JP5523282B2 - 蛍光コバラミンおよびその使用 - Google Patents
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Description
本発明は、(ここではCobalaFluorsという場合もある)蛍光コバラミンおよびこれらの化合物の使用に関する。さらに詳しくは、本発明は、コバラミンに共有結合した蛍光、リン光、ルミネセント、光−発生化合物よりなる蛍光コバラミンに関する。これらの蛍光コバラミンは、(a)癌細胞を含むリンパ節の同定を含め、健康な細胞および組織から癌細胞および組織を区別し、および(b)コバラミン−ベースの治療バイオコンジュゲートを用いる化学療法に個体が陽性的に応答するかを判断するための診断および予後マーカーとして用いることができる。
本発明は、蛍光コバラミンおよびこれらの化合物の使用に関する。さらに詳しくは、本発明は、コバラミン(ビタミンB12)に共有結合した蛍光化合物(フルオロフォア)、リン光化合物(ホスホロフォア)、ルミネセント化合物(ケミルミネセントクロモフォア)または光−発生化合物を含む蛍光コバラミンに関する。これらの蛍光コバラミンは、(a)癌細胞を含むリンパ節の同定を含め、健康な細胞および組織から癌細胞および癌性組織を区別し、および(b)コバラミン−治療バイオコンジュゲートを用いる化学療法に個体が陽性的に応答するかを決定するために診断および予後マーカーとして用いることができる。
本発明の蛍光コバラミンは、一般式:
R1がCN、OH、OH2、CH3、5’−デオキシアデノシンまたは(CH2)pNHC(=S)Yであり;R2、R3、R4、R5、R6およびR7が独立してCONH2またはCO−XmYであり;R9がOHまたはO(C=O)XmYであり;mが1であり;XがN(CH2)nNHO(C=O)であって;R1ないしR7およびR9の基のうちの少なくとも1つがYを含む場合、R8はCH2OHではなく;かつ
R1がCN、OH、OH2、CH3、5’−デオキシアデノシンまたは(CH2)pNHC(=S)Yであり;R2、R3、R4、R5、R6およびR7が独立してCONH2またはCO−XmYであり;R9がOHまたはO(C=O)XmYであり;mが0であって;R1ないしR7およびR9の基のうちの少なくとも1つがYを含む場合、R8はCH2OHではない]
によって表すことができる。少なくともR8はYを含むことが好ましい。
・蛍光顕微鏡、蛍光腹腔鏡検査、蛍光内視鏡検査またはフローサイトメトリーを介して肉眼で癌性組織を同定し;
・組織バイオプシーからの組織切片または試料中の癌性細胞を同定し;
・イン・ビボ、エクス・ビボまたはイン・サイチュにおいて腫瘍の境界を画定し;
・イン・ビボ、エクス・ビボまたはイン・サイチュにて癌を診断し、検出し、予後し、予測しまたはモニターし;
・イン・ビボ、エクス・ビボまたはイン・サイチュにて転移性癌を同定し;
・癌の進行段階を判断し;
・経皮的に癌を同定し;
・転移性癌を経皮的に同定し;
・腹腔鏡検査または内視鏡検査のごとき最小限侵入的技術の使用を含め、センチネルリンパ節または複数リンパ節、または腋窩リンパ節また複数リンパ節を含めたリンパ節において癌を同定し;
・乳癌、卵巣癌、肺癌、前立腺癌、上皮癌(腺癌)、肝臓癌、黒色腫およびリンパ腫のごとき癌の治療、検出、予測、予後またはモニタリングにおいて転移性病気を同定し;
・白血病またはリンパ腫を診断し、予測し、予後し、モニターしまたは特徴付けるために、骨髄吸引物または末梢血液試料のフローサイトメトリー実験を行い;
・コバラミン−療法バイオコンジュゲートの使用に基づく化学療法に患者が陽性的に応答するか否かを予測し;
・バイオプシーまたはランペクトミーにおいて腫瘍の微細境界の画定を改良し;
・バイオプシー、ランペクトミーまたは腫瘍摘除において癌細胞を残す確率を減少させ、それにより、残りの癌細胞を除去するために、補足的外科処置の必要性を減少させるのに用いることができる。
