JP5555765B2 - 固形組織内の検体の光音響検出法及び検出システム - Google Patents
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Description
本実験では、僅か500個程度の黒色腫細胞を有するリンパ節からの光音響応答を正確に検出し、リンパ節の三次元空間内におけるリンパ節内でのこれら細胞の位置を決定することができるようにするため、複数の検知器により情報を獲得した。正常なリンパ節は応答を示さなかった。このように、本発明の検出方法及びシステムは、完全にインタクトなリンパ節内の微小転移巣の存在を検出するために用いることができる。また、リンパ節のさらなる組織学的観察の指針として用いることもでき、これにより、センチネルリンパ節生検の精度は向上する。今回の観察では偽陽性又は偽陰性の結果は観察されなかった。
周波数三倍化QスイッチNd:YAGレーザー(Vibrant355II、Opotek製、米国カルフォルニア州カールズバッド)を光学パラメーター式発振器をパンプするために用いた。このシステムは、410−2400nmの波長範囲を有していた。実験では、このシステムを、532nmの波長に設定し、図1に示すようにリンパ節を照射するため、直径600μmの光ファイバーを用いて焦点を合わせた。レーザーエネルギーは4−6mJの範囲であり、レーザーパルス持続時間は5n秒であった。レーザーシステムの繰り返し率は10Hzであった。リンパ節内で生じた光音響信号は、ポリフッ化ビニリデン(Polyvinylidene Fluoride;PVDF)のフィルム(Ketech社、米国ニューメキシコ州アルバカーキ)から作られた3つの圧電音響検知器により受信された。この信号は、レーザー出力を監視する光ダイオード(DETIOA、Thorlabs製、米国ニュージャージー州ニュートン)によりトリガーされたオシロスコープ(TDS024、Tektronix製、米国オレゴン州ウィルソンヴィル)に送信された。光ファイバーは、リンパ節上約1cmに配置された。音響検知器は、リンパ節に対して直角に、各検知器のリンパ節表面から最も近い所での位置が1−3mmの間となるよう、配置された。光音響波の時間と組織内での音速(約1.5mm/μs)との積を求めることにより、それぞれの波形から、より正確な位置を推定することができる。変換器は、約10cm長の半剛体の同軸ケーブル(Micor−coax製、米国ペンシルベニア州ポットタウン)のセグメントから作られた。PVDFと同軸ケーブルとから音響検知器を作成する手順は、J.Viator等,“Clinical Testing of a Photoacoustic Probe for Port Wine Stain Depth Determination”,2002年,第30巻,141−148頁に記載されている。本実験では、外部導体の直径は3.6mm、内部導体の直径は0.9mmであり、両導体は誘電体により絶縁された。25μm厚のPVDFフィルムは同軸ケーブルの露出研磨面に取り付けられた。
イヌのリンパ節を、該リンパ節の周囲の結合組織及びその他の組織から分離し、その後、リンパ節内部又は周囲の血液を取り除くため脱イオン水中に一晩浸けた。このリンパ節はライマメの形状をしており約1cmの長さであった。リンパ節全体を音響媒体内に配置した。音響媒体は脱イオン水槽であった。これにより、検知器までの音波伝達が保証された。532nmの波長を直径600μmの光ファイバーを通してリンパ節の上面に向けた。検知信号は350MHzの計装用増幅器(SR445、Stanford Research Systems製、米国カリフォルニア州サニーベール)を用いて5倍に増幅され、その後、平均を128回取った。10Hzのレーザー繰り返し率で、128回の平均をとるのに12.8秒かかった。
本システムの黒色腫を検出する能力を試験するため、リンパ節に黒色腫細胞を注入した。ヒト悪性黒色腫細胞系列HS936を培養したものを黒色腫細胞源として用いた。黒色腫がペレットを形成するまで、高濃度黒色腫懸濁液を遠心機にかけた。上澄みを取り除き、高濃度の黒色腫をピペットにより吸い上げた。黒色腫細胞の総数は約1x106であった。この細胞塊の直径は約1mmであった。リンパ節に照射したレーザースポットの直径は約1.5mmであった。レーザービームをリンパ節全体に照射するよう走査した。1.5mmのスポットはリンパ節のより広い区域に拡散するが、リンパ節全体に照射するためにレーザービームの走査を用いた。微小転移巣を模倣するため、リンパ節の側面に小さな切開部を設け、黒色腫をピペットを用いてその切開部に注入した。黒色腫を移植しない対照リンパ節においても、切開部の形成を含む試験を繰り返した。
