JP5530330B2 - Microscope system - Google Patents
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Description
本発明は、顕微鏡システムに関し、特に、液浸対物レンズを含む顕微鏡システムに関する。 The present invention relates to a microscope system, and more particularly, to a microscope system including an immersion objective lens.
標本を保持するカバーガラスやガラスボトムディッシュなどの保持部材と対物レンズとの間を水や油などの液体（以降、液浸媒体と記す）で満すことで、光学系の開口数を高め、分解能と輝度の向上を実現する技術が知られている。このような液浸技術を利用した液浸対物レンズは、現在、広く普及しており、例えば、タイムラプス観察などでも利用されている。 The numerical aperture of the optical system is increased by filling the space between the holding member such as the cover glass or glass bottom dish that holds the specimen and the objective lens with a liquid such as water or oil (hereinafter referred to as an immersion medium) Techniques that improve resolution and brightness are known. An immersion objective lens using such an immersion technique is now widely used, and is also used in, for example, time-lapse observation.
しかしながら、長時間にわたって生細胞等の標本を観察するタイムラプス観察に液浸対物レンズを用いる場合、観察期間中に液浸媒体が蒸発することにより、保持部材と液浸対物レンズの間に液浸媒体で満たされていない空間（以降、ギャップと記す）が生じることがある。 However, when the immersion objective lens is used for time-lapse observation in which a specimen such as a living cell is observed for a long time, the immersion medium evaporates during the observation period, so that the immersion medium is interposed between the holding member and the immersion objective lens. A space (hereinafter referred to as a gap) that is not filled with may occur.
また、標本中の複数の部位を観察する多点タイムラプス観察などでは、液浸対物レンズに対して標本の相対的な移動が発生するが、倒立顕微鏡の場合には、保持部材の下面に液浸媒体の一部が残ってしまう。このため、移動後の液浸対物レンズ上の液浸媒体が不足し、保持部材と液浸対物レンズの間にギャップが生じることがある。 In addition, in multipoint time lapse observations that observe a plurality of parts in a specimen, the specimen moves relative to the immersion objective lens. In the case of an inverted microscope, the bottom surface of the holding member is immersed in the liquid. Part of the medium remains. For this reason, the immersion medium on the immersion objective lens after the movement is insufficient, and a gap may be formed between the holding member and the immersion objective lens.
このようなギャップが生じると、液浸対物レンズの光学性能は著しく低下してしまう。このような技術的な課題を踏まえ、例えば、特許文献１では、液浸媒体を自動的に供給する技術が開示されている。 When such a gap occurs, the optical performance of the immersion objective lens is significantly deteriorated. In view of such a technical problem, for example, Patent Document 1 discloses a technique for automatically supplying an immersion medium.
特許文献１で開示される技術では、液浸媒体を自動的に供給することが可能である。しかしながら、保持部材と液浸対物レンズの間のギャップを検出することはできず、液浸媒体が不足していることを検出することはできない。 In the technique disclosed in Patent Document 1, it is possible to automatically supply an immersion medium. However, the gap between the holding member and the immersion objective lens cannot be detected, and it cannot be detected that the immersion medium is insufficient.
従って、液浸媒体の不足による光学性能の低下を防止するためには、液浸媒体が不足しているか否かに関わらず、撮影毎に常に液浸媒体を供給しなおす必要がある。 Therefore, in order to prevent the optical performance from being deteriorated due to the shortage of the immersion medium, it is necessary to always supply the immersion medium every time photographing is performed regardless of whether the immersion medium is insufficient.
以上のような実情を踏まえ、本発明では、液浸媒体の不足を検出する技術を提供することを課題とする。 In view of the above circumstances, an object of the present invention is to provide a technique for detecting the shortage of the immersion medium.
本発明の第１の態様は、液浸対物レンズと、標本と標本を保持する保持部材とを含む標本ユニットに液浸対物レンズを合焦する合焦手段と、合焦手段により合焦された液浸対物レンズの、標本に対する光軸方向の相対的な座標である、合焦座標を検出する合焦座標検出手段と、合焦座標検出手段により検出された合焦座標を記録する記録手段と、記録手段に記録された合焦座標に基づいて、保持部材と液浸対物レンズの間が液浸媒体で満たされているか否かを判定する判定手段と、を含む顕微鏡システムを提供する。 The first aspect of the present invention is focused by a focusing unit that focuses an immersion objective lens on a specimen unit that includes an immersion objective lens and a specimen and a holding member that holds the specimen. A focus coordinate detection means for detecting a focus coordinate, which is a relative coordinate in the optical axis direction of the immersion objective lens, and a recording means for recording the focus coordinate detected by the focus coordinate detection means; And a determination unit that determines whether the space between the holding member and the immersion objective lens is filled with the immersion medium based on the in-focus coordinates recorded in the recording unit.
本発明の第２の態様は、第１の態様に記載の顕微鏡システムにおいて、さらに、判定手段による判定に用いられる閾値を設定する閾値設定手段を含み、判定手段は、現在の合焦座標と記録手段に記録された合焦座標との差が閾値未満であるときに、保持部材と液浸対物レンズの間が液浸媒体で満たされていると判定し、現在の合焦座標と記録手段に記録された合焦座標との差異が閾値以上であるときに、保持部材と液浸対物レンズの間が液浸媒体で満たされていないと判定する顕微鏡システムを提供する。 According to a second aspect of the present invention, the microscope system according to the first aspect further includes threshold setting means for setting a threshold used for determination by the determination means, and the determination means includes the current in-focus coordinates and recording. When the difference between the in-focus coordinates recorded in the means is less than the threshold value, it is determined that the space between the holding member and the immersion objective lens is filled with the immersion medium, and the current in-focus coordinates and the recording means are Provided is a microscope system that determines that a space between a holding member and an immersion objective lens is not filled with an immersion medium when a difference from a recorded in-focus coordinate is a threshold value or more.
本発明の第３の態様は、第２の態様に記載の顕微鏡システムにおいて、記録手段に記録された合焦座標は、現在の合焦座標が記録される直前に記録された前回の合焦座標である顕微鏡システムを提供する。 According to a third aspect of the present invention, in the microscope system according to the second aspect, the in-focus coordinates recorded in the recording unit are the previous in-focus coordinates recorded immediately before the current in-focus coordinates are recorded. A microscope system is provided.
本発明の第４の態様は、第２の態様または第３の態様に記載の顕微鏡システムにおいて、閾値は、保持部材の光軸方向の厚さを用いて算出される値である顕微鏡システムを提供する。 According to a fourth aspect of the present invention, there is provided the microscope system according to the second aspect or the third aspect, wherein the threshold value is a value calculated using the thickness of the holding member in the optical axis direction. To do.
本発明の第５の態様は、第１の態様乃至第４の態様のいずれか１つに記載の顕微鏡システムにおいて、さらに、ユーザに液浸媒体の不足を通知する通知手段を含み、通知手段は、判定手段により保持部材と液浸対物レンズの間が液浸媒体で満たされていないと判定されたときに、ユーザに液浸媒体の不足を通知する顕微鏡システムを提供する。 According to a fifth aspect of the present invention, the microscope system according to any one of the first to fourth aspects further includes a notification unit that notifies the user of the shortage of the immersion medium. When the determination means determines that the space between the holding member and the immersion objective lens is not filled with the immersion medium, a microscope system is provided that notifies the user of the lack of the immersion medium.
本発明の第６の態様は、第１の態様乃至第４の態様のいずれか１つに記載の顕微鏡システムにおいて、さらに、液浸媒体を供給する供給手段を含み、供給手段は、判定手段により保持部材と液浸対物レンズの間が液浸媒体で満たされていないと判定されたときに、液浸媒体を供給する顕微鏡システムを提供する。 According to a sixth aspect of the present invention, in the microscope system according to any one of the first to fourth aspects, the image forming apparatus further includes a supply unit that supplies an immersion medium. Provided is a microscope system that supplies an immersion medium when it is determined that the space between the holding member and the immersion objective lens is not filled with the immersion medium.
本発明の第７の態様は、第１の態様乃至第６の態様のいずれか１つに記載の顕微鏡システムにおいて、さらに、標本の撮影を行う撮影手段を含み、判定手段は、撮影手段により標本の撮影が行われる前に、保持部材と液浸対物レンズの間が液浸媒体で満たされているか否かを判定する顕微鏡システムを提供する。 According to a seventh aspect of the present invention, in the microscope system according to any one of the first to sixth aspects, the imaging system further includes an imaging unit that performs imaging of the specimen. Provided is a microscope system that determines whether or not the space between the holding member and the immersion objective lens is filled with the immersion medium before the imaging is performed.
本発明によれば、液浸媒体の不足を検出する技術を提供することができる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the technique which detects the lack of immersion media can be provided.
図１は、本実施例に係る顕微鏡システムの構成を例示した図である。なお、本実施例では、図１の紙面に直交する方向をＹ方向として、各レンズの光軸方向をＺ方向として、図１の紙面に平行で且つ光軸と直交する方向をＸ方向として、定義する。 FIG. 1 is a diagram illustrating the configuration of the microscope system according to the present embodiment. In this embodiment, the direction perpendicular to the paper surface of FIG. 1 is the Y direction, the optical axis direction of each lens is the Z direction, and the direction parallel to the paper surface of FIG. 1 and perpendicular to the optical axis is the X direction. Define.
図１に例示される顕微鏡システム１は、ガラスディッシュ３に保持された標本Ｓを観察する倒立型の蛍光顕微鏡システムであり、対物レンズ１０とガラスディッシュ３との間に液浸媒体が満たされている否かを判定して、液浸媒体の不足を検出することができる顕微鏡システムである。 A microscope system 1 illustrated in FIG. 1 is an inverted fluorescence microscope system that observes a specimen S held on a glass dish 3, and an immersion medium is filled between the objective lens 10 and the glass dish 3. This is a microscope system that can detect whether or not the immersion medium is insufficient by determining whether or not it is present.
顕微鏡システム１は、電動レボルバ１９に装着された複数の対物レンズ１０（乾燥系対物レンズ１０ａ、液浸対物レンズ１０ｂ）と、培養液２に浸された標本Ｓと標本Ｓを保持するガラスディッシュ３とを含む標本ユニットＳＵが固定された電動ステージ４と、標本Ｓを蛍光観察するための蛍光観察手段と、標本ユニットＳＵに対物レンズ１０を合焦する合焦手段と、顕微鏡システム１全体を制御するコントロール部１８と、ユーザからの指示の入力に用いられる操作部４０と、を含んでいる。 The microscope system 1 includes a plurality of objective lenses 10 (a dry objective lens 10a and an immersion objective lens 10b) mounted on an electric revolver 19, a specimen S immersed in a culture solution 2, and a glass dish 3 that holds the specimen S. The motorized stage 4 including the specimen unit SU including the fluorescent stage, the fluorescence observation means for observing the specimen S with fluorescence, the focusing means for focusing the objective lens 10 on the specimen unit SU, and the entire microscope system 1 are controlled. The control part 18 to perform and the operation part 40 used for the input of the instruction | indication from a user are included.
