の形態を添付図面に基づいて詳述する。 A preferred embodiment of the present invention will be described below in detail with reference to the accompanying drawings.
先ず、メタノサルシナ属などメタノコンドロイチンなどからなる硬い細胞壁を持つ微生物は、ＣＡＲＤ−ＦＩＳＨ法により蛍光染色を施しても酵素つきのプローブが細胞壁によりブロックされて浸透せず、またタンパク分解酵素によっても細胞壁を分解することが出来ないため、そのままでは、ＣＡＲＤ−ＦＩＳＨ法で検出が出来ない。 First, microorganisms with a hard cell wall consisting of methanochondroitin, such as methanosarcinia genus, do not permeate because the probe with the enzyme is blocked by the cell wall even if fluorescent staining is performed by the CARD-FISH method, and the cell wall is also degraded by proteolytic enzymes Therefore, detection by the CARD-FISH method cannot be performed as it is.
このため、本発明では、酵素のような選択性を持つ処理とは異なる物理的な処理による細胞の透過性向上を行った。 For this reason, in this invention, the permeability | transmittance improvement of the cell was performed by the physical process different from the process with selectivity like an enzyme.
その物理的な処理とは、細胞壁にせん断力を与えるということになるが、具体的にはＦＩＳＨ等の手法用に用意された微生物サンプル（しばしばフィルター上に固定した状態にある）に上下からたとえば小さな金属製の板のようなものではさみ圧力を加えた状態で一方の金属板を横にずらす。その際にサンプルに対してせん断力が与えられ、プローブの通過できる隙間が形成されると考えられる。 The physical treatment means that a shear force is applied to the cell wall. Specifically, for example, a microorganism sample prepared for a technique such as FISH (often fixed on a filter) is applied from above and below, for example. With something like a small metal plate, one metal plate is shifted to the side with scissor pressure applied. At that time, it is considered that a shearing force is applied to the sample, and a gap through which the probe can pass is formed.
この効果によってたとえば酵素による分解が困難な細胞壁を持つ微生物においてもＣＡＲＤ−ＦＩＳＨの適用が可能となる。 This effect makes it possible to apply CARD-FISH even in microorganisms having cell walls that are difficult to be decomposed by enzymes, for example.
この処理のあとにタンパク分解酵素等で処理することによってさらにプローブの透過性が向上し、明るい蛍光シグナルを得ることができる。 By performing the treatment with a proteolytic enzyme after this treatment, the permeability of the probe is further improved, and a bright fluorescent signal can be obtained.
これはせん断力の副次的効果として、タンパク分解酵素等も細胞壁を透過できるようになり、内側から細胞壁の分解に作用したと考えられる。 As a secondary effect of shearing force, it is considered that proteolytic enzymes and the like can permeate the cell wall and act on the degradation of the cell wall from the inside.
ＣＡＲＤ−ＦＩＳＨ等の手法によって選択的にメタノサルシナ等の標的とする微生物を光らせることができ、また赤色以外の色素においても良好なシグナルが得られるため、従来以上に信頼性の高い標的微生物の同定、検出、定量が行える。 ＣＡＲＤ−ＦＩＳＨの強力な蛍光はサンプルを選ばず、また、低倍率における顕微鏡観察でも容易に認識できるため、コンピューターによる画像処理をもちいて定量する場合に、どのようなサンプルでも殆どの場合解析可能で、広範囲を一枚の写真に収めることができ、定量値の信頼性が高くなる。また、コンピューターの自動画像処理機能を用いることによって作業効率が飛躍的に高くなる。 Target microorganisms such as methanosarcina can be selectively lit by a technique such as CARD-FISH, and a good signal can be obtained even with dyes other than red, so identification of target microorganisms with higher reliability than before, Detection and quantification are possible. The strong fluorescence of CARD-FISH can be easily recognized even by microscopic observation at a low magnification regardless of the sample, so any sample can be analyzed in most cases when quantified using computer image processing. , Can cover a wide area in one photo, and the reliability of quantitative value is high. In addition, the use of the computer's automatic image processing function dramatically increases the work efficiency.