かなり少ない数の黒色腫細胞から球体を形成した。上述した遠心からこの手順は異なる。具体的には、黒色腫細胞はアクリルアミド溶液内に懸濁物として集められた。このアクリルアミド溶液は、過硫酸アンモニウム及びテトラメチルエチレンジアミン(Tetramethylethylenediamine;TEMED)(共に米国ミズーリ州セントルイス所在のSigma Aldrich製)を用いて、直径約1mmの球体に凝固された。浮遊細胞を含有する重合開始前のアクリルアミド溶液をミネラルオイル中に滴下すると、過硫酸アンモニウム及びTEMEDにより1分以内に硬化し、球体が形成された。この技術により形成された球体のそれぞれは、約500個の黒色腫細胞を含有しており、健康なブタのリンパ節に移植された。健康なブタ由来のリンパ節はイヌのリンパ節と同程度の大きさと形状であった。『陽性』のリンパ節にそれぞれ黒色腫細胞を移植した。
図2A−2Cは、イヌリンパ節への照射後黒色腫細胞の注入前に得られた3つの検知器のそれぞれからの光音響波形を示す。図2D−2Fは、黒色腫細胞の注入後の検知器のそれぞれからの波形を示す。1μ秒以内に生じる最初の波形はレーザーからの電気的ノイズによるものである。黒色腫細胞を添加していないリンパ節では、図2A−2Cから分かるように、光音響信号は見られない。信号は、約100μVのベースラインのノイズ値の平坦な直線を示すのみである。黒色腫細胞が存在するリンパ節では、図2D−2Fから分かるように、かなりの光音響信号が見られる。検出器1では、図2Dから分かるように、約0.5mVのピーク振幅のピークを有する約9μ秒の信号が生じた。検出器2では、図2Eから分かるように、約0.4mVの振幅で約4.5μ秒の信号が生じた。検出器3では、図2Fから分かるように、約0.6mVの振幅で約4.2μ秒の信号が生じた。検出器3からの波長は音波回折のため逆転している。しかし、検出のために必要なのは波の存在のみであり、また、位置の決定に必要なのは波のタイミングのみであって、波の形状は問題とならない。
リンパ節内の微小転移巣の特定の位置を決定するための技術の1つとして、光音響逆投影法が挙げられる。この方法は、組織学的検査の指針として用いることが可能であり、これにより、偽陽性の画面を減らすことができる。逆投影法による再構築を用いることで、転移がんの位置を特定しリンパ節内のその位置を決定することができ、これにより、組織学的検査のために検出確率が最も高い組織切片を選択することが可能となる。逆投影法は、異なる位置を用いて信号を三角測量するのと類似した数学的方法である。さらに、フィルター処理及びノイズ除去処理を行なってもよい。適切な逆投影法は、『Iterative Reconstruction Algorithm for Optoacoustic Imaging』,J.Acoust.Soc.Am.,2002年10月,第112巻,第4号,1536−1544頁に開示されている。
本実験では、偽陽性率は観察されなかった。しかし、実際的には、リンパ節のリンスが不完全であるため、リンパ節内に血液が残存している可能性があった。血液の寄与による不要な光音響応答を避けるために、レーザー波長を、赤色、例えば、630nmに変更してもよく、これにより、脱酸素化ヘモグロビン由来の光音響応答は約8分の1に、酸素化ヘモグロビン由来の応答は約50分の1未満に減少する。一方、メラニン由来の応答は約2分の1程度にしか減少しないだろう。このようにして、ノイズを制限しつつ、感度は改善される。
本願は、合衆国法典第35巻第119条に基づき、2009年4月20日に出願の米国特許仮出願第61/170,880号の優先権を主張する。
Claims (13)
- 生体外での解析のために摘出した固形組織内の黒色腫細胞を直接検出する方法であって、
前記固形組織(12)は、外因的に添加された光吸収体により変性されていないインタクトなリンパ節又は該リンパ節の要部を含み、
前記固形組織を所定の位置に配置する工程、
