JP5556444B2 - Microscope, culture observation equipment - Google Patents
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Description
本発明は、顕微鏡、培養観察装置に関する。 The present invention relates to a microscope and a culture observation apparatus.
従来、細胞等の試料を培養する際には、シャーレ（ディッシュ）やウェルプレート等の培養容器が使用されている。
シャーレは、ポリスチレン等の透明なプラスチック製で円形の皿部材と蓋部材とからなり、蓋部材を開けて試料と試料を培養するための培養液（培地）を注入して使用される。なお、このようなシャーレは、その径の大きさ等によって複数の種類、例えば３５、６０、１００ｍｍディッシュ等に分類される。
ウェルプレートは、シャーレと同様にプラスチック製で、試料を培養するための小さな円筒状の凹部（ウェル）が多数形成された板状部材と蓋部材とからなる。斯かるウェルプレートは、各ウェルに試料を注入して異なる培地等で同時に培養しながら実験を行うことができるため、取扱い易さや省スペース化の向上を図ることができる。なお、ウェルプレートには、１、６、２４、９６、３８４個等のウェルが形成されたものが知られている。特に、９６個のウェルが形成された９６ウェルプレートは創薬現場等においてよく用いられている。
Conventionally, when culturing a sample such as a cell, a culture vessel such as a petri dish (dish) or a well plate has been used.
The petri dish is made of a transparent plastic such as polystyrene and is composed of a circular dish member and a lid member, and is used by injecting a culture solution (medium) for culturing the sample and the sample by opening the lid member. Such petri dishes are classified into a plurality of types, for example, 35, 60, and 100 mm dishes, depending on the size of the diameter.
The well plate is made of plastic like the petri dish, and is composed of a plate-like member and a lid member on which many small cylindrical recesses (wells) for culturing a sample are formed. Such a well plate can be tested while injecting a sample into each well and simultaneously culturing in different media or the like, so that it is possible to improve ease of handling and space saving. In addition, well plates in which 1, 6, 24, 96, 384, etc. are formed are known. In particular, a 96-well plate in which 96 wells are formed is often used at drug discovery sites.
ここで、上述のような培養容器、特にウェルの内径が小さな９６ウェルプレート等においては、ウェルに培養液を注入すると、培養液の液面が表面張力によって湾曲し凹面を形成してしまう。このため、斯かるウェルプレートを顕微鏡のステージに載置して試料を観察する場合には、培養液の凹面で生じたレンズ効果（メニスカス効果）の影響によって試料の観察像が劣化してしまうという問題があった。
そこで、このような問題を解消するために、ウェルプレートと、ウェルプレートの各ウェルに対向するように配置された、培養液の凹面によるレンズ効果を打ち消すためのレンズアレイとからなる培養容器を備えた顕微鏡が提案されている（例えば、特許文献１を参照。）。
Here, in a culture vessel as described above, particularly a 96-well plate with a small inner diameter of the well, when the culture solution is injected into the well, the liquid level of the culture solution is curved due to surface tension to form a concave surface. Therefore, when such a well plate is placed on a microscope stage and the sample is observed, the observation image of the sample is deteriorated due to the lens effect (meniscus effect) generated on the concave surface of the culture solution. There was a problem.
Therefore, in order to solve such a problem, a culture vessel comprising a well plate and a lens array arranged so as to face each well of the well plate to cancel the lens effect due to the concave surface of the culture solution is provided. A microscope has been proposed (see, for example, Patent Document 1).
しかしながら、上述のような従来の顕微鏡では、レンズ効果をレンズアレイによって効果的に打ち消すことができず、試料の良好な観察像を得ることができないという問題があった。
そこで本発明は上記問題点に鑑みてなされたものであり、培養容器中の試料を観察する際に培養液にレンズ効果が生じている場合でも、試料の良好な観察像を得ることが可能な顕微鏡、培養観察装置を提供することを目的とする。
However, the conventional microscope as described above has a problem that the lens effect cannot be effectively canceled by the lens array, and a good observation image of the sample cannot be obtained.
Therefore, the present invention has been made in view of the above problems, and it is possible to obtain a good observation image of a sample even when a lens effect occurs in the culture solution when observing the sample in the culture vessel. An object is to provide a microscope and a culture observation apparatus.
上記課題を解決するために本発明は、
観察対象となる試料と前記試料を培養する培養液とを保持する培養容器内に、前記培養液中に浸した状態で前記試料を観察するための顕微鏡において、
前記試料を第１の観察方法で観察するための第１光学系と、
前記試料を第２の観察方法で観察するための第２光学系と、
を含む少なくとも２つの光学系を切替可能に有しており、
前記第１光学系は、照明光学系と、対物レンズを有する観察光学系とを有し、前記照明光学系から射出される照明光の実効的なＮＡを前記対物レンズの開口数よりも小さくすることが可能であり、
前記培養容器中の観察位置に応じて、前記少なくとも２つの光学系を切り替えて使用することを特徴とする顕微鏡。
In order to solve the above problems, the present invention
In a culture vessel holding a sample to be observed and a culture medium for culturing the sample, in a microscope for observing the sample in a state immersed in the culture solution,
A first optical system for observing the sample by a first observation method;
A second optical system for observing the sample by a second observation method;
And at least two optical systems including
The first optical system includes an illumination optical system and an observation optical system having an objective lens, and makes an effective NA of illumination light emitted from the illumination optical system smaller than the numerical aperture of the objective lens. Is possible and
A microscope characterized in that the at least two optical systems are switched and used in accordance with an observation position in the culture vessel.
また本発明は、
前記顕微鏡と、
前記顕微鏡を収納する筐体と、
前記筐体内に配置されており、前記培養容器を格納するための棚部と、
前記培養容器を前記棚部から前記顕微鏡まで搬送する搬送部と、
前記筐体内を所定の環境に維持するための環境維持部と、
を有することを特徴とする培養観察装置を提供する。
The present invention also provides
The microscope;
A housing for housing the microscope;
A shelf that is disposed within the housing for storing the culture vessel;
A transport unit for transporting the culture vessel from the shelf to the microscope;
An environment maintaining unit for maintaining the inside of the housing in a predetermined environment;
A culture observation apparatus is provided.
本発明によれば、培養容器中の試料を観察する際に培養液にレンズ効果が生じている場合でも、試料の良好な観察像を得ることが可能な顕微鏡、培養観察装置を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide a microscope and a culture observation apparatus capable of obtaining a good observation image of a sample even when a lens effect is generated in the culture medium when observing the sample in the culture vessel. it can.
はじめに、ウェルプレートの各ウェルに注入された培養液の凹面で生じるレンズ効果について詳細に説明する。
ウェルプレートで培養した試料を顕微鏡で明視野観察、位相差観察、或いは微分干渉観察等する場合、試料を透過照明することが必須である。しかしながら、ウェル内の試料を透過照明した際には、照明光が培養液の凹面のレンズ効果によって屈折してしまう。このため、屈折した照明光で照明された試料からの透過光は、対物レンズへ入射することができなくなってしまう。或いは、屈折した照明光がウェルの壁面で反射又は透過してしまい、ウェル内の試料を均一に照明することができなくなってしまう。
ここで、培養液の凹面によるレンズ効果の影響は、凹面の曲率半径が小さく、また当該凹面に対する照明光の入射角度が大きいほど大きくなる。また、ウェルの壁面近傍では、培養液の液面が表面張力によってせり上がるように湾曲するため、凹面の外周部分は略非球面形状となる。したがって、凹面の外周部分におけるレンズ効果の影響は非常に大きくなり、試料の観察がより困難になってしまう。
また、培養液の凹面でレンズ効果が発生すると、顕微鏡で得られる試料の観察像のコントラストが視野内の位置によって反転してしまう。具体的には、視野内の中心部では観察像が黒色で背景が白色であるのに対して、視野内の周辺部では観察像が白色で背景が黒色となり、視野内の周辺部にある試料を観察することが困難になってしまう。また、このように観察像の見え方が視野内の位置によって一様でないため、細胞カウンティング等の画像解析が困難になり、正確な解析及び培養の自動化システムの作成も阻害されることとなってしまう。
First, the lens effect generated on the concave surface of the culture solution injected into each well of the well plate will be described in detail.
When a sample cultured in a well plate is observed with a microscope for bright field observation, phase difference observation, differential interference observation, or the like, it is essential that the sample is transmitted and illuminated. However, when the sample in the well is transmitted and illuminated, the illumination light is refracted by the concave lens effect of the culture solution. For this reason, the transmitted light from the sample illuminated with the refracted illumination light cannot enter the objective lens. Alternatively, the refracted illumination light is reflected or transmitted by the wall surface of the well, and the sample in the well cannot be illuminated uniformly.
Here, the influence of the lens effect due to the concave surface of the culture solution becomes larger as the radius of curvature of the concave surface is smaller and the incident angle of the illumination light with respect to the concave surface is larger. Further, in the vicinity of the wall surface of the well, since the liquid level of the culture solution is curved so as to rise due to surface tension, the outer peripheral portion of the concave surface has a substantially aspherical shape. Therefore, the influence of the lens effect on the outer peripheral portion of the concave surface becomes very large, and the observation of the sample becomes more difficult.
In addition, when a lens effect occurs on the concave surface of the culture solution, the contrast of the observation image of the sample obtained with a microscope is reversed depending on the position in the field of view. Specifically, the observation image is black and the background is white in the center of the field of view, whereas the observation image is white and the background is black in the periphery of the field of view. It becomes difficult to observe. Moreover, since the appearance of the observation image is not uniform depending on the position in the field of view, image analysis such as cell counting becomes difficult, and accurate analysis and creation of an automated culture system are hindered. End up.