電動レボルバ１９は、コントロール部１８からの制御信号により、任意の対物レンズ１０を光路上に挿入することができる。図１では、液浸対物レンズ１０ｂが、光路上に挿入されて、標本ユニットＳＵに対向して配置されている。また、電動レボルバ１９は、モータ２２ａを備えた架台２３に固定されている。コントロール部１８からの制御信号によりモータ制御部２４ａがモータ２２ａを駆動させることで、架台２３は光路上に挿入された対物レンズ１０の光軸方向（Ｚ方向）に移動する。この架台２３の移動により、対物レンズ１０も移動するため、標本Ｓに対する対物レンズ１０の光軸方向の相対的な座標（以降、単に対物レンズの座標と記す）を変化させることができる。また、対物レンズ１０の座標は、モータ２２ａに取り付けられたエンコーダ２１からの出力信号が入力される座標検出部２５により検出することができる。 The electric revolver 19 can insert an arbitrary objective lens 10 on the optical path by a control signal from the control unit 18. In FIG. 1, the immersion objective lens 10 b is inserted on the optical path and arranged to face the sample unit SU. Further, the electric revolver 19 is fixed to a gantry 23 provided with a motor 22a. When the motor control unit 24a drives the motor 22a according to a control signal from the control unit 18, the gantry 23 moves in the optical axis direction (Z direction) of the objective lens 10 inserted on the optical path. Since the objective lens 10 is also moved by the movement of the gantry 23, relative coordinates in the optical axis direction of the objective lens 10 with respect to the specimen S (hereinafter simply referred to as objective lens coordinates) can be changed. The coordinates of the objective lens 10 can be detected by a coordinate detection unit 25 to which an output signal from an encoder 21 attached to the motor 22a is input.
ガラスディッシュ３が固定された電動ステージ４は、対物レンズ１０の光軸に直交するＸ方向及びＹ方向に移動可能であり、ステージ制御部５は、コントロール部１８からの制御信号により、電動ステージ４の移動を制御する。 The electric stage 4 to which the glass dish 3 is fixed is movable in the X direction and the Y direction orthogonal to the optical axis of the objective lens 10, and the stage control unit 5 is controlled by the control signal from the control unit 18. Control the movement of.
蛍光観察手段は、標本Ｓを励起する励起光を射出する光源６と、コレクタレンズ７と、標本Ｓの励起に適した波長の光を透過する励起フィルタ８と、励起光を反射し蛍光を透過するダイクロイックミラー９と、観察に不要な波長の光を分離する吸収フィルタ１１と、標本Ｓから生じた蛍光の進行方向を切り換える光路切換え部１２と、ミラーＭと、接眼レンズ１３と、光源６から射出される励起光を遮断する電動シャッタ１７を含んでいる。電動シャッタ１７は、コントロール部１８からの制御信号により、励起光を遮断するＯＮ状態と励起光を遮断しないＯＦＦ状態とのいずれかの状態に制御される。 The fluorescence observation means includes a light source 6 that emits excitation light for exciting the sample S, a collector lens 7, an excitation filter 8 that transmits light having a wavelength suitable for excitation of the sample S, and reflects the excitation light and transmits fluorescence. From the dichroic mirror 9 that performs, the absorption filter 11 that separates light having a wavelength unnecessary for observation, the optical path switching unit 12 that switches the traveling direction of the fluorescence generated from the sample S, the mirror M, the eyepiece lens 13, and the light source 6. An electric shutter 17 that blocks the emitted excitation light is included. The electric shutter 17 is controlled according to a control signal from the control unit 18 to either an ON state where the excitation light is blocked or an OFF state where the excitation light is not blocked.
光源６から射出される励起光は、コレクタレンズ７及び励起フィルタ８を介して入射したダイクロイックミラー９を反射して対物レンズ１０に入射する。対物レンズ１０は、励起光を標本Ｓに照射することで、標本Ｓを励起光で照明する。励起光の照射により励起された標本Ｓから生じた蛍光は、対物レンズ１０を介してダイクロイックミラー９に入射する。さらに、蛍光は、ダイクロイックミラー９を通過し、吸収フィルタ１１、光路切換え部１２、ミラーＭを介して、接眼レンズ１３に入射する。従って、顕微鏡システム１では、蛍光観察手段を用いることで、標本Ｓを目視観察することができる。 The excitation light emitted from the light source 6 is reflected by the dichroic mirror 9 incident through the collector lens 7 and the excitation filter 8 and is incident on the objective lens 10. The objective lens 10 irradiates the sample S with the excitation light by irradiating the sample S with the excitation light. Fluorescence generated from the specimen S excited by the excitation light irradiation enters the dichroic mirror 9 via the objective lens 10. Further, the fluorescence passes through the dichroic mirror 9 and enters the eyepiece 13 via the absorption filter 11, the optical path switching unit 12, and the mirror M. Therefore, in the microscope system 1, the sample S can be visually observed by using the fluorescence observation means.
また、顕微鏡システム１は、顕微鏡システム１の外部に設けられた、ＣＣＤカメラユニット１４とビデオキャプチャボード１５とホストＰＣ１６に接続することができる。さらに、顕微鏡システム１は、光路切換え部１２により蛍光をＣＣＤカメラユニット１４に導くことで、ＣＣＤカメラユニット１４により標本Ｓを撮像し、さらに、撮像された標本Ｓの画像を、ビデオキャプチャボード１５を介して、ホストＰＣ１６に保存することができる。即ち、顕微鏡システム１は、蛍光観察手段による目視観察のみではなく、標本Ｓの撮影を行うこともできる。 The microscope system 1 can be connected to a CCD camera unit 14, a video capture board 15, and a host PC 16 provided outside the microscope system 1. Further, the microscope system 1 guides the fluorescence to the CCD camera unit 14 by the optical path switching unit 12, so that the sample S is imaged by the CCD camera unit 14, and the image of the imaged specimen S is displayed on the video capture board 15. Via the host PC 16. That is, the microscope system 1 can perform not only visual observation by the fluorescence observation means but also photographing of the specimen S.
図１では、ＣＣＤカメラユニット１４、ビデオキャプチャボード１５、及び、ホストＰＣ１６は、顕微鏡システム１の外部に設けられているが、特にこれに限られない。顕微鏡システム１が、ＣＣＤカメラユニット１４、ビデオキャプチャボード１５、及び、ホストＰＣ１６を含んでもよい。即ち、顕微鏡システム１は、蛍光観察手段と、ＣＣＤカメラユニット１４と、ビデオキャプチャボード１５と、ホストＰＣ１６とからなる撮影手段を含んでもよい。 In FIG. 1, the CCD camera unit 14, the video capture board 15, and the host PC 16 are provided outside the microscope system 1, but are not limited thereto. The microscope system 1 may include a CCD camera unit 14, a video capture board 15, and a host PC 16. That is, the microscope system 1 may include an imaging unit including a fluorescence observation unit, a CCD camera unit 14, a video capture board 15, and a host PC 16.
合焦手段は、標本ユニットＳＵに対物レンズ１０を自動的に合焦する、いわゆるオートフォーカス機能を実現する手段である。合焦手段は、可視外領域の赤外光であるレーザー光を発光する赤外光半導体レーザー２６と、コントロール部１８からの制御信号により赤外光半導体レーザー２６の発光を制御するレーザー駆動部２７と、赤外光半導体レーザー２６から発光されたレーザー光を略平行光に変換するコリメートレンズ２８と、レーザー光の光束の一部を遮断する投光側ストッパ２９と、Ｐ偏光を反射しＳ偏光を透過するＰＢＳ３０と、集光レンズ群３１と、オフセット補正レンズ群３２と、λ／４板３３と、赤外光を反射するダイクロイックミラー３４と、集光レンズ群３５と、受光センサ３６と、標本ユニットＳＵに対物レンズ１０が合焦されているか否かについての判定（以降、合焦判定と記す）を行う合焦判別部３７と、を含んでいる。なお、受光センサ３６は、それぞれ独立に入射光を検出する受光領域Ａと受光領域Ｂを有する２分割フォトダイオードであり、光軸を中心に設置されている。 The focusing means is means for realizing a so-called autofocus function for automatically focusing the objective lens 10 on the sample unit SU. The focusing means includes an infrared semiconductor laser 26 that emits laser light that is infrared light in an invisible region, and a laser driving unit 27 that controls light emission of the infrared semiconductor laser 26 by a control signal from the control unit 18. A collimating lens 28 for converting laser light emitted from the infrared light semiconductor laser 26 into substantially parallel light, a light-projecting side stopper 29 for blocking a part of the light flux of the laser light, and reflecting P-polarized light and S-polarized light. PBS 30, transmitting lens group 31, offset correction lens group 32, λ / 4 plate 33, dichroic mirror 34 reflecting infrared light, focusing lens group 35, light receiving sensor 36, An in-focus determination unit 37 for determining whether or not the objective lens 10 is in focus on the sample unit SU (hereinafter referred to as in-focus determination). The light receiving sensor 36 is a two-divided photodiode having a light receiving area A and a light receiving area B for detecting incident light independently of each other, and is disposed around the optical axis.
合焦手段は、さらに、架台２３を移動させるモータ２２ａと、モータ２２ａの駆動を制御するモータ制御部２４ａと、オフセット補正レンズ群３２を移動させるモータ２２ｂと、モータ２２ｂの駆動を制御するモータ制御部２４ｂを含んでいる。 The focusing means further includes a motor 22a for moving the gantry 23, a motor control unit 24a for controlling driving of the motor 22a, a motor 22b for moving the offset correction lens group 32, and motor control for controlling driving of the motor 22b. Part 24b is included.
赤外光半導体レーザー２６から照明光として発光されたレーザー光は、コリメートレンズ２８により略平行光に変換されて、投光側ストッパ２９に入射する。レーザー光の光束の半分は投光側ストッパ２９により遮断されて、レーザー光の残りの半分はＰＢＳ３０に入射する。その後、レーザー光のＰ偏光成分のみがＰＢＳ３０を反射して、集光レンズ群３１により集光され、オフセット補正レンズ群３２を通過する。なお、オフセット補正レンズ群３２の機能については、後に詳述する。 Laser light emitted as illumination light from the infrared light semiconductor laser 26 is converted into substantially parallel light by the collimator lens 28 and enters the light projecting side stopper 29. Half of the laser beam is blocked by the light-projecting side stopper 29, and the remaining half of the laser beam enters the PBS 30. Thereafter, only the P-polarized component of the laser light is reflected by the PBS 30, collected by the condenser lens group 31, and passes through the offset correction lens group 32. The function of the offset correction lens group 32 will be described in detail later.
