JP5561130B2 - 血液適合性等の評価用の実験方法 - Google Patents

Description

本発明は、動物由来組織やドナー組織等の移植組織等の免疫反応や抗血栓性に関する血液適合性等の評価を行う際に、実際の体内環境に近い状態で実験を行うための血液適合性等の評価用の実験システム及び実験方法、並びに、これらに用いるサンプル容器に関する。

近時、動物由来組織から細胞成分を除去し、低抗原化して再生の足場として応用する研究が行われている。このような動物由来組織には、拒絶反応を呈する抗原があり、中でも、ブタやウシ等の組織をヒトに移植すると、数十分から数時間以内に超急性拒絶反応を引き起こす糖鎖抗原の存在が知られている。従って、動物由来組織を無細胞化処理してヒトへの移植を目指すには、当該無細胞化処理後の組織とヒトの血液との接触による免疫反応に関する安全性評価が重要になる。免疫反応には、血液成分の中でも異物認識機能を有する白血球が深く関わっていることが知られており、一般的には、ヒト血液から白血球を分離し、培養皿に乗せた組織に白血球を作用させる実験や、組織から抽出したタンパク質を培養皿に入れ、そこに白血球を作用させる実験が行われている。これまでの実験では、血液から白血球のみを分離し、空気接触という体内に存在しない環境で、炭酸ガスインキュベータ内で白血球を組織に作用させるように、限られた条件で安全性評価が行われていた。このように血液から白血球のみを分離する理由として、赤血球は、多量のグルコースを消費して乳酸を産生することで血中のｐＨを低下させてしまうことや、血小板は、空気接触することで血液凝固反応が進む等の問題があるためである。換言すれば、体内でコントロールされるものが、体外でコントロールできないために、簡易的に白血球のみを分離して血液適合性評価の実験が行われている。また、この実験では、体内とは大きく異なる静地環境で白血球による免疫反応が調べられているが、体内では常に血液が流れており、それが免疫反応に及ぼす影響は殆ど理解されていない。更に、体内の免疫反応は、白血球、赤血球、血小板、血漿等を総合した血液によって起こるものであり、白血球のみでは限定的で、体内での免疫反応の全てを再現することはできない。

ところで、下記特許文献１には、所定の割合でヘパリンを混合した全血を医療用材料に接触させ、医療用材料に付着した血液成分の定量を行う評価方法が開示されている。

特開２００５−６９９６６号公報

しかしながら、前記特許文献１の方法は、生体組織が血液に接触することによる免疫反応についての血液適合性評価を行うものではなく、当該免疫反応に関する正確な評価を得ることができない。つまり、体内の血液は、外気非接触の状態にあり、赤血球による前述のグルコースの消費が行われる他、白血球がグルコースと酸素を取り入れて二酸化炭素を排出する好気的解糖等の様々な活動が行われる中で、血液中のｐＨが所定範囲内に維持される。ところが、前記特許文献１の方法では、血液を外気非接触の状態で、血液中のｐＨを人体の正常範囲に維持して実験を行うものでないことから、動物由来組織等による免疫反応や抗血栓性について血液適合性の評価を行った場合に、信頼性のある評価を得ることができない。

本発明は、このような課題を解決するために案出されたものであり、その目的は、全血を用い、人体内の血液と同様の状況下でサンプルの血液適合性等の評価を行うことができる血液適合性等の評価用の実験システム及び実験方法、並びに、これらに用いるサンプル容器を提供することにある。

本発明は、グルコースを添加した血液にサンプルを浸漬した状態で、これら血液及びサンプルを外気非接触の状態でサンプル容器に封入し、当該サンプル容器のガス交換部を通じて、当該サンプル容器の外側とその内部の血液との間で酸素及び二酸化炭素のガス交換を行うことで、前記血液のｐＨが人体の正常範囲内に維持するようにしたことが主たる特徴である。

本発明によれば、白血球の好気的解糖を行うためのグルコースが添加された血液にサンプルを浸漬し、当該血液を外気非接触とした状態で、サンプル容器の外側と血液中との間の酸素及び二酸化炭素の交換がガス交換部を通じて行われ、血液中のｐＨが人体の正常範囲内に維持されることになる。従って、全血を用いて人体内の血液と同様の状況下でサンプルの血液適合性の評価を行うことが可能になり、動物由来組織やドナー組織等の移植組織等について、ヒトに適用する前に、ヒト全血との免疫反応や抗血栓性に関する血液適合性を科学的に評価することができる。しかも、移植組織の血液適合性評価をごく少量のヒト血液を用いて体外で安全に行うことができ、更に、血液に薬等を添加した状態とすることで、移植組織に対する薬等の効果が評価可能になる。

