JP5526407B2 - 抗adam−15抗体及びその利用 - Google Patents
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Description
特許文献1 : 米国特許第5830742号
特許文献2 : 米国特許第6013466号
非特許文献1 : Almeida, E.A. et al., Cell, 81, 1095-1104, 1995
非特許文献2 : Wen, C. et al., Development, 124, 4759-4767, 1997
非特許文献3 : Tortorella, M. D. et al., Science, 284, 1664-1666, 1999
非特許文献4 : Alfandari, D. et al., Dev.Biol., 182, 314-330, 1997
非特許文献5 : Zhang, X.P. et al., J. Biol.Chem. 273, 7345-7350, 1998
非特許文献6 : Nath, D. et al., J. Cell Sci. 112, 579-587,1999
非特許文献7 : Eto, K. et al. J. Biol. Chem. 277, 17804-17810, 2002
非特許文献8 : Trochon-Joseph, V., et al., Cancer Res, 64, 2062-2069, 2004
非特許文献9 : Herren, B., et al., Exp Cell Res, 271, 152-160, 2001
非特許文献10 : Charrier, L., et al., J Biol Chem, 282, 16948-16958, 2007
非特許文献11 : Ham, C., et al., Exp Cell Res, 279, 239-247, 2002
非特許文献12 : Horiuchi, K., et al., Mol Cell Biol, 23, 5614-5624, 2003
非特許文献13 : Komiya, K., et al., Arthritis Res Ther, 7, R1158-1173, 2005
(2)ADAM−15のディスインテグリンドメインドメインを認識し、かつ、ADAM−15のディスインテグリンドメイン内のループ領域を認識しない抗体またはその断片。
(3)上記(1)又は(2)に記載の抗体またはその断片であって、ADAM−15及びインテグリンαvβ3依存性細胞接着を阻害する抗体またはその断片。
(4)上記(1)〜(3)のいずれか1項に記載の抗体またはその断片であって、ADAM−15及びインテグリンα9β1依存性細胞接着を阻害する抗体またはその断片。
(5)上記(1)〜(4)のいずれか1項に記載の抗体またはその断片であって、癌細胞の増殖を抑制することを特徴とする抗体またはその断片。
(6)上記抗体が、モノクローナル抗体である、上記(1)〜(5)のいずれか1項に記載の抗体またはその断片。
(7)上記抗体が、配列番号12のアミノ酸配列を有する重鎖および/または配列番号14のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、上記(1)〜(6)のいずれか1項に記載の抗体またはその断片。
(8)上記抗体が、受領番号FERM ABP−10950で特定されるハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体である、上記(6)に記載の抗体またはその断片。
(9)上記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は、ヒト抗体である、上記(1)〜(7)のいずれか1項に記載の抗体またはその断片。
(10)上記抗体断片が、F(ab’)2、Fab’、Fab、一本鎖Fv(scFv)、ジスルフィド結合Fv(dsFv)若しくはこれらの重合体、又は、二量体化V領域(Diabody)である、上記(1)〜(5)のいずれか1項に記載の抗体またはその断片。
(11)上記抗体の断片が、抗体のCDR配列を含むペプチドである、上記(1)〜(5)のいずれか1項に記載の抗体またはその断片。
(12)上記CDR配列が、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、または配列番号20のアミノ酸配列を有する、上記(11)に記載の抗体またはその断片。
(13)上記(1)〜(12)のいずれか1項に記載の抗体またはその断片をコードするDNA。
(14)上記(13)に記載のDNAを含有する組み換えベクター。