以上のような現象は、ウェルプレートに限られず殆ど全ての培養容器において発生する。そして、培養容器の試料を注入する凹部の径が小さいものほど、培養液の液面の湾曲した部分の占める割合が大きくなるため、視野内で観察困難な領域が大きくなる。特に、９６ウェルプレートにおいては、各ウェルの内径はΦ６．４ｍｍ程度であるが、ウェル内において観察が容易な領域は中心部のΦ２ｍｍ程度の範囲となってしまう。
また、レンズ効果を引き起こす培養液の凹面は、次のような要因によってその形状が変化する。
１）培養容器の種類（１〜３８４ウェルプレート、３５〜１００ｍｍディッシュ）
２）培養液の組成
３）培養容器の材質や培養容器表面のコーティング処理
４）培養液の量
特に、９６ウェルプレートにおいては、培養液の凹面の曲率半径が４．０〜１０．０程度まで変化し、ウェルの壁面近傍では上述のように凹面の外周部分が略非球面形状となる。
The above phenomenon occurs not only in well plates but in almost all culture vessels. And the smaller the diameter of the concave portion for injecting the sample in the culture container, the larger the proportion of the curved portion of the liquid surface of the culture solution, so the region that is difficult to observe in the field of view increases. In particular, in a 96-well plate, the inner diameter of each well is about Φ6.4 mm, but the region that can be easily observed in the well is in the range of about Φ2 mm at the center.
In addition, the shape of the concave surface of the culture solution causing the lens effect changes depending on the following factors.
1) Type of culture vessel (1-384 well plate, 35-100 mm dish)
2) Composition of culture solution 3) Material of culture vessel and coating treatment of culture vessel surface 4) Amount of culture solution Especially in 96-well plates, the radius of curvature of the concave surface of the culture solution is about 4.0 to 10.0. In the vicinity of the well wall, the outer peripheral portion of the concave surface has a substantially aspherical shape as described above.
また近年では、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞の研究が進み、再生医療に向けた研究が盛んになりつつある。斯かる研究においては、細胞が均一で純粋な、１つの細胞から増殖した細胞群を用いることが必要である。このような純化された細胞群を得るためには、培養容器中に細胞をまいてコロニーを形成させ、良好なコロニーのみを培養容器中からピックアップしなければならない。このため、顕微鏡を用いて培養容器の全域から良好なコロニーを探索する必要があり、斯かる作業のスループット向上のためには広視野での観察が可能な顕微鏡が求められることとなる。しかしながら、広視野即ち低倍率でレンズ効果のある培養容器を観察することは、視野内でレンズ効果の影響を受ける領域の割合が、狭い視野即ち高倍率で観察する場合よりも増えるということであり、レンズ効果の影響がより顕著になってしまう。したがって、前述のスループット向上のためには、広視野でありながらレンズ効果の影響を解消可能な顕微鏡が必要となる。
また、培養容器において細胞が注入される凹部は、通常、円筒形状である。このため、ユーザーが培養容器を手で持ち運ぶ際には、凹部内の培養液に凹部の中心を軸とした渦が生じてしまう。そしてこの渦の影響により、凹部内の細胞の生え方が一様でなくなってしまい、特に、凹部の壁面近傍に細胞が多く生えることとなる。このため、凹部内の細胞の数を精度良く確認するためには、凹部内の中心部だけでなく、凹部の壁面近傍に生えている細胞の数まで確認しなければならない。しかしながらこのように凹部の全域にわたって細胞の数を確認することは、上述したレンズ効果によって困難であった。
In recent years, research on iPS cells and ES cells has progressed, and research for regenerative medicine is becoming active. In such studies, it is necessary to use a group of cells grown from a single cell that is homogeneous and pure. In order to obtain such a purified cell group, cells must be dispersed in a culture vessel to form colonies, and only good colonies must be picked up from the culture vessel. For this reason, it is necessary to search for good colonies from the entire culture vessel using a microscope, and a microscope capable of observation with a wide field of view is required to improve the throughput of such work. However, observing a culture vessel that has a lens effect with a wide field of view, ie, low magnification, means that the proportion of the area affected by the lens effect within the field of view is greater than when observing with a narrow field of view, ie, high magnification. The effect of the lens effect becomes more prominent. Therefore, in order to improve the above-described throughput, a microscope capable of eliminating the influence of the lens effect while having a wide field of view is required.
Moreover, the recessed part into which a cell is inject | poured in a culture container is usually cylindrical shape. For this reason, when the user carries the culture container by hand, a vortex about the center of the recess is generated in the culture solution in the recess. Due to the influence of this vortex, the way of growing the cells in the recesses is not uniform, and in particular, many cells grow near the wall surface of the recesses. For this reason, in order to accurately confirm the number of cells in the recess, it is necessary to confirm not only the central portion in the recess but also the number of cells growing in the vicinity of the wall surface of the recess. However, it was difficult to confirm the number of cells over the entire area of the concave portion due to the lens effect described above.
以上をまとめると、従来の顕微鏡は、培養容器における培養液の凹面のレンズ効果によって、容器内の試料を透過照明して観察する、特に視野内の全域で観察することが困難になる。具体的には、次の５つの不具合が挙げられる。
１）培養容器の凹部の壁面へ向かってシェーディングが生じるため、視野の明るさが均一でない。
２）培養容器の凹部の壁面近傍には、照明光が全く届かない暗黒領域が発生し、試料が全く見えなくなってしまう。
３）培養容器の凹部の中心部に位置する試料と壁面近傍に位置する試料では、観察像のコントラストが反転してしまうため、画像解析を行うことが困難である。
４）レンズ効果の大きさは、培養容器の種類、培養液の組成、培養容器の材質、及び培養液の量等によって様々であるため、試料の観察条件が一様でない。
５）観察の精度を確保しながらスループットの向上を図るために、広視野で試料を観察することが望まれるものの、広視野の観察においてはレンズ効果の影響が顕著になる。
In summary, the conventional microscope makes it difficult to observe the sample in the container through transmission illumination, particularly in the entire field of view, due to the concave lens effect of the culture solution in the culture container. Specifically, there are the following five problems.
1) Since shading occurs toward the wall surface of the concave portion of the culture vessel, the brightness of the visual field is not uniform.
2) In the vicinity of the wall surface of the concave portion of the culture vessel, a dark region where the illumination light does not reach at all occurs, and the sample cannot be seen at all.
3) Since the contrast of the observation image is inverted between the sample located in the center of the concave portion of the culture vessel and the sample located near the wall surface, it is difficult to perform image analysis.
4) Since the magnitude of the lens effect varies depending on the type of the culture vessel, the composition of the culture solution, the material of the culture vessel, the amount of the culture solution, and the like, the observation conditions of the sample are not uniform.
5) Although it is desired to observe the sample with a wide field of view in order to improve the throughput while ensuring the accuracy of observation, the influence of the lens effect becomes significant in the observation of the wide field of view.
また近年では、複数の試料を観察位置の再現性を保持しながら顕微鏡によるタイムラプス観察やライブ観察を行うことが可能な培養観察装置が提案されている。この培養観察装置は、複数の培養容器に配した試料を培養したり、培養中の試料を培養環境下で自動観察及び自動撮影することが可能であり、これによって次のようなメリットを有している。
１）培養環境下での試料の観察が可能であるため、顕微鏡観察時の環境暴露による試料へのダメージが少ない。
２）培養中の試料の観察、記録、及び管理を自動で行うことが可能であるため、使用者の負担を軽減することができる。
しかしながら、斯かる培養観察装置においても、培養容器中の培養液にはレンズ効果が発生してしまう。特に、培養観察装置によって試料を自動で撮影する場合には、撮影された試料の画像を後で使用者が判断することとなるため、次のような問題が生じる。
１）オートフォーカスで自動撮影を行うが、レンズ効果の影響によってピントがボケてしまう。
２）レンズ効果によって視野の中心部又は周辺部で露光ムラが発生し、細胞が見えなくなってしまう。
３）前記１）、２）の影響により、細胞カウンティング等の画像解析が不能になってしまう。
In recent years, a culture observation apparatus capable of performing time-lapse observation or live observation with a microscope while maintaining reproducibility of observation positions of a plurality of samples has been proposed. This culture observation device can cultivate samples placed in a plurality of culture vessels, and can automatically observe and automatically shoot samples under culture in a culture environment. ing.
1) Since the sample can be observed in a culture environment, damage to the sample due to environmental exposure during microscopic observation is small.
2) Since it is possible to automatically observe, record, and manage the sample during culture, the burden on the user can be reduced.
However, even in such a culture observation apparatus, a lens effect occurs in the culture solution in the culture vessel. In particular, when a sample is automatically photographed by the culture observation apparatus, the user will later determine the photographed sample image, which causes the following problems.
1) Automatic shooting is performed with autofocus, but the focus is blurred due to the effect of the lens effect.
2) Due to the lens effect, exposure unevenness occurs at the center or periphery of the field of view, and the cells become invisible.
3) Due to the effects of 1) and 2), image analysis such as cell counting becomes impossible.
次に、本発明の各実施形態に係る培養観察装置について添付図面を参照して説明する。
（第１実施形態）
図１に示すように、第１実施形態に係る培養観察装置１は、箱状の第１筐体２ａとその下方に配置された箱状の第２筐体２ｂとからなる。
第１筐体２ａ内には、複数の培養容器３を格納するストッカー４、培養容器３をストッカー４から顕微鏡６まで搬送する搬送装置５、環境維持部１３、及び顕微鏡６の照明装置７とステージ２０が備えられている。なお、環境維持部１３は第１筐体２ａ内の温度、湿度、二酸化炭素濃度、及び酸素濃度等を調整するものであり、これによって第１筐体２ａ内を所定の培養環境に維持することができる。また、第１筐体２ａには扉８が設けられており、扉８の外面にはタッチパネルの機能を有する表示モニタ９が備えられている。
第２筐体２ｂ内には、搬送装置５、環境維持部１３、及び顕微鏡６等を制御するための制御部１０、及び顕微鏡本体１１が備えられている。なお、制御部１０には、後述する記憶部１０ａが備えられている。
Next, the culture observation apparatus according to each embodiment of the present invention will be described with reference to the accompanying drawings.
(First embodiment)
As shown in FIG. 1, the culture observation apparatus 1 according to the first embodiment includes a box-shaped first casing 2a and a box-shaped second casing 2b disposed below the box-shaped first casing 2a.