本実施形態に係る血液適合性等の評価用の実験システムの概略構成図。 図１のＡ−Ａ線に沿う概略断面図。 サンプル容器の概略正面図。

以下、本発明の実施形態について図面を参照しながら説明する。

図１には、本実施形態に係る血液適合性等の評価用の実験システムの概略構成図が示され、図２には、図１のＡ−Ａ線に沿う概略断面図が示されている。これらの図において、前記実験システム１０は、所定量のグルコースとヘパリンが添加された血液に、血液適合性評価の対象となるサンプルＳを浸漬した状態で収容するサンプル容器１１と、サンプル容器１１を保持する保持装置１２と、保持装置１２を囲むように設けられ、サンプル容器１１の周囲の温度を所定の温度に調整する温度調整装置としての恒温器１４と、酸素及び二酸化炭素を含むガスをサンプル容器１１の周囲に供給するガス供給装置１５とを備えている。

前記サンプル容器１１は、図３に示されるように、同図中左右両端側が開放部分となるチューブ状の容器本体１７と、前記各開放部分に装着され、当該各開放部分を閉塞するためのキャップ１８，１８と、各キャップ１８，１８にそれぞれ取り付けられ、容器本体１７の内部からキャップ１８，１８を貫通して容器本体１７の外側に延びる流路２０，２０とを備えている。

前記容器本体１７は、その内外間で酸素及び二酸化炭素を透過可能とするシリコーン製の膜体によって円筒状に形成されている。容器本体１７の内部の収容空間１７Ａには、動物由来組織、ドナー組織等の移植組織や人工臓器のパーツや医療用材料等のサンプルＳが収容された上で、血液（全血）が充填される。

前記キャップ１８は、段付の円柱状をなし、外径が小さい方の部分が容器本体１７の図３中左右両端側から収容空間１７Ａに嵌め込まれる。このとき、当該嵌め込み部分を介しての容器本体１７の内外間における空気の流通と、収容空間１７Ａに封入されたサンプルＳ及び血液の前記嵌め込み部分からの流出が阻止されるようになっている。なお、本実施形態では、前記嵌め込み部分を結束バンド（図示省略）で結束することで、容器本体１７とキャップ１８とが固定される。

前記流路２０は、収容空間１７Ａに一端側が連なって通じるチューブ２２と、チューブ２２の他端側に取り付けられた三方活栓２３とを備えている。

以上の構成のサンプル容器１１には、次のようにして、サンプルＳと所定量のグルコースを添加した血液とが封入される。先ず、何れか一方のキャップ１８を外した状態で、収容空間１７ＡにサンプルＳを入れる。その上で、他方のキャップ１８を容器本体１７に嵌め込み、同両端側の流路２０，２０に設けられた三方活栓２３，２３の１ポートをそれぞれ開放し、一方の流路２０で開放されたポートから収容空間１７Ａ内の空気を抜きながら、他方の流路２０で開放されたポートから収容空間１７Ａに血液を注入する。空気が取り除かれた状態で血液が収容空間１７Ａに充填されると、各三方活栓２３，２３をそれぞれ閉塞する。この状態では、外気非接触の血液にサンプルＳが浸漬されることになる。ここで、キャップ１８，１８が嵌め込まれていない容器本体１７の周壁部分が、その内外間で酸素及び二酸化炭素のガス交換を可能とするガス交換部２５となる。従って、容器本体１７内に血液を封入し、当該血液を外気非接触にした状態で、収容空間１７Ａの内外間での酸素及び二酸化炭素の流通が可能になり、収容空間１７Ａに封入された血液に対する容器本体１７の外側からの酸素の供給と、白血球等の活動や代謝による血液から容器本体１７の外側への二酸化炭素の排出とが、血液を外気非接触にした環境下で行えることになる。なお、流路２０は、実験中に収容空間１７Ａ内の血液を一部抜いて血液性状を検査する際にも用いられる。

前記保持装置１２は、図１及び図２に示されるように、サンプル容器１１を支持する支持部２７と、支持部２７に設置されたサンプル容器１１をカバーし、サンプル容器１１の設置空間Ｃを内部に形成するケース２９とを備えている。

