JP5521901B2

JP5521901B2 - Nonlinear microscope and nonlinear observation method

Info

Publication number: JP5521901B2
Application number: JP2010190938A
Authority: JP
Inventors: 直樹福武
Original assignee: Nikon Corp
Current assignee: Nikon Corp
Priority date: 2010-08-27
Filing date: 2010-08-27
Publication date: 2014-06-18
Anticipated expiration: 2030-08-27
Also published as: JP2012047632A

Description

本発明は、非線形顕微鏡及び非線形観察方法に関する。 The present invention relates to a nonlinear microscope and a nonlinear observation method.

近年、バイオ産業の勢いはとどまるところを知らず、とりわけ生体試料を観察対象とした３次元分解顕微鏡の需要は高まる一方である。その中でも空間分解能の高い共焦点顕微鏡は、古くから現在に至るまで広く使われている。従来の共焦点顕微鏡は、生体試料に含まれる蛍光分子が照射光の強度に対して線形な強度で発する蛍光（線形光学過程による信号）を観測するものであるが、近年になると、生体試料に含まれる特定種類の分子が照射光の強度に対して非線形な強度で発する光（非線形光学過程による信号）を観測する非線形顕微鏡が注目されつつある。 In recent years, the momentum of the bio industry has not been limited, and in particular, the demand for a three-dimensional resolving microscope for observing a biological sample is increasing. Among them, confocal microscopes with high spatial resolution have been widely used since ancient times. Conventional confocal microscopes observe fluorescence emitted by fluorescent molecules contained in a biological sample at a linear intensity with respect to the intensity of irradiation light (a signal due to a linear optical process). A nonlinear microscope that observes light (signal by a nonlinear optical process) emitted from a specific type of contained molecules with a nonlinear intensity with respect to the intensity of irradiation light is attracting attention.

非線形顕微鏡は、照射光として比較的長い波長の光（例えば近赤外線）を用いるので、試料の深部まで観察することが可能である。また、上述した非線形過程は対物レンズの焦点近傍の微小領域でしか生起しないので、非線形顕微鏡が取得する画像は極めて薄い層の画像（セクショニング画像）となる。このような非線形顕微鏡の１つに、非線形過程としてコヒーレントアンチストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）を利用したＣＡＲＳ顕微鏡がある（特許文献１等を参照）。 Since the nonlinear microscope uses light having a relatively long wavelength (for example, near infrared rays) as irradiation light, it is possible to observe the deep part of the sample. Further, since the nonlinear process described above occurs only in a minute region near the focal point of the objective lens, the image acquired by the nonlinear microscope is an extremely thin layer image (sectioning image). As one of such nonlinear microscopes, there is a CARS microscope that uses coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) as a nonlinear process (see Patent Document 1).

特開２００９−４７４３５号公報JP 2009-47435 A

しかしながら従来のＣＡＲＳ顕微鏡では、ＣＡＲＳ過程による信号（ＣＡＲＳ信号）と共に、ＣＡＲＳ信号と同じ波長のノイズ信号も発生するため、セクショニング画像のコントラストが低い（バックグラウンドノイズが大きい）という問題がある。 However, in the conventional CARS microscope, a noise signal having the same wavelength as that of the CARS signal is generated together with a signal by the CARS process (CARS signal), so that there is a problem that the contrast of the sectioning image is low (background noise is large).

そこで本発明は、セクショニング画像を高コントラストに取得することのできる非線形顕微鏡及び非線形観察方法を提供することを目的とする。 Therefore, an object of the present invention is to provide a nonlinear microscope and a nonlinear observation method that can acquire a sectioning image with high contrast.

本発明を例示する非線形顕微鏡の一態様は、観察対象物中の特定種類の分子に非線形光学過程による特定波長の光を生起させるためのレーザ光を生成する生成手段と、前記生成手段が生成した前記レーザ光を集光して前記観察対象物の観察対象面上にレーザスポットを形成する集光手段と、前記観察対象面上に形成される前記レーザスポットを、面内位置のずれた１対のレーザスポットに分離する分離手段と、前記１対のレーザスポットの一方で生起した前記特定波長の光と他方で生起した前記特定波長の光との間の位相ズレを示す信号を生成する検出手段と、前記１対のレーザスポットで前記観察対象面上を走査しながら前記検出手段が生成する信号を繰り返し取り込むことにより、前記観察対象面における前記信号の分布を計測する制御手段とを備える。 One aspect of a nonlinear microscope exemplifying the present invention is a generation unit that generates laser light for generating light of a specific wavelength by a nonlinear optical process in a specific type of molecule in an observation object, and the generation unit generates Condensing means for condensing the laser light to form a laser spot on the observation target surface of the observation object, and a pair of the laser spots formed on the observation target surface shifted in in-plane positions Separating means for separating the laser spot, and detection means for generating a signal indicating a phase shift between the light of the specific wavelength generated in one of the pair of laser spots and the light of the specific wavelength generated in the other And measuring the distribution of the signal on the observation target surface by repeatedly taking in the signal generated by the detection means while scanning the observation target surface with the pair of laser spots. And a stage.