オフセット補正レンズ群３２を通過したレーザー光はλ／４板３３に入射する。λ／４板３３は、レーザー光の偏光方向を４５度回転させて、Ｐ偏光であるレーザー光を円偏光に変換する。その後、レーザー光は、赤外光を反射するダイクロイックミラー３４を反射し、対物レンズ１０により集光して、標本ユニットＳＵに照射される。 The laser light that has passed through the offset correction lens group 32 enters the λ / 4 plate 33. The λ / 4 plate 33 rotates the polarization direction of the laser light by 45 degrees to convert the laser light that is P-polarized light into circularly polarized light. Thereafter, the laser light is reflected by the dichroic mirror 34 that reflects infrared light, condensed by the objective lens 10, and irradiated onto the sample unit SU.
標本ユニットＳＵを反射したレーザー光は、対物レンズ１０、ダイクロイックミラー３４を介して、λ／４板３３に入射する。λ／４板３３は、レーザー光の偏光方向を４５度回転させて、円偏光であるレーザー光をＳ偏光に変換する。Ｓ偏光であるレーザー光は、オフセット補正レンズ群３２及び集光レンズ群３１を通過して、ＰＢＳ３０に入射する。ＰＢＳ３０はＳ偏光を透過するため、レーザー光はＰＢＳ３０を通過して、集光レンズ群３５に入射し、受光センサ３６に照射される。受光センサ３６は、レーザー光を光電変換によりセンサ信号に変換して、合焦判別部３７へ出力する。 The laser light reflected from the sample unit SU is incident on the λ / 4 plate 33 via the objective lens 10 and the dichroic mirror 34. The λ / 4 plate 33 rotates the polarization direction of the laser light by 45 degrees to convert the laser light that is circularly polarized light into S-polarized light. S-polarized laser light passes through the offset correction lens group 32 and the condenser lens group 31 and enters the PBS 30. Since the PBS 30 transmits S-polarized light, the laser light passes through the PBS 30, enters the condenser lens group 35, and is applied to the light receiving sensor 36. The light receiving sensor 36 converts the laser light into a sensor signal by photoelectric conversion, and outputs the sensor signal to the focus determination unit 37.
合焦判別部３７は、受光センサ３６から出力されたセンサ信号を受信し、受光領域Ａからのセンサ信号（以降、センサ信号ＳＡと記す）と受光領域Ｂからのセンサ信号（以降、センサ信号ＳＢと記す）とを識別する。さらに、合焦判別部３７は、受光領域Ａへ入射したレーザー光の強度の総和（以降、強度ＩＡ）をセンサ信号ＳＡから算出し、受光領域Ｂへ入射したレーザー光の強度の総和（以降、強度ＩＢ）をセンサ信号ＳＢから算出する。その上で、合焦判別部３７は、強度ＩＡ及び強度ＩＢに基づいて、合焦判定を行う。対物レンズ１０が合焦されていないと合焦判別部３７が判定した場合には、コントロール部１８からの制御信号によりモータ制御部２４ａがモータ２２ａを駆動させて、対物レンズ１０の座標を変化させる。 Focusing determination unit 37 receives a sensor signal output from the light receiving sensor 36, the sensor signal (hereinafter, referred to as a sensor signal S A) from the light receiving regions A and sensor signals (later from the light receiving region B, the sensor signal identifying a and referred) and S B. Further, the focusing determination unit 37, the sum (hereinafter, the intensity I A) of the intensity of the laser beam incident to the light receiving region A is calculated from the sensor signal S A, the sum of the intensity of the laser beam incident to the light receiving region B ( Thereafter, the intensity I B ) is calculated from the sensor signal S B. On top of that, the focusing determination unit 37, based on the intensity I A and the intensity I B, performs the focus determination. When the focus determination unit 37 determines that the objective lens 10 is not focused, the motor control unit 24a drives the motor 22a according to a control signal from the control unit 18 to change the coordinates of the objective lens 10. .
合焦手段は、合焦判別部３７により対物レンズ１０が合焦されていると判定されるまで、対物レンズ１０の移動と合焦判別部３７による合焦判定を繰り返すことで、対物レンズ１０を標本ユニットＳＵに合焦することができる。 The focusing means repeats the movement of the objective lens 10 and the focus determination by the focus determination unit 37 until the focus determination unit 37 determines that the objective lens 10 is in focus, thereby The specimen unit SU can be focused.
合焦判定では、対物レンズ１０によりレーザー光が集光する集光位置（以降、単に集光位置と記す）とレーザー光が標本ユニットＳＵを反射する反射位置（以降、単に反射位置と記す）との位置関係によって、受光センサ３６の受光領域Ａ及び受光領域Ｂに入射するレーザー光の強度のバランスが変化することを利用する。なお、顕微鏡システム１では、受光センサ３６は、集光位置とおよそ光学的に共役な位置に配置されている。 In the in-focus determination, a condensing position where laser light is collected by the objective lens 10 (hereinafter simply referred to as a condensing position) and a reflecting position where the laser light reflects the sample unit SU (hereinafter simply referred to as a reflecting position). It is utilized that the balance of the intensity of the laser light incident on the light receiving area A and the light receiving area B of the light receiving sensor 36 changes depending on the positional relationship. In the microscope system 1, the light receiving sensor 36 is disposed at a position that is optically conjugate with the light collection position.
図２は、集光位置と反射位置とが一致しているときに受光センサに入射するレーザー光を例示した図である。図２（ａ）は、受光センサ３６に入射するレーザー光をＹ方向から見た図を示し、図２（ｂ）は、受光センサ３６に入射するレーザー光をＸ方向から見た図を示している。図３及び図４は、集光位置と反射位置とが一致していないときに受光センサに入射するレーザー光を例示した図である。図３（ａ）及び図４（ａ）は、受光センサ３６に入射するレーザー光をＹ方向から見た図を示し、図３（ｂ）及び図４（ｂ）は、受光センサ３６に入射するレーザー光をＸ方向から見た図を示している。 FIG. 2 is a diagram illustrating laser light incident on the light receiving sensor when the light collection position and the reflection position coincide with each other. 2A shows a view of the laser light incident on the light receiving sensor 36 from the Y direction, and FIG. 2B shows a view of the laser light incident on the light receiving sensor 36 viewed from the X direction. Yes. FIG. 3 and FIG. 4 are diagrams illustrating laser light incident on the light receiving sensor when the condensing position and the reflecting position do not match. FIGS. 3A and 4A show the laser light incident on the light receiving sensor 36 as viewed from the Y direction, and FIGS. 3B and 4B are incident on the light receiving sensor 36. The figure which looked at the laser beam from the X direction is shown.
また、図５は、対物レンズの各座標における受光センサの各受光領域で検出されるレーザー光の強度の総和を示すグラフを例示した図である。なお、図５で例示されるグラフの縦軸は、受光センサ３６の受光領域Ａ及び受光領域Ｂの各々で検出されるレーザー光の強度の総和（強度ＩＡ及び強度ＩＢ）を示している。横軸は、対物レンズの座標を示している。ここでは、集光位置と反射位置とが一致する合焦状態での対物レンズ１０の座標（以降、合焦座標と記す）を０としている。 FIG. 5 is a diagram illustrating a graph showing the sum of the intensities of the laser beams detected in each light receiving region of the light receiving sensor at each coordinate of the objective lens. Note that the vertical axis of the graph illustrated in FIG. 5 indicates the sum of the intensities (intensity I A and intensity I B ) of the laser light detected in each of the light receiving area A and the light receiving area B of the light receiving sensor 36. . The horizontal axis indicates the coordinates of the objective lens. Here, the coordinates of the objective lens 10 in the in-focus state where the condensing position and the reflection position coincide with each other (hereinafter referred to as in-focus coordinates) are set to zero.
集光位置と反射位置とが一致している場合、即ち、対物レンズ１０が標本ユニットＳＵに合焦している合焦状態にある場合には、図２に例示されるように、標本ユニットＳＵを反射したレーザー光は、光軸を中心とした受光センサ３６上の極狭い領域に集光する。従って、図５に例示されるように、合焦座標では、強度ＩＡと強度ＩＢは略等しい値を示す。 When the condensing position and the reflection position coincide with each other, that is, when the objective lens 10 is in focus with the sample unit SU, the sample unit SU is exemplified as shown in FIG. The laser light reflected from the light is condensed in an extremely narrow region on the light receiving sensor 36 around the optical axis. Accordingly, as illustrated in Figure 5, the focus coordinate, intensity I A and intensity I B shows a value substantially equal.
これに対して、集光位置と反射位置とが一致していない場合、即ち、非合焦点状態にある場合には、図３及び図４に例示されるように、標本ユニットＳＵを反射したレーザー光は、光軸に対して偏った状態で受光センサ３６に照射される。 On the other hand, when the condensing position and the reflecting position do not match, that is, when the focusing position is not in focus, the laser that reflects the sample unit SU as illustrated in FIGS. 3 and 4 The light is applied to the light receiving sensor 36 in a state of being deviated with respect to the optical axis.
具体的には、合焦状態から対物レンズ１０が標本ユニットＳＵ側（以降、標本側と記す。）に移動して集光位置が反射位置によりも標本側に位置する場合、即ち、前ピン状態にある場合、図３に例示されるように、標本ユニットＳＵを反射したレーザー光は、受光領域Ａに偏って入射する。従って、図５に例示されるように、対物レンズ１０が合焦座標より標本側に位置する場合には、強度ＩＡが強度ＩＢより大きな値を示す。 Specifically, when the objective lens 10 moves from the in-focus state to the sample unit SU side (hereinafter referred to as the sample side) and the light collection position is located on the sample side with respect to the reflection position, that is, in the front pin state 3, the laser light reflected from the sample unit SU is incident on the light receiving area A with a bias as illustrated in FIG. 3. Accordingly, as illustrated in Figure 5, when the objective lens 10 is positioned on the sample side of the focus coordinates, the intensity I A exhibits a value greater than the intensity I B.
また、合焦状態から対物レンズ１０が電動レボルバ１９側（以降、像側と記す。）に移動して集光位置が反射位置より像側に位置する場合、即ち、後ピン状態にある場合、図４に例示されるように、標本ユニットＳＵを反射したレーザー光は、受光領域Ｂに偏って入射する。従って、図５に例示されるように、対物レンズ１０が合焦座標より像側に位置する場合には、強度ＩＢが強度ＩＡより大きな値を示す。 Further, when the objective lens 10 is moved from the in-focus state to the electric revolver 19 side (hereinafter referred to as the image side) and the condensing position is located on the image side from the reflection position, that is, in the rear pin state, As illustrated in FIG. 4, the laser light reflected from the specimen unit SU is incident on the light receiving region B with a bias. Accordingly, as illustrated in Figure 5, when the objective lens 10 is positioned on the image side of the focus coordinates, the intensity I B is a larger value than the intensity I A.