(15)上記(14)に記載の組み換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換細胞。
(16)ハイブリドーマ細胞系である、上記(15)に記載の細胞。
(17)受領番号FERM ABP−10950で特定されるハイブリドーマ細胞系である、上記(16)に記載の細胞。
(18)上記(15)又は(16)に記載の細胞を培養し、培養物中で抗体またはその断片を生成させ、培養物から抗体またはその断片を抽出することを特徴とする、上記(1)〜(12)のいずれか1項に記載の抗体またはその断片の製造方法。
(19)上記(1)〜(12)のいずれか1項に記載の抗体またはその断片を有効成分として含有する、医薬組成物。
(20)細胞増殖、細胞遊走、細胞間接着、又は、血管新生に起因する疾患の治療薬又は予防薬である、上記(19)に記載の医薬組成物。
(21)抗癌剤又は癌転移抑制剤である、上記(19)に記載の医薬組成物。
(22)上記(1)〜(12)のいずれか1項に記載の抗体またはその断片を備える診断薬。
(23)細胞増殖、細胞遊走、細胞間接着、又は、血管新生に起因する疾患の診断薬である、上記(22)に記載の診断薬。
本発明の抗体は、例えば、ADAM−15、又は、ADAM−15の一部を有するペプチドを、必要に応じて免疫賦活剤(例えば、鉱油若しくはアルミニウム沈殿物と加熱死菌若しくはリポ多糖体、フロインドの完全アジュバント、または、フロインドの不完全アジュバント等)とともに、非ヒト哺乳動物または鳥類に免疫することにより作製することができる。
例えば、PEG法の場合、上述の方法に従って得られた抗体産生細胞及び骨髄腫細胞を、培地、PBS(Phosphate Buffered Saline)等で洗浄後、30〜60%のPEG(平均分子量1000〜6000)等の細胞凝集性媒体を含む適当な培地または緩衝液中で、脾細胞と骨髄腫細胞を1:2〜10:1(好ましくは、5:1〜10:1)の混合比で懸濁し、温度約25〜37℃、pH6〜8の条件下で、約30秒〜3分間程度反応させる(Elsevier Publishing, 1988)。反応終了後、PEG溶液を除いて培地に再懸濁し、セルウェルプレート中に播種して培養を続ける。
培養後、培養上清を採取し、ELISA等により、抗原タンパク質に結合し、非抗原タンパク質に結合しないサンプルを選択する。例えば、「新臨床免疫実験操作法」(part 3)(科学評論社、1997)に記載された細胞ELISA法を用いて確認及びスクリーニングを行うことができる。このようなクローンから限界希釈法を1から5回、好適には2から4回繰り返すことにより単一細胞化を行い、安定して高い抗体価を示す細胞を選択することができる。
(1)ヒト型キメラ抗体
本発明のヒト型キメラ抗体は、ADAM−15と結合し、ADAM−15の機能を阻害する非ヒト動物由来モノクローナル抗体のVH及びVLをコードするDNAを調製し、これをヒト由来免疫グロブリンの定常領域cDNAと結合して発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞に当該ベクターを導入して発現させることにより得ることができる(Morrison, S.L.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851-6855, 1984)。
本発明のヒト化抗体は、ADAM−15と結合し、ADAM−15の活性を阻害する非ヒト動物由来モノクローナル抗体のVH及びVLのCDRをコードするアミノ酸配列をヒト抗体のVH及びVLのフレームワーク領域(FR)に移植したV領域をコードするDNAを構築し、構築したDNAをヒト由来免疫グロブリンの定常領域cDNAと結合して発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞に当該ベクターを導入して発現させることにより得ることができる(L. Rieohmannら, Nature, 332, 323, 1988; Kettleborough, C. A.ら, Protein Eng., 4, 773-783, 1991; Clark M., Immunol. Today., 21, 397-402, 2000参照)。
ヒト抗体は、例えば、ヒト抗体ファージライブラリーまたはヒト抗体産生トランスジェニックマウスを利用することにより得ることができる(富塚ら, Nature Genet., 15, 146-156(1997))。
本発明の抗体の断片(F(ab’)2、Fab’、Fab、scFv、dsFv若しくはこれらの重合体、Diabody、または、CDRを含むペプチド)は、以下の方法により作製することができる。