・蛍光マーカーはいずれの節が周期的骨盤窩を排出しているかを単に示すよりはむしろ、リンパ管および節中の癌細胞に特異的である。また蛍光マーカーは癌細胞を健康な細胞から区別する。
・該マーカーは、蛍光検出によって供される内生感度のため、低濃度で用いることができる。現在用いられている青色色素は活性な節をあいまいとする傾向にあり、病理学者により組織の外科処置後の調査を複雑化する。また、青色色素は出血する血管をあいまいとする傾向にあり、それにより、節の外科的切除および引き続いての創傷の閉鎖を複雑化する。蛍光マーカーの使用はこれらの問題を回避するはずである。
・癌細胞に特異的な蛍光マーカーは、現在実施される手法で見られるような、5ないし10%の偽陰性率を改良する。
・増大した偽陰性率は、患者および外科医によるこの技術の許容性を改良する。これは、外科医がこの手法を学ぶのに必要な訓練時間(典型的には、完全な軸方向の節の切開、30以上のケース)を減少させる。
・蛍光マーカーは、癌細胞の可視化のための腹腔鏡、内視鏡および顕微鏡技術の使用を可能とする。また、これらの技術を用いて、初代腫瘍、転移性腫瘍、腋窩リンパ節、鼡径リンパ節および頚部リンパ節を可視化することができる。これらの技術は、癌の分析において、大きな切除およびリンパ経路の技術的に挑戦する調査の必要性を低減化する。これらの技術の結果、切開は小さくなり、苦痛が少なくなり、精度は良好となる。
以下に実施例を挙げて本発明をさらに記載するが、それは例示的として掲げるのであって、断じて本発明を限定する意図のものではない。当該分野でよく知られた標準的な技術および後に具体的に記載する技術を利用した。
フルオロフォアのコバルトへの結合による蛍光コバラミンの合成
コバラミン局所化の目で見えるインジケーターとして、フルオレセインをコバラミンに共有結合させることによって、コバラミンの5つの蛍光アナログを調製した。緑色光の照射下で、フルオレセイン分子は黄色光を発し、これは0.1ppmよりも低い濃度までの暗く適合された目によって検出することができる。この発光は、エピ蛍光顕微鏡を介する、ならびに肉眼での観察による癌細胞の感度の良い検出を可能とする。5つの蛍光コバラミンの各々は、固有の蛍光を呈した。これらの化合物の全ては、公表された技術に従って、塩化アミノプロピルをコバ(I)ラミンと反応させて、アミノプロピルコバ(III)ラミンを生じさせることによって合成した。引き続いての工程において、アミノプロピルコバ(III)ラミンを種々のフルオロフォアイソチオシアネート(すなわち、フルオレセインイソチオシアナート「FITC」)と反応させて、アミノプロビルリンカーを介してコバラミンに結合した対応するフルオロフォア(すなわち、フルオレセイン−アミノプロピル−コバ(III)ラミン)を得た。この酵素の反応を、図2に示す。
同様にして、フルオロフォアがナフトフルオレセインまたはオレゴングリーンである蛍光コバラミンを調製した。全ての蛍光コバラミンは、組換えトランスコバラミン(rhTCII)に対して高い親和性を保持し、かくして、天然に生じるコバラミンで観察されるのと同様な生物学的分布を可能とすることが判明した。
癌細胞によるコバラミンアナログの取込
白血病骨髄芽細胞調製物は急性骨髄性白血病(AML)M1を有する61歳の患者の骨髄から作成した(FAB分類において、最小限に成熟した骨髄芽細胞)。実施例1に記載されたごとく調製した蛍光コバラミンで、細胞を収穫3日後に処理した。正常および白血病ヒト骨髄における、蛍光顕微鏡または蛍光フルオサイトメトリーによって測定した、蛍光コバラミンアナログの異なる取込が見出された。正常骨髄細胞および白血病骨髄芽細胞(癌細胞)の間の差は特に注目すべきであり、正常細胞によって取り込まれるコバラミンは検出できない。健康な個体からの骨髄試料は蛍光標識を示さなかった。もともと、優れた化学療法化合物として合成されたドキソルビシン−コバラミンコンジュゲートが、T−388ネズミ白血病細胞およびHTC−116ヒト結腸腫瘍細胞で観察された。これらの結果は、白血病および固体腫瘍細胞系におけるコバラミンの蛍光誘導体の取込を説明する。