次に、より具体的な実施の形態を説明する。 Next, a more specific embodiment will be described.
廃棄物処理サンプルに含まれるメタノサルシナ属のアーキア（微生物）を検出するためにＣＡＲＤ−ＦＩＳＨ法を行った。 The CARD-FISH method was performed to detect archaea (microorganisms) of the genus Methanosarcina contained in the waste treatment sample.
すなわち、公知のＣＡＲＤ−ＦＩＳＨ法（非特許文献２、３）に基づいた以下の操作を行った。
That is, the following operation based on the well-known CARD-FISH method (
まずサンプルを終濃度４％のパラホルムアルデヒド水溶液につけ、４℃で一晩、化学固定を行った。 First, the sample was immersed in an aqueous paraformaldehyde solution having a final concentration of 4% and chemically fixed at 4 ° C. overnight.
次にサンプル中の微生物を分散させるために、ホモジナイズや１分間の超音波処理を行って分散化処理させ、その一部を外径２５ｍｍ、孔径０．２２μｍのポリカーポネートフィルターでろ過し、微生物をフィルター表面に乗せる。 Next, in order to disperse the microorganisms in the sample, homogenization and ultrasonic treatment for 1 minute are performed for dispersion treatment, and a part thereof is filtered through a polycarbonate filter having an outer diameter of 25 mm and a pore diameter of 0.22 μm. On the filter surface.
その後、０．１％寒天につけ、乾燥させることで表面をカバーし、以降の処理中での微生物の剥離を防いだ。 Thereafter, the surface was covered with 0.1% agar and dried to prevent detachment of microorganisms during the subsequent treatment.
そのフィルターサンプルは１／１２〜１／２４位の大きさに３枚切り出し、せん断力の効果を見るために以下のＡ，Ｂ，Ｃの異なる処理を行った。 Three filter samples were cut out to a size of about 1/12 to 1/24, and the following treatments A, B, and C were performed in order to see the effect of shearing force.
Ａ：無処理。 A: No processing.
Ｂ：せん断処理
６５℃で５分間熱処理したフィルターサンプルに対して以下のせん断力付加装置で１０回以上位置をずらしながらはさみ、せん断力を与えた。
B: Shearing treatment The filter sample heat-treated at 65 ° C. for 5 minutes was sandwiched with the following shearing force application device while shifting the
このせん断力付加装置は、効果的にせん断力を与えるために、図１（ａ）、図１（ｂ）に示すように、先の広いピンセット１０を加工して簡単にせん断力を与えられるよう作製した。
In order to effectively apply a shearing force, this shearing force applying device can easily apply a shearing force by processing a
すなわち、ピンセット１０の一方の柄部１１ａと、その先の摘み部１２ａは、直線状とし、他方の柄部１１ｂの先端部とその摘み部１２ｂは、他方の摘み部１２ａ側に湾曲させると共に摘み部１２ｂを上方に湾曲させた形状とした。
That is, one
このピンセット１０を図２（ａ）に示すように、下方の摘み部１２ａ上にフィルターサンプル２０を乗せ、図２（ｂ）に示すように、他方の摘み部１２ｂでフィルターサンプル２０を挟み、その状態で、約１ｋｇ／ｃｍ2 の圧力をかけながら、ピンセット１０又はフィルターサンプル２０を横方向に約１０回程度ずらすことで、縦方向の圧力とともに横方向へのずれが生じ、メタノサルシナなどの微生物２１に、せん断力を与えることができる。
As shown in FIG. 2 (a), the
Ｃ：せん断処理＋タンパク分解酵素
Ｂと同様の処理後に、アクロモペプチダーゼ液中につけて室温で３０分反応させ、水洗、エタノールによる脱水、乾燥をした。その後、各サンプルは０．００１５％Ｈ2Ｏ2を含むメタノール中に３０分つけた。
C: Shearing treatment + proteolytic enzyme After the same treatment as B, it was put in an achromopeptidase solution and reacted at room temperature for 30 minutes, washed with water, dehydrated with ethanol, and dried. Thereafter, each sample was placed in methanol containing 0.0015% H 2 O 2 for 30 minutes.