本発明のADAM−15に結合する抗体等は、上述の方法により得られた抗体等のうち、所望のエピトープを認識する抗体等を選択することにより得ることができる。また、本発明のADAM−15を認識する抗体等は、上述の抗ADAM−15抗体作製方法において、抗原として所望のエピトープ配列(好ましくは、ディスインテグリンドメイン配列)を有するペプチドを投与することにより得ることができる。
ADAM−15のディスインテグリンドメインを認識し、かつ、ADAM−15のディスインテグリンドメイン内のループ領域を認識しない抗体等は、前記方法により得られたDAM−15のディスインテグリンドメインを認識する抗体等の中から、ADAM−15のディスインテグリンドメイン内のループ領域を認識しない抗体等を当業者に周知の方法により選択することにより得ることができる。例えば、ADAM−15のディスインテグリンドメインを認識し、かつ、ADAM−15のディスインテグリンドメイン内のループ領域を認識しない抗体等は、ADAM−15を構成するアミノ酸のうち、ADAM−15のディスインテグリンドメイン内のループ領域の少なくとも1アミノ酸にアラニンミューテーションを導入した全長ADAM−15変異体またはADAM−15変異体断片を作製して、当該変異体等と得られた抗体等との結合活性を測定し、全長ADAM−15またはADAM−15断片との結合活性と比較して、結合活性が変化しない抗体等を選択することにより得ることができる。
得られた抗体がADAM−15及びインテグリンαvβ3依存性細胞接着を阻害するか否かは、例えば、得られた抗体の存在下/非存在下における、ADAM−15リコンビナントタンパク質を固相化したプレートへの、インテグリンαvβ3発現細胞の結合を比較することにより調べることができる。コントロールとして抗インテグリンαvβ3抗体の存在下/非存在下における、ADAM−15リコンビナントタンパク質を固相化したプレートへの、インテグリンαvβ3発現細胞の結合を測定することにより、測定している細胞接着が、インテグリンαvβ3依存性細胞接着であるか否かを知ることができる。
得られた抗体がADAM−15及びインテグリンαvβ3依存性細胞接着を阻害するか否かは、例えば、得られた抗体の存在下/非存在下における、ADAM−15リコンビナントタンパク質を固相化したプレートへの、インテグリンα9β1発現細胞の結合を比較することにより調べることができる。コントロールとして抗インテグリンα9β1抗体の存在下/非存在下における、ADAM−15リコンビナントタンパク質を固相化したプレートへの、インテグリンα9β1発現細胞の結合を測定することにより、測定している細胞接着が、インテグリンα9β1依存性細胞接着であるか否かを知ることができる。
得られた抗体等は、ADAM−15とインテグリンとの結合を阻害することにより、情報の細胞内シグナル伝達を遮断できることから、このようなシグナルが関与する疾患の治療薬として使用することができる。ADAM−15とインテグリンを発現している細胞や癌細胞を用い、得られた抗体等の存在下での結合阻害をin vitro又はin vivoで観察することにより、本発明の抗体等の対象疾患を見出すことができる。
本発明の抗体等は、ADAM−15を特異的に認識することができるので、被検液中のADAM−15の定量に使用することができる。本発明の抗体等を備える診断薬は、炎症性疾患、例えばリウマチ関節炎、肝炎、気管支喘息、線維症、糖尿病、癌転移、動脈硬化、多発性硬化症、肉芽腫等の診断剤、また臓器移植後の慢性拒絶反応抑制、全身性自己免疫疾患・エリテマトーデス・ぶどう膜炎・ベーチェト病・多発性筋炎・糸状体増殖性腎炎・サルコイドーシス等の自己免疫疾患の診断剤として用いることができる。本発明の診断薬は、抗体分子を用いた公知の方法に基づくことができる。このような方法としては、例えば、ELISA(Catty, Raykundalia, 1989)、ラジオイムノアッセイ(Catty, Murphy, 1989)、免疫組織化学的方法(Heiderら、1993)、イムノメトリック法、または、ウェスタンブロット等を挙げることができる。本発明の診断薬の検体としては、例えば、生検として被験者から採取した組織試料または液体を使用することができる。使用される生検は、ADAM−15の免疫学的測定の対象となるものであれば特に限定はなく、例えば、組織、血液、尿、漿液、髄液、関節液、眼房水、涙液、唾液またはそれらの分画物若しくは処理物を挙げることができる。本発明の診断薬による分析は、定性的、定量的または半定量的に行うことができる。