図６及び図７は、合焦判定に用いられるグラフを例示した図である。図６は、対物レンズの各座標における強度ＩＡと強度ＩＢの和（＝ＩＡ＋ＩＢ、以降、第１の評価値と記す）を示す関数（以降、第１の評価関数と記す）のグラフである。図７は、対物レンズの各座標における強度ＩＡと強度ＩＢの和に対する強度ＩＡと強度ＩＢの差の比率（＝（ＩＡ−ＩＢ）／（ＩＡ＋ＩＢ）、以降、第２の評価値と記す）を示す関数（以降、第２の評価関数と記す）のグラフである。 6 and 7 are diagrams illustrating graphs used for in-focus determination. Figure 6 is a sum of the intensities I A and the intensity I B at each coordinate of the objective lens (= I A + I B, hereinafter referred to as a first evaluation value) indicating function (hereinafter, referred to as a first evaluation function) It is a graph of. 7, the difference ratio of the sum with respect to the intensity I A and the intensity I B of the intensity I A and the intensity I B at each coordinate of the objective lens (= (I A -I B) / (I A + I B), and later, It is a graph of a function (hereinafter referred to as a second evaluation function) indicating a second evaluation value).
なお、図５に例示される強度ＩＡが示す形状と強度ＩＢが示す形状は合焦座標に対して互いに対称であるため、図６に例示される第１の評価関数は、合焦座標（縦軸）に対して軸対称な形状を有する。また、同様の理由から、図７に例示される第２の評価関数は、合焦座標（原点）に対して点対称な形状を示す。 Since the shape indicated by the shape and intensity I B indicating the strength I A illustrated in FIG. 5 are symmetrical to each other with respect to focus coordinate, first evaluation function illustrated in Figure 6, focus coordinate It has an axisymmetric shape with respect to (vertical axis). For the same reason, the second evaluation function illustrated in FIG. 7 shows a point-symmetric shape with respect to the in-focus coordinates (origin).
図６に例示されるように、合焦状態で第１の評価関数は最大となるため、合焦判別部３７は第１の評価値が最大値を示しているか否かによって合焦状態を判定する。従って、第１の評価値を用いて合焦判定を実施する場合、合焦手段は、合焦判別部３７により第１の評価値が最大値を示していると判定される位置に対物レンズ１０を移動させることで、対物レンズ１０を標本ユニットＳＵに合焦する。 As illustrated in FIG. 6, since the first evaluation function becomes maximum in the in-focus state, the in-focus determination unit 37 determines the in-focus state based on whether or not the first evaluation value indicates the maximum value. To do. Therefore, when the focus determination is performed using the first evaluation value, the focusing unit 10 is positioned at a position where the focus determination unit 37 determines that the first evaluation value indicates the maximum value. Is moved, the objective lens 10 is focused on the sample unit SU.
図７に例示されるように、合焦状態で第２の評価関数は０となるため、合焦判別部３７は第２の評価値が０か否かによって合焦状態を判定する。従って、第２の評価関数を用いて合焦判定を実施する場合、合焦手段は、合焦判別部３７により第２の評価値が０であると判定される位置に対物レンズ１０を移動させることで、対物レンズ１０を標本ユニットＳＵに合焦する。 As illustrated in FIG. 7, since the second evaluation function is 0 in the in-focus state, the in-focus determination unit 37 determines the in-focus state based on whether or not the second evaluation value is 0. Therefore, when the focus determination is performed using the second evaluation function, the focusing unit moves the objective lens 10 to a position where the second evaluation value is determined to be 0 by the focus determination unit 37. Thus, the objective lens 10 is focused on the sample unit SU.
第１の評価関数、第２の評価関数のいずれを用いても対物レンズ１０を標本ユニットＳＵに合焦することができるが、合焦するために対物レンズ１０を移動すべき方向を容易に認識できる点で、第２の評価関数を用いることがより望ましい。 The objective lens 10 can be focused on the sample unit SU by using either the first evaluation function or the second evaluation function, but the direction in which the objective lens 10 should be moved for focusing is easily recognized. It is more desirable to use the second evaluation function in that it can be done.
図７に例示されるように、合焦座標に対して対物レンズ１０が標本側にある場合、即ち、前ピン状態では、第２の評価値は正の値を示し、合焦座標に対して対物レンズ１０が像側にある場合、即ち、後ピン状態では、第２の評価値は負の値を示す。従って、第２の評価値の正負により対物レンズ１０の移動すべき方向が特定できる。具体的には、第２の評価値が正の値であれば、矢印１で示されるように対物レンズ１０を像側に、第２の評価値が負の値であれば、矢印２で示されるように対物レンズ１０を標本側に移動させればよい。 As illustrated in FIG. 7, when the objective lens 10 is on the sample side with respect to the in-focus coordinates, that is, in the front pin state, the second evaluation value indicates a positive value, and the in-focus coordinates are When the objective lens 10 is on the image side, that is, in the rear pin state, the second evaluation value shows a negative value. Therefore, the direction in which the objective lens 10 should move can be specified by the sign of the second evaluation value. Specifically, if the second evaluation value is a positive value, the objective lens 10 is directed to the image side as indicated by the arrow 1, and if the second evaluation value is a negative value, it is indicated by the arrow 2. The objective lens 10 may be moved to the sample side as described above.
次に、本実施例に係る顕微鏡システム１による液浸媒体の不足の検出方法について説明する。
図８は、乾燥系対物レンズの合焦状態を例示した図である。図９は、液浸対物レンズの合焦状態を例示した図である。ここで、図８に例示される乾燥系対物レンズ１０ａと図９に例示される液浸対物レンズ１０ｂは、焦点距離が等しいものとする。
Next, a method for detecting the shortage of the immersion medium by the microscope system 1 according to the present embodiment will be described.
FIG. 8 is a diagram illustrating an in-focus state of the dry system objective lens. FIG. 9 is a diagram illustrating an in-focus state of the immersion objective lens. Here, it is assumed that the dry objective lens 10a illustrated in FIG. 8 and the immersion objective lens 10b illustrated in FIG. 9 have the same focal length.
乾燥系対物レンズ１０ａを使用する場合、図８に例示されるように、ガラスディッシュ３の底面（以降、界面ＩＦ１と記す）は、屈折率の異なる空気と接しているため、乾燥系対物レンズ１０ａから射出されたレーザー光は、界面ＩＦ１で反射する。従って、像側から標本ユニットＳＵに乾燥系対物レンズ１０ａを合焦する場合、集光位置が界面ＩＦ１に一致したときに、乾燥系対物レンズ１０ａは合焦される。 When the dry system objective lens 10a is used, as illustrated in FIG. 8, the bottom surface of the glass dish 3 (hereinafter referred to as interface IF1) is in contact with air having a different refractive index, and thus the dry system objective lens 10a. The laser beam emitted from is reflected at the interface IF1. Accordingly, when the dry system objective lens 10a is focused on the sample unit SU from the image side, the dry system objective lens 10a is focused when the condensing position coincides with the interface IF1.
一方、液浸対物レンズ１０ｂを使用する場合、通常、液浸対物レンズ１０ｂと標本ユニットＳＵの間は液浸媒体ＷＴで満たされているため、図９に例示されるように、ガラスディッシュ３の底面は、液浸媒体ＷＴと接している。液浸媒体ＷＴとして例えばオイルを用いている場合、ガラスディッシュ３と液浸媒体ＷＴの屈折率は略等しいため、対物レンズ１０から射出されたレーザー光は、界面ＩＦ１で反射せず、ガラスディッシュ３と培養液２（または標本Ｓ）の界面（以降、界面ＩＦ２と記す）で反射する。従って、像側から標本ユニットＳＵに液浸対物レンズ１０ｂを合焦する場合、集光位置が界面ＩＦ２に一致したときに、液浸対物レンズ１０ｂは合焦される。 On the other hand, when the immersion objective lens 10b is used, the space between the immersion objective lens 10b and the specimen unit SU is usually filled with the immersion medium WT. Therefore, as illustrated in FIG. The bottom surface is in contact with the immersion medium WT. For example, when oil is used as the immersion medium WT, since the refractive index of the glass dish 3 and the immersion medium WT is substantially equal, the laser light emitted from the objective lens 10 is not reflected by the interface IF1, and the glass dish 3 And the culture medium 2 (or specimen S) (hereinafter referred to as interface IF2). Therefore, when the immersion objective lens 10b is focused on the specimen unit SU from the image side, the immersion objective lens 10b is focused when the condensing position coincides with the interface IF2.
図８及び図９に例示されるように、乾燥系対物レンズ１０ａと液浸対物レンズ１０ｂでは、合焦位置が光軸方向にガラスディッシュ３の厚さｔだけ異なるため、乾燥系対物レンズ１０ａと液浸対物レンズ１０ｂを切り換えると、合焦座標は厚さｔだけ変化する。 As illustrated in FIGS. 8 and 9, the drying objective lens 10 a and the immersion objective lens 10 b have different in-focus positions in the optical axis direction by the thickness t of the glass dish 3. When the immersion objective lens 10b is switched, the in-focus coordinates change by the thickness t.
図１０は、液浸媒体の不足による液浸対物レンズの合焦状態の変化を例示した図である。図１０は、液浸対物レンズ１０ｂと標本ユニットＳＵの間に液浸媒体で満たされている状態を点線で、液浸対物レンズ１０ｂと標本ユニットＳＵの間に液浸媒体で満たされていない状態を実線で示している。 FIG. 10 is a diagram exemplifying a change in the focus state of the immersion objective lens due to the shortage of the immersion medium. FIG. 10 shows a state where the immersion objective lens 10b and the specimen unit SU are filled with the immersion medium with a dotted line, and a state where the immersion objective lens 10b and the specimen unit SU are not filled with the immersion medium. Is shown by a solid line.
図１０に例示されるように、液浸媒体が不足すると、界面ＩＦ１をまたがって屈折率の差異が生じることになるため、液浸対物レンズ１０ｂから射出されたレーザー光は、界面ＩＦ１で反射する。従って、像側から標本ユニットＳＵに液浸対物レンズ１０ｂを合焦する場合、乾燥系対物レンズ１０ａと同様に、集光位置が界面ＩＦ１に一致したときに、液浸対物レンズ１０ｂは合焦される。 As illustrated in FIG. 10, when the immersion medium is insufficient, a difference in refractive index occurs across the interface IF1, so that the laser light emitted from the immersion objective lens 10b is reflected at the interface IF1. . Therefore, when the immersion objective lens 10b is focused on the specimen unit SU from the image side, the immersion objective lens 10b is focused when the condensing position coincides with the interface IF1, similarly to the dry objective lens 10a. The
このように、液浸対物レンズ１０ｂと標本ユニットＳＵの間が液浸媒体で満たされている場合と満たされていない場合では、液浸対物レンズ１０ｂと乾燥系対物レンズ１０ａとを切り換えた場合と同様に、合焦座標が厚さｔだけ変化することになる。従って、合焦座標の変化を検出することで、液浸媒体の不足を検出することができる。 As described above, the case where the space between the immersion objective lens 10b and the specimen unit SU is filled with the immersion medium and the case where it is not filled with the immersion objective lens 10b and the dry objective lens 10a are switched. Similarly, the focus coordinate changes by the thickness t. Therefore, the lack of the immersion medium can be detected by detecting the change of the in-focus coordinates.