次に、上述したＡ〜Ｃの処理を行ったフィルターサンプルに対して、ハイブリダイゼーション溶液（０．９Ｍ ＮａＣｌ，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（有機バッファの名称），３５％ｆｏｒｍａｍｉｄｅ，２％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔと０．０２％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム））３００μｌと、ブロープの水溶液（８ｐｍｏ１／μｌ）２μｌを混合した液にフィルターサンプルをいれ、４５℃で２時間ハイブリダイゼーションを行った。 Next, a hybridization solution (0.9 M NaCl, 20 mM Tris-Cl (name of an organic buffer), 35% formamide, 2% Blocking reagent and 0. A filter sample was put in a solution obtained by mixing 300 μl of 02% SDS (sodium dodecyl sulfate) and 2 μl of an aqueous solution of probe (8 pmo1 / μl), and hybridization was performed at 45 ° C. for 2 hours.
その後、洗浄液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，８０ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＥＤＴＡ）と、０．０１％ＳＤＳにフィルターサンプルを浸せきし（４８℃、１５分）余分なプローブを洗浄した。 Thereafter, the filter sample was immersed in a washing solution (20 mM Tris-Cl, 80 mM NaCl, 5 mM EDTA) and 0.01% SDS (48 ° C., 15 minutes) to wash the excess probe.
その後、フィルターサンプルは、１０ｍｌ程度のＰＢＳ（８ｇのＮａＣｌ，０．２ｇのＫＣｌ，１．４４ｇのＮａ2ＨＰＯ4 と、０．２４ｇのＫＨ2ＰＯ4を１Ｌの超純水に溶かしｐＨ７．４にする）に数分漬けたのち、反応液に１５分間３７℃で反応させ、蛍光色素を標的細胞内に沈着させた。 Thereafter, about 10 ml of PBS (8 g of NaCl, 0.2 g of KCl, 1.44 g of Na 2 HPO 4 and 0.24 g of KH 2 PO 4 was dissolved in 1 L of ultrapure water and the pH of the filter sample was about 7.4. After that, the reaction solution was reacted for 15 minutes at 37 ° C. to deposit the fluorescent dye in the target cells.
反応液の組成は０．００１５％Ｈ2Ｏ2，１％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔのＰＢＳ溶液５００μｌと３μｌの５，６−ＦＡＭ（蛍光色素の名前）で標識したｔｙｒａｍｉｄｅ液の混合物である。 The composition of the reaction solution is a mixture of 500 μl of 0.0015% H 2 O 2 , 1% Blocking reagent PBS solution and 3 μl of tyramide solution labeled with 5,6-FAM (name of fluorescent dye).
反応後、約１０ｍｌのＰＢＳで５分問、超純水で１分間洗浄後にエタノール中につけて脱水して乾燥した。そのフィルターサンプルはＤＮＡ染色試薬とグリセリンを含む液を用いてスライドグラスとカバーガラスの間に設置し、蛍光顕微鏡観察を行った。 After the reaction, it was washed with about 10 ml of PBS for 5 minutes, washed with ultrapure water for 1 minute, then placed in ethanol, dehydrated and dried. The filter sample was placed between a slide glass and a cover glass using a solution containing a DNA staining reagent and glycerin, and observed with a fluorescence microscope.
図３、４は、それぞれ処理Ｂ、Ｃのサンプルの蛍光顕微鏡写真である。 3 and 4 are fluorescence micrographs of the samples of treatments B and C, respectively.