In the first housing 2a, a stocker 4 for storing a plurality of culture containers 3, a transport device 5 for transporting the culture containers 3 from the stocker 4 to the microscope 6, an environment maintaining unit 13, and an illumination device 7 for the microscope 6 and a stage 20 is provided. The environment maintaining unit 13 adjusts the temperature, humidity, carbon dioxide concentration, oxygen concentration, and the like in the first housing 2a, thereby maintaining the inside of the first housing 2a in a predetermined culture environment. Can do. Moreover, the door 8 is provided in the 1st housing | casing 2a, and the display monitor 9 which has the function of a touch panel is provided in the outer surface of the door 8. FIG.
In the second housing 2b, a transport device 5, an environment maintaining unit 13, a control unit 10 for controlling the microscope 6 and the like, and a microscope main body 11 are provided. The control unit 10 includes a storage unit 10a described later.
図２に示すように顕微鏡６は、培養容器３の凹部３ａに培養液１２とともに注入されている試料１３を観察するものであり、照明装置７とステージ２０と顕微鏡本体１１とからなる。
顕微鏡本体１１は、位相差観察部１６と新明視野観察部１７を切替可能に保持する回転切替部１８と、撮像部１９とを有している。
なお、回転切替部１８には、制御部１０からの指示により回転切替部１８を軸Ｏを中心に回転させるための不図示の駆動部が備えられており、これによって位相差観察部１６と新明視野観察部１７を切り替えて選択的に光路中に配置することができる。また、位相差観察部１６と新明視野観察部１７の構成については後述する。
撮像部１９には、２／３インチＣＣＤカメラが備えられている。
As shown in FIG. 2, the microscope 6 observes the sample 13 injected into the concave portion 3 a of the culture vessel 3 together with the culture solution 12, and includes the illumination device 7, the stage 20, and the microscope body 11.
The microscope main body 11 includes a rotation switching unit 18 that holds the phase difference observation unit 16 and the new bright field observation unit 17 in a switchable manner, and an imaging unit 19.
The rotation switching unit 18 is provided with a drive unit (not shown) for rotating the rotation switching unit 18 around the axis O in accordance with an instruction from the control unit 10. The bright field observation unit 17 can be switched and selectively placed in the optical path. The configurations of the phase difference observation unit 16 and the new bright field observation unit 17 will be described later.
The imaging unit 19 is provided with a 2/3 inch CCD camera.
照明装置７は、位相差照明部２１と新明視野照明部２２を切替可能に保持する回転切替部２３と、光源２５とを有している。
なお、回転切替部２３には、制御部１０からの指示により回転切替部２３を軸Ｑを中心に回転させるための不図示の駆動部が備えられており、これによって位相差照明部２１と新明視野照明部２２を切り替えて選択的に光路中に配置することができる。また、位相差照明部２１と新明視野照明部２２の構成については後述する。
光源２５には、コヒーレント性の高い赤色ＬＥＤ（発光ダイオード）が用いられている。これにより、照明の均一化と長寿命化を図ることができる。また、培養液１２内のフェノールレッド等の栄養素が培養液１２の劣化に伴って変色し、これが可視広域の光を吸収してしまうため、培養状態によって観察像の明るさが変化してしまうという影響を解消することができる。
ステージ２０には、ステージ２０を駆動するための不図示の駆動部と、当該駆動部によって駆動されたステージ２０の位置情報を検出するための不図示の位置検出部が備えられている。
The illumination device 7 includes a rotation switching unit 23 that holds the phase difference illumination unit 21 and the new bright field illumination unit 22 in a switchable manner, and a light source 25.
The rotation switching unit 23 is provided with a drive unit (not shown) for rotating the rotation switching unit 23 around the axis Q in accordance with an instruction from the control unit 10. The bright field illumination unit 22 can be switched and selectively placed in the optical path. The configurations of the phase difference illumination unit 21 and the new bright field illumination unit 22 will be described later.
As the light source 25, a red LED (light emitting diode) with high coherency is used. Thereby, it is possible to achieve uniform illumination and long life. In addition, nutrients such as phenol red in the culture solution 12 change color as the culture solution 12 deteriorates, and this absorbs light in a wide visible range, so that the brightness of the observation image changes depending on the culture state. The effect can be eliminated.
The stage 20 includes a drive unit (not shown) for driving the stage 20 and a position detection unit (not shown) for detecting position information of the stage 20 driven by the drive unit.
ここで、位相差観察部１６は、ステージ２０側から順に、対物レンズ２６、及び結像レンズ２７を有する。また、対物レンズ２６の瞳面には、リング形状の位相膜（不図示）が配置されている。
位相差照明部２１は、ステージ２０側から順に、コンデンサレンズ２７、リング形状の開口が形成されたリング絞り（不図示）、及びコリメートレンズ（不図示）を有する。なお、リング絞りは、位相差観察部１６の対物レンズ２６中の位相膜に対して共役となるように配置されている。
斯かる構成の下、回転切替部１８，２３によって位相差照明部２１と位相差観察部１６を光路中に配置した際には、培養容器３の凹部３ａ中の試料１３を位相差観察することが可能となる。
Here, the phase difference observation unit 16 includes an objective lens 26 and an imaging lens 27 in order from the stage 20 side. A ring-shaped phase film (not shown) is disposed on the pupil plane of the objective lens 26.
The phase difference illumination unit 21 includes, in order from the stage 20 side, a condenser lens 27, a ring stop (not shown) in which a ring-shaped opening is formed, and a collimating lens (not shown). The ring diaphragm is arranged so as to be conjugate with the phase film in the objective lens 26 of the phase difference observation unit 16.
Under such a configuration, when the phase difference illumination unit 21 and the phase difference observation unit 16 are arranged in the optical path by the rotation switching units 18 and 23, the phase difference of the sample 13 in the recess 3a of the culture vessel 3 is observed. Is possible.
新明視野観察部１７は、図２に示すように、ステージ２０側から順に、第１対物レンズ３０、及び第２対物レンズ３１を有する。
第１対物レンズ３０は、培養容器３の凹部３ａの底面から射出された光を略漏れなく集光するための高い開口数（ＮＡ）を有する対物レンズであり、本実施形態においてはΦ６．４ｍｍ程度の実視野を実現するために、倍率が１．２５倍、開口数が０．２５以上のものが用いられている。また、第１対物レンズ３０には、第１対物レンズ３０を光軸方向へ移動させるための不図示の駆動部が備えられている。このため、当該駆動部によって第１対物レンズ３０を光軸方向へ移動させることで合焦位置を変更することができる。
As illustrated in FIG. 2, the new bright field observation unit 17 includes a first objective lens 30 and a second objective lens 31 in order from the stage 20 side.
The first objective lens 30 is an objective lens having a high numerical aperture (NA) for condensing light emitted from the bottom surface of the concave portion 3a of the culture vessel 3 with almost no leakage, and in the present embodiment, Φ6.4 mm. In order to realize a real field of view, a lens with a magnification of 1.25 times and a numerical aperture of 0.25 or more is used. The first objective lens 30 is provided with a drive unit (not shown) for moving the first objective lens 30 in the optical axis direction. Therefore, the in-focus position can be changed by moving the first objective lens 30 in the optical axis direction by the driving unit.
新明視野照明部２２は、図３に示すように、ステージ２０側から順に、コンデンサレンズ３３、開口絞り３４、可動絞り３５、及びコレクタレンズ３６を有する。
可動絞り３５は、培養容器３の凹部３ａの底面を略均一に照明するための所謂低ＮＡの照明光を生成するための絞り部材である。本実施形態において可動絞り３５には、新明視野照明部２２から射出される照明光の実効的なＮＡが０．１以下となるように、絞り径や光軸上の位置等が予め設計された絞り部材が用いられている。ここで、照明光の実効的なＮＡとは、新明視野照明部２２から射出される照明光のうち、新明視野観察部１７の第１対物レンズ３０に入射する観察光を形成する照明光のＮＡをいう。なお、斯かる可動絞り３５は、照明光が凹部３ａの壁面で反射又は透過することを防止するために、照明光の光束が凹部３ａの内径よりも小さくなるように照明光の照射領域を絞る役割も果たしている。
また、可動絞り３５には、可動絞り３５を光軸方向へ移動させるための不図示の駆動部と、可動絞り３５の絞り径を変更するための不図示の調整機構とが備えられている。これにより、前記駆動部によって可動絞り３５を光軸方向へ移動させることで、照明光の実効的なＮＡを変更するとともに照明光の主光線の方向を変更することができる。また、前記調整機構によって可動絞り３５の絞り径を変更することで、照明光の実効的なＮＡを変更することができる。
As illustrated in FIG. 3, the new bright field illumination unit 22 includes a condenser lens 33, an aperture stop 34, a movable stop 35, and a collector lens 36 in order from the stage 20 side.
The movable diaphragm 35 is a diaphragm member for generating so-called low NA illumination light for illuminating the bottom surface of the recess 3a of the culture vessel 3 substantially uniformly. In the present embodiment, the diameter of the stop, the position on the optical axis, and the like are designed in advance so that the effective NA of the illumination light emitted from the new bright field illumination unit 22 is 0.1 or less. A diaphragm member is used. Here, the effective NA of the illumination light is the illumination light that forms the observation light incident on the first objective lens 30 of the new bright field observation unit 17 out of the illumination light emitted from the new bright field illumination unit 22. Of NA. The movable diaphragm 35 restricts the illumination light irradiation area so that the luminous flux of the illumination light is smaller than the inner diameter of the recess 3a in order to prevent the illumination light from being reflected or transmitted by the wall surface of the recess 3a. It also plays a role.
Further, the movable diaphragm 35 is provided with a drive unit (not shown) for moving the movable diaphragm 35 in the optical axis direction and an adjustment mechanism (not shown) for changing the diaphragm diameter of the movable diaphragm 35. Thereby, by moving the movable stop 35 in the optical axis direction by the drive unit, the effective NA of the illumination light can be changed and the direction of the principal ray of the illumination light can be changed. Further, the effective NA of the illumination light can be changed by changing the stop diameter of the movable stop 35 by the adjusting mechanism.