また、本発明を例示する非線形観察方法の一態様は、観察対象物中の特定種類の分子に非線形光学過程による特定波長の光を生起させるためのレーザ光を生成する生成手順と、前記生成手順で生成された前記レーザ光を集光して前記観察対象物の観察対象面上にレーザスポットを形成する集光手順と、前記観察対象面上に形成される前記レーザスポットを、面内位置のずれた１対のレーザスポットに分離する分離手順と、前記１対のレーザスポットの一方で生起した前記特定波長の光と他方で生起した前記特定種類の光との間の位相ズレを示す信号を生成する検出手順と、前記１対のレーザスポットで前記観察対象面上を走査しながら前記検出手順で生成される信号を繰り返し取り込むことにより、前記観察対象面における前記信号の分布を計測する制御手順とを含む。 Also, one aspect of the nonlinear observation method illustrating the present invention is a generation procedure for generating laser light for generating light of a specific wavelength by a nonlinear optical process in a specific type of molecule in an observation object, and the generation procedure A condensing procedure for condensing the laser beam generated in step (b) to form a laser spot on the observation target surface of the observation target, and the laser spot formed on the observation target surface at an in-plane position. A separation procedure for separating into a pair of shifted laser spots, and a signal indicating a phase shift between the light of the specific wavelength generated in one of the pair of laser spots and the specific type of light generated in the other The detection procedure to be generated and the signal generated on the observation target surface are repeatedly captured by scanning the surface of the observation target with the pair of laser spots. And a control procedure for measurement.

本発明によれば、セクショニング画像を高コントラストに取得することのできる非線形顕微鏡及び非線形観察方法が実現する。 According to the present invention, a nonlinear microscope and a nonlinear observation method that can acquire a sectioning image with high contrast are realized.

第１実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡の構成図である。It is a block diagram of the CARS microscope of 1st Embodiment. 空間光位相変調素子１６１、１６２の機能を説明する図である。It is a figure explaining the function of spatial light phase modulation element 161,162. ＣＡＲＳ過程及び非共鳴過程を説明する図である。It is a figure explaining a CARS process and a non-resonance process. 点像振幅分布φ１、φ２、φｒを説明する模式図である。It is a schematic diagram explaining point image amplitude distribution (phi) 1, (phi) 2, (phi) r. 点像Ｓｔ、Ｓｔ’とダブルスリット板２３との関係を説明する図である。It is a figure explaining the relationship between point images St and St 'and the double slit plate. 干渉縞Ｓｐとピンホールアレイ板２５との関係を説明する図である。It is a figure explaining the relationship between the interference fringe Sp and the pinhole array board 25. FIG. 第２実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡の構成図である。It is a block diagram of the CARS microscope of 2nd Embodiment. 点像Ｓｔ、Ｓｔ’とピンホール板２２５との関係を説明する図である。It is a figure explaining the relationship between point images St and St 'and the pinhole plate 225. 点像Ｓｔ、Ｓｔ’の強度分布を説明する模式図である。It is a schematic diagram explaining intensity distribution of point images St and St '. 第３実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡の構成図である。It is a block diagram of the CARS microscope of 3rd Embodiment.

［第１実施形態］
以下、本発明の第１実施形態を説明する。本実施形態は、ＣＡＲＳ顕微鏡の実施形態である。 [First Embodiment]
Hereinafter, a first embodiment of the present invention will be described. This embodiment is an embodiment of a CARS microscope.

図１は、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡の構成図である。図１に示すとおり、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡には、レーザ光源１１と、波長可変の光パラメトリック発振器（ＯＰＯ：optical parametric oscillator）１２と、ビームエキスパンダ１３と、ダイクロイックミラー１４と、全反射ミラー１５１、１５２と、空間光位相変調素子１６１、１６２と、ダイクロイックミラー１７と、第１対物レンズ１８と、透過型の試料ステージ１９と、第２対物レンズ２０と、波長選択フィルタ２１と、集光レンズ２２と、ダブルスリット板２３と、コリメートレンズ２４と、ピンホールアレイ板２５と、光検出器２６と、制御部３０とが備えられる。 FIG. 1 is a configuration diagram of a CARS microscope according to the present embodiment. As shown in FIG. 1, the CARS microscope of the present embodiment includes a laser light source 11, a variable wavelength optical parametric oscillator (OPO) 12, a beam expander 13, a dichroic mirror 14, and a total reflection mirror. 151, 152, spatial light phase modulation elements 161, 162, dichroic mirror 17, first objective lens 18, transmissive sample stage 19, second objective lens 20, wavelength selection filter 21, and condensing light. A lens 22, a double slit plate 23, a collimating lens 24, a pinhole array plate 25, a photodetector 26, and a control unit 30 are provided.

試料ステージ１９には、透明な培養容器１０が配置される。培養容器１０には生体細胞を含んだ透明な培養液が収容されており、生体細胞に含まれる特定種類の分子（タンパク質、脂質など）が観察対象となる。以下、観察対象となる特定種類の分子を「観察対象分子」と称す。 A transparent culture vessel 10 is disposed on the sample stage 19. The culture vessel 10 contains a transparent culture solution containing biological cells, and specific types of molecules (proteins, lipids, etc.) contained in the biological cells are to be observed. Hereinafter, a specific type of molecule to be observed is referred to as “observed molecule”.