ヒトα9インテグリン遺伝子はG361細胞から抽出したトータルRNAから、ReverTraAce (TOYOBO)を用いて合成したcDNAを鋳型としてPCRを行うことでクローニングした。ヒトα9インテグリン遺伝子のクローニングは5’側断片と3’側断片に分割して、以下のプライマーを用いて行った。
ヒトα9インテグリン遺伝子5’側断片
センスプライマー:5’-TTTTAAGCTTGCCACCATGGGCGGCCCGGCTG-3’(配列番号1)
アンチセンスプライマー:5’-AAACTGCAGTCCGGAGCACTGGATTTATCTTCT-3’(配列番号2)
ヒトα9インテグリン遺伝子3’側断片
センスプライマー:5’-AAATCCGGATGTTTGGTCCATATC-3’(配列番号3)
アンチセンスプライマー:5’-AAATCTAGATCACTGGTTTTTCTGGACCCAGTC-3’(配列番号4)
ヒトADAM−15ディスインテグリンドメインのDNA鎖をPCR法で複製した。HUVECのcDNA 1μLを鋳型とし、それぞれ0.5μLの100μMセンスプライマーと100μMアンチセンスプライマー、8μLの2.5mM dNTP mix、0.5μLのEX-Tagポリメラーゼ(2.5U/100μL: Takara)、10μLの10×PCRバッファー、を79.5μLの超純水に加え、PCR反応液を調整した。サーマルサイクラーを用いて、94℃で5分を1サイクル、94℃で1分、55℃で1分、72℃で1分を35サイクル、72℃で5分を1サイクルでPCR反応を行なった。使用したプライマーは以下のとおりである。
センスプライマー:5’-CCTATGGCTGCTTTCTGC-3’(配列番号5)
アンチセンスプライマー:5’-CATGCACACAGCTTGCCC-3’(配列番号6)
センスプライマー:5’-AAGGATCCGCTGCTTTCTGCGGA-3’(配列番号7)
アンチセンスプライマー:5’-ATTCTCGAGATCCCCTAGGCTGACAT-3’(配列番号8)
実施例2で作製した、ヒトADAM−15ディスインテグリンドメイン/ pGEX-6P-1をJM-109に形質転換し、アンピシリン(SIGMA-Ardrich)を添加したLB培地で増殖させ、対数増殖期に200μM IPTG(Amersham Bioscience)を添加することでGST融合タンパク質の発現を誘導した。大腸菌を回収後、NETN-150バッファー(50mM Tris pH7.2, 1mM EDTA, 150mM NaCl, 0.5% NP-40)に懸濁し、ソニケーションをかけることでタンパク質を抽出した。遠心後、その上清をグルタチオンセファロースビーズ4B(Amersham Bioscience)に添加し、4℃で2時間転倒混和した。ビーズをNETN-100バッファー(50mM Tris pH7.2, 1mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5%NP-40)で洗浄し、還元型グルタチオン溶液(100mM Tris pH8.8, 20mM Reduced Glutathione(Wako))で溶出し、これをGST融合タンパク質とした。また、GSTを切断したタンパク質を作製する際には、大腸菌で発現させたタンパク質をグルタチオンセファロースビーズに吸着させるまでは同様の方法で行い、ビーズをNETN-100バッファーで洗浄した後に、prescission protease(Amersham Bioscience) を用いて酵素処理することでGSTを切断した。
ヒトADAM−15ディスインテグリンドメインにおけるRGD配列をRAA配列に置換したタンパク質(以下、「ヒトADAM−15ディスインテグリンドメインタンパク質(RAA置換体)」という)は、次の方法により作製した。実施例2で作製した、ヒトADAM−15ディスインテグリンドメイン/ pGEX-6P-1を鋳型としてそれぞれ1.25μLの、100μg/mlのセンスプライマーと100μg/mlのアンチセンスプライマー、1μLの2.5mM dNTP mix、1μLのpfu turboポリメラーゼ(2.5U/μL)、5μLの10×PCRバッファーを、40.4μLの超純水に加え、PCR反応液を調整した。サーマルサイクラーを用いて、95℃で30秒を1サイクル、95℃で30秒、55℃で1分、68℃で5分30秒を18サイクル、72℃で7分を1サイクルでPCR反応を行なった。使用したプライマーは以下のとおりである。
センスプライマー:5’-CAGTGTCCTACCAGAGCTGCTTGTGACTTGCCTG-3’(配列番号9)
アンチセンスプライマー:5’-CAGGCAAGTCACAAGCAGCTCTGGTAGGACGACACTG-3(配列番号10)