斯かる構成の下、回転切替部１８，２３によって新明視野照明部２２と新明視野観察部１７を光路中に配置した際には、光源２５から発せられた照明光は、コレクタレンズ３６を経て可動絞り３５と開口絞り３４を通過した後、コンデンサレンズ３３によって集光されて、培養容器３の凹部３ａ中の試料１３に培養液１２を介して照射される。なお、斯かる照明光は、可動絞り３５を通過することで実効的なＮＡと主光線の方向が適切に制御され、実効的なＮＡが第１対物レンズ３０の開口数よりも小さくなっている。
ここで、培養容器３の凹部３ａ中の培養液１２の液面は上述のように凹面となってレンズ効果を生じる。そこで、このような液面に対して実効的なＮＡの小さな照明光を照射することで、照明光が当該液面で屈折しても、凹部３ａの壁面で反射又は透過することを防止することができる。詳細には、照明光の主光線の方向は可動絞り３５の光軸上の位置に応じて変化する。このため、本実施形態において可動絞り３５の光軸上の位置は、照明光の主光線が培養液１２の液面で屈折される方向を考慮し、培養液１２の液面で屈折された照明光の主光線の方向が光軸に対して前記屈折される方向と逆方向へ向くように予め設定されており、これによって照明光が凹部３ａの壁面で反射又は透過することを防止することができる。したがって、照明光が凹部３ａ内のみを進行することとなり、凹部３ａの底面をムラなく略均一に照明することが可能となり、また、凹部３ａの底面から射出された光を第１対物レンズ３０へ入射させることが可能となる。
Under such a configuration, when the new bright field illumination unit 22 and the new bright field observation unit 17 are arranged in the optical path by the rotation switching units 18 and 23, the illumination light emitted from the light source 25 passes through the collector lens 36. Then, after passing through the movable diaphragm 35 and the aperture diaphragm 34, the light is condensed by the condenser lens 33 and irradiated to the sample 13 in the concave portion 3 a of the culture vessel 3 through the culture solution 12. Note that such illumination light passes through the movable aperture 35 so that the effective NA and the direction of the principal ray are appropriately controlled, and the effective NA is smaller than the numerical aperture of the first objective lens 30. .
Here, the liquid level of the culture solution 12 in the concave portion 3a of the culture vessel 3 becomes concave as described above to produce a lens effect. Therefore, by irradiating illumination light having a small effective NA to such a liquid surface, even if the illumination light is refracted on the liquid surface, it is prevented from being reflected or transmitted by the wall surface of the recess 3a. Can do. Specifically, the direction of the chief ray of the illumination light changes according to the position of the movable diaphragm 35 on the optical axis. For this reason, the position on the optical axis of the movable diaphragm 35 in this embodiment takes into account the direction in which the chief ray of the illumination light is refracted by the liquid surface of the culture solution 12, and the illumination refracted by the liquid surface of the culture solution 12 The direction of the principal ray of light is set in advance so as to be directed in the direction opposite to the direction of refraction with respect to the optical axis, thereby preventing the illumination light from being reflected or transmitted by the wall surface of the recess 3a. it can. Accordingly, the illumination light travels only in the concave portion 3a, and the bottom surface of the concave portion 3a can be illuminated substantially uniformly without any unevenness, and the light emitted from the bottom surface of the concave portion 3a is directed to the first objective lens 30. It becomes possible to make it enter.
そして、以上のように第１対物レンズ３０の開口数よりも実効的なＮＡの小さな照明光で照明された試料１３からの光は第１対物レンズ３０に入射する。ここで、第１対物レンズ３０は上述のように開口数が十分に大きいため、凹部３ａの底面から射出された光を略漏れなく集光することができる。このようにして第１対物レンズ３０によって集光された光は、第２対物レンズ３１を介して撮像部１９の撮像面上に試料１３の観察像を形成する。詳細には、上述のように実効的なＮＡと主光線の方向を適切に設定した照明光によって、凹部３ａの壁面での反射光即ちノイズ光の発生を抑えながら凹部３ａの底面を略均一に照明することで、試料１３の背景（バックグラウンド）からの光（直接光）のＮＡが小さくなるため、斯かる直接光と試料１３で回折された回折光とが干渉してコントラストの良好な観察像が形成されることとなる。このようにして形成された試料１３の観察像は撮像部１９で撮影され、表示モニタ９や不図示のパーソナルコンピュータのモニタに表示されて使用者に観察されることとなる。なお、以上のように新明視野照明部２２と新明視野観察部１７を用いて行う観察を新明視野観察と称する。 As described above, the light from the sample 13 illuminated with the illumination light having an effective NA smaller than the numerical aperture of the first objective lens 30 enters the first objective lens 30. Here, since the first objective lens 30 has a sufficiently large numerical aperture as described above, the light emitted from the bottom surface of the recess 3a can be collected almost without leakage. The light condensed by the first objective lens 30 in this way forms an observation image of the sample 13 on the imaging surface of the imaging unit 19 via the second objective lens 31. Specifically, as described above, the bottom surface of the concave portion 3a is made substantially uniform while suppressing the generation of reflected light, that is, noise light, on the wall surface of the concave portion 3a by the illumination light in which the effective NA and the principal ray direction are appropriately set. By illuminating, the NA of the light (direct light) from the background of the sample 13 is reduced, so that the direct light and the diffracted light diffracted by the sample 13 interfere with each other to observe with good contrast. An image will be formed. The observation image of the sample 13 formed in this way is taken by the imaging unit 19 and displayed on the display monitor 9 or a monitor of a personal computer (not shown) and observed by the user. Note that observation performed using the new bright field illumination unit 22 and the new bright field observation unit 17 as described above is referred to as new bright field observation.
上述のように、培養液１２のレンズ効果の大きさは、培養容器３の種類や材質、培養液１２の組成や量等によって様々に変化する。特に、培養容器３の種類によって培養液１２の凹面の直径は異なり、これによって凹面の曲率半径は大きく変化し、レンズ効果も大きく変化することとなる。そして、レンズ効果が大きく変化すれば、培養容器３の凹部３ａの底面を略均一に照明することが困難になってしまうおそれがある。
そこで、本実施形態における顕微鏡６は、培養液１２のレンズ効果の変化に応じて、可動絞り３５を光軸方向に移動させたり、可動絞り３５の絞り径を変更することで、照明光の実効的なＮＡや照明光の主光線の方向を変更することができる。これにより、培養液１２のレンズ効果が変化した場合でも、これに対応する実効的なＮＡと主光線の方向を設定した低ＮＡの照明光によって凹部３ａの底面を略均一に照明することができ、レンズ効果の影響を解消した試料１３の観察像を取得することができる。
As described above, the magnitude of the lens effect of the culture solution 12 varies depending on the type and material of the culture vessel 3, the composition and amount of the culture solution 12, and the like. In particular, the diameter of the concave surface of the culture solution 12 differs depending on the type of the culture vessel 3, and the radius of curvature of the concave surface changes greatly, and the lens effect also changes greatly. And if a lens effect changes greatly, there exists a possibility that it may become difficult to illuminate the bottom face of the recessed part 3a of the culture container 3 substantially uniformly.
Therefore, the microscope 6 in this embodiment moves the movable diaphragm 35 in the optical axis direction or changes the diaphragm diameter of the movable diaphragm 35 in accordance with the change in the lens effect of the culture solution 12, so that the effective illumination light can be obtained. The direction of the principal ray of the general NA and illumination light can be changed. As a result, even when the lens effect of the culture solution 12 changes, the bottom surface of the recess 3a can be illuminated substantially uniformly by the low NA illumination light in which the effective NA corresponding to this and the direction of the principal ray are set. An observation image of the sample 13 in which the influence of the lens effect is eliminated can be acquired.
ここで、可動絞り３５を光軸方向へ移動させることによる照明光の主光線の方向の変更について具体的に説明する。
図４（ａ）に示すように、培養容器３の凹部３ａ中の培養液１２の凹面の曲率半径が小さい、即ち培養液１２のレンズ効果が大きい場合、斯かる培養液１２に主光線の方向を光軸と略同じ方向とした照明光を照射すれば、凹面で屈折した光は、凹部３ａの壁面で反射又は透過することはないものの、第１対物レンズ３０に入射することができなくなってしまい、所謂、視野欠けを招くこととなってしまう。
このため、図４（ｂ）に示すように、可動絞り３５を光源２５側へ移動させて光軸に対する照明光の主光線の角度を大きくすることで、凹面で屈折した光は、凹部３ａの壁面で反射又は透過することなく、第１対物レンズ３０に漏れなく入射することができ、これによりレンズ効果の影響を解消した試料１３の観察像を取得することが可能となる。
Here, the change of the direction of the chief ray of the illumination light by moving the movable diaphragm 35 in the optical axis direction will be specifically described.
As shown in FIG. 4A, when the radius of curvature of the concave surface of the culture solution 12 in the recess 3a of the culture vessel 3 is small, that is, when the lens effect of the culture solution 12 is large, the direction of the chief ray in the culture solution 12 Is irradiated with illumination light having substantially the same direction as the optical axis, the light refracted by the concave surface is not reflected or transmitted by the wall surface of the concave portion 3a, but cannot enter the first objective lens 30. As a result, a so-called lack of visual field is caused.
For this reason, as shown in FIG. 4B, by moving the movable diaphragm 35 toward the light source 25 and increasing the angle of the principal ray of the illumination light with respect to the optical axis, the light refracted on the concave surface is reflected by the concave portion 3a. Without being reflected or transmitted by the wall surface, the light can enter the first objective lens 30 without omission, whereby an observation image of the sample 13 in which the influence of the lens effect is eliminated can be acquired.