レーザ光源１１は、パルスレーザ光を発振するパルスレーザ光源であって、レーザ光源１１が発振するパルスレーザ光のパルス形状は、適切な形状に設定されている。パルス形状の設定により、後述するレーザスポットの中心部分のエネルギー密度は、観察対象分子にＣＡＲＳ信号を発生させるのに適したエネルギー密度となる。 The laser light source 11 is a pulse laser light source that oscillates pulse laser light, and the pulse shape of the pulse laser light oscillated by the laser light source 11 is set to an appropriate shape. By setting the pulse shape, the energy density of the center portion of the laser spot described later becomes an energy density suitable for generating a CARS signal in the observation target molecule.

光パラメトリック発振器１２は、レーザ光源１１が発振したパルスレーザ光により、光周波数の互いに異なる（すなわち波長の互いに異なる）２種類のパルスレーザ光Ｌ１、Ｌ２を生成し、それらのパルスレーザ光Ｌ１、Ｌ２を同軸で出射する。なお、この光パラメトリック発振器１２は、外部から与えられた電気信号に応じて、パルスレーザ光Ｌ１の光周波数ω１と、パルスレーザ光Ｌ２の光周波数ω２との組み合わせを変更することができる。よって、光パラメトリック発振器１２は、観察対象分子の変更に対応できる。通常、光パラメトリック発振器１２が出射するパルスレーザ光Ｌ１、Ｌ２の光周波数ω１、ω２の組み合わせは、観察対象分子の固有振動数ωｖに対してωｖ＝ω１−ω２の式を満たすように設定される。 The optical parametric oscillator 12 generates two types of pulsed laser beams L1 and L2 having different optical frequencies (that is, different in wavelength) from the pulsed laser beam oscillated by the laser light source 11, and these pulsed laser beams L1 and L2 are generated. Is output coaxially. The optical parametric oscillator 12 can change the combination of the optical frequency ω1 of the pulsed laser light L1 and the optical frequency ω2 of the pulsed laser light L2 in accordance with an electrical signal given from the outside. Therefore, the optical parametric oscillator 12 can cope with the change of the observation target molecule. Usually, the combination of the optical frequencies ω1 and ω2 of the pulsed laser beams L1 and L2 emitted from the optical parametric oscillator 12 is set so as to satisfy the equation ωv = ω1−ω2 with respect to the natural frequency ωv of the observation target molecule. .

ビームエキスパンダ１３は、光パラメトリック発振器１２から射出したパルスレーザ光Ｌ１、Ｌ２を、径の太い平行光束に変換する。 The beam expander 13 converts the pulse laser beams L1 and L2 emitted from the optical parametric oscillator 12 into a parallel light beam having a large diameter.

ダイクロイックミラー１４は、ビームエキスパンダ１３を射出したパルスレーザ光Ｌ１、Ｌ２を互いに分離する。ここでは、ダイクロイックミラー１４の反射／透過波長特性は、パルスレーザ光Ｌ１と同じ光周波数（光周波数ω１）の光を反射し、かつパルスレーザ光Ｌ２と同じ光周波数（光周波数ω２）の光を透過するような特性に設定されているものとする。 The dichroic mirror 14 separates the pulse laser beams L1 and L2 emitted from the beam expander 13 from each other. Here, the reflection / transmission wavelength characteristic of the dichroic mirror 14 reflects light having the same optical frequency (optical frequency ω1) as the pulsed laser light L1, and reflects light having the same optical frequency (optical frequency ω2) as the pulsed laser light L2. It is assumed that the transmission characteristics are set.

ダイクロイックミラー１４を反射したパルスレーザ光Ｌ１は、全反射ミラー１５１及び空間光位相変調素子１６１を介してダイクロイックミラー１７へ入射し、ダイクロイックミラー１４を透過したパルスレーザ光Ｌ２は、全反射ミラー１５２及び空間光位相変調素子１６２を介してダイクロイックミラー１７へ入射する。 The pulse laser beam L1 reflected from the dichroic mirror 14 is incident on the dichroic mirror 17 via the total reflection mirror 151 and the spatial light phase modulation element 161, and the pulse laser beam L2 transmitted through the dichroic mirror 14 is converted into the total reflection mirror 152 and The light enters the dichroic mirror 17 via the spatial light phase modulation element 162.

空間光位相変調素子１６１、１６２の各々は、光路長分布が非一様な位相板（媒質厚さ分布が非一様な位相板）であって、その光路長分布の非一様性により、入射光束の波面（位相分布）を変形する。ここでは、パルスレーザ光Ｌ１、Ｌ２の光周波数の組み合わせが可変であるので、空間光位相変調素子１６１、１６２は、外部から与えられた電気信号に応じて光路長分布を変化させることができるものとする。 Each of the spatial light phase modulation elements 161 and 162 is a phase plate having a non-uniform optical path length distribution (a phase plate having a non-uniform medium thickness distribution), and due to the non-uniformity of the optical path length distribution, The wavefront (phase distribution) of the incident light beam is deformed. Here, since the combination of the optical frequencies of the pulse laser beams L1 and L2 is variable, the spatial light phase modulation elements 161 and 162 can change the optical path length distribution in accordance with an externally applied electric signal. And

なお、光路長分布が可変の空間光位相変調素子１６１、１６２の各々としては、例えば、特表２００８−５０４５８３号公報、特表２００９−５０１９５３号公報、特表２０１０−５０７１１９号公報の何れかに記載されたディジタルレンズが適用可能である。 In addition, as each of the spatial light phase modulation elements 161 and 162 whose optical path length distribution is variable, for example, any one of JP-T 2008-504583, JP-T 2009-501953, and JP-T 2010-507119 The described digital lens is applicable.