実施例3で作製した、ヒトADAM−15ディスインテグリンドメイン−GSTタンパク質をBALB/cマウス(メス、7週令: SAMKYO LABO SERVICE CORPORATION)に計4回免疫した。初回は100μgのタンパク質を完全フロイントアジュバンド(SIGMA)で乳化して、以降は50μgのタンパク質を不完全フロイントアジュバンド(SIGMA)で乳化して、マウスに免疫した。4回免疫後、マウスから採血し、その血清を用いて抗体価測定をELISAにより行った。その後、50μgのタンパク質をPBSに溶解し、追加免疫した。
(実施例6)抗ADAM−15モノクローナル抗体23G9と8F7の結合活性比較
GSTを除去したヒトADAM−15ディスインテグリンドメインリコンビナントタンパク質、又は、ヒトADAM−15ディスインテグリンドメインタンパク質(RAA置換体)を、PBSで0〜5μg/mLに調製し、96ウェルプレートの各ウェルに50μLずつ添加し、37℃で1時間インキュベートして、固相化させた。その後、0.5%BSA/PBSを各ウェルに200μLずつ添加し、室温で1時間インキュベートすることでブロッキング反応を行なった。PBSで洗浄後、実施例1で作製したhα9/CHO細胞、又は、非遺伝子導入CHO-K1細胞を0.25%BSA含有培地(D-MEM Ham’sF-12)で1×105cells/mlに調製して、各ウェルに200μLずつ添加し、37℃で1時間インキュベートして固相に固定化させたタンパク質に接着させた。その後、あらかじめ37℃に温めておいたPBSで洗浄して、接着していない細胞を除去した。クリスタルバイオレットを各ウェルに50μLずつ添加し、室温で30分間インキュベートすることで、細胞を固定、染色した。水道水で洗浄後、20%酢酸水を各ウェルに100μLずつ添加し、細胞を溶解後、プレートリーダーで590nmの吸光度を測定した。
ヒト腎癌細胞株NRC-12細胞を用いて、8F7のRGD非依存的な接着を抑制できるかを検討するために、NRC-12細胞におけるintegrinの発現をフローサイトメトリーで確認した。0.5%BSA、0.01NaN3/PBS(FACSバッファー)で細胞を5×106/mlに調整し、96穴V底プレートの各ウェルに100mlずつ添加し、プレート遠心機で細胞を回収した。その後、CFBSを各ウェルに100mlずつ添加し、氷上で30分間インキュベートすることで、細胞膜表面上のFcレセプターをブロッキングした。一次抗体を0.5μg添加し、氷上で20分間インキュベートした。FACSバッファーで2回洗浄後、200倍希釈した二次抗体(anti-mouse IgG FITC標識:Jackson immunoresearch)を各ウェルに100μLずつ添加し、氷上で20分間インキュベートした。FACSバッファーで2回洗浄後、7-AAD(50μg/ml)を各ウェルに20μLずつ添加し、氷上で20分間インキュベートした。FACSバッファーで3回洗浄後、細胞をメッシュに通し、最終的に500μLのFACSバッファーに溶解した。その後、FACSキャリバー(日本ベクトン・ディッキンソン)用いて、FL-1を検出し、cell questで解析した。
(実施例9)ヒト腎癌細胞株NRC-12細胞を用いた細胞接着及び細胞接着阻害試験
実施例6と同様の方法により、ヒト腎癌細胞株NRC-12細胞の、d.d.、固相化したd.d.と合成ペプチド(GRGDS)の混合物(d.d.+GRGDS)、d.d.と合成ペプチド(GRGES)の混合物(d.d.+GRGES)、合成ペプチド(GRGDS)をBSA(牛血清アルブミン)と結合させたもの(GRGDS-BSA)、合成ペプチド(GRGDS)をBSA(牛血清アルブミン)と結合させたものと合成ペプチド(GRGDS)の混合物(GRGDS-BSA+GRGDS)、又は、合成ペプチド(GRGDS)をBSA(牛血清アルブミン)と結合させたもの合成ペプチド(GRGES)の混合物(GRGDS-BSA+GRGES)への細胞接着活性を測定した。また、実施例6と同様の方法により、ヒト腎癌細胞株NRC-12細胞の、d.d固相化表面への細胞接着に対する、8F7の阻害活性を測定した。
ヒト乳癌細胞株435S(MDA-MB-435S)におけるADAM−15とintegrinの発現をフローサイトメトリーで確認した。フローサイトメトリーは、実施例7に記載の方法に準じて行った。