また、図４（ｃ）に示すように、培養液１２の凹面の曲率半径が大きい、即ち培養液１２のレンズ効果が小さい場合には、斯かる培養液１２に光軸に対して主光線の角度を大きく傾けた照明光を照射すれば、照明光の一部が凹部３ａの壁面に外側から直接照射されてケラれてしまうため、視野内にシェーディングが生じることとなってしまう。
このため、図４（ｄ）に示すように、可動絞り３５をステージ２０側へ移動させて光軸に対する照明光の主光線の角度を小さくすることで、照明光が凹部３ａの壁面でケラれることを防止でき、レンズ効果の影響を解消した試料１３の観察像を取得することが可能となる。
以上より、本実施形態における顕微鏡６では、培養液１２の凹面の形状、即ちレンズ効果の大きさに応じて、当該レンズ効果の影響を解消することに最適な位置に可動絞り３５を配置することが好ましい。なお、可動絞り３５の絞り径を変更して照明光の実効的なＮＡを変更する際にも、レンズ効果の大きさに応じて適切に設定することが好ましい。
In addition, as shown in FIG. 4C, when the curvature radius of the concave surface of the culture solution 12 is large, that is, when the lens effect of the culture solution 12 is small, the principal ray of the culture solution 12 is not incident on the optical axis. If illumination light with a large angle is irradiated, a part of the illumination light is directly irradiated from the outside onto the wall surface of the recess 3a and vignetting occurs, so that shading occurs in the field of view.
Therefore, as shown in FIG. 4D, the illumination light is vignetted on the wall surface of the recess 3a by moving the movable diaphragm 35 toward the stage 20 to reduce the angle of the principal ray of the illumination light with respect to the optical axis. This makes it possible to obtain an observation image of the sample 13 in which the influence of the lens effect is eliminated.
As described above, in the microscope 6 according to the present embodiment, the movable diaphragm 35 is arranged at a position optimal for eliminating the influence of the lens effect according to the shape of the concave surface of the culture solution 12, that is, the magnitude of the lens effect. Is preferred. In addition, when changing the aperture diameter of the movable aperture 35 to change the effective NA of the illumination light, it is preferable to set appropriately according to the magnitude of the lens effect.
以上に述べた新明視野観察によれば、全域にわたって明るさの略均一な視野を実現し、コントラストの良好な試料１３の観察像を得ることができる。具体的には、次の５つの効果を奏することができる。
１）培養容器３の凹部３ａの壁面へ向かってシェーディングが生じることを解消し、全域にわたって明るさの略均一な視野で試料１３を観察することができる。
２）培養容器３の凹部３ａの底面を略均一に照明することができるため、視野の全域で、コントラストの一様な試料１３を観察することができる。
３）前記１）、２）の結果、ソフトウェア等によるセルカウンティング等の画像解析を行うことが容易になる。
４）培養液１２のレンズ効果が変化した場合でも、可動絞り３５を光軸方向へ移動させること等により、レンズ効果の影響を解消した試料１３の観察像を取得することができる。また、受精卵観察用培地ドロップ等のように培養液１２の凹面形状が逆転する観察対象にも対応することができる。
５）後述のように広視野で試料１３を観察することができるため、観察の精度を確保しながらスループットの向上を図ることができる。
According to the new bright field observation described above, a substantially uniform field of view can be realized over the entire area, and an observation image of the sample 13 with good contrast can be obtained. Specifically, the following five effects can be achieved.
1) It is possible to eliminate the occurrence of shading toward the wall surface of the recess 3a of the culture vessel 3, and the sample 13 can be observed with a substantially uniform field of view over the entire area.
2) Since the bottom surface of the recess 3a of the culture vessel 3 can be illuminated substantially uniformly, the sample 13 having a uniform contrast can be observed in the entire field of view.
3) As a result of 1) and 2), it becomes easy to perform image analysis such as cell counting by software or the like.
4) Even when the lens effect of the culture solution 12 is changed, an observation image of the sample 13 in which the influence of the lens effect is eliminated can be obtained by moving the movable diaphragm 35 in the optical axis direction. Moreover, it can respond also to the observation object which the concave shape of the culture solution 12 reverses, such as a culture drop for fertilized egg observation.
5) Since the sample 13 can be observed with a wide field of view as described later, the throughput can be improved while ensuring the accuracy of observation.
ここで、上述のように再生医療の研究等において培養した細胞を観察する際には、低倍率で視野の全域を観察することが求められており、培養液のレンズ効果の影響を考慮しながら視野の全域で観察を行うためには、第１対物レンズに０．２５相当の開口数と１．２５倍程度の倍率が必要となる。
そこで、本実施形態における顕微鏡６は、上述のように照明光の実効的なＮＡを０．１以下、第１対物レンズ３０の倍率を１．２５倍、開口数を０．２５以上とすることで、視野の全域（Φ６．４ｍｍ程度の実視野）での新明視野観察を実現している。また、上述のように９６ウェルプレートにおけるウェルの内径はΦ６．４ｍｍ程度であるため、培養容器３に９６ウェルプレートを用いる場合には、２／３インチＣＣＤカメラを備えた撮像部１９によって、９６ウェルプレートのウェルの底面全域を１枚の画像として撮影することができる。即ち、最大限のスループットでレンズ効果の影響を解消した試料１３の観察像を取得することが可能となる。
Here, when observing cells cultured in regenerative medicine research and the like as described above, it is required to observe the entire field of view at a low magnification, while taking into consideration the influence of the lens effect of the culture solution. In order to perform observation over the entire field of view, the first objective lens requires a numerical aperture equivalent to 0.25 and a magnification of about 1.25 times.
Therefore, as described above, the microscope 6 in this embodiment has an effective NA of illumination light of 0.1 or less, a magnification of the first objective lens 30 of 1.25 times, and a numerical aperture of 0.25 or more. Therefore, new bright field observation is realized in the entire field of view (real field of view of about 6.4 mm). Further, as described above, since the inner diameter of the well in the 96-well plate is about 6.4 mm, when the 96-well plate is used for the culture vessel 3, the imaging unit 19 equipped with a 2/3 inch CCD camera is used. The entire bottom surface of the well of the well plate can be taken as a single image. That is, it is possible to acquire an observation image of the sample 13 in which the influence of the lens effect is eliminated with the maximum throughput.
一方、本実施形態の顕微鏡６において、培養容器３に内径の大きなウェルが形成されたウェルプレート（例えば、６ウェルプレート等）を用いて新明視野観察を行う場合、培養液の液面は、ウェルの壁面付近で湾曲し、ウェルの中心付近では略平坦となる。このため、ウェルの壁面付近を新明視野観察すれば画質の改善を実現できるものの、ウェルの中心付近を新明視野観察すれば画質の劣化（特に、画像の明るさムラ等）が発生してしまうおそれがある。このことは、９６ウェルプレート等のようにウェルの内径が小さい場合、即ち培養液の液面全体が湾曲し、レンズ効果が液面全体で発生する場合には問題とならない。なお、斯かる問題は、ウェルプレートに限られず、ディッシュ等のその他の培養容器を用いて新明視野観察を行う際にも同様に生じるものである。 On the other hand, in the microscope 6 of this embodiment, when performing a new bright field observation using a well plate (for example, a 6-well plate) in which a well having a large inner diameter is formed in the culture vessel 3, the liquid level of the culture solution is: It is curved near the wall surface of the well and is substantially flat near the center of the well. For this reason, image quality can be improved by observing the vicinity of the wall of the well with a new bright field of view, but deterioration of the image quality (especially uneven brightness of the image, etc.) occurs when observing near the center of the well. There is a risk that. This is not a problem when the inner diameter of the well is small as in a 96-well plate or the like, that is, when the entire liquid surface of the culture solution is curved and the lens effect occurs over the entire liquid surface. Such a problem is not limited to the well plate, but also occurs when a new bright field observation is performed using another culture vessel such as a dish.
そこで、本実施形態に係る培養観察装置１は、培養容器３の凹部３ａ中の観察位置に応じて観察方法を自動的に切り替えて試料１３を自動的に撮影するための観察方法切替ルーチンを実行可能に構成されている。
図５に示す本実施形態の観察方法切替ルーチンは、使用者が表示モニタ９を操作して本ルーチンの開始の指示を制御部１０へ入力することで開始される。なお、使用者は、本ルーチンを実行するにあたり、位相差観察部１６の対物レンズ１６や位相差照明部２１のリング絞り等の情報を制御部１０へ予め入力しておく。
ステップＳ１：制御部１０が、ステージ２０に培養容器３が載置されているか否かを判定する。ステージ２０に培養容器３が載置されている場合はステップＳ２へ進み、そうでない場合は本ステップＳ１を再度実行する。
Therefore, the culture observation apparatus 1 according to this embodiment executes an observation method switching routine for automatically photographing the sample 13 by automatically switching the observation method according to the observation position in the recess 3a of the culture vessel 3. It is configured to be possible.
The observation method switching routine of this embodiment shown in FIG. 5 is started when the user operates the display monitor 9 and inputs an instruction to start this routine to the control unit 10. Note that the user inputs information such as the objective lens 16 of the phase difference observation unit 16 and the ring stop of the phase difference illumination unit 21 to the control unit 10 in advance when executing this routine.
Step S <b> 1: The control unit 10 determines whether or not the culture vessel 3 is placed on the stage 20. If the culture vessel 3 is placed on the stage 20, the process proceeds to step S2, and if not, this step S1 is executed again.