前記支持部２７は、図２中左右方向に沿って複数配置された回転体としてのローラ３１を備えている。各ローラ３１は、フレームＦに回転可能に支持されており、図示しないモータによって予め設定した回転数で回転可能に設けられている。サンプル容器１１は、その中心線方向がローラ３１の回転中心線方向に沿う向きで、隣り合う２個のローラ３１，３１を跨ぐようにこれらローラ３１，３１の上方に載せられる。このとき、サンプル容器１１のキャップ１８，１８の外周面がローラ３１，３１の外周面に接触することになり、各ローラ３１，３１を同一方向に回転させると、ローラ３１，３１との接触部分に生ずる摩擦抵抗により、キャップ１８，１８が容器本体１７と一体的に回転し、サンプル容器１１が中心線回りに回転することとなる。従って、キャップ１８は、ローラ３１に接触する接触部を構成する。

前記ケース２９は、設置空間Ｃの開閉を自在に行えるように支持部２７に取り付けられ、設置空間Ｃが開放状態にあるときに、設置空間Ｃに対するサンプル容器１１の出し入れが可能になる。

前記恒温器１４は、実験中、サンプル容器１１が設置空間Ｃに収容された状態で、サンプル容器１１の周囲の温度が人体の体温程度（例えば、３７℃）に維持されるように、温度調整がされる。なお、恒温器１４を用いずに、保持装置１２に設置空間Ｃの温度調整を行う他の温度調整装置を設け、サンプル容器１１の周囲の温度を前述のように調整しても良い。

前記ガス供給装置１５は、所定の濃度に調整された酸素及び二酸化炭素に窒素等を混合したガスを設置空間Ｃに供給するようになっている他、図示省略しているが、設置空間Ｃに供給されるガスの圧力調整をするレギュレータと、ガスの流量調整を行う絞り抵抗とを含んで構成されている。つまり、ガス供給装置１５は、前記ガス中の酸素及び二酸化炭素の濃度、圧力及び流量を調整可能に設けられている。

次に、前記実験システム１０を使った血液適合性評価のための実験方法について説明する。

先ず、前述の手順で、サンプルＳと所定量のグルコースとヘパリンを添加した血液とをサンプル容器１１内に注入しながらその中の空気を排出し、容器本体１７内に封入された血液を外気非接触の状態にする。この際、グルコースの添加量は、実験中に経時的に消費するグルコースの量を考慮し、実験期間を通じて血液中のグルコース濃度が人体の正常範囲（７０ｍｇ／ｄｌ〜２００ｍｇ／ｄｌ）内に収まるように調整される。本発明者らの研究によれば、本発明の実験を行うと、実験時間１時間当たり、血中のグルコース濃度が約２０ｍｇ／ｄｌの減少率となることが実証された。従って、実験時間（例えば、５時間）を予め決めた上で前記減少率を用いると、実験開始時のグルコース濃度から、実験終了時のグルコース濃度を予測できるため、実験開始時と実験終了時のグルコース濃度が人体の正常範囲になるように、実験前のグルコースの添加量が求められる。

そして、サンプルＳ及び血液が内部に収容されたサンプル容器１１を支持部２７に置き、ケース２９を閉めてから、ローラ３１を所定の回転速度（例えば、４０ｒｐｍ）で回転させ、サンプル容器１１を回転させる。これにより、サンプル容器１１中の血液に対し、溶血の抑制と血球成分の沈下や凝集による分離が抑制される。この状態で、実験中、酸素と二酸化炭素とを含むガスをガス供給装置１５から設置空間Ｃに供給する。設置空間Ｃに供給された酸素は、容器本体１７の周壁部分のガス交換部２５を透過して血液中に供給されることになり、外気非接触の状態の血液中に酸素が供給されることになる。また、白血球等の活動によって血液中で発生した二酸化炭素は、ガス交換部２５を透過してサンプル容器１１の外側に排出されることになる。ここで、ガス供給装置１５から供給されるガス中の酸素濃度は、約２０％程度に設定され、前記ガス中の二酸化炭素の濃度は、約２％前後に設定される。これら酸素及び二酸化炭素の濃度は、本発明者らが予め行った実験により得られた適正値、つまり、サンプル容器１１中の血液のｐＨを人体の正常範囲（ｐＨ７．３０〜７．４５）内に維持するための適正値に設定される。すなわち、ここでの酸素の濃度は、白血球の好気的解糖等の活動による消費に必要十分となる値が設定される。また、二酸化炭素の濃度は、空気中の二酸化炭素の濃度（約０．０４％）よりも高く設定されているが、空気中の二酸化炭素の濃度と同等にすると、白血球等の活動によって血液中に発生した二酸化炭素が、ガス交換部２５からサンプル容器１１の外側に排出され過ぎてしまい、血液中の二酸化炭素濃度が低下し過ぎて、血液のｐＨが人体の正常範囲よりも高くなるためである。一方、前記ガス中の二酸化炭素の濃度を５％程度にすると、血液中に発生した二酸化炭素が、サンプル容器１１の外側に十分に排出できなくなり、血液のｐＨが人体の正常範囲よりも低くなってしまう。従って、ガス供給装置１５から供給されるガス中の酸素及び二酸化炭素の濃度は、血液中の各物質の代謝とガス交換部２５でのガス交換能力とを考慮して、実験中、サンプル容器１１内の血液のｐＨを人体の正常範囲内に維持可能に設定される。