図１に例示されるように、本実施例に係る顕微鏡システム１は、合焦座標を検出する合焦座標検出手段であるエンコーダ２１及び座標検出部２５と、合焦座標検出手段により検出された合焦座標を記録する記録手段である合焦座標記録部４１と、合焦座標記録部４１に記録された合焦座標に基づいて標本ユニットＳＵと液浸対物レンズ１０ｂの間が液浸媒体で満たされているか否かを判定する判定手段である液浸媒体充填判定部４２と、を含んでいる。顕微鏡システム１は、さらに、液浸媒体充填判定部４２による判定に用いられる閾値を設定する閾値設定手段である閾値設定部４３と、ユーザに液浸媒体の不足を通知する通知手段である液浸媒体不足通知部４４と、を含んでいる。 As illustrated in FIG. 1, the microscope system 1 according to the present embodiment is detected by an in-focus coordinate detection unit that detects an in-focus coordinate, an encoder 21 and a coordinate detection unit 25, and the in-focus coordinate detection unit. Based on the in-focus coordinates recorded in the in-focus coordinates recording unit 41, the in-focus medium is an immersion medium between the sample unit SU and the immersion objective lens 10b. An immersion medium filling determination unit 42 which is a determination unit for determining whether or not the liquid is satisfied. The microscope system 1 further includes a threshold setting unit 43 that is a threshold setting unit that sets a threshold used for determination by the immersion medium filling determination unit 42, and an immersion unit that is a notification unit that notifies the user that the immersion medium is insufficient. A medium shortage notification unit 44.
顕微鏡システム１は、撮影手段により標本Ｓの撮影が行われる前に、撮影毎に、合焦手段により液浸対物レンズ１０ｂを合焦し、液浸媒体充填判定部４２により充填判定を行う。なお、撮影とは、標本Ｓの１枚の画像を取得するために行われる一連の動作をいうが、合焦動作やステージの移動などは含まないものとする。また、充填判定とは、標本ユニットＳＵと液浸対物レンズ１０ｂの間が液浸媒体で満たされているか否かの判定をいう。 The microscope system 1 focuses the immersion objective lens 10b by the focusing unit and performs the filling determination by the immersion medium filling determination unit 42 every time the photographing is performed by the photographing unit. Note that imaging refers to a series of operations performed to acquire one image of the sample S, but does not include a focusing operation or stage movement. The filling determination is a determination of whether or not the space between the specimen unit SU and the immersion objective lens 10b is filled with the immersion medium.
エンコーダ２１は、液浸対物レンズ１０ｂが移動すると移動量に応じた電気信号を座標検出部２５へ出力する。座標検出部２５は、合焦手段により液浸対物レンズ１０ｂが標本ユニットＳＵに合焦されると、エンコーダ２１から出力された電気信号に基づいて、液浸対物レンズ１０ｂの標本Ｓに対する光軸方向の相対的な座標を算出し、それを合焦座標として検出する。座標検出部２５は、合焦座標をコントロール部１８へ出力し、合焦座標記録部４１は、コントロール部１８から入力される合焦座標を記録する。 The encoder 21 outputs an electrical signal corresponding to the amount of movement to the coordinate detection unit 25 when the immersion objective lens 10b moves. When the immersion objective lens 10b is focused on the sample unit SU by the focusing means, the coordinate detection unit 25 is based on the electrical signal output from the encoder 21, and the optical axis direction with respect to the sample S of the immersion objective lens 10b. Relative coordinates are calculated and detected as in-focus coordinates. The coordinate detection unit 25 outputs the in-focus coordinates to the control unit 18, and the in-focus coordinate recording unit 41 records the in-focus coordinates input from the control unit 18.
液浸媒体充填判定部４２は、座標検出部２５で検出された現在の合焦座標Ｚｎと前回の撮影時に合焦座標記録部４１に記録された合焦座標Ｚｎ−１との差を算出し、その差が閾値設定部４３に設定されている閾値ＴＡを上回るか否かを判定する。 The immersion medium filling determination unit 42 calculates a difference between the current in-focus coordinate Z n detected by the coordinate detection unit 25 and the in - focus coordinate Z n−1 recorded in the in-focus coordinate recording unit 41 at the previous photographing. It is calculated, and it is determined whether or not the difference exceeds a threshold TA set in the threshold setting unit 43.
閾値ＴＡは、ガラスディッシュ３の厚さｔを基準に閾値設定部４３に算出されるもので値であり、予めユーザがガラスディッシュ３の厚さｔを入力することにより自動的に設定される。例えば、閾値ＴＡは、ガラスディッシュ３の厚さｔと係数ｋの積であり、ここでは、ｋ＝０．８として算出されている。 The threshold TA is calculated by the threshold setting unit 43 based on the thickness t of the glass dish 3 and is automatically set by the user inputting the thickness t of the glass dish 3 in advance. For example, the threshold value TA is a product of the thickness t of the glass dish 3 and the coefficient k, and is calculated here as k = 0.8.
なお、係数ｋは、ガラスディッシュ３の厚さｔの熱ドリフトを考慮して設定されるものであり、測定間隔、設定温度によって１未満の異なる値に設定され得る。
液浸媒体充填判定部４２は、｜Ｚｎ−１−Ｚｎ｜≦ＴＡであれば、合焦座標の変化は小さいため、液浸対物レンズ１０ｂと標本ユニットＳＵの間は液浸媒体で満たされていると判定する。この場合、顕微鏡システム１は、液浸媒体充填判定部４２の判定結果を受けて、撮影動作を開始し、標本Ｓの画像を取得する。
The coefficient k is set in consideration of the thermal drift of the thickness t of the glass dish 3, and can be set to a different value less than 1 depending on the measurement interval and the set temperature.
The immersion medium filling determination unit 42 fills the space between the immersion objective lens 10b and the specimen unit SU with the immersion medium because the change of the in-focus coordinates is small if | Z n-1 −Z n | ≦ TA. It is determined that In this case, the microscope system 1 receives the determination result of the immersion medium filling determination unit 42, starts the photographing operation, and acquires the image of the sample S.
一方、液浸媒体充填判定部４２は、｜Ｚｎ−１−Ｚｎ｜＞ＴＡであれば、合焦座標の変化が大きいため、液浸対物レンズ１０ｂと標本ユニットＳＵの間は液浸媒体で満たされておらず液浸媒体が不足していると判定する。この場合、液浸媒体充填判定部４２は、液浸媒体不足通知部４４へ液浸媒体の不足を示す信号を送信し、液浸媒体不足通知部４４は、ユーザに液浸媒体の不足を通知する。具体的には、液浸媒体不足通知部４４は例えばＬＥＤであり、ＬＥＤの点灯により液浸媒体の不足をユーザに通知してもよい。 On the other hand, if | Z n−1 −Z n |> TA, the immersion medium filling determination unit 42 has a large change in the in-focus coordinates, and therefore, the immersion medium between the immersion objective lens 10 b and the sample unit SU It is determined that the immersion medium is insufficient. In this case, the immersion medium filling determination unit 42 transmits a signal indicating that the immersion medium is insufficient to the immersion medium shortage notification unit 44, and the immersion medium shortage notification unit 44 notifies the user that the immersion medium is insufficient. To do. Specifically, the immersion medium shortage notification unit 44 is, for example, an LED, and may notify the user of the shortage of the immersion medium by turning on the LED.
さらに、顕微鏡システム１では、オフセット補正レンズ群３２を用いて、合焦状態におけるレーザー光の集光位置と励起光の集光位置とをずらすことができる。図１１は、オフセット補正レンズ群によりレーザー光の集光位置と励起光の集光位置とをずらした液浸対物レンズの合焦状態を例示した図である。 Furthermore, in the microscope system 1, the offset correction lens group 32 can be used to shift the condensing position of the laser light and the condensing position of the excitation light in the focused state. FIG. 11 is a diagram illustrating an in-focus state of the immersion objective lens in which the laser light condensing position and the excitation light condensing position are shifted by the offset correction lens group.
図１に例示されるオフセット補正レンズ群３２は、オフセット補正レンズ群３２から射出されるレーザー光の状態を、収束状態や発散状態に調整するためのレンズ群であり、オフセット補正レンズ群３２の光軸方向に移動可能に配置されている。コントロール部１８からの制御信号によりモータ制御部２４ｂがモータ２２ｂを駆動させることで、オフセット補正レンズ群３２が光軸方向に移動し、オフセット補正レンズ群３２から射出されるレーザー光の状態が調整される。これにより、対物レンズ１０へ入射するレーザー光の状態が変化してレーザー光の集光位置が変化する。一方で、オフセット補正レンズ群３２の移動により、光源６から射出される励起光の集光位置は変化しない。 The offset correction lens group 32 illustrated in FIG. 1 is a lens group for adjusting the state of the laser light emitted from the offset correction lens group 32 to a convergence state or a divergence state. It is arranged to be movable in the axial direction. When the motor control unit 24b drives the motor 22b according to the control signal from the control unit 18, the offset correction lens group 32 moves in the optical axis direction, and the state of the laser light emitted from the offset correction lens group 32 is adjusted. The As a result, the state of the laser light incident on the objective lens 10 changes and the condensing position of the laser light changes. On the other hand, due to the movement of the offset correction lens group 32, the condensing position of the excitation light emitted from the light source 6 does not change.
このため、オフセット補正レンズ群３２によりレーザー光の集光位置と励起光の集光位置をずらすことで、合焦状態で標本Ｓを観察する観察面（励起光の集光位置）を界面ＩＦ２からずらすことができる。図１１では、オフセット補正レンズ群３２により、観察面ＶＰが界面ＩＦ２からＺＳだけずれている状態が例示されている。従って、合焦状態で標本の内部を観察することができる。 For this reason, the observation surface (excitation light condensing position) for observing the sample S in the focused state is shifted from the interface IF2 by shifting the condensing position of the laser light and the condensing position of the excitation light by the offset correction lens group 32. Can be shifted. In Figure 11, the offset correction lens group 32, a state in which observation plane VP is shifted from the interface IF2 by Z S is illustrated. Therefore, the inside of the sample can be observed in a focused state.