シアノコバラミンモノカルボン酸の調製
b−、d−およびe−モノカルボン酸はシアノコバラミンの酸触媒加水分解によって調製した。図3参照。簡単に述べれば、シアノコバラミン(527.0mg,0.389ミリモル)を100mlの丸底フラスコに入れ、40mlの0.5M HClに溶解させた。フラスコを50℃の水浴に入れ、4時間攪拌した。表1に掲げたグラジエントを用い、反応をHPLC(Waters, Inc. 3.9×300mm DeltaPak 100 C−18カラム)を介してモニターした。
CNCbl酸と1,12ジアミノデカンとのコンジュゲーション
b−およびd−アミンは図4に示すごとく調製した。CBC−195(55.4mg,0.0408ミリモル)を小さなガラスバイアルに添加し、約2.5mlのDMSOに溶解させ、続いて、EDCI HCl(12mg.0.0626ミリモル)およびN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)(25mg,0.217ミリモル)を添加した。反応を室温にて一晩攪拌した。以前の試みにより、反応を駆動して完了させるには数当量のEDCIおよびNHS(合計6当量)が必要であった。24時間後、さらに1当量のEDCIを添加し、合計26時間以内に反応は完了した。表3のグラジエントを用いて、反応をHPLCを介してモニターした。CBC−195は9.07分の保持時間を有し、CBC−195のNHS−エステルは10.55分の保持時間を有する。
CBC−208およびフルオレセイン−5EX−NHSのコンジュゲーション
CBC−208は、図5に従い、(Molecular Probes,Inc.から入手可能な)フルオレセイン誘導体のフルオレセイン−5EXにカップリングされている。CBC−208(6.0mg,3.87μモル)を小さなグラスバイアルに添加し、約0.5mlのDMSOに溶解させ、続いて、フルオレセイン−5EX−NHS(2.5mg,4.23μモル)を添加した。反応物を室温にて一晩攪拌した。表5中の方法を用い、反応をHPLCを介してモニターした。
顕微鏡を介する乳癌組織のエクス・ビボ調査
正常周辺組織が付着した乳癌を含む悪性および良性腫瘍の試料を患者から切り出す。これらの試料は、University of Utah Institutional Review Board(IRB)およびHuntsman Cancer Institute Clinical Cancer Investigation Committee(CCIC)の同意の下に採取する。生きた組織の試料を、前記で調製した蛍光コバラミン誘導体の1つと共に4ないし6時間インキュベートする。各試料の薄い組織片をクリオミクロトームで調製し、エピ蛍光顕微鏡によって、蛍光マーカーの量を正常および癌性組織で定量する。解剖病理学者による評価のため、対応する組織片をヘマトキシリン/エオシン(H&E)染料で染色する。正常および癌性細胞の間の界面を注意深く調べる。腫瘍内部からの細胞も蛍光マーカーの取込について調べる。というのは、腫瘍の低酸素領域内の細胞がしばしば代謝を低下させているからである。
リンパ節における癌細胞のエクス・ビボ調査
転移性病気を持つ切り出したリンパ節を患者から取り出し、前記調製の蛍光コバラミン誘導体のうちの1つと共に4ないし8時間インキュベートする。各リンパ節を切片化し、蛍光コバラミンの癌細胞への輸送につき顕微鏡で調べる。この実験は、イメージングおよび可視化のために十分な蛍光コバラミンを取り込むリンパ節内の転移性細胞の能力を示した。
患者がコバラミン−ベースの治療バイオコンジュゲート化学療法に好都合に応答するか否かを判断するための蛍光コバラミンの使用