各フィルターサンプル上には、ほぼ同様の量のメタノサルシナが存在すると仮定すると、処理Ａでは、ほとんどシグナルが観察されなかったが（ほとんど何も写っていない写真になってしまうので写真は省略）、処理Ｂ，Ｃではシグナルが観察されるため、せん断力付加処理によって細胞壁にプローブが通り抜けられるひび、もしくは穴のようなものが形成されたと考えられる。 Assuming that approximately the same amount of methanosarcina is present on each filter sample, the signal was not observed in treatment A (the photo is omitted because it is a photograph showing almost nothing). Since signals are observed in B and C, it is considered that a crack or a hole that allows the probe to pass through the cell wall was formed by applying the shearing force.
Ｃ（図３）は、Ｂ（図２）よりもさらに明るく、細胞内全体からシグナルが観察される。 C (FIG. 3) is much brighter than B (FIG. 2), and signals are observed throughout the cell.
これはタンパク分解酵素によって細胞壁成分が分解されて、さらにブローブの透過性が向上したためであると考えられる。 This is thought to be because cell wall components were decomposed by proteolytic enzymes, and the permeability of the probe was further improved.
この効果はせん断力を付加しないときには見られず、ＣＡＲＤ−ＦＩＳＨ法で用いるＤＮＡプローブとしては、公知のメタノサルシナ検出用プローブを分子量約４０ｋＤａの西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したもののほか、他の微生物をみるためには、例えば真正細菌には公知のＥＵＢ３３８プローブ、アーキアには公知のＡＲＣ９１５を西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したもの等、基本的にＦＩＳＨ用に設計されたプローブであれば使用可能である。 This effect is not seen when shearing force is not applied. As a DNA probe used in the CARD-FISH method, a known probe for detecting methanosarcina is labeled with horseradish peroxidase having a molecular weight of about 40 kDa, and other microorganisms are used. For example, a known EUB338 probe for eubacteria and a known ARC915 labeled with horseradish peroxidase for archaea can be used as long as they are basically designed for FISH.
せん断力を与えることによって細胞の少なくとも一部にひびが入ることでＣＡＲＤ−ＦＩＳＨのプローブが細胞内に入っていくことができるようになる。ただ圧力をかけただけでは効果は無かった。圧力とともに与える横方向のずれにより、効果的にひびが入ると考えられる。 By applying a shearing force, at least a part of the cell is cracked, so that the CARD-FISH probe can enter the cell. Just applying pressure had no effect. It is considered that cracks are effectively generated by the lateral shift given with the pressure.
せん断力を与えたあとにタンパク分解酵素のような細胞壁成分を分解する酵素で処理Ｃすることによってこの効果は大きくなる。 This effect is increased by treating with an enzyme that degrades cell wall components such as proteolytic enzymes after applying shearing force.
せん断力によってひびが入りタンパク分解酵素をも通しやすくなったためこの効果は得られると考えられる。 This effect is thought to be obtained because the shearing force caused cracks and facilitated the passage of proteolytic enzymes.
上述の実施の形態では、ピンセット１０でせん断力を付与する例で説明したが、ピンセット１０でのせん断力付与では、個人差が生じやすいため、図５のようなせん断力付加装置を用いるのが好ましい。
In the above-described embodiment, the example in which the shear force is applied by the
図５において下部支持板３０に支柱３１を介して上部支持板３２を設け、その下部支持板３０上に下部金属片３３を保持し、上部支持板３２に押圧用ネジ３５にて上部金属片３４を下部金属片３３に対して所定の圧力を付与できるようにし、この二枚の金属片３３，３４にフィルターサンプル２０を挟み、圧力を加えながら片方の金属片３４にハンマー３６で横方向へずらす力を与えるようにする。
In FIG. 5, an
このせん断力付加装置は、押圧用ネジ３５にて所定の押圧力を付与でき、またハンマー３６で金属片３４を所定の力で１０回程度繰り返し殴打するため、微生物２１に対して一定のせん断力を付与することができ、より再現性の高い検出が行える。
In this shearing force applying device, a predetermined pressing force can be applied with the
１０ ピンセット（せん断力付加装置）
２０ サンプルフィルター
２１ 微生物
10 Tweezers (Shearing force application device)
20
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