ステップＳ２：制御部１０が、使用者によって各種情報が制御部１０へ入力されているか否かを判定する。各種情報が制御部１０へ入力されている場合はステップＳ３へ進み、そうでない場合は本ステップＳ２を再度実行する。ここで、本実施形態において各種情報とは、培養容器３の種類（６〜３８４ウェルプレート、３５〜１００ｍｍディッシュ、受精卵観察用培地ドロップ等）、培養容器３の材質とコーティング、培養液１２の組成、培養液１２の量、及び試料１３として観察する細胞の種類（大きさや形状）等である。
ステップＳ３：制御部１０が、各種情報に基づくシミュレーションによって培養容器３の凹部３ａ中の培養液１２の液面の形状（具体的には、曲率半径）を算出し、算出した液面の形状に基づいて、凹部３ａ中の観察位置に応じて観察方法を切り替えるための基準となる切替位置情報を算出する。ここで、切替位置情報とは、培養液１２の液面の凹部３ａの壁面付近の湾曲部分と中心付近の平坦部分との境界を規定し、当該平坦部分の範囲（例えば、培養容器３に６ウェルプレートを用いた場合、培養液１２の液面において曲率半径が１００以上となる凹部３ａの中心から半径１２ｍｍの円形の範囲等）を示すものである。なお、斯かる範囲を切替範囲と称する。
ステップＳ４：制御部１０が、使用者又は制御部１０の指示によってステージ２０が操作されたか否かを判定する。ステージ２０が操作された場合はステップＳ５へ進み、そうでない場合は本ステップＳ４を再度実行する。
Step S2: The control unit 10 determines whether various types of information are input to the control unit 10 by the user. If various types of information are input to the control unit 10, the process proceeds to step S3. If not, step S2 is executed again. Here, in this embodiment, various information includes the type of the culture vessel 3 (6-384 well plate, 35-100 mm dish, medium drop for fertilized egg observation, etc.), the material and coating of the culture vessel 3, and the culture solution 12. The composition, the amount of the culture solution 12, and the type (size and shape) of the cells observed as the sample 13.
Step S3: The control unit 10 calculates the shape (specifically, the radius of curvature) of the culture solution 12 in the recess 3a of the culture vessel 3 by simulation based on various information, and the calculated shape of the liquid level is obtained. Based on this, the switching position information serving as a reference for switching the observation method according to the observation position in the recess 3a is calculated. Here, the switching position information defines the boundary between the curved portion near the wall surface of the recess 3a of the liquid surface of the culture solution 12 and the flat portion near the center, and the range of the flat portion (for example, 6 to the culture vessel 3). In the case of using a well plate, a circular range having a radius of 12 mm from the center of the concave portion 3a having a radius of curvature of 100 or more on the liquid surface of the culture solution 12 is shown. Such a range is referred to as a switching range.
Step S4: The control unit 10 determines whether or not the stage 20 has been operated according to a user or an instruction from the control unit 10. If the stage 20 is operated, the process proceeds to step S5, and if not, this step S4 is executed again.
ステップＳ５：制御部１０が、不図示の位置検出部で検出されたステージ２０の位置情報に基づいて、使用者が観察しようとしている凹部３ａ中の観察位置を算出し、当該観察位置がステップＳ３で求めた切替範囲外にあるか否かを判定する。観察位置が切替範囲外にある場合、言い換えれば観察位置に対応する培養液１２の液面の形状が湾曲している場合はステップＳ６へ進む。一方、観察位置が切替範囲内にある場合、言い換えれば観察位置に対応する培養液１２の液面の形状が略平坦である場合にはステップＳ７へ進む。
ステップＳ６：制御部１０が、回転切替部１８，２３を回転させて新明視野照明部２２と新明視野観察部１７を光路中に配置する。これによって顕微鏡６は新明視野観察を行うことが可能な状態になる。
ステップＳ７：制御部１０が、回転切替部１８，２３を回転させて位相差照明部２１と位相差観察部１６を光路中に配置する。これによって顕微鏡６は位相差観察を行うことが可能な状態になる。
ステップＳ８：制御部１０の指示の下、撮像部１９が試料１３の画像を撮影する。
ステップＳ９：制御部１０が、表示モニタ９に文字情報「撮影終了？」を表示させ、使用者によって撮影を終了する旨の指示が制御部１０へ入力されているか否かを判定する。撮影を終了する旨の指示が制御部１０へ入力されている場合には本ルーチンが終了し、そうでない場合にはステップＳ４へ戻る。
Step S5: The control unit 10 calculates the observation position in the concave portion 3a that the user intends to observe based on the position information of the stage 20 detected by the position detection unit (not shown), and the observation position is the step S3. It is determined whether or not it is outside the switching range obtained in step (1). When the observation position is outside the switching range, in other words, when the shape of the liquid surface of the culture solution 12 corresponding to the observation position is curved, the process proceeds to step S6. On the other hand, when the observation position is within the switching range, in other words, when the shape of the liquid surface of the culture medium 12 corresponding to the observation position is substantially flat, the process proceeds to step S7.
Step S6: The control unit 10 rotates the rotation switching units 18 and 23 to place the new bright field illumination unit 22 and the new bright field observation unit 17 in the optical path. As a result, the microscope 6 becomes ready for new bright field observation.
Step S7: The control unit 10 rotates the rotation switching units 18 and 23 to arrange the phase difference illumination unit 21 and the phase difference observation unit 16 in the optical path. As a result, the microscope 6 becomes ready for phase difference observation.
Step S8: Under the instruction of the control unit 10, the imaging unit 19 captures an image of the sample 13.
Step S9: The control unit 10 causes the display monitor 9 to display the character information “shooting end?” And determines whether an instruction to end shooting is input to the control unit 10 by the user. If an instruction to end shooting is input to the control unit 10, this routine ends. If not, the process returns to step S4.
以上より、本実施形態に係る培養観察装置１は、上記観察方法切替ルーチンを実行することで、培養容器３の凹部３ａ中の観察位置に対応する培養液１２の液面が湾曲している場合には新明視野観察によって試料１３を撮影し、また、観察位置に対応する培養液１２の液面が略平坦である場合には位相差観察によって試料１３を撮影することができる。したがって、観察位置に対応する培養液１２の液面の形状に関わらず、明るさムラ等のない良好な画質で試料１３を撮影することができる。 As described above, when the culture observation apparatus 1 according to the present embodiment performs the observation method switching routine, the liquid level of the culture solution 12 corresponding to the observation position in the recess 3a of the culture vessel 3 is curved. In this case, the sample 13 can be photographed by observation with a new bright field, and the sample 13 can be photographed by phase difference observation when the liquid surface of the culture solution 12 corresponding to the observation position is substantially flat. Therefore, regardless of the shape of the liquid surface of the culture solution 12 corresponding to the observation position, the sample 13 can be photographed with good image quality without brightness unevenness.
（第２実施形態）
第２実施形態に係る培養観察装置は、上記第１実施形態と基本的に同様の構成であるため、図１乃至図３を参照して説明する。
上述のように、培養液１２のレンズ効果の大きさは、培養容器３の種類や材質、培養液１２の組成や量等によって様々に変化する。そして、培養液１２のレンズ効果が変化すれば、新明視野観察において、培養容器３の凹部３ａの底面を略均一に照明することが困難になり、また、撮影時にピントボケや露光ムラが生じてしまうおそれがある。
そこで、本実施形態に係る培養観察装置は、培養容器３の凹部３ａ中の観察位置に応じて観察方法を自動的に切り替えることに加えて、新明視野観察を行う際には、自動的に凹部３ａの底面の略均一な照明を実現しながらピントボケと露光ムラを解消するための観察方法切替ルーチンを実行可能に構成されている。
(Second Embodiment)
The culture observation apparatus according to the second embodiment has basically the same configuration as that of the first embodiment, and will be described with reference to FIGS.
As described above, the magnitude of the lens effect of the culture solution 12 varies depending on the type and material of the culture vessel 3, the composition and amount of the culture solution 12, and the like. If the lens effect of the culture solution 12 changes, it becomes difficult to illuminate the bottom surface of the concave portion 3a of the culture vessel 3 substantially uniformly in new bright field observation, and out-of-focus and uneven exposure occur during photographing. There is a risk that.
Therefore, the culture observation apparatus according to the present embodiment automatically switches the observation method according to the observation position in the recess 3a of the culture vessel 3 and automatically performs a new bright field observation. An observation method switching routine for eliminating out-of-focus and uneven exposure is realized while realizing substantially uniform illumination of the bottom surface of the recess 3a.
なお、本実施形態において、制御部１０内の記憶部１０ａには、培養液１２の液面の形状に応じて、新明視野照明部２２と新明視野観察部１７を構成する光学要素の補正を行うための複数の補正情報が予め記憶されている。なお、この複数の補正情報は、各種情報（培養容器３の種類（６〜３８４ウェルプレート、３５〜１００ｍｍディッシュ、受精卵観察用培地ドロップ等）、培養容器３の材質とコーティング、培養液１２の組成、培養液１２の量、及び試料１３として観察する細胞の種類（大きさや形状）等）に対応しており、補正情報テーブルとして記憶部１０ａに記憶されている。
具体的には、記憶部１０ａは、前記補正情報として、培養液１２の液面の形状に応じて照明光の実効的なＮＡと主光線の方向を変更するための可動絞り３５の光軸上の位置情報を記憶している。この位置情報に基づいて可動絞り３５を光軸方向へ移動させて照明光の実効的なＮＡと主光線の方向を適切に設定することで、培養容器３の凹部３ａの底面の略均一な照明を実現することが可能となる。
また、記憶部１０ａは、前記補正情報として、培養液１２の液面の形状に応じて合焦位置を変更するための第１対物レンズ３０の光軸上の位置情報を記憶している。この位置情報に基づいて第１対物レンズ３０を光軸方向へ移動させて合焦位置を補正することで、撮影時のピントボケを解消することが可能となる。
また、記憶部１０ａは、前記補正情報として、培養液１２の液面の形状に応じて露光量を変更するための露光情報（具体的には、撮像部１９の感度情報）を記憶している。この感度情報に基づいて撮像部１９の感度を変更して露光量を補正することで、撮影時の露光ムラを解消することが可能となる。
In the present embodiment, the storage unit 10a in the control unit 10 corrects the optical elements constituting the new bright field illumination unit 22 and the new bright field observation unit 17 according to the shape of the liquid surface of the culture solution 12. A plurality of correction information for performing is stored in advance. The plurality of correction information includes various information (type of the culture vessel 3 (6 to 384 well plate, 35 to 100 mm dish, medium drop for fertilized egg observation, etc.), material and coating of the culture vessel 3, and the culture solution 12. This corresponds to the composition, the amount of the culture solution 12, and the type (size and shape) of the cells observed as the sample 13, and is stored in the storage unit 10a as a correction information table.