ヒト乳癌細胞株435Sでのインテグリンの発現が確認できたため、これらのインテグリンが機能的であるかどうかを細胞接着試験により検討した。即ち、d.d.又はd.d.-RAAに対する435Sの細胞接着を以下の方法により測定した。d.d、d.d.-RAA、ヒトテネーシンC分子内に存在する3番目のフィブロネクチンtypeIIIドメインのリコンビナント蛋白(hTNfn3)のRGD配列をRAAに置換した蛋白(hTNfn3(RAA))、又は、GRGDS-BSAを、PBSで0〜5μg/mLに調製し、96ウェルプレートの各ウェルに50μLずつ添加し、37℃で1時間インキュベートして、固相化させた。その後、0.5%BSA/PBSを各ウェルに200μLずつ添加し、室温で1時間インキュベートすることでブロッキング反応を行なった。PBSで洗浄後、ヒト乳癌細胞株435S細胞を0.25%BSA含有培地(TIL)で1×105cells/mlに調製して、各ウェルに200μLずつ添加し、37℃で1時間インキュベートして固相化させたタンパク質に接着させた。その後、あらかじめ37℃に温めておいたPBSで洗浄して、接着していない細胞を除去した。クリスタルバイオレットを各ウェルに50μLずつ添加し、室温で30分間インキュベートすることで、細胞を固定、染色した。水道水で洗浄後、20%酢酸水を各ウェルに100μLずつ添加し、細胞を溶解後、プレートリーダーで590nmの吸光度を測定した。
ヒト乳癌細胞株435S細胞を用いた細胞接着阻害試験においては、Mnイオンを用いることにより、インテグリンを活性化させた。細胞接着試験と同様の方法でd.d、又は、d.d.-RAA(6.25μg/mlに調製)を固相化させ、ブロッキング反応を行なった。ADAM−15を阻害することによる細胞接着阻害活性試験においては、固相に固定したタンパク質に8F7を添加した。また、インテグリンを阻害することによる細胞接着阻害活性試験においては、ヒト乳癌細胞株435S細胞2×104細胞に、ヒトα9β1インテグリンに対する抗体であるY9A2(chemicon)、又は、ヒトαvβ3インテグリンに対する抗体であるLM-609(chemicon)を添加し、37℃で20分間インキュベートした。その後、細胞接着試験と同様の方法で細胞を各ウェルに添加して細胞接着を測定した。
ヒト乳癌細胞株435S細胞(MDA-MB-435S:435S)を10% FCS含有TIL培地で2×104 / mlに調整し、96ウェルプレートの各ウェルに100μLずつまき、37℃で一晩培養した後、FCS不含TIL培地に交換し、同様に一晩培養した。培地を除去し、5%FCS含有TIL培地で20μg/mlに調整した抗体(実施例5で作製した8F7、又は、抗ヒトαvβ3インテグリン抗体LM-609(chemicon))を各ウェルに100μLずつ添加し、cell counting kit-8(DOUJINDO)を各ウェルに10μLずつ添加した。37℃で2時間30分インキュベートした後にプレートリーダーで450nmの吸光度を測定した。これを0時間とし、抗体を含む5%FCS含有TIL培地で48時間培養した細胞においても、同様の方法で実験を行った。450nm(48時間)/450nm(0時間)の割合を算出し、これらの割合を抗体非添加群と比較した。
本明細書に記載の実施例において、ELISA法は、次の方法により行った。まず、抗原を96ウェルプレートに添加し、4℃で一晩固相化させた。その後、PBSで3回洗浄し、1%BSA、0.05% NaN3/PBSを200ml/wellで添加することでブロッキング反応を行った。0.05%Tween/PBSで5回洗浄後、1% BSA、0.05% Tween/PBSで希釈した一次抗体を各ウェルに100μLずつ添加し、37℃で1時間反応させた。0.05%Tween/PBSで7回洗浄後、1% BSA、0.05% Tween/PBSで1000倍希釈した二次抗体(anti-mouse IgG HRP標識: Jackson immunoresearch)を50ml/wellで添加し、37℃で30分反応させた。0.05%Tween/PBSで9回洗浄後、o-フェニレンジアミン溶液(Wako)を50ml/wellで添加し、室温、暗所で15分反応させた。2N硫酸で反応停止後、プレートリーダーを用いてOD490の吸光度を測定した。
本明細書における細胞接着阻害試験においては、抗体非添加群のOD590を基準とし、抗体添加群で得られたOD590の割合を算出した。細胞増殖試験においては、各々で48時間後 / 0時間の値を算出し、抗体非添加群で得られた割合を基準にし、抗体添加群の割合を算出した。これらの実験はすべて3回ずつ行い、スチューデントのt検定を行った。