白血病を持つ患者からの骨髄吸引物および末梢血液試料を蛍光コバラミンコンジュゲートと共にインキュベートする。4ないし8時間後、骨髄吸引物または末梢血液試料を洗浄して、取り込まれなかった蛍光標識を除去し、エピ蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーによる定性的または定量的蛍光分析に細胞試料を付す。有意な量の蛍光コバラミンを取り込んだ細胞はより明るい蛍光を呈する。有意な量の蛍光コバラミンの取り込みは、患者の白血病のタイプが、コバラミン−ベースの治療剤での治療に好都合に応答するであろうことを示す。蛍光コバラミンコンジュゲートでの処理の後に有意な蛍光を示さない骨髄吸引物または末梢血液試料は、当該患者がコバラミン−ベースの治療コンジュゲートに好都合に応答しないであろうことを示す。同様のアプローチを固体腫瘍に適用することができる。この場合、切り出した腫瘍組織の一部を蛍光コバラミンコンジュゲート共にインキュベートし、約4ないし8時間後、腫瘍組織中の蛍光を定量する。腫瘍組織によって呈される蛍光が大きくなれば、癌が、コバラミン−ベースの化学療法での治療に好都合に応答するであろう確率は大きくなる。
CobalaFluor Yの合成
一般的脱塩手法。2カラム容量のメタノールおよび3カラム容量の脱イオン水でカートリッジをコンディショニングすることによって、全てのコバラミンを10gのC−18 SepPak(Waters,Inc.)で脱塩した。コバラミンをカラムに適用し、3カラム容量の脱イオン水で洗浄し、メタノール(10mL)で溶出させた。回転蒸発を介してメタノールを除去し、生成物を凍結乾燥によって乾燥した。
分析クロマトグラフィーは、Waters DeltaPak C−18 300×3.9mmカラムにて、2mL/分の液速で行った。95%溶液A(0.05Mリン酸緩衝液、pH3.0)および5%溶液B(9:1アセトニトリルおよび水)の2分間のイソクラティック流動の後、70%Aおよび30%Bまでの16.4分間の直線グラジエントにより、11.8分において注目する化合物が溶出した。
競合アッセイ
材料。コバラミンのブタ非−内生因子(HC およびIFの50:1混合物)、およびブタ内生因子はSigma Chemical Co.から購入した。HPLCトレースは、Waters 2487デュアル波長吸光度ディテクターを備えたWaters Delta 600システムを用いて得た。BIACORE2000および3000(BIACORE AB)装置を表面プラズモン共鳴バイオセンサー分析のために用いた。
動物モデル実験
腫瘍を持つマウスにおけるイン・ビボ取込。メスマウスの右後足に1×106 RD995腫瘍細胞を皮下移植することによって、腫瘍をマウスに移植する。マウス腫瘍細胞系をイン・ビトロで増殖させた。細胞の移植から6週間後、10mm腫瘍が目に見えた。この時点で、マウスに、滅菌生理食塩水に溶解させた2.2μgのCobalaFluor Yの後眼窩静脈内注射を与えた。注射から6時間後、ハロタンを吸入させてマウスを沈静させた。腫瘍をスライスして開き、633nm HeNeレーザを照射した。HeNeレーザを用い、CobalaFluor Yの注射54時間後にもマウスの腫瘍を分析した。マウスを切開し、内部器官および健康な組織を分析することができた。結果を図13に示す。これは、蛍光標識コバラミンがマウスにおいて腫瘍組織に局在化することを示す。
組織取込実験
蛍光コバラミン取込。最小必須培地、アルファ修飾(α−MEM;7.5%新生児ウシ血清、2.5%胎児ウシ血清、0.2%ナイスタチン、2.5%ペニシリン/ストレプトマイシン、pH7.2;Sigma)を調製し、滅菌した25mLのスクリュー頂部組織バイオフラスコに一部を入れた(10mL)。培地を37℃とし、組織試料(新形成***組織、健康な***組織、新形成リンパ節組織および健康なリンパ節組織)をα−MEM中で蛍光標識したコバラミン(10pM)、シアノコバラミン(1nM)と共に3時間インキュベートした。ヒト組織試料をIRB認可のプロトコルに従って獲得した。