Specifically, the storage unit 10a uses, as the correction information, on the optical axis of the movable diaphragm 35 for changing the effective NA of the illumination light and the direction of the chief ray according to the shape of the liquid surface of the culture solution 12. Is stored. Based on this positional information, the movable diaphragm 35 is moved in the optical axis direction so that the effective NA of the illumination light and the direction of the principal ray are appropriately set, so that substantially uniform illumination of the bottom surface of the recess 3a of the culture vessel 3 is achieved. Can be realized.
Moreover, the memory | storage part 10a has memorize | stored the positional information on the optical axis of the 1st objective lens 30 for changing a focus position according to the shape of the liquid level of the culture solution 12 as said correction information. By moving the first objective lens 30 in the direction of the optical axis based on this position information and correcting the in-focus position, it is possible to eliminate out-of-focus blur during shooting.
Moreover, the memory | storage part 10a has memorize | stored the exposure information (specifically the sensitivity information of the imaging part 19) for changing an exposure amount according to the shape of the liquid level of the culture solution 12 as the said correction information. . By correcting the exposure amount by changing the sensitivity of the imaging unit 19 based on this sensitivity information, it is possible to eliminate exposure unevenness during shooting.
斯かる構成の下、図６に示す本実施形態の観察方法切替ルーチンは、上記第１実施形態の観察方法切替ルーチンと同様に、使用者が本ルーチンの開始の指示を制御部１０へ入力することによって開始される。なお、使用者は、本ルーチンを実行するにあたり、位相差観察部１６の対物レンズ１６や位相差照明部２１のリング絞り等の情報を制御部１０へ予め入力しておく。
ステップＴ１：上記第１実施形態の観察方法切替ルーチンのステップＳ１と同様。
ステップＴ２：上記第１実施形態の観察方法切替ルーチンのステップＳ２と同様。
ステップＴ３：上記第１実施形態の観察方法切替ルーチンのステップＳ３と同様。
ステップＴ４：上記第１実施形態の観察方法切替ルーチンのステップＳ４と同様。
ステップＴ５：上記第１実施形態の観察方法切替ルーチンのステップＳ５と同様。
ステップＴ６：上記第１実施形態の観察方法切替ルーチンのステップＳ６と同様。
ステップＴ７：制御部１０が後述する補正情報算出サブルーチンを実行する。
ステップＴ８：制御部１０が、ステップＴ７で得られた補正情報に基づいて、可動絞り３５を光軸方向へ移動させて照明光の実効的なＮＡと主光線の方向を適切に設定し、第１対物レンズ３０を光軸方向へ移動させて合焦位置を補正し、撮像部１９の感度を変更して露光量を補正する。そして制御部１０が撮像部１９に試料１３の画像を撮影させる。
ステップＴ９：上記第１実施形態の観察方法切替ルーチンのステップＳ７と同様。
ステップＴ１０：制御部１０が撮像部１９に試料１３の画像を撮影させる。
ステップＴ１１：上記第１実施形態の観察方法切替ルーチンのステップＳ９と同様。
Under such a configuration, the observation method switching routine of the present embodiment shown in FIG. 6 is similar to the observation method switching routine of the first embodiment described above, and the user inputs an instruction to start this routine to the control unit 10. Be started by. Note that the user inputs information such as the objective lens 16 of the phase difference observation unit 16 and the ring stop of the phase difference illumination unit 21 to the control unit 10 in advance when executing this routine.
Step T1: The same as Step S1 of the observation method switching routine of the first embodiment.
Step T2: Same as step S2 of the observation method switching routine of the first embodiment.
Step T3: The same as step S3 in the observation method switching routine of the first embodiment.
Step T4: Same as step S4 of the observation method switching routine of the first embodiment.
Step T5: Same as step S5 in the observation method switching routine of the first embodiment.
Step T6: Same as step S6 of the observation method switching routine of the first embodiment.
Step T7: The control unit 10 executes a correction information calculation subroutine which will be described later.
Step T8: Based on the correction information obtained in Step T7, the control unit 10 moves the movable diaphragm 35 in the optical axis direction to appropriately set the effective NA of the illumination light and the direction of the principal ray, and 1 The objective lens 30 is moved in the optical axis direction to correct the in-focus position, and the sensitivity of the imaging unit 19 is changed to correct the exposure amount. Then, the control unit 10 causes the imaging unit 19 to capture an image of the sample 13.
Step T9: Same as step S7 in the observation method switching routine of the first embodiment.
Step T10: The control unit 10 causes the imaging unit 19 to capture an image of the sample 13.
Step T11: Same as step S9 of the observation method switching routine of the first embodiment.
図７に示す補正情報算出サブルーチンは、上記観察方法切替ルーチンにおいて新明視野観察を実施するにあたって、ステップＴ２で得られた各種情報に基づいて補正情報を算出するためのものである。
ステップＰ１：制御部１０が、ステップＴ２で得られた各種情報を参照して、当該各種情報に対応する補正情報（可動絞り３５の光軸上の位置情報、第１対物レンズ３０の光軸上の位置情報、及び撮像部１９の感度情報）を記憶部１０ａの補正情報テーブルから読み出す。
ステップＰ２：制御部１０が、ステップＰ１で読み出した補正情報を前記各種情報と関連付けて記憶部１０ａに登録する。
ステップＰ３：制御部１０が、表示モニタ９に文字情報「ライブ観察を実行？」を表示させ、使用者によってライブ観察を実行する旨の指示が制御部１０へ入力されているか否かを判定する。ライブ観察を実行する旨の指示が制御部１０へ入力されている場合、新明視野観察による試料１３のライブ画像が表示モニタ９に表示され、顕微鏡６は使用者が試料１３をライブ観察しながら可動絞り３５の光軸上の位置、第１対物レンズ３０の光軸上の位置、及び撮像部１９の感度を自ら補正することが可能な状態となり、ステップＰ４へ進む。一方、ライブ観察を実行しない旨の指示が制御部１０へ入力されている場合には、本サブルーチンを終了して上記観察方法切替ルーチンへ戻る。
The correction information calculation subroutine shown in FIG. 7 is for calculating correction information based on various information obtained in step T2 when performing the new bright field observation in the observation method switching routine.
Step P1: The control unit 10 refers to the various information obtained in Step T2, and performs correction information corresponding to the various information (position information on the optical axis of the movable diaphragm 35, on the optical axis of the first objective lens 30). Are read from the correction information table of the storage unit 10a.
Step P2: The control unit 10 registers the correction information read in Step P1 in the storage unit 10a in association with the various information.
Step P3: The control unit 10 causes the display monitor 9 to display the character information “Execute live observation?” And determines whether an instruction to perform live observation is input to the control unit 10 by the user. . When an instruction to perform live observation is input to the control unit 10, a live image of the sample 13 by new bright field observation is displayed on the display monitor 9, and the microscope 6 is used while the user observes the sample 13 live. The position on the optical axis of the movable diaphragm 35, the position on the optical axis of the first objective lens 30, and the sensitivity of the imaging unit 19 can be corrected by itself, and the process proceeds to Step P4. On the other hand, if an instruction not to perform live observation is input to the control unit 10, the present subroutine is terminated and the process returns to the observation method switching routine.
ステップＰ４：制御部１０が、表示モニタ９に文字情報「新たな補正情報を登録？」を表示させ、使用者が補正した可動絞り３５の光軸上の位置、第１対物レンズ３０の光軸上の位置、及び撮像部１９の感度を新たな補正情報として登録する旨の指示が使用者によって制御部１０へ入力されているか否かを判定する。新たな補正情報を登録する旨の指示が制御部１０へ入力されている場合はステップＰ５へ進み、そうでない場合は本ステップＰ４を再度実行する。
ステップＰ５：制御部が、使用者が補正した可動絞り３５の光軸上の位置、第１対物レンズ３０の光軸上の位置、及び撮像部１９の感度を、新たな補正情報として前記各種情報に関連付けて記憶部１０ａに登録する。
Step P4: The control unit 10 displays character information “Register new correction information?” On the display monitor 9, and the position on the optical axis of the movable diaphragm 35 corrected by the user, the optical axis of the first objective lens 30. It is determined whether or not an instruction to register the upper position and the sensitivity of the imaging unit 19 as new correction information is input to the control unit 10 by the user. If an instruction to register new correction information is input to the control unit 10, the process proceeds to step P5, and if not, this step P4 is executed again.
Step P5: The control unit corrects the position of the movable diaphragm 35 on the optical axis, the position of the first objective lens 30 on the optical axis, and the sensitivity of the imaging unit 19 as new correction information. Is registered in the storage unit 10a.
以上より、本実施形態に係る培養観察装置は、上記観察方法切替ルーチンを実行することで、上記第１実施形態の観察方法切替ルーチンの奏する効果に加えて、新明視野観察を行う際には、培養容器３の凹部３ａの底面の略均一な照明を実現しながらピントボケと露光ムラを解消してより良好な画質で試料１３を撮影することができる。 As described above, the culture observation apparatus according to the present embodiment executes the observation method switching routine to perform the new bright field observation in addition to the effect exerted by the observation method switching routine of the first embodiment. The sample 13 can be photographed with better image quality by eliminating out-of-focus and exposure unevenness while realizing substantially uniform illumination of the bottom surface of the recess 3a of the culture vessel 3.