空間光位相変調素子１６１がパルスレーザ光Ｌ１に与える位相分布は、図２（Ａ）の左側に示すとおりに設定され、空間光位相変調素子１６２がパルスレーザ光Ｌ２に与える位相分布は、図２（Ａ）の右側に示すとおりに設定される。すなわち、空間光位相変調素子１６１は、光軸を含む所定の平面（図２ではＹＺ平面）でパルスレーザ光Ｌ１の波面を空間的に２分割し、かつ、分割波面の一方（プラスＸ側）と他方（マイナスＸ側）との間に位相差πを与える。また、空間光位相変調素子１６２は、前記平面に対応する平面（ＹＺ平面）でパルスレーザ光Ｌ２の波面を空間的に２分割し、分割波面の一方（プラスＸ側）と他方（マイナスＸ側）との間に位相差πを与える。 The phase distribution given to the pulse laser beam L1 by the spatial light phase modulation element 161 is set as shown on the left side of FIG. 2A, and the phase distribution given to the pulse laser beam L2 by the spatial light phase modulation element 162 is shown in FIG. It is set as shown on the right side of (A). That is, the spatial light phase modulation element 161 spatially divides the wavefront of the pulsed laser light L1 into two on a predetermined plane including the optical axis (YZ plane in FIG. 2), and one of the divided wavefronts (plus X side) And the other (minus X side) are given a phase difference π. The spatial light phase modulation element 162 spatially divides the wavefront of the pulsed laser light L2 into two planes (YZ plane) corresponding to the plane, and one (plus X side) and the other (minus X side) of the divided wavefronts. ) Is given a phase difference π.

なお、パルスレーザ光Ｌ１とパルスレーザ光Ｌ２との間では光周波数が異なるので、空間光位相変調素子１６１と空間光位相変調素子１６２との間では、入射光に与える位相分布が互いに等しくとも、光路長分布（プラスＸ側の光路長とマイナスＸ側の光路長との段差）は互いに異なる。 Since the optical frequency is different between the pulsed laser light L1 and the pulsed laser light L2, the spatial light phase modulation element 161 and the spatial light phase modulation element 162 may have the same phase distribution to the incident light. The optical path length distribution (the step between the optical path length on the plus X side and the optical path length on the minus X side) is different from each other.

また、図１には示さなかったが、ダイクロイックミラー１４からダイクロイックミラー１７までのパルスレーザ光Ｌ１の光路長と、ダイクロイックミラー１４からダイクロイックミラー１７までのパルスレーザ光Ｌ２の光路長との少なくとも一方は調節可能であって、ダイクロイックミラー１７へパルスレーザ光Ｌ１が入射するタイミングと、ダイクロイックミラー１７へパルスレーザ光Ｌ２が入射するタイミングとは合致しているものとする。これにより、培養容器１０にパルスレーザ光Ｌ１が入射するタイミングと培養容器１０にパルスレーザ光Ｌ２が入射するタイミングとが合致する。 Although not shown in FIG. 1, at least one of the optical path length of the pulse laser beam L1 from the dichroic mirror 14 to the dichroic mirror 17 and the optical path length of the pulse laser beam L2 from the dichroic mirror 14 to the dichroic mirror 17 is It is adjustable, and the timing at which the pulse laser beam L1 enters the dichroic mirror 17 and the timing at which the pulse laser beam L2 enters the dichroic mirror 17 are assumed to match. Thereby, the timing at which the pulse laser beam L1 enters the culture vessel 10 and the timing at which the pulse laser beam L2 enters the culture vessel 10 match.

ダイクロイックミラー１７は、空間光位相変調素子１６１を射出したパルスレーザ光Ｌ１と、空間光位相変調素子１６２を射出したパルスレーザ光Ｌ２とを同軸に統合する。このダイクロイックミラー１７の反射／透過波長特性は、パルスレーザ光Ｌ１と同じ光周波数の光を反射し、かつパルスレーザ光Ｌ２と同じ光周波数の光を透過するような特性に設定されている。 The dichroic mirror 17 concentrically integrates the pulse laser light L1 emitted from the spatial light phase modulation element 161 and the pulse laser light L2 emitted from the spatial light phase modulation element 162. The reflection / transmission wavelength characteristic of the dichroic mirror 17 is set such that it reflects light having the same optical frequency as that of the pulsed laser light L1 and transmits light having the same optical frequency as that of the pulsed laser light L2.

第１対物レンズ１８は、ダイクロイックミラー１７で統合されたパルスレーザ光Ｌ１、Ｌ２を、第１対物レンズ１８の焦点面上に集光する。この焦点面は、培養容器１０の深部の特定層に一致しており、この層が観察対象面となる。以下、この観察対象面上でパルスレーザ光Ｌ１、Ｌ２の照射される部分を「レーザスポット」と称す。 The first objective lens 18 condenses the pulse laser beams L1 and L2 integrated by the dichroic mirror 17 on the focal plane of the first objective lens 18. This focal plane coincides with a specific layer in the deep part of the culture vessel 10, and this layer becomes the observation target plane. Hereinafter, the portions irradiated with the pulse laser beams L1 and L2 on the observation target surface are referred to as “laser spots”.