次に、本実施例に係る顕微鏡システム１によるタイムラプス観察の処理フローについて説明する。図１２Ａは、本実施例に係る顕微鏡システム１によるタイムラプス観察の準備作業のフローを例示したフローチャートである。図１２Ｂは、本実施例に係る顕微鏡システム１によるタイムラプス観察の処理フローを例示したフローチャートである。また、図１３は、図１に例示される顕微鏡システムによるタイムラプス観察時の時間と合焦状態の座標を例示した図である。縦軸は合焦座標を、横軸は撮影時の時間を示している。
図１３は、撮影時間ｔｓ６と撮影時間ｔｓ７の間で、合焦座標がＺ６からＺ７へ閾値ＴＡ以上に変化してオイル（液浸媒体）切れが発生した例を示している。
Next, a processing flow of time lapse observation by the microscope system 1 according to the present embodiment will be described. FIG. 12A is a flowchart illustrating a flow of preparation work for time-lapse observation by the microscope system 1 according to the present embodiment. FIG. 12B is a flowchart illustrating a processing flow of time-lapse observation by the microscope system 1 according to the present embodiment. FIG. 13 is a diagram exemplifying time and in-focus coordinates during time-lapse observation by the microscope system illustrated in FIG. The vertical axis represents the in-focus coordinates, and the horizontal axis represents the time at the time of shooting.
FIG. 13 shows an example in which the out of oil (immersion medium) is generated between the photographing time ts6 and the photographing time ts7 when the in-focus coordinates change from Z6 to Z7 to a threshold TA or more.
図１２Ａに例示されるように、顕微鏡システム１では、タイムラプス観察の開始前に、閾値設定部４３に閾値が設定される。まず、操作部４０を介してユーザから観察に使用するガラスディッシュ３の厚さｔが入力される（ステップＳ１００）。次に、閾値設定部４３は、入力された厚さｔと係数ｋを掛けて閾値ＴＡを算出し（ステップＳ１０１）、算出された閾値ＴＡを記録する（ステップＳ１０２）。これにより、閾値設定部４３に閾値ＴＡが設定される。 As illustrated in FIG. 12A, in the microscope system 1, a threshold value is set in the threshold value setting unit 43 before the start of time-lapse observation. First, the thickness t of the glass dish 3 used for observation is input from the user via the operation unit 40 (step S100). Next, the threshold value setting unit 43 calculates the threshold value TA by multiplying the input thickness t and the coefficient k (step S101), and records the calculated threshold value TA (step S102). As a result, the threshold value TA is set in the threshold value setting unit 43.
図１２Ｂに例示されるように、顕微鏡システム１では、タイムラプス観察が開始されると、まず、操作部４０を介してユーザから撮影間隔時間、撮影枚数、撮影オフセット値が入力される（ステップＳ２００）。撮影間隔時間、撮影枚数、撮影オフセット値は、それぞれ、例えば、１時間、８枚、１０μｍである。次に、ステップＳ２００で設定された撮影オフセット値に基づいてオフセット補正レンズ群３２を駆動することで、観察面が調整される（ステップＳ２０１）。 As illustrated in FIG. 12B, in the microscope system 1, when time-lapse observation is started, first, a shooting interval time, the number of shots, and a shooting offset value are input from the user via the operation unit 40 (step S200). . The shooting interval time, the number of shots, and the shooting offset value are, for example, 1 hour, 8 shots, and 10 μm, respectively. Next, the observation plane is adjusted by driving the offset correction lens group 32 based on the photographing offset value set in step S200 (step S201).
その後、ステップＳ２０２からステップＳ２１１で示されるタイムラプスサイクルが開始される。タイムラプスサイクルの各サイクルでは、まず、合焦手段により標本ユニットＳＵに対物レンズ１０を合焦する（ステップＳ２０２）。次に、合焦座標検出手段であるエンコーダ２１及び座標検出部２５により合焦座標Ｚｎを検出して、合焦座標記録部４１に記録する（ステップＳ２０３）。さらに、前回のタイムラプスサイクルで取得され合焦座標記録部４１に記録されている合焦座標Ｚｎ−１を読み出し（ステップＳ２０４）後、液浸媒体充填判定部４２により充填判定が行われる（ステップＳ２０５）。具体的には、現在の合焦座標Ｚｎと前回のタイムラプスサイクルで取得され合焦座標記録部４１に記録されている合焦座標Ｚｎ−１との差が閾値設定部４３に設定されている閾値ＴＡを上回るか否かが判定される。 Thereafter, the time lapse cycle shown in steps S202 to S211 is started. In each cycle of the time lapse cycle, first, the objective lens 10 is focused on the sample unit SU by the focusing means (step S202). Then, by detecting the coordinates Z n focused by the encoder 21 and the coordinate detection unit 25 is a focus coordinate detection means, and records the in-focus coordinate the recording unit 41 (step S203). Further, after reading the in - focus coordinates Z n−1 acquired in the previous time lapse cycle and recorded in the in-focus coordinate recording unit 41 (step S204), the immersion medium filling determination unit 42 performs the filling determination (step S204). S205). Specifically, a difference between the current in-focus coordinate Z n and the in-focus coordinate Z n−1 acquired in the previous time lapse cycle and recorded in the in-focus coordinate recording unit 41 is set in the threshold setting unit 43. It is determined whether or not a certain threshold TA is exceeded.
液浸媒体充填判定部４２が差は閾値ＴＡ以下であると判定すると、顕微鏡システム１は、標本ユニットＳＵと液浸対物レンズ１０ｂの間は液浸媒体で満たされていると判断して、撮影動作を開始し、撮影手段により標本Ｓを撮影する（ステップＳ２０６）。 When the immersion medium filling determination unit 42 determines that the difference is equal to or less than the threshold value TA, the microscope system 1 determines that the space between the specimen unit SU and the immersion objective lens 10b is filled with the immersion medium, and imaging is performed. The operation is started, and the specimen S is photographed by the photographing means (step S206).
一方、液浸媒体充填判定部４２が差は閾値ＴＡを上回っていると判定すると、撮影動作は開始されず、液浸媒体不足通知部４４によりユーザに液浸媒体の不足が通知される（ステップＳ２０７）。ユーザは、液浸媒体不足通知部４４からの通知を確認し、標本ＳＵと液浸対物レンズ１０ｂの間にオイル等の液浸媒体を供給し、標本ＳＵと液浸対物レンズ１０ｂの間を液浸媒体で満たす（ステップＳ２０８）。 On the other hand, if the immersion medium filling determination unit 42 determines that the difference exceeds the threshold TA, the photographing operation is not started, and the immersion medium shortage notifying unit 44 notifies the user of the shortage of the immersion medium (step). S207). The user confirms the notification from the immersion medium shortage notification unit 44, supplies an immersion medium such as oil between the specimen SU and the immersion objective lens 10b, and liquids between the specimen SU and the immersion objective lens 10b. Fill with immersion medium (step S208).
顕微鏡システム１は、その後、改めて合焦手段により標本ユニットＳＵに対物レンズ１０を合焦し（ステップＳ２０９）、合焦座標検出手段であるエンコーダ２１及び座標検出部２５により合焦座標Ｚｎを検出して、合焦座標記録部４１に記録する（ステップＳ２１０）。その後、顕微鏡システム１は、液浸媒体充填判定部４２による充填判定を行うことなく、撮影動作を開始し、撮影手段により標本Ｓを撮影する（ステップＳ２０６）。なお、撮影動作を開始する前に、再度、液浸媒体充填判定部４２により充填判定が行われてもよい。 Microscope system 1 is then again the objective lens 10 on the specimen unit SU by focusing means focusing (step S209), detects the coordinates Z n focused by the encoder 21 and the coordinate detection unit 25 is a focus coordinate detection means Then, it records in the focus coordinate recording part 41 (step S210). Thereafter, the microscope system 1 starts the imaging operation without performing the filling determination by the immersion medium filling determination unit 42, and images the specimen S by the imaging unit (step S206). Note that the filling determination may be performed again by the immersion medium filling determination unit 42 before the photographing operation is started.
撮影後、顕微鏡システム１は、ステップＳ２００で設定された撮影枚数だけ標本Ｓを撮影したか否かを判定し（ステップＳ２１１）、設定された撮影枚数だけ撮影が行われていれば、タイムラプス観察を終了する。 After shooting, the microscope system 1 determines whether or not the sample S has been shot for the number of shots set in step S200 (step S211). If the set number of shots has been shot, time-lapse observation is performed. finish.
撮影枚数に達していない場合には、ステップＳ２００で設定された撮影間隔時間だけ待機（ステップＳ２１２）後に、ステップＳ２０２へ制御が遷移し、新たなタイムラプスサイクルが開始される。そして、設定された撮影枚数だけ標本Ｓを撮影するまでタイムラプスサイクルを繰り返して、タイムラプス観察を終了する。 If the number of shots has not been reached, after waiting for the shooting interval time set in step S200 (step S212), control is transferred to step S202, and a new time lapse cycle is started. Then, the time lapse cycle is repeated until the set number of shots is taken, and the time lapse observation is completed.
以上、本実施例に係る顕微鏡システム１によれば、液浸対物レンズ１０ｂと標本ユニットＳＵの間は液浸媒体で満たされて否かを判定することで、液浸媒体の不足を検出することができる。このため、顕微鏡システム１は、観察期間中に液浸媒体が蒸発するなどとして、液浸媒体が不足することがある長期間にわたるタイムラプス観察などに、特に有効である。なお、図１２Ｂでは、標本Ｓ中の一箇所のみを観察するタイムラプス観察を例示したが、特にこれに限られない。顕微鏡システム１は、標本Ｓ中の複数箇所を観察する多点タイムラプス観察にも好適である。 As described above, according to the microscope system 1 according to the present embodiment, the lack of the immersion medium is detected by determining whether or not the space between the immersion objective lens 10b and the specimen unit SU is filled with the immersion medium. Can do. For this reason, the microscope system 1 is particularly effective for time-lapse observation over a long period in which the immersion medium may be insufficient because the immersion medium evaporates during the observation period. In addition, in FIG. 12B, although the time lapse observation which observes only one place in the sample S was illustrated, it is not restricted to this in particular. The microscope system 1 is also suitable for multipoint time lapse observation in which a plurality of locations in the specimen S are observed.
また、顕微鏡システム１によれば、撮影動作を開始する前に液浸媒体の不足を検出することができるため、液浸媒体が不足した状態での標本Ｓの撮影を防止することが可能であり、撮影画像の画質の劣化を防止することができる。 Further, according to the microscope system 1, since the shortage of the immersion medium can be detected before the photographing operation is started, it is possible to prevent the specimen S from being photographed when the immersion medium is insufficient. Therefore, it is possible to prevent deterioration of the image quality of the photographed image.
また、顕微鏡システム１によれば、液浸媒体不足通知部４４を通じてユーザに液浸媒体の不足を通知することができるため、ユーザが適宜液浸媒体を供給し直すことで、常に液浸媒体が満たされた状態で標本Ｓを撮影することが可能となり、液浸媒体の不足に起因する光学性能の低下を防止し、常に良好な画像を撮影することができる。 Further, according to the microscope system 1, since the user can be notified of the shortage of the immersion medium through the immersion medium shortage notifying unit 44, the immersion medium is always supplied by appropriately supplying the immersion medium again by the user. The specimen S can be photographed in the filled state, the optical performance can be prevented from being deteriorated due to the lack of the immersion medium, and a good image can always be photographed.