組織をフラスコから取り出し、ダルベッコウのリン酸緩衝化生理食塩水(DPBS;Sigma)で洗浄し、−20℃にて、凍結片スライシングのためにOCT化合物(Shandon)と共に真鍮プレート上に設置した。−20℃にて、組織をCTD Harrisクリスタット中でスライスした(4ないし6μmの切片)。小さな美術用ブラシで組織片を引き戻し、100%エタノールで顕微鏡スライドグラスに固定した。標準ヘマトキシリン染色手法:95%エタノール、20秒;水、5秒;ヘマトキシリン(Fisher)、45秒;水、5秒;藍染色溶液(水道水)、10秒;95%エタノール、10秒;100%エタノール、10秒;キシレン、10秒;およびキシレン、10秒を用いてスライドグラスを染色した。スライドグラスを10×、60×および100×の倍率にてエピ蛍光顕微鏡によって評価した。(a)新形成***組織における腫瘍イメージングを図14に示し、(b)新形成リンパ節組織を図15に示す。
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Claims (27)
- 一般式:
R1がCN、OH、OH2、CH3、5’−デオキシアデノシルまたは(CH2)pNHC(=S)Yであり;R2、R3、R4、R5、R6およびR7がCONH2であり;R9がOHまたはO(C=O)XmYであり;mが1であり;XがNH−(CH2)n−NHO(C=O)であって;R1およびR9の基のうちの少なくとも1つがYを含む場合、R8はCH2OHではなく;かつ
R1がCN、OH、OH2、CH3、5’−デオキシアデノシルまたは(CH2)pNHC(=S)Yであり;R2、R3、R4、R5、R6およびR7がCONH2であり;R9がOHまたはO(C=O)XmYであり;mが0であって;R1およびR9の基のうちの少なくとも1つがYを含む場合、R8はCH2OHではない]を有するコバラミンであって、該コバラミンからYが切断されることなく、可視光を照射すると、蛍光を発する該コバラミン。 - R8が、フルオロフォアを含む請求項1記載のコバラミン。
- R1が、フルオロフォアを含む請求項1記載のコバラミン。
- R9が、フルオロフォアを含む請求項1記載のコバラミン。
- 癌性組織または細胞が、蛍光を発し、健康な組織が、より少ない蛍光を呈することを特徴とする、癌性であるか、または癌性細胞を含むことが疑われる組織において、癌組織または癌性細胞を含む組織を同定するための組成物の製造における請求項1〜4のいずれか1記載のコバラミンの使用。
- 癌性組織が、蛍光を発し、健康な組織が、より少ない蛍光を呈することを特徴とする、癌性組織と健康な組織を目視により区別するための組成物の製造における請求項1〜4のいずれか1記載のコバラミンの使用。
- 腫瘍組織が蛍光を発し、および腫瘍の境界を明らかにすることを特徴とする、イン・ビボ、エクス・ビボまたはイン・サイチュにて腫瘍の境界を明らかにするための組成物の製造における請求項1〜4のいずれか1記載のコバラミンの使用。
- 転移性癌組織または細胞が、蛍光を発することを特徴とする、該転移性癌組織または細胞を同定するための組成物の製造における請求項1〜4のいずれか1記載のコバラミンの使用。
- 癌組織または細胞が、蛍光を発し、健康な組織が、より少ない蛍光を呈することを特徴とする、イン・ビボ、エクス・ビボまたはイン・サイチュにて癌を診断、検出またはモニターするための組成物の製造における請求項1〜4のいずれか1記載のコバラミンの使用。
- 癌組織または細胞が、蛍光を発し、健康な組織が、より少ない蛍光を呈することを特徴とする、個体の癌の治療、診断、検出またはモニタリングにおいて転移性病気を同定するための組成物の製造における請求項1〜4のいずれか1記載のコバラミンの使用。
- 非−癌性細胞に比較して癌細胞のより大きな蛍光が、癌細胞が治療に都合よく応答することを示すことを特徴とする、治療に対する癌細胞の応答を予測するための組成物の製造における請求項1〜4のいずれか1記載のコバラミンの使用。