前記固形組織をわずかにしか吸収されずに通過し、前記固形組織内に収容された検体に少なくとも部分的に吸収されるように選択された光のパルス状波長を、前記外因的に添加された光吸収体の非存在下で前記固形組織に照射する工程、
光音響波形を得るためにある期間の間、前記照射工程により発生した光音響応答を音響学的に検知する工程、
前記光音響波形においてメラニンの吸収スペクトルを解析する工程、及び、
前記光音響波形がメラニンによる吸収を示す場合、検出した応答ピークを前記検体の存在に起因させる工程、
からなる方法。 - 前記配置工程は、前記固形組織を音響媒体(14)中の所定の位置に配置することを含み、及び、
前記音響学的検知工程は、前記音響媒体を介して前記光音響応答を検知することを含む、請求項1に記載の方法。 - 前記音響媒体は脱イオン水、油又はゲルからなる、請求項2に記載の方法。
- 前記解析工程は、検出した応答ピークのタイミングに基づいて、検出した任意の検体の位置を決定することを含む、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記音響学的検知工程は、複数の特徴的光音響応答を獲得することを含み、及び、
前記解析工程は、検出した任意の検体の位置を決定することに加えて、前記検体の有無を決定する、請求項1から4のいずれか1項に記載の方法。 - 前記照射工程は、前記固形組織の全体を覆うようなレーザービーム及び/又は走査を含む、請求項1から5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記音響学的検知工程は、前記固形組織内の前記検体の位置を推定するために、同一直線上にない異なる位置に配置されている複数の音響検知器(20a,20b,20c)を備え、該各検知器からの検出時間及び該各検知器の相対的位置を用い検知することを含む、請求項1から6のいずれか1項に記載の方法。
- 外因的に添加された光吸収体により変性されていないインタクトなリンパ節又は該リンパ節の要部を含む固形組織(12)を所定のボリュームでその内部に保持するよう構成されている試料保持器(16)、
パルス状レーザービームを発生することのできるレーザー(22)、
前記パルス状レーザービームを前記固形組織内に向けるための光フォーカサー(23,24)、
固形組織内に収容された検体の光音響応答を検出するために配置されている音響検知器(20a)、及び、
前記光音響応答を解析し且つ前記光音響応答に基づいて前記固形組織内の黒色腫細胞の有無を決定するためのコンピューターであって、前記光音響応答の波形においてメラニンの吸収スペクトルを解析し、且つ、前記光音響応答の波形がメラニンによる吸収を示す場合、検出した応答ピークを前記検体の存在に起因させるコンピューター(28)を備える、生体外での解析のために摘出した固形組織内の黒色腫細胞を検出するためのシステム。 - 前記音響検知器は、同一直線上に配置されていない少なくとも3つの音響検知器(20a,20b,20c)を含み、及び、
前記コンピューターは、前記少なくとも3つの音響検知器から独立した信号を受け取り、且つ、前記独立した信号を用いて、該信号及び該信号のタイミングから黒色腫細胞の有無及び位置を決定する、請求項8に記載のシステム。 - 前記音響検知器は、三次元空間を測るように配置されている少なくとも3つの音響検知器(20a,20b,20c)を含み、及び、
前記コンピューターは、前記少なくとも3つの音響検知器から独立した信号を受け取り、且つ、前記独立した信号を用いて、該信号及び該信号のタイミングから黒色腫細胞の有無及び位置を決定する、請求項8又は9に記載のシステム。 - 前記試料保持器は、三次元座標系を定める指標要素を備え、
前記固形組織は、前記三次元座標系内の既知の位置に配置され、
前記少なくとも3つの検知器は、定められた前記三次元座標系に対して既知の位置に配置される、請求項8から10のいずれか1項に記載のシステム。 - 前記音響検知器は、誘電体により絶縁され、且つ、薄い音響学的に感度の高いフィルムにより覆われた露出研磨面で終始する複数の同軸導体を含む、請求項8から11のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記音響学的に感度の高いフィルムは、ポリフッ化ビニリデンからなる、請求項12に記載のシステム。
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