ここで、パルスレーザ光Ｌ１の分割波面には図２（Ａ）の左側に示したとおり位相差πが付与されているため、パルスレーザ光Ｌ１のレーザスポットは、図２（Ｂ）の左側に示すとおり１対のレーザスポットＳ１、Ｓ１’に分離している。また、パルスレーザ光Ｌ２の分割波面にも図２（Ａ）の右側に示したとおり位相差πが付与されているため、パルスレーザ光Ｌ２のレーザスポットも、図２（Ｂ）の右側に示すとおり１対のレーザスポットＳ２、Ｓ２’に分離している。１対のレーザスポットＳ１、Ｓ１’の間では位相がπだけずれており、１対のレーザスポットＳ２、Ｓ２’の間では位相がπだけずれている。 Here, since the phase difference π is given to the divided wavefront of the pulse laser beam L1 as shown on the left side of FIG. 2A, the laser spot of the pulse laser beam L1 is on the left side of FIG. 2B. As shown, the laser beam is separated into a pair of laser spots S1 and S1 ′. Further, since the phase difference π is given to the divided wavefront of the pulse laser beam L2 as shown on the right side of FIG. 2A, the laser spot of the pulse laser beam L2 is also shown on the right side of FIG. As shown, the laser spot is separated into a pair of laser spots S2 and S2 ′. The phase is shifted by π between the pair of laser spots S1 and S1 ', and the phase is shifted by π between the pair of laser spots S2 and S2'.

なお、１対のレーザスポットＳ１、Ｓ１’の分離方向は、パルスレーザ光Ｌ１の波面の分割方向（Ｘ方向）に対応しており、１対のレーザスポットＳ２、Ｓ２’の分離方向も、パルスレーザ光Ｌ２の波面の分割方向（Ｘ方向）に対応している。また、１対のレーザスポットＳ１、Ｓ１’の横ズレ量は、第１対物レンズ１８の開口数によって決まる微小距離（例えば数百ｎｍ）であり、１対のレーザスポットＳ２、Ｓ２’の横ズレ量も、第１対物レンズ１８の開口数によって決まる微小距離（例えば数百ｎｍ）である。なお、レーザスポットＳ１、Ｓ１’の各々のサイズは、パルスレーザ光Ｌ１の光周波数ω１によって決まり、レーザスポットＳ２、Ｓ２’の各々のサイズは、パルスレーザ光Ｌ２の光周波数ω２によって決まるので、レーザスポットＳ１、Ｓ１’のサイズとレーザスポットＳ２、Ｓ２’のサイズとは若干異なる。しかし、マイナスＸ側に位置するレーザスポットＳ１、Ｓ２同士はほぼ一致し、プラスＸ側に位置するレーザスポットＳ１’、Ｓ２’同士はほぼ一致する。よって、以下では、マイナスＸ側に位置するレーザスポットＳ１、Ｓ２を纏めて「レーザスポットＳ」と称し、プラスＸ側に位置するレーザスポットＳ１’、Ｓ２’を纏めて「レーザスポットＳ’」と称す（図２（Ｃ）参照。）。 The separation direction of the pair of laser spots S1 and S1 ′ corresponds to the division direction (X direction) of the wavefront of the pulse laser beam L1, and the separation direction of the pair of laser spots S2 and S2 ′ is also a pulse. This corresponds to the wavefront division direction (X direction) of the laser beam L2. Further, the lateral deviation amount of the pair of laser spots S1 and S1 ′ is a minute distance (for example, several hundred nm) determined by the numerical aperture of the first objective lens 18, and the lateral deviation of the pair of laser spots S2 and S2 ′. The amount is also a minute distance (for example, several hundred nm) determined by the numerical aperture of the first objective lens 18. The size of each of the laser spots S1 and S1 ′ is determined by the optical frequency ω1 of the pulse laser beam L1, and the size of each of the laser spots S2 and S2 ′ is determined by the optical frequency ω2 of the pulse laser beam L2. The sizes of the spots S1 and S1 ′ are slightly different from the sizes of the laser spots S2 and S2 ′. However, the laser spots S1 and S2 located on the minus X side are almost coincident with each other, and the laser spots S1 'and S2' located on the plus X side are almost coincident with each other. Therefore, hereinafter, the laser spots S1 and S2 positioned on the minus X side are collectively referred to as “laser spot S”, and the laser spots S1 ′ and S2 ′ positioned on the plus X side are collectively referred to as “laser spot S ′”. (Refer to FIG. 2C).

ここで、上述したとおり、レーザ光源１１の出射パルス形状は適切に設定されているので、図２（Ｃ）に示すとおり、レーザスポットＳの中央部分Ｓｒのエネルギー密度と、レーザスポットＳ’の中央部分Ｓｒ’のエネルギー密度とは、観察対象分子がＣＡＲＳ信号を発生するのに適したエネルギー密度となる（但し、図２（Ｂ）、（Ｃ）は模式図なので、実際のスポット形状は、図２（Ｂ）、（Ｃ）のとおりになるとは限らない。）。 Here, since the emission pulse shape of the laser light source 11 is appropriately set as described above, the energy density of the central portion Sr of the laser spot S and the center of the laser spot S ′ as shown in FIG. The energy density of the portion Sr ′ is an energy density suitable for the observation target molecule to generate a CARS signal (however, since FIGS. 2B and 2C are schematic diagrams, the actual spot shape is shown in FIG. 2 (B) and (C) are not necessarily the same).