なお、本実施例では、合焦手段として、赤外光半導体レーザー２６と２分割フォトダイオードである受光センサ３６を含む構成を例示し、これらを用いた合焦方法を例示したが、合焦手段や合焦方法は、特にこれに限られない。合焦手段は、例えば、赤外光半導体レーザー２６の代わりにＬＥＤ光源を含んでもよく、例えば、２分割フォトダイオードの代わりに４分割フォトダイオード、ラインセンサ、またはＣＣＤ等を含んでもよい。また、合焦方法も既知の他の方法を利用しても良い。 In this embodiment, as the focusing means, a configuration including the infrared light semiconductor laser 26 and the light receiving sensor 36 which is a two-divided photodiode is illustrated, and a focusing method using these is illustrated. The focusing method is not limited to this. The focusing means may include, for example, an LED light source instead of the infrared light semiconductor laser 26, and may include, for example, a quadrant photodiode, a line sensor, or a CCD instead of the two-segment photodiode. Also, another known method may be used as the focusing method.
また、本実施例では、合焦手段が、対物レンズ１０を光軸方向へ移動させることにより、対物レンズ１０を標本ユニットＳＵに合焦する例を示したが、特にこれに限られない。合焦手段は、電動ステージ４を光軸方向へ移動させることにより、対物レンズ１０を標本ユニットＳＵに合焦してもよい。なお、その場合、合焦座標検出手段は、電動ステージ４に備えられたエンコーダと座標検出部から構成されてもよい。 In the present embodiment, the example in which the focusing unit moves the objective lens 10 in the optical axis direction to focus the objective lens 10 on the sample unit SU has been described. However, the present invention is not limited thereto. The focusing means may focus the objective lens 10 on the sample unit SU by moving the electric stage 4 in the optical axis direction. In this case, the in-focus coordinate detection means may be composed of an encoder and a coordinate detection unit provided in the electric stage 4.
また、本実施例では、液浸媒体充填判定部４２が、判定式として、｜Ｚｎ−１−Ｚｎ｜＞ＴＡを用いて、液浸対物レンズ１０ｂと標本ユニットＳＵの間が液浸媒体で満たされているか否かを判定する例を示したが、判定式は特にこれに限られない。観察中にガラスディッシュ３に熱が加わることでガラスディッシュ３の厚さが変化する現象である熱ドリフトを考慮した判定式を用いても良い。 In the present embodiment, the immersion medium filling determination unit 42 uses | Z n-1 −Z n |> TA as a determination formula, and the immersion medium between the immersion objective lens 10 b and the specimen unit SU is used. However, the determination formula is not particularly limited to this. A judgment formula in consideration of thermal drift, which is a phenomenon in which the thickness of the glass dish 3 changes when heat is applied to the glass dish 3 during observation, may be used.
例えば、判定式として、｜｜Ｚｎ−１−Ｚｎ｜−｜Ｚｎ−２−Ｚｎ−１｜｜≦ＴＡを用いても良い。なお、ここで、ＴＡは閾値を、Ｚｎは現在の合焦座標、Ｚｎ−１は前回の撮影時の合焦座標、Ｚｎ−２は前々回の撮影時の合焦座標である。これにより、撮影間に生じる熱ドリフトによる合焦座標の変化を相殺することができるため、より高い精度の充填判定を行うことができる。 For example, || Z n-1 −Z n | − | Z n−2 −Z n−1 || ≦ TA may be used as the determination formula. Here, TA is a threshold value, Z n is the current in-focus coordinate, Z n−1 is the in - focus coordinate at the previous shooting, and Z n−2 is the in - focus coordinate at the previous shooting. Thereby, since the change of the focus coordinate by the thermal drift which arises between imaging | photography can be canceled, more accurate filling determination can be performed.
また、本実施例では、液浸媒体不足通知部４４としてＬＥＤを例示したが、特にこれに限られない。ホストＰＣ１６が液浸媒体不足通知部４４として機能してもよく、その場合、ホストＰＣ１６の画面上に液浸媒体の不足を示すメッセージ等を表示してもよい。また、液浸媒体不足通知部４４として警告音を発する装置を用いても良い。また、液浸媒体不足通知部４４は、タイムラプス観察中に合焦が不可能となった場合にも、ユーザに液浸媒体の不足を通知しても良い。 In the present embodiment, the LED is illustrated as the immersion medium shortage notifying unit 44, but the present invention is not limited to this. The host PC 16 may function as the immersion medium shortage notification unit 44, and in that case, a message indicating the shortage of the immersion medium may be displayed on the screen of the host PC 16. Further, a device that emits a warning sound may be used as the immersion medium shortage notification unit 44. Further, the immersion medium shortage notifying unit 44 may notify the user of the shortage of the immersion medium even when focusing becomes impossible during time-lapse observation.
また、本実施例では、顕微鏡システム１として、倒立顕微鏡を含むシステムを例示したが特にこれに限られない。顕微鏡システム１は、正立顕微鏡を含むシステムや、顕微鏡を含むインキュベータ装置などであってもよい。 In the present embodiment, the microscope system 1 is exemplified by a system including an inverted microscope, but is not limited thereto. The microscope system 1 may be a system including an upright microscope, an incubator apparatus including a microscope, or the like.
また、本実施例では、標本保持部材として、ガラスディッシュ３を例示したが特にこれに限られない。例えば、カバーガラスなどであってもよい。また、標本保持部材の材料もガラス材料に限られない。標本保持部材の材料は、液浸媒体の屈折率に近い屈折率を有する材料であればよい。 In the present embodiment, the glass dish 3 is exemplified as the specimen holding member, but the present invention is not limited to this. For example, a cover glass may be used. Further, the material of the specimen holding member is not limited to the glass material. The material of the specimen holding member may be a material having a refractive index close to that of the immersion medium.
また、本実施例では、液浸媒体として、オイルを例示したが特にこれに限られない。液浸媒体は、液浸媒体は、標本保持部材の屈性率に近い屈折率を有する媒体であればよい。 In this embodiment, oil is exemplified as the immersion medium, but the present invention is not limited to this. The immersion medium may be a medium having a refractive index close to the refractive index of the specimen holding member.
図１４は、本実施例に係る顕微鏡システムの構成を例示した図である。図１４に例示される顕微鏡システム４５は、液浸媒体不足通知部４４の代わりに、液浸媒体を供給する供給手段であるオイル供給制御部４６及びオイル供給部４７を含む点が、図１に例示される顕微鏡システム１と異なっている。その他の構成は顕微鏡システム１と同様であるため、同一の構成要素には同一の符号を付して説明を省略する。なお、オイル供給部４７は、内部に液浸媒体であるオイルを保持している。また、オイル供給部４７は、電動ステージ４に搭載されていて、電動ステージ４の移動によりオイル供給部４７も移動するように構成されている。 FIG. 14 is a diagram illustrating the configuration of the microscope system according to the present embodiment. The microscope system 45 illustrated in FIG. 14 includes an oil supply control unit 46 and an oil supply unit 47, which are supply means for supplying an immersion medium, instead of the immersion medium shortage notification unit 44 in FIG. It is different from the microscope system 1 illustrated. Since other configurations are the same as those of the microscope system 1, the same components are denoted by the same reference numerals and description thereof is omitted. The oil supply unit 47 holds oil as an immersion medium inside. The oil supply unit 47 is mounted on the electric stage 4, and is configured such that the oil supply unit 47 moves as the electric stage 4 moves.
図１４に例示される顕微鏡システム４５では、液浸媒体充填判定部４２により行われる充填判定の結果、標本ＳＵと液浸対物レンズ１０ｂの間が液浸媒体で満たされていないと判断された場合、コントロール部１８からの制御信号により、オイル供給制御部４６がオイル供給部４７を制御して、自動的に標本ＳＵと液浸対物レンズ１０ｂの間を液浸媒体で満たす。 In the microscope system 45 illustrated in FIG. 14, when it is determined that the space between the specimen SU and the immersion objective lens 10 b is not filled with the immersion medium as a result of the filling determination performed by the immersion medium filling determination unit 42. The oil supply control unit 46 controls the oil supply unit 47 according to the control signal from the control unit 18 to automatically fill the space between the specimen SU and the immersion objective lens 10b with the immersion medium.
より具体的には、まず、ステージ駆動部５が、標本ユニットＳＵと液浸対物レンズ１０ｂが対向する図１５に例示される観察ポジションから、オイル供給部４７と液浸対物レンズ１０ｂが対向する図１６に例示される供給ポジションへ、電動ステージ４を移動させる。次に、オイル供給制御部４６がオイル供給部４７に液浸対物レンズ１０ｂ上へ適量のオイルを供給させる。オイル供給部４７は、不図示の小型ポンプを用いることで、内部に保持されているオイルから適量のオイルを液浸対物レンズ１０ｂ上へ供給することができる。最後に、ステージ駆動部５が、電動ステージ４を図１６に例示される供給ポジションから図１５に例示される観察ポジションへ戻す。 More specifically, first, the stage drive unit 5 is a diagram in which the oil supply unit 47 and the immersion objective lens 10b face each other from the observation position illustrated in FIG. 15 where the sample unit SU and the immersion objective lens 10b face each other. The electric stage 4 is moved to the supply position exemplified in FIG. Next, the oil supply control unit 46 causes the oil supply unit 47 to supply an appropriate amount of oil onto the immersion objective lens 10b. The oil supply unit 47 can supply an appropriate amount of oil from the oil held inside to the immersion objective lens 10b by using a small pump (not shown). Finally, the stage driving unit 5 returns the electric stage 4 from the supply position illustrated in FIG. 16 to the observation position illustrated in FIG.
図１７は、本実施例に係る顕微鏡システム４５によるタイムラプス観察の処理フローを例示したフローチャートである。図１７に例示されるタイムラプス観察の処理フローは、充填判定の結果、液浸媒体が不足していると判定された場合に行われる処理のみが、図１２Ｂに例示される顕微鏡システム１によるタイムラプス観察の処理フローと異なっている。このため、顕微鏡システム１の処理と同一の処理には同一の符号を付して説明を省略する。なお、顕微鏡システム４５によるタイムラプス観察の準備作業のフローは、図１２Ａに例示される顕微鏡システム１によるタイムラプス観察の準備作業のフローと同様である。 FIG. 17 is a flowchart illustrating a processing flow of time lapse observation by the microscope system 45 according to the present embodiment. The processing flow of the time lapse observation illustrated in FIG. 17 is the time lapse observation by the microscope system 1 illustrated in FIG. 12B only when the filling determination determines that the immersion medium is insufficient. The processing flow is different. For this reason, the same processes as those of the microscope system 1 are denoted by the same reference numerals and the description thereof is omitted. Note that the flow of preparation work for time lapse observation by the microscope system 45 is the same as the flow of preparation work for time lapse observation by the microscope system 1 illustrated in FIG. 12A.