なお、前記サンプル容器１１の形状及び構成は、前記実施形態のものに限定されず、サンプルＳを浸漬した状態の血液を封入し、酸素及び二酸化炭素をサンプル容器１１の内外間で流通可能なガス交換部２５を備えている限りにおいて、種々の態様を採用することができる。具体的に、ガス交換部２５は、酸素及び二酸化炭素を透過可能となる材質によって形成されていれば何でも良い。この場合、ガス供給装置１５から供給されるガス中の酸素及び二酸化炭素の濃度は、前記実施形態で述べた濃度に限定されるものではなく、ガス交換部２５の材質をも考慮し、実験中にサンプル容器１１内の血液のｐＨを人体の正常範囲内に維持可能となるように設定される。

また、多少の空気を含んだ状態の血液をサンプル容器１１に封入した上で、血液が外気に直接触れない状態にし、ガス交換部２５を介して血液に対するガス交換を行っても良い。

更に、サンプル容器１１として、容器本体１７内の収容空間１７Ａの容積を可変にする弾性材料で構成することもできる。この場合、サンプル容器１１の弾性により、収容空間１７Ａに封入される血液量が可変となり、当該血液量に応じてガス交換部２５を通じたガス交換能力のコントロールが可能になる。つまり、収容空間１７Ａに注入される血液量を通常よりも増やして収容空間１７Ａが膨張すると、収容空間１７Ａ内の圧力が高くなり、サンプル容器１１の外側から血液内に流入するガスの量が減る一方で、血液内からサンプル容器１１の外側に排出されるガスの量が増えることになる。逆に、収容空間１７Ａに注入される血液量を通常よりも減らして収容空間１７Ａが収縮すると、収容空間１７Ａ内の圧力が低くなり、サンプル容器１１の外側から血液内に流入するガスの量が増える一方で、血液内からサンプル容器１１の外側に排出されるガスの量が減ることになる。

また、前述した血液適合性等の評価のための実験方法は、同様の手順で実験を行える限りにおいて、種々の装置を使用することができる。

その他、本発明における装置各部の構成は図示構成例に限定されるものではなく、実質的に同様の作用を奏する限りにおいて、種々の変更が可能である。

１０ 実験システム
１１ サンプル容器
１２ 保持装置
１４ 恒温器（温度調整装置）
１５ ガス供給装置
１７ 容器本体
１７Ａ 収容空間
１８ キャップ（接触部）
２５ ガス交換部
３１ ローラ（回転体）
Ｓ サンプル

Claims (2)

1. 血液適合性等の評価対象となるサンプルを血液に浸漬した状態で封入可能な収容空間を備え、前記血液を外気非接触とした状態で前記収容空間の内外間で酸素及び二酸化炭素を透過可能に設けられたサンプル容器を使用し、前記サンプルの血液適合性評価を行う際の実験方法であって、
   実験期間中に減少する血液中のグルコースの濃度を考慮し、実験期間中を通じて、血液中のグルコースの濃度が人体の正常範囲内に収まるように、所定量のグルコースを血液に添加した上で、当該血液と前記サンプルを前記サンプル容器に封入した後、
   前記サンプル容器内の周囲に酸素及び二酸化炭素を含むガスを供給するとともに、前記血液のｐＨが人体の正常範囲内に維持されるように、前記ガス中の酸素及び二酸化炭素の供給状態を調整することを特徴とする血液適合性等の評価用の実験方法。
2. 実験時間に対する血液中のグルコースの濃度の減少率を予め定めておき、当該減少率と所望の実験時間から、前記グルコースの添加量を決定することを特徴とする請求項１記載の血液適合性等の評価用の実験方法。

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