よって、レーザスポットＳの中央部分Ｓｒに観察対象分子が存在していれば、その部分ＳｒにおいてＣＡＲＳ過程（図３（Ａ））の生起する可能性があり、レーザスポットＳ’の中央部分Ｓｒ’に観察対象分子が存在していれば、その部分Ｓｒ’においてＣＡＲＳ過程（図３（Ａ））の生起する可能性がある。以下、レーザスポットＳのうちＣＡＲＳ信号の発生しうる部分Ｓｒを「高密度スポットＳｒ」と称し、レーザスポットＳ’のうちＣＡＲＳ信号の発生しうる部分Ｓｒ’を「高密度スポットＳｒ’」と称す。なお、前述したとおり、レーザスポットＳ、Ｓ’の横ズレ量は微小（数百ｎｍ）なので、高密度スポットＳｒ、Ｓｒ’の横ズレ量も微小である。 Therefore, if the observation target molecule exists in the central portion Sr of the laser spot S, the CARS process (FIG. 3A) may occur in the portion Sr, and the central portion Sr ′ of the laser spot S ′. If there is a molecule to be observed, the CARS process (FIG. 3A) may occur in the portion Sr ′. Hereinafter, the portion Sr in which the CARS signal can be generated in the laser spot S is referred to as “high density spot Sr”, and the portion Sr ′ in which the CARS signal can be generated in the laser spot S ′ is referred to as “high density spot Sr ′”. . As described above, since the amount of lateral deviation of the laser spots S and S ′ is very small (several hundred nm), the amount of lateral deviation of the high-density spots Sr and Sr ′ is also minute.

ここで、ＣＡＲＳ過程（図３（Ａ））は、次のとおり生起する。すなわち、光周波数ω１を有したパルスレーザ光Ｌ１と光周波数ω２を有したパルスレーザ光Ｌ２は、光周波数（ω１−ω２）を有したうなりを発生させるが、観察対象分子の固有振動数ωｖは、そのうなりの光周波数（ω１−ω２）と等しいため、観察対象分子はうなりに共鳴して励起状態へと移行する。そして、励起状態となった観察対象分子に対して光周波数ω１を有したパルスレーザ光Ｌ１が照射されると、観察対象分子は、（ωｖ＋ω１）に相当するエネルギーを有した中間状態へと移行する。その後、中間状態の観察対象分子が基底状態へ移行する際に、光周波数ωｒ＝２ω１−ω２を有したＣＡＲＳ信号が発生する。 Here, the CARS process (FIG. 3A) occurs as follows. That is, the pulse laser beam L1 having the optical frequency ω1 and the pulse laser beam L2 having the optical frequency ω2 generate beats having the optical frequency (ω1-ω2), but the natural frequency ωv of the molecule to be observed is Since it is equal to the optical frequency (ω1-ω2) of the beat, the observation target molecule resonates with the beat and shifts to an excited state. When the observation target molecule in the excited state is irradiated with the pulsed laser light L1 having the optical frequency ω1, the observation target molecule shifts to an intermediate state having energy corresponding to (ωv + ω1). . Thereafter, when the observation target molecule in the intermediate state shifts to the ground state, a CARS signal having an optical frequency ωr = 2ω1−ω2 is generated.

因みに、このＣＡＲＳ過程によると、高密度スポットＳｒ、Ｓｒ’で発生し得るＣＡＲＳ信号の振幅分布φｒ（Ｘ，Ｙ）（＝観察対象分子の密度が一様であるときにＣＡＲＳ信号が観察対象面に形成する点像振幅分布）は、以下の式で表される。 Incidentally, according to this CARS process, the amplitude distribution φr (X, Y) of CARS signals that can be generated in the high-density spots Sr and Sr ′ (= the CARS signal is observed when the density of the molecules to be observed is uniform. The point image amplitude distribution formed in (1) is expressed by the following equation.

φｒ（Ｘ，Ｙ）＝｛φ１（Ｘ，Ｙ）｝^２×｛φ２（Ｘ，Ｙ）｝^＊
但し、この式におけるφ１（Ｘ，Ｙ）は、レーザスポットＳ１、Ｓ１’の振幅分布（＝パルスレーザ光Ｌ１が観察対象面に形成する点像振幅分布）であり、φ２（Ｘ，Ｙ）は、レーザスポットＳ２、Ｓ２’の振幅分布（＝パルスレーザ光Ｌ２が観察対象面に形成する点像振幅分布）である。 φr (X, Y) = {φ1 (X, Y)} ² × {φ2 (X, Y)} ^*
However, φ1 (X, Y) in this equation is the amplitude distribution of the laser spots S1 and S1 ′ (= point image amplitude distribution formed on the observation target surface by the pulsed laser light L1), and φ2 (X, Y) is Amplitude distribution of the laser spots S2 and S2 ′ (= point image amplitude distribution formed by the pulsed laser light L2 on the observation target surface).