8F7の細胞浸潤に及ぼす影響を調べるために細胞浸潤試験を行った。細胞浸潤試験はマトリゲルインベージョンチャンバー(BD社)を用いて行った。無血清のTIL培地(免疫生物研究所社)をウェルとインサートに500mlずつ添加し、インサートをウェルに浸した。37℃で2時間インキュベーションすることで、マトリゲルを水和した。その後、インサート内の培地を吸引除去し、化学誘因物質を750ml添加した別のウェルに浸した。化学誘因物質はヒト繊維芽肉腫細胞株HT-1080細胞株の培養上清を用いた。無血清のTIL培地で1×105個/mlに調整した435S細胞懸濁液をインサートに500ml添加し、37℃で22時間インキュベーションすることで浸潤を誘導した。抗体による細胞浸潤の阻害効果を調べる場合は、乳癌細胞をインサートに添加する前に、8F7抗体またはコントロール抗体を10mg/mlになるように添加し、37℃で20分インキュベーションし、435S細胞懸濁液をインサートに添加した。浸潤後に、インサート内の細胞懸濁液を吸引除去し、綿棒でマトリゲルと非浸潤細胞を拭き取った。その後、冷却したメタノールにインサートを浸し、-80℃で20分インキュベーションすることで、浸潤細胞を固定した。固定後、ギムザ溶液(武藤化学株式会社)にインサートを15分浸し、浸潤細胞を染色した。水道水で洗浄後、インサートからフィルターを取り外し、スライド上に置き、マウント剤にて封入した。光学顕微鏡でフィルター下層の浸潤面を観察し、核が観察できる細胞を浸潤細胞として計数した。なお、6視野を計数し、その平均値を算出した。
ハイブリドーマ細胞を、illustra Quickprep Micro mRNAPurification Kit(GEヘルスケアバイオサインス社)を用いてRNAを抽出し、SuprScriptFirst−strand cDNA for RT−PCRキット(インビトロジェン社)にてcDNAを作製した。Heavy primer増幅キット(アマシャムバイオサイエンス社)およびLightprimer増幅キット(アマシャムバイオサイエンス社)を用いてPCRを行い、抗体の重鎖(Heavy chain)および抗体の軽鎖(Lightchain)cDNAを伸張させ、重鎖のPCR産物をpTAベクター(東洋紡績社)へ、そして軽鎖のPCR産物をMighty Cloning Kit <Blunt End>(タカラバイオ社)組み込み、cDNA配列、アミノ酸配列を決定した。CDR領域は、Kabat numbering systemを利用して決定した。
[CDRH1]
SYNMH(配列番号15)
[CDRH2]
AIYPGDGDTSYNQKFKG(配列番号16)
[CDRH3]
DRGDYGYGFAY(配列番号17)
(軽鎖)
[CDRL1]
RSSQSLVHSNGNTYLH(配列番号18)
[CDRL2]
KVSNRFS(配列番号19)
[CDRL3]
SQNTHVPPWT(配列番号20)
Claims (22)
- 配列番号12のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号14のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、ADAM−15のディスインテグリンドメインを認識し、かつ、ADAM−15のディスインテグリンドメイン内のRGD配列を認識しない抗体またはその抗原結合能を有する断片。
- 請求項1に記載の抗体またはその抗原結合能を有する断片であって、ADAM−15のディスインテグリンドメインドメインを認識し、かつ、ADAM−15のディスインテグリンドメイン内のループ領域を認識しない抗体またはその抗原結合能を有する断片。
- 請求項1または2に記載の抗体またはその抗原結合能を有する断片であって、ADAM−15及びインテグリンαvβ3依存性細胞接着を阻害する抗体またはその抗原結合能を有する断片。
- 請求項1〜請求項3のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合能を有する断片であって、ADAM−15及びインテグリンα9β1依存性細胞接着を阻害する抗体またはその抗原結合能を有する断片。
- 請求項1〜請求項4のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合能を有する断片であって、癌細胞の増殖を抑制することを特徴とする抗体またはその抗原結合能を有する断片。
- 前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項1〜請求項5のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合能を有する断片。
- 前記抗体が、受託番号FERM BP−10950で特定されるハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体である、請求項6に記載の抗体またはその抗原結合能を有する断片。