図１７に例示されるように、本実施例に係る顕微鏡システム４５では、ステップＳ２０５の充填判定処理の結果、液浸媒体が不足していると判定されると、図１６に例示される供給ポジションへ電動ステージ４が移動する（ステップＳ３００）。そして、コントロール部１８からの制御信号によりオイル供給制御部４６がオイル供給部４７を制御し、オイル供給部４７が液浸対物レンズ１０ｂ上へ適量のオイルを供給する（ステップＳ３０１）。オイルの供給が終了すると、ステップＳ３００での移動前に位置していた図１５に例示される観察ポジションへ電動ステージ４が復帰する（ステップＳ３０２）。その後の処理は、実施例１に係る顕微鏡システム１の場合と同様である。 As illustrated in FIG. 17, in the microscope system 45 according to the present embodiment, when it is determined that the immersion medium is insufficient as a result of the filling determination process in step S205, the supply position illustrated in FIG. The electric stage 4 moves to (step S300). Then, the oil supply control unit 46 controls the oil supply unit 47 by the control signal from the control unit 18, and the oil supply unit 47 supplies an appropriate amount of oil onto the immersion objective lens 10b (step S301). When the oil supply is completed, the electric stage 4 returns to the observation position illustrated in FIG. 15 that was located before the movement in Step S300 (Step S302). The subsequent processing is the same as in the case of the microscope system 1 according to the first embodiment.
以上、本実施例に係る顕微鏡システム４５によれば、実施例１に係る顕微鏡システム１と同様に、液浸媒体の不足を検出することができる。また、実施例１に係る顕微鏡システム１と同様に、撮影動作を開始する前に液浸媒体の不足を検出することができるため、液浸媒体が不足した状態での標本Ｓの撮影を防止することが可能であり、撮影画像の画質の劣化を防止することができる。 As described above, according to the microscope system 45 according to the present embodiment, as in the microscope system 1 according to the first embodiment, the shortage of the immersion medium can be detected. Further, similarly to the microscope system 1 according to the first embodiment, since the shortage of the immersion medium can be detected before the photographing operation is started, the photographing of the specimen S in the state where the immersion medium is insufficient is prevented. It is possible to prevent degradation of the image quality of the captured image.
さらに、本実施例に係る顕微鏡システム４５によれば、液浸媒体の不足を検出した場合に、自動的に液浸媒体を供給することができる。このため、タイムラプス観察におけるユーザの負担を大幅に削減することができる。 Furthermore, according to the microscope system 45 according to the present embodiment, the immersion medium can be automatically supplied when the shortage of the immersion medium is detected. For this reason, a user's burden in time-lapse observation can be reduced significantly.
なお、本実施例では、供給手段として、オイル供給制御部４６と電動ステージ４上に配置されたオイル供給部４７とを含む構成を例示したが、特にこれに限られない。供給手段は、液浸媒体の不足を検出した場合に、液浸対物レンズ１０ｂ上に適量の液浸媒体を供給できれば良い。 In the present embodiment, the configuration including the oil supply control unit 46 and the oil supply unit 47 disposed on the electric stage 4 is exemplified as the supply unit, but is not limited thereto. The supply means only needs to supply an appropriate amount of the immersion medium onto the immersion objective lens 10b when the shortage of the immersion medium is detected.
また、本実施例に係る顕微鏡システム４５も、実施例１に係る顕微鏡システム１と同様に、合焦手段、顕微鏡、標本保持部材、液浸媒体、充填判定の判定式等を適宜変更してもよい。 In addition, the microscope system 45 according to the present embodiment can also appropriately change the focusing means, the microscope, the specimen holding member, the immersion medium, the determination formula for the filling determination, and the like, similarly to the microscope system 1 according to the first embodiment. Good.
１、４５・・・顕微鏡システム、２・・・培養液、３・・・ガラスディッシュ、４・・・電動ステージ、５・・・ステージ制御部、６・・・光源、７・・・コレクタレンズ、８・・・励起フィルタ、９、３４・・・ダイクロイックミラー、１０・・・対物レンズ、１０ａ・・・乾燥系対物レンズ、１０ｂ・・・液浸対物レンズ、１１・・・吸収フィルタ、１２・・・光路切換え部、１３・・・接眼レンズ、１４・・・ＣＣＤカメラユニット、１５・・・ビデオキャプチャボード、１６・・・ホストＰＣ、１７・・・電動シャッタ、１８・・・コントロール部、１９・・・電動レボルバ、２１・・・エンコーダ、２２ａ、２２ｂ・・・モータ、２３・・・架台、２４ａ、２４ｂ・・・モータ制御部、２５・・・座標検出部、２６・・・赤外光半導体レーザー、２７・・・レーザー駆動部、２８・・・コリメートレンズ、２９・・・投光側ストッパ、３０・・・ＰＢＳ、３１、３５・・・集光レンズ群、３２・・・オフセット補正レンズ群、３３・・・λ／４板、３６・・・受光センサ、３７・・・合焦判別部、４０・・・操作部、４１・・・合焦座標記録部、４２・・・液浸媒体充填判定部、４３・・・閾値設定部、４４・・・液浸媒体不足通知部、４６・・・オイル供給制御部、４７・・・オイル供給部、Ｓ・・・標本、ＳＵ・・・標本ユニット、ＩＦ１、ＩＦ２・・・界面、ＶＰ・・・観察面、Ｍ・・・ミラー
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1,45 ... Microscope system, 2 ... Culture solution, 3 ... Glass dish, 4 ... Electric stage, 5 ... Stage control part, 6 ... Light source, 7 ... Collector lens , 8 ... Excitation filter, 9, 34 ... Dichroic mirror, 10 ... Objective lens, 10a ... Drying objective lens, 10b ... Immersion objective lens, 11 ... Absorption filter, 12 ... Optical path switching unit, 13 ... Eyepiece, 14 ... CCD camera unit, 15 ... Video capture board, 16 ... Host PC, 17 ... Electric shutter, 18 ... Control unit , 19 ... Electric revolver, 21 ... Encoder, 22a, 22b ... Motor, 23 ... Mount, 24a, 24b ... Motor control unit, 25 ... Coordinate detection unit, 26 ... Half infrared light Body laser, 27... Laser drive unit, 28... Collimating lens, 29... Projection side stopper, 30... PBS, 31, 35. Lens group, 33... Λ / 4 plate, 36... Light receiving sensor, 37... Focus determination unit, 40... Operation unit, 41. Immersion medium filling determination unit, 43... Threshold setting unit, 44... Immersion medium shortage notification unit, 46... Oil supply control unit, 47. ..Sample unit, IF1, IF2 ... interface, VP ... observation surface, M ... mirror
Claims (7)
標本と前記標本を保持する保持部材とを含む標本ユニットに前記液浸対物レンズを合焦する合焦手段と、
前記合焦手段により合焦された前記液浸対物レンズの、前記標本に対する光軸方向の相対的な座標である、合焦座標を検出する合焦座標検出手段と、
前記合焦座標検出手段により検出された合焦座標を記録する記録手段と、
前記記録手段に記録された合焦座標に基づいて、前記保持部材と前記液浸対物レンズの間が液浸媒体で満たされているか否かを判定する判定手段と、を含む
ことを特徴とする顕微鏡システム。 An immersion objective lens;
Focusing means for focusing the immersion objective lens on a specimen unit including a specimen and a holding member that holds the specimen;
In-focus coordinate detection means for detecting in-focus coordinates, which are relative coordinates in the optical axis direction with respect to the specimen of the immersion objective lens focused by the in-focus means;
Recording means for recording the in-focus coordinates detected by the in-focus coordinate detection means;
Determination means for determining whether or not the space between the holding member and the immersion objective lens is filled with an immersion medium based on the in-focus coordinates recorded in the recording means. Microscope system.
前記判定手段による判定に用いられる閾値を設定する閾値設定手段を含み、
前記判定手段は、
現在の合焦座標と前記記録手段に記録された合焦座標との差が前記閾値未満であるときに、前記保持部材と前記液浸対物レンズの間が前記液浸媒体で満たされていると判定し、
現在の合焦座標と前記記録手段に記録された合焦座標との差異が前記閾値以上であるときに、前記保持部材と前記液浸対物レンズの間が前記液浸媒体で満たされていないと判定する
ことを特徴とする顕微鏡システム。 The microscope system according to claim 1, further comprising:
Including a threshold value setting means for setting a threshold value used for determination by the determination means;
The determination means includes
When the difference between the current in-focus coordinates and the in-focus coordinates recorded in the recording means is less than the threshold, the space between the holding member and the immersion objective lens is filled with the immersion medium. Judgment,
When the difference between the current in-focus coordinates and the in-focus coordinates recorded in the recording means is equal to or greater than the threshold, the space between the holding member and the immersion objective lens is not filled with the immersion medium. A microscope system characterized by judging.
前記記録手段に記録された合焦座標は、現在の合焦座標が記録される直前に記録された前回の合焦座標である
ことを特徴とする顕微鏡システム。 The microscope system according to claim 2,
2. The microscope system according to claim 1, wherein the in-focus coordinates recorded in the recording means are the previous in-focus coordinates recorded immediately before the current in-focus coordinates are recorded.
前記閾値は、前記保持部材の光軸方向の厚さを用いて算出される値である
ことを特徴とする顕微鏡システム。 The microscope system according to claim 2 or claim 3,
The microscope system according to claim 1, wherein the threshold value is a value calculated using a thickness of the holding member in the optical axis direction.
ユーザに前記液浸媒体の不足を通知する通知手段を含み、
前記通知手段は、前記判定手段により前記保持部材と前記液浸対物レンズの間が前記液浸媒体で満たされていないと判定されたときに、ユーザに前記液浸媒体の不足を通知する
ことを特徴とする顕微鏡システム。 The microscope system according to any one of claims 1 to 4, further comprising:
Notifying means for notifying the user of the shortage of the immersion medium,
The notification means notifies the user of the lack of the immersion medium when the determination means determines that the space between the holding member and the immersion objective lens is not filled with the immersion medium. A featured microscope system.
前記液浸媒体を供給する供給手段を含み、
前記供給手段は、前記判定手段により前記保持部材と前記液浸対物レンズの間が前記液浸媒体で満たされていないと判定されたときに、前記液浸媒体を供給する
ことを特徴とする顕微鏡システム。 The microscope system according to any one of claims 1 to 4, further comprising:
Supply means for supplying the immersion medium;
The microscope supplies the immersion medium when the determination means determines that the space between the holding member and the immersion objective lens is not filled with the immersion medium. system.
前記標本の撮影を行う撮影手段を含み、
前記判定手段は、前記撮影手段により前記標本の撮影が行われる前に、前記保持部材と前記液浸対物レンズの間が前記液浸媒体で満たされているか否かを判定する
ことを特徴とする顕微鏡システム。 The microscope system according to any one of claims 1 to 6, further comprising:
Including imaging means for imaging the specimen;
The determination unit determines whether or not a space between the holding member and the immersion objective lens is filled with the immersion medium before the sample is imaged by the imaging unit. Microscope system.
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