なお、パルスレーザ光Ｌ１の点像振幅分布φ１（Ｘ）は、例えば図４（Ａ）の左側に示すような２つの点像振幅分布を合成したものであり、パルスレーザ光Ｌ２の点像振幅分布φ２（Ｘ）も、例えば図４（Ａ）の右側に示すような２つの点像振幅分布を合成したものであるので、ＣＡＲＳ信号の点像振幅分布φｒ（Ｘ）は、例えば図４（Ｂ）に示すように、互いに分離した２つの点像振幅分布となる（但し、図４は模式図なので、実際の振幅分布が図４のとおりになるとは限らない。）。 The point image amplitude distribution φ1 (X) of the pulse laser beam L1 is a combination of two point image amplitude distributions as shown on the left side of FIG. 4A, for example, and the point image amplitude of the pulse laser beam L2 Since the distribution φ2 (X) is also a combination of two point image amplitude distributions as shown on the right side of FIG. 4A, for example, the point image amplitude distribution φr (X) of the CARS signal is, for example, FIG. As shown in FIG. 4B, two point image amplitude distributions separated from each other are obtained (however, since FIG. 4 is a schematic diagram, the actual amplitude distribution is not necessarily as shown in FIG. 4).

ところで、高密度スポットＳｒ、Ｓｒ’（図２（Ｃ）参照）の各々では、共鳴過程の１種であるＣＡＲＳ過程（図３（Ａ））だけでなく、非共鳴過程（図３（Ｂ））も生起し得る。この非共鳴過程は、培養液中及び細胞中の水分子に起因するものであって、ノイズ信号の原因となる過程である。 By the way, in each of the high-density spots Sr and Sr ′ (see FIG. 2C), not only the CARS process (FIG. 3A), which is one type of resonance process, but also a non-resonant process (FIG. 3B). ) Can also occur. This non-resonant process is caused by water molecules in the culture solution and cells, and is a process that causes a noise signal.

ここで、水分子による非共鳴過程（図３（Ｂ））は次のとおり生起する。すなわち、水分子は、光周波数ω１を有したパルスレーザ光Ｌ１によって２光子励起され、２×ω１に相当するエネルギーを有した中間状態へと移行する可能性がある。その後、中間状態の水分子が基底状態へ移行する際に、光周波数ωｒを有した第１の光と、光周波数ω２を有した第２の光とが発生する。 Here, the non-resonant process (FIG. 3B) due to water molecules occurs as follows. That is, the water molecule may be two-photon excited by the pulse laser beam L1 having the optical frequency ω1, and may shift to an intermediate state having energy corresponding to 2 × ω1. After that, when the water molecules in the intermediate state shift to the ground state, the first light having the optical frequency ωr and the second light having the optical frequency ω2 are generated.

このうち、第２の光は、ＣＡＲＳ信号と光周波数が異なるため波長選択フィルタ２１でカットすることができるが、第１の光は、ＣＡＲＳ信号と光周波数が同じであるため波長選択フィルタ２１でカットすることができない。しかも、第１の光は、ＣＡＲＳ信号と比較して強度が高く、ＣＡＲＳ信号に対してコヒーレントである。この第１の光が、前述したバックグラウンドノイズとなる。以下、この第１の光を「バックグラウンドノイズ」と称す。 Among these, the second light can be cut by the wavelength selection filter 21 because the optical frequency is different from that of the CARS signal. However, the first light is the wavelength selection filter 21 because the optical frequency is the same as that of the CARS signal. Can't cut. In addition, the first light is higher in intensity than the CARS signal and is coherent with the CARS signal. This first light becomes the background noise described above. Hereinafter, this first light is referred to as “background noise”.

しかしながら、非共鳴過程（図３（Ｂ））とＣＡＲＳ過程（図３（Ａ））との相違により、バックグラウンドノイズとＣＡＲＳ信号との間では、位相が必ずπ／２だけずれるという特徴がある。 However, due to the difference between the non-resonance process (FIG. 3B) and the CARS process (FIG. 3A), there is a feature that the phase is always shifted by π / 2 between the background noise and the CARS signal. .

本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡は、バックグラウンドノイズに関するこれらの特徴（ＣＡＲＳ信号より強度が高く、ＣＡＲＳ信号とは位相がπ／２だけずれるという特徴）を利用して、ＣＡＲＳ信号をバックグラウンドノイズから分離する。前述したとおりレーザスポットを１対のレーザスポットに分離したのも、ＣＡＲＳ信号をバックグラウンドノイズから分離するためである。 The CARS microscope according to the present embodiment uses these characteristics related to background noise (characteristic that the intensity is higher than that of the CARS signal and the phase is shifted by π / 2 from the CARS signal) to separate the CARS signal from the background noise. To do. As described above, the laser spot is separated into a pair of laser spots in order to separate the CARS signal from the background noise.

図１に戻り、第２対物レンズ２０は、培養容器１０を挟み第１対物レンズ１８に対向する位置に配置されており、第２対物レンズ２０の光軸は第１対物レンズ１８の光軸に一致し、第２対物レンズ２の焦点は第１対物レンズ１８の焦点に一致している。よって、第２対物レンズ２０は、レーザスポットＳ、Ｓ’から射出する光（パルスレーザ光Ｌ１、Ｌ２、ＣＡＲＳ信号、バックグラウンドノイズ、第２の光）を捉える。 Returning to FIG. 1, the second objective lens 20 is disposed at a position facing the first objective lens 18 with the culture vessel 10 interposed therebetween, and the optical axis of the second objective lens 20 is the optical axis of the first objective lens 18. The focal points of the second objective lens 2 coincide with the focal points of the first objective lens 18. Therefore, the second objective lens 20 captures light (pulse laser light L1, L2, CARS signal, background noise, second light) emitted from the laser spots S, S ′.