なお、上記各実施形態の観察方法切替ルーチンでは、上述のように制御部１０が各種情報に基づいて培養容器３の凹部３ａ中の培養液１２の液面の形状を算出し、さらに液面の形状に基づいて切替位置情報を算出する構成である。しかしこれに限られず、予め制御部１０内の記憶部１０ａに各種情報に対応する複数の切替位置情報が切替位置情報テーブルとして記憶されており、斯かる記憶部１０ａから制御部１０が切替位置情報を適宜読み出す構成とすることもできる。
また、上記各実施形態の観察方法切替ルーチンでは、上述のように凹部３ａ中の観察位置が切替範囲内にある場合には位相差観察が実施される。しかしこれに限られず、観察位置が切替範囲内にある場合には、制御部１０が各種情報のうちの試料１３の種類の情報を参照して、試料１３が受精胚である場合にはホフマンモジュレーション観察、試料１３が薄い細胞である場合には微分干渉観察、試料１３が標準的な厚みの細胞である場合には位相差観察、試料１３が厚い細胞である場合には斜光照明観察を実行する構成としてもよい。なお、斯かる場合には、顕微鏡６の回転切替部１８，２３に各々の観察方法に必要な照明部と観察部をそれぞれ追加すればよい。
In the observation method switching routine of each of the above embodiments, as described above, the control unit 10 calculates the shape of the liquid level of the culture solution 12 in the recess 3a of the culture vessel 3 based on various information, and further determines the liquid level. The switching position information is calculated based on the shape. However, the present invention is not limited to this, and a plurality of switching position information corresponding to various types of information is stored in advance in the storage unit 10a in the control unit 10 as a switching position information table. Can be appropriately read out.
In the observation method switching routine of each of the embodiments described above, phase difference observation is performed when the observation position in the recess 3a is within the switching range as described above. However, the present invention is not limited to this, and when the observation position is within the switching range, the control unit 10 refers to the information on the type of the sample 13 among the various information, and when the sample 13 is a fertilized embryo, the Hoffman modulation is performed. Observation, differential interference observation is performed when the sample 13 is a thin cell, phase difference observation is performed when the sample 13 is a standard thickness cell, and oblique illumination observation is performed when the sample 13 is a thick cell. It is good also as a structure. In such a case, an illumination unit and an observation unit necessary for each observation method may be added to the rotation switching units 18 and 23 of the microscope 6.
また、上記第２実施形態の観察方法切替ルーチンでは、記憶部１０ａが補正情報として培養液１２の液面の形状に応じて照明光の実効的なＮＡを変更するための可動絞り３５の絞り径情報をさらに記憶しており、この絞り径情報に基づいて可動絞り３５の絞り径を変更して照明光の実効的なＮＡをより適切に設定する構成としてもよい。これにより、培養容器３の凹部３ａの底面のより均一な照明を実現することができる。
また、上記各実施形態の観察方法切替ルーチンでは、観察位置、撮影回数、インターバルタイム、総時間等の撮影条件を制御部１０に予め入力することで、タイムラプス撮影を実施することもできる。この場合、オートフォーカスで自動撮影を行う際のピントボケを解消し、露光ムラによって試料が見えなくなることを解消することができるため、観察像の品質を効果的に向上させることができる。またこれにより、細胞カウンティング等の画像解析を正確に実施することも可能となる。
また、上記各実施形態の観察方法切替ルーチンは、制御部１０によって実行される構成であるが、これに限られず顕微鏡本体１１内に備えられた不図示の制御部によって実行される構成とすることも勿論可能である。
In the observation method switching routine of the second embodiment, the aperture diameter of the movable diaphragm 35 for the storage unit 10a to change the effective NA of the illumination light according to the shape of the liquid surface of the culture solution 12 as correction information. Information may be further stored, and the effective NA of the illumination light may be set more appropriately by changing the aperture diameter of the movable aperture 35 based on the aperture diameter information. Thereby, more uniform illumination of the bottom surface of the recess 3a of the culture vessel 3 can be realized.
In the observation method switching routine of each of the embodiments described above, time-lapse imaging can be performed by inputting imaging conditions such as the observation position, the number of imaging, the interval time, and the total time in advance to the control unit 10. In this case, it is possible to eliminate out-of-focus when performing automatic photographing with autofocus, and it is possible to eliminate the invisibility of the sample due to uneven exposure, so that the quality of the observation image can be effectively improved. This also makes it possible to accurately perform image analysis such as cell counting.
In addition, the observation method switching routine of each of the above embodiments is configured to be executed by the control unit 10, but is not limited thereto, and is configured to be executed by a control unit (not shown) provided in the microscope main body 11. Of course it is possible.
以上、上記各実施形態によれば、培養容器中の試料を観察する際に培養液にレンズ効果が生じている場合でも、試料の良好な観察像を得ることが可能な顕微鏡とこれを備えた培養観察装置を実現することができる。 As described above, according to each of the above embodiments, a microscope capable of obtaining a good observation image of a sample even when the lens effect is generated in the culture medium when observing the sample in the culture vessel is provided. A culture observation apparatus can be realized.
１ 培養観察装置
３ 培養容器
６ 顕微鏡
１０ 制御部
１０ａ 記憶部
１２ 培養液
１３ 試料
１６ 位相差観察部
１７ 新明視野観察部
２０ ステージ
２１ 位相差照明部
２２ 新明視野照明部
ＡＸ 光軸
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Culture observation apparatus 3 Culture container 6 Microscope 10 Control part 10a Memory | storage part 12 Culture solution 13 Sample 16 Phase difference observation part 17 New bright field observation part 20 Stage 21 Phase difference illumination part 22 New bright field illumination part AX Optical axis
Claims (17)
前記試料を第１の観察方法で観察するための第１光学系と、
前記試料を第２の観察方法で観察するための第２光学系と、
を含む少なくとも２つの光学系を切替可能に有しており、
前記第１光学系は、照明光学系と、対物レンズを有する観察光学系とを有し、前記照明光学系から射出される照明光の実効的なＮＡを前記対物レンズの開口数よりも小さくすることが可能であり、
前記培養容器中の観察位置に応じて、前記少なくとも２つの光学系を切り替えて使用することを特徴とする顕微鏡。 In a culture vessel holding a sample to be observed and a culture medium for culturing the sample, in a microscope for observing the sample in a state immersed in the culture solution,
A first optical system for observing the sample by a first observation method;
A second optical system for observing the sample by a second observation method;
And at least two optical systems including
The first optical system includes an illumination optical system and an observation optical system having an objective lens, and makes an effective NA of illumination light emitted from the illumination optical system smaller than the numerical aperture of the objective lens. Is possible and
A microscope characterized in that the at least two optical systems are switched and used in accordance with an observation position in the culture vessel.
前記制御部は、前記培養容器の種類、前記培養容器の材質、前記培養液の組成、及び前記培養液の量のうちの少なくとも１つの情報に基づいて前記記憶部から前記切替位置情報を取得することを特徴とする請求項１０に記載の顕微鏡。 A storage unit storing a plurality of the switching position information;
The control unit acquires the switching position information from the storage unit based on at least one of the type of the culture vessel, the material of the culture vessel, the composition of the culture solution, and the amount of the culture solution. The microscope according to claim 10 .
前記制御部は、前記培養容器の種類、前記培養容器の材質、前記培養液の組成、及び前記培養液の量のうちの少なくとも１つの情報に基づいて前記記憶部から前記可動絞りの光軸上の位置情報を取得し、前記可動絞りの光軸上の位置情報に合わせて前記可動絞りを光軸方向へ移動させることを特徴とする請求項１２に記載の顕微鏡。 The storage unit stores a plurality of pieces of positional information on the optical axis of the movable diaphragm for changing the effective NA of the illumination light according to the shape of the liquid level of the culture medium as the correction information. ,
The control unit is arranged on the optical axis of the movable diaphragm from the storage unit based on at least one information of the type of the culture vessel, the material of the culture vessel, the composition of the culture solution, and the amount of the culture solution. 13. The microscope according to claim 12 , wherein the position information is acquired, and the movable diaphragm is moved in the optical axis direction in accordance with position information on the optical axis of the movable diaphragm.
前記記憶部は、前記培養液の液面の形状に応じて露光量を変更するための露光情報を前記補正情報として複数個記憶しており、
前記制御部は、前記培養容器の種類、前記培養容器の材質、前記培養液の組成、及び前記培養液の量のうちの少なくとも１つの情報に基づいて前記記憶部から前記露光情報を取得し、前記露光情報に合わせて前記撮像部の感度を設定することを特徴とする請求項１２又は請求項１３に記載の顕微鏡。 An imaging unit for capturing an image of the sample;
The storage unit stores a plurality of exposure information as the correction information for changing the exposure amount according to the shape of the liquid level of the culture solution,
The control unit acquires the exposure information from the storage unit based on at least one information of the type of the culture vessel, the material of the culture vessel, the composition of the culture solution, and the amount of the culture solution, The microscope according to claim 12 or 13 , wherein sensitivity of the imaging unit is set in accordance with the exposure information.
前記制御部は、前記培養容器の種類、前記培養容器の材質、前記培養液の組成、及び前記培養液の量のうちの少なくとも１つの情報に基づいて前記記憶部から前記対物レンズの光軸上の位置情報を取得し、前記対物レンズの光軸上の位置情報に合わせて前記対物レンズを光軸方向へ移動させることを特徴とする請求項１２から請求項１４のいずれか一項に記載の顕微鏡。 The storage unit stores a plurality of positional information on the optical axis of the objective lens for changing the focus position according to the shape of the liquid level of the culture medium as the correction information,
The control unit is arranged on the optical axis of the objective lens from the storage unit based on at least one of the type of the culture vessel, the material of the culture vessel, the composition of the culture solution, and the amount of the culture solution. of acquiring position information, according to any one of claims 12 to 14, which according to the position information on the optical axis and moving the objective lens in the optical axis direction of said objective lens microscope.
前記顕微鏡を収納する筐体と、
前記筐体内に配置されており、前記培養容器を格納するための棚部と、
前記培養容器を前記棚部から前記顕微鏡まで搬送する搬送部と、
前記筐体内を所定の環境に維持するための環境維持部と、
を有することを特徴とする培養観察装置。 The microscope according to any one of claims 1 to 16 ,
A housing for housing the microscope;
A shelf that is disposed within the housing for storing the culture vessel;
A transport unit for transporting the culture vessel from the shelf to the microscope;
An environment maintaining unit for maintaining the inside of the housing in a predetermined environment;
A culture observation apparatus comprising:
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