- 該治療が、コバラミン−化学療法またはホルモン療法である請求項11記載の使用。
- コバラミン−ベースの療法に対する癌細胞の応答が、非−癌性細胞と比較して、該癌細胞の蛍光に直接比例することを特徴とする、癌の進行段階を決定するための組成物の製造における請求項1〜4のいずれか1記載のコバラミンの使用。
- 健康な組織または細胞の蛍光より大きい該癌組織または細胞の蛍光が、該療法に対する都合よい治療の応答または患者の結果を示すことを特徴とする、イン・ビボ、エクス・ビボまたはイン・サイチュにて癌の療法後の治療の応答または患者の結果を予測するための組成物の製造における請求項1〜4のいずれか1記載のコバラミンの使用。
- 請求項1〜4のいずれか1記載のコバラミンを含み、癌性組織または細胞が、蛍光を発し、健康な組織が、より少ない蛍光を呈することを特徴とする、癌性であるか、または癌性細胞を含むことが疑われる組織において、癌組織または癌性細胞を含む組織を同定するための剤。
- 請求項1〜4のいずれか1記載のコバラミンを含み、癌性組織が、蛍光を発し、健康な組織が、より少ない蛍光を呈することを特徴とする、癌性組織と健康な組織を目視により区別するための剤。
- 請求項1〜4のいずれか1記載のコバラミンを含み、腫瘍組織が蛍光を発し、および腫瘍の境界を明らかにすることを特徴とする、イン・ビボ、エクス・ビボまたはイン・サイチュにて腫瘍の境界を明らかにするための剤。
- 請求項1〜4のいずれか1記載のコバラミンを含み、転移性癌組織または細胞が、蛍光を発することを特徴とする、該転移性癌組織または細胞を同定するための剤。
- 請求項1〜4のいずれか1記載のコバラミンを含み、癌組織または細胞が、蛍光を発し、健康な組織が、より少ない蛍光を呈することを特徴とする、イン・ビボ、エクス・ビボまたはイン・サイチュにて癌を診断、検出またはモニターするための剤。
- 請求項1〜4のいずれか1記載のコバラミンを含み、癌組織または細胞が、蛍光を発し、健康な組織が、より少ない蛍光を呈することを特徴とする、個体の癌の治療、診断、検出またはモニタリングにおける転移性病気を同定するための剤。
- 請求項1〜4のいずれか1記載のコバラミンを含み、非−癌性細胞に比較して癌細胞のより大きな蛍光が、癌細胞が治療に都合よく応答することを示すことを特徴とする、治療に対する癌細胞の応答を予測するための剤。
- 該治療が、コバラミン−化学療法またはホルモン療法である請求項21記載の剤。
- 請求項1〜4のいずれか1記載のコバラミンを含み、コバラミン−ベースの療法に対する癌細胞の応答が、非−癌性細胞と比較して、該癌細胞の蛍光に直接比例することを特徴とする、癌の進行段階を決定するための剤。
- 請求項1〜4のいずれか1記載のコバラミンを含み、健康な組織または細胞の蛍光より大きい癌組織または細胞の蛍光が、療法に都合よい治療の応答または患者の結果を示すことを特徴とする、イン・ビボ、エクス・ビボまたはイン・サイチュにて癌の療法後の治療の応答または患者の結果を予測するための剤。
- 請求項1〜4のいずれか1記載のコバラミンを用いて、試料に対して競合結合アッセイを行い、次いで、該試料中に存在するコバラミンの量を測定することを特徴とする試料中のコバラミンの量をアッセイする方法。
- 請求項1〜4のいずれか1記載のコバラミン用いて、試料から単離されたコバラミン結合蛋白質に対して競合結合アッセイを行い、次いで、該試料中の不飽和コバラミン結合能力の量を測定することを特徴とする該試料中のコバラミン結合蛋白質の不飽和コバラミン結合能力の量をアッセイする方法。
- 請求項1〜4のいずれか1記載のコバラミンを用いて、試料から単離されたコバラミン結合蛋白質から分離されたコバラミンの競合結合アッセイを行い、次いで、該試料中の該蛋白質に結合したコバラミンの量を測定することを特徴とする該試料中のコバラミン結合蛋白質に結合したコバラミンの量をアッセイする方法。
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