波長選択フィルタ２１は、第２対物レンズ２０の光射出側に配置され、ＣＡＲＳ信号と同じ光周波数の光を透過し、他の光周波数の光をカットするような特性に設定されている。よって、パルスレーザ光Ｌ１、Ｌ２及び第２の光は波長選択フィルタ２１でカットされるが、ＣＡＲＳ信号及びバックグラウンドノイズは波長選択フィルタ２１を透過する。 The wavelength selection filter 21 is disposed on the light exit side of the second objective lens 20 and is set to have such characteristics as to transmit light having the same optical frequency as that of the CARS signal and cut light having other optical frequencies. Therefore, the pulse laser beams L 1 and L 2 and the second light are cut by the wavelength selection filter 21, but the CARS signal and the background noise are transmitted through the wavelength selection filter 21.

集光レンズ２２は、波長選択フィルタ２１の光射出側に配置されており、集光レンズ２２の光軸は第２対物レンズ２０の光軸に一致している。この集光レンズ２２は、波長選択フィルタ２１を透過した光（ＣＡＲＳ信号及びバックグラウンドノイズ）を、所定面上に向けて集光する。この所定面は、集光レンズ２２及び第２対物レンズ２０に関して観察対象面と光学的に共役な面である。よって、この所定面には、図５（Ａ）に示すような１対の点像Ｓｔ、Ｓｔ’が形成される（なお、図５は模式図なので、点像の実際の形状は図５のとおりになるとは限らない。）。 The condenser lens 22 is disposed on the light exit side of the wavelength selection filter 21, and the optical axis of the condenser lens 22 coincides with the optical axis of the second objective lens 20. The condensing lens 22 condenses the light (the CARS signal and background noise) transmitted through the wavelength selection filter 21 toward a predetermined surface. The predetermined surface is a surface optically conjugate with the observation target surface with respect to the condenser lens 22 and the second objective lens 20. Therefore, a pair of point images St and St ′ as shown in FIG. 5A are formed on this predetermined surface (Note that FIG. 5 is a schematic diagram, and the actual shape of the point image is shown in FIG. Not always.)

ダブルスリット板２３は、これら１対の点像Ｓｔ、Ｓｔ’の形成面に配置される。ダブルスリット板２３には、図５（Ｂ）に示すとおり、Ｙ方向に延びる２本のスリット２３ａ、２３ａ’がＸ方向に並べて形成されており、一方のスリット２３ａのＸ方向の形成先は、一方の点像Ｓｔのピーク位置（強度がピークとなる位置であって、点像Ｓｔのほぼ中心）であり、他方のスリット２３ａ’のＸ方向の形成先は、他方の点像Ｓｔ’のピーク位置（強度がピークとなる位置であって、点像Ｓｔ’のほぼ中心）である。また、スリット２３ａ、２３ａ’の各々のスリット幅は十分に狭く設定されており、スリット２３ａを透過した光（ＣＡＲＳ信号及びバックグラウンドノイズからなる混合光）のＸ方向の波面形状と、他方のスリット２３ａ’を透過した光（ＣＡＲＳ信号及びバックグラウンドノイズからなる混合光）のＸ方向の波面形状とは、理想的球面状となる。 The double slit plate 23 is disposed on the formation surface of the pair of point images St and St ′. In the double slit plate 23, as shown in FIG. 5B, two slits 23a and 23a ′ extending in the Y direction are formed side by side in the X direction, and the formation destination of one slit 23a in the X direction is It is the peak position of one point image St (the position where the intensity reaches a peak and is substantially the center of the point image St), and the formation destination of the other slit 23a ′ in the X direction is the peak of the other point image St ′. It is a position (a position where the intensity reaches a peak and is substantially the center of the point image St ′). The slit width of each of the slits 23a and 23a ′ is set to be sufficiently narrow, and the wavefront shape in the X direction of the light (mixed light composed of CARS signal and background noise) transmitted through the slit 23a and the other slit The wavefront shape in the X direction of the light transmitted through 23a '(mixed light composed of CARS signal and background noise) is an ideal spherical shape.

コリメートレンズ２４は、ダブルスリット板２３の光射出側に配置され、コリメートレンズ２４の光軸は、集光レンズ２２の光軸に一致し、コリメートレンズ２４の焦点は、集光レンズ２２の焦点に一致している。よって、コリメートレンズ２４は、ダブルスリット板２３の像を無限遠方に形成する。この場合、コリメートレンズ２４の光射出側の所定面（ダブルスリット板２３のフーリエ面）にダブルスリット板２３のフーリエ変換像が形成される。このフーリエ変換像は、例えば図６（Ａ）に模式的に示すような干渉縞Ｓｐであって、この干渉縞ＳｐのＸ軸上の強度分布は正弦波状である。 The collimator lens 24 is disposed on the light exit side of the double slit plate 23, the optical axis of the collimator lens 24 coincides with the optical axis of the condenser lens 22, and the focal point of the collimator lens 24 is the focal point of the condenser lens 22. Match. Therefore, the collimating lens 24 forms an image of the double slit plate 23 at infinity