- 前記抗体が、キメラ抗体、又は、ヒト化抗体である、請求項1〜請求項6のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合能を有する断片。
- 前記抗体断片が、F(ab’)2、Fab’、Fab、一本鎖Fv(scFv)、ジスルフィド結合Fv(dsFv)若しくはこれらの重合体、又は、二量体化V領域(Diabody)である、請求項1〜請求項5のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合能を有する断片。
- 前記抗体の断片が、抗体のCDR配列を含むペプチドである、請求項1〜請求項5のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合能を有する断片。
- 前記CDR配列が、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列
番号19、または配列番号20のアミノ酸配列を有する、請求項10に記載の抗体または
その抗原結合能を有する断片。 - 請求項1〜請求項11のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合能を有する断片をコードするDNA。
- 請求項12に記載のDNAを含有する組み換えベクター。
- 請求項13に記載の組み換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換細胞。
- ハイブリドーマ細胞系である、請求項14に記載の細胞。
- 受託番号FERM BP−10950で特定されるハイブリドーマ細胞系である、請求項15に記載の細胞。
- 請求項14又は請求項15に記載の細胞を培養し、培養物中で抗体またはその抗原結合能を有する断片を生成させ、培養物から抗体またはその抗原結合能を有する断片を抽出することを特徴とする、請求項1〜請求項11のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合能を有する断片の製造方法。
- 請求項1〜請求項11のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合能を有する断片を有効成分として含有する、医薬組成物。
- 細胞増殖、細胞遊走、細胞浸潤、細胞間接着、又は、血管新生に起因する疾患の治療薬
又は予防薬である、請求項18に記載の医薬組成物。 - 抗癌剤又は癌転移抑制剤である、請求項18に記載の医薬組成物。
- 請求項1〜請求項11のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合能を有する断片を備える診断薬。
- 細胞増殖、細胞遊走、細胞浸潤、細胞間接着、又は、血管新生に起因する疾患の診断薬
である、請求項21に記載の診断薬。
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JPN6009010219; ETO,K. et al: 'Functional classification of ADAMs based on a conserved motif for binding to integrin alpha 9beta 1:' J Biol Chem Vol.277, No.20, 2002, p.17804-10 * |
JPN6009010220; MARTIN,J. et al: 'The role of ADAM 15 in glomerular mesangial cell migration' J Biol Chem Vol.277, No.37, 2002, p.33683-9 * |
JPN6009010221; ZHANG,X.P. et al: 'Specific interaction of the recombinant disintegrin-like domain of MDC-15 (metargidin, ADAM-15) with' J Biol Chem Vol.273, No.13, 1998, p.7345-50 * |
JPN6009010222; SCHUTZ,A. et al: 'Expression of ADAM15 in lung carcinomas' Virchows Arch Vol.446, No.4, 2005, p.421-9 * |
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