JP5523411B2 - バイオナノカプシドを用いた有害藻類の制御方法 - Google Patents
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Description
1)ヘテロシグマ属渦鞭毛藻類抑制能を有するシュードモナス属微生物を選別する工程と、
2)工程1)のシュードモナス属微生物を培養して培養物を獲得する工程と、
3)工程2)の培養物を赤潮発生海域に散布する工程とで構成されている。
1)赤潮及び緑潮現象を起こす有害藻類を採取して培養する工程と、
2)前記培養された有害藻類に特異性があるウイルスを選別する工程と、
3)前記選別されたウイルスのカプシド遺伝子をクローニングする工程と、
4)前記クローニングされた遺伝子を組換え大腸菌または酵母で発現した後、ナノカプシドを大量産生する工程、及び
5)前記大量産生されたナノカプシドに殺藻物質を搭載する工程とを含むナノカプシドを用いた有害藻類制御方法を提供する。
1)赤潮及び緑潮現象を起こす有害藻類を採取して培養する工程と、
2)前記培養された有害藻類に特異性があるウイルスを選別する工程と、
3)前記選別されたウイルスのカプシド遺伝子をクローニングする工程と、
4)前記クローニングされた遺伝子を組換え大腸菌または酵母で発現した後ナノカプシドを大量産生する工程、及び
5)前記大量産生されたナノカプシドに殺藻物質を搭載する工程とを含むナノカプシドを用いた有害藻類制御方法を提供する。
前記報告された有害藻類中の渦鞭毛藻類の一種であるヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ(Heterocapsa circularisquama)を2009年8月2日から9月25日まで全羅南道麗水の沖合で分離及び選別した。選別された藻類をf/2培地に接種した後、20℃で培養した。HcRNAV109ウイルスの野生型カプシド遺伝子情報は、Genbank No. AB218609.1から得、1,080bpの遺伝子を酵母であるピチア(Pichia)で最適発現されるように変形させた後、pPICZAプラスミドに入れて最終的にpPICZA−CPベクターを製造した。クローニングしたpPICZA−CPベクターをピチアパストリス(Pichia pastoris)宿主に挿入した後、ゼオシン(zeocin)−YPD培地上で1次スクリーニングして分離した宿主をメタノール誘導培地で培養してHcRNAV遺伝子の発現を確認して40kDaの分子量を有するタンパク質を大量産生することができる組換え菌株を確保した。前記大量増殖されたプラスミド(plasmid)は、図2に示したように1,080bpのサイズを有する遺伝子であることを確認し(図2)、最終産生されたカプシドタンパク質は、40kDaのサイズを有するタンパク質であることを確認することができた(図3)。すなわち、該当のウイルス遺伝子は、PCRを通じて獲得が可能であり、この獲得された遺伝子は大腸菌またはピチアに使用可能なシャトルベクターに入れてクローニングすることができ、このクローニングされた遺伝子は最終的にピチア宿主の大量発酵過程を通じて産生することができることを確認した。発酵は、グリセロールを炭素源として流加培養で進行して、40時間以後に3.6ml/hのメタノールを供給しながらタンパク質発現を誘導した。
遺伝子組換え方法を用いてヘテロカプサ・サーキュラリスカーマRNAウイルス(Heterocapsa circularisquma RNA virus,HcRNAV)及びキートケロス・サルスギネウム核内封入体ウイルス(Chaetoceros salsugineum nuclear inclusion virus,CsNIV)のカプシド遺伝子をそれぞれピチアで共発現(coexpression)した後、Niセファロース(Ni Sepharose)カラムを用いて親和性クロマトグラフィー(affinity chromatography)方法で精製した。精製されたウイルスカプシドタンパク質の自己組立化(self assembly)を増大させるために蒸留水で1日間透析した。自己組立されたカプシドタンパク質の宿主特異的結合及び殺藻物質の搭載能力を調査するために、まずカプシドタンパク質を瓦解用緩衝溶液(dissociation buffer,10mM Tris−HCl,150mM NaCl,10mM EGTA,pH8.5)に1時間の間露出させて解離させた。解離されたカプシドタンパク質にTD系殺藻物質と特性が類似の蛍光物質FITCを添加した後、再結合緩衝溶液(reassociation buffer,10mM Tris−HCl,150mM NaCl,1mM CaCl2,pH8.5)で1日間透析して蛍光物質が搭載されたかどうかを確認することで搭載能を調査した。また、蛍光物質が搭載されたカプシドタンパク質を有害藻類と混ぜた後、3時間の間培養して蛍光顕微鏡下でカプシドタンパク質の宿主特異的結合を調査した。カプシドタンパク質に搭載されないFITCの藻類に対する非特異的結合を防止するために1日間さらに透析した後、タンパク質電気泳動を実施して蛍光物質が搭載されたカプシドタンパク質のみを確認した。海洋環境と同一条件を維持するために海水に保存した藻類にカプシドタンパク質を処理して3時間の間培養した。藻類に付着しないカプシドタンパク質を除去するためにフィルター滅菌された海水を用いて三回洗浄した後、FITCが搭載されたカプシドタンパク質がキートケロス・サルスギネウムに対して特異的に結合するかどうかを緑色(FITC)フィルターが装着された蛍光顕微鏡下で調査した。
殺藻物質として下記の化学式4または5のチアゾリジンジオン(thiazolidinedione,TD)系化合物を用いて殺藻能スクリーン実験を遂行した。選択された有害藻類7種を対象に135種のTD化合物を濃度別に処理することで、殺藻能スクリーニングを進行した。マイクロプレートに同量の細胞を入れて0.05、0.1、1、2、5、10、20、50、100μMの濃度で処理した後、3日後にビルケルチュルク血球計数盤とセジウィック・ラフター(Sedgwick−Rafter)カウンティング・チャンバーを用いて細胞密度を測定した。測定された細胞密度で減少率(%)を計算して正確なIC50値を測定した。
本願発明で用いられるまた一つの殺藻物質である有機クレイは、金属塩化物試薬として塩化マグネシウム水和物(MgCl2,6H2O,Junsei98%)を用い、作用基がついたシラン化合物は3−アミノプロピルトリエトキシシラン(3−aminopropyl−triethoxysilane,APTES)(Aldrich98%)を用い、溶剤はエチルアルコール(95%、試薬用)、1N−NaOH溶液、アンモニア水(30%、試薬用)を用いて製造した。反応から得た生成物である有機クレイの合成有無を調べるために、次のような機器を用いて分析した。固体試料は、29Si−HPDEC NMR(Avance 400,Bruker,Germany)を用いてSi−OまたはSi−OH構造分析を行ない、D2Oに溶解するMetal−APTES化合物の1H−NMR(JEOL,300MHz,D2O)分析を通じてアミノプロピル末端グループがクレイに導入されたことを確認した。そして、FT−IR(NICOLET6700,Thermoscientific,米国)分析は、ブロム化カリウム(KBr)ペレットで製造して分析し、作用基すなわち、アミノプロピル(−(CH2)3NH2)の導入有無を確認した。X線回折(XRD)パターンは、X線回折計(X’Pert PRO,PANalytical B.V.)を用いて得、固体(パウダー)試料をCuKα radiation(20mA及び40kV)、2θは2゜から70゜まで2゜/分の速度で測定して結晶の構造を確認した。透過及び走査電子顕微鏡の分析から有機クレイの形態(morphology)を確認し、EDXを通じて金属/Si成分を分析して有機クレイの合成有無を確認した(図11)。塩化マグネシウム水和物1.68g(MgCl2 6H2O,8.3mmol)を50mlのエチルアルコールに溶解した溶液にAPTES 2.6ml(11.1mmol)を強く撹拌しながら徐々に加えると沈殿物が析出して、この反応物を室温で24時間反応させた。白色の沈殿物は遠心分離後エチルアルコールで3回以上洗浄した後、乾燥した。収得率は96%以上であり、IR、NMR、SEM、TEM、XRDなどを分析して合成有無を確認した。そして報告された方法どおりに水酸化ナトリウム溶液(1N NaOH,10ml)を触媒に用いて合成したが、反応物のpHが約9.87で、NaOH水溶液を入れない反応物のpH8.15よりは高いpH値を維持した。しかし、生成物の収得率の差は大きくなかった。
マグネシウム有機クレイを有害藻類3種(ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ、ヘテロシグマ・アカシオ及びコクロディニウム・ポリクリコイデス)に0.2mg/mlの濃度で処理した時、対照群に比べて80%以上の殺藻能を示すことを確認した。一方、無害藻類4種{ナヴィクラ・ペリクローサ(Navicula pelliculosa)、ファエオダチラム(Phaeodactylum)EPV、ナンノクロロプシス(Nannochloropsis)WT、アンフィディニウム属(Amphidinium sp.)}には、最大20%の殺藻能を示すことを確認した。また、商業用ミネラルクレイを同じ有害藻類に処理した時、有機クレイより効能が落ちることを確認した。これを通じて、低い濃度での有機クレイを用いて有害藻類のみを選択的に制御することが可能であることを確認した(図12)。また、表4のIC50値をみるとマグネシウム有機クレイが類似の化合物である黄土あるいは塩化アンモニウムより優れた値を示すことが分かり、製造に用いられた塩化マグネシウムとの比較でも低いIC50値を示し、高い殺藻能を有していることが証明された(表4)。
Claims (7)
- 1)ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマ(Heterocapsa circularisquama)、キートケロス・サルスギネウム(Chaetoceros salsugineum)、コクロディニウム・ポリクリコイデス(Cochlodinium polykrikoides)、ヘテロシグマ・アカシオ(Heterosigma akashiwo)、シャットネラ・マリーナ(Chattonella marina)及びプロトケラチウム・レティキュラータム(Protoceratium reticulatum)からなる群から選択されるいずれかひとつである赤潮及び緑潮現象を起こす有害藻類を採取して培養する工程、
2)前記工程1)で培養された有害藻類に特異性があるウイルスを選別する工程、
3)前記工程2)で選別されたウイルスのカプシド遺伝子をクローニングする工程、
4)前記工程3)でクローニングされた遺伝子を組換え大腸菌または酵母で発現した後、ナノカプシドを大量産生する工程、及び
5)前記工程4)で大量産生されたナノカプシドに殺藻物質を搭載する工程とを含み、
前記有害藻類に特異性のあるウイルスは、カプシド内部に核酸がなく、増殖力がなくて人体有害性がなく、カプシドタンパク質が殺藻物質の伝達体にのみ用いられることを特徴とする、ナノカプシドを用いた有害藻類の制御方法。 - 前記殺藻物質が、マグネシウム有機クレイ、キノン系化合物及びチアゾリジンジオン(thiazolidinedione)系化合物からなる群から選択されるいずれかひとつであることを特徴とする、請求項1に記載のナノカプシドを用いた有害藻類の制御方法。
- 前記有害藻類に特異性のあるウイルスは、ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマRNAウイルス(Heterocapsa circularisquama RNA Virus,HcRNAV)、キートケロス・サルスギネウム核内封入体ウイルス(Chaetoceros salsugineum Nuclear Inclusion Virus,CsNIV)及びヘテロシグマ・アカシオRNAウイルス(Heterosigma akashiwo RNA virus,HaRNAV)からなる群から選択されるいずれかひとつであることを特徴とする、請求項1〜4のいずれかに記載のナノカプシドを用いた有害藻類の制御方法。
- 前記ナノカプシドに殺藻物質を搭載する工程は、生物化学的な搭載方法及び物理化学的搭載方法のいずれか一つの方法、または2つの方法を混合した方法で遂行されることを特徴とする、請求項1〜5のいずれかに記載のナノカプシドを用いた有害藻類の制御方法。
- 前記生物学的な搭載方法は、遺伝子組換え方法を用いた共発現(coexpression)、または瓦解用または再結合用緩衝溶液(dissociation or re−association buffer)を用いた自己組立化(self assembly)法によって遂行されることを特徴とする、請求項6に記載のナノカプシドを用いた有害藻類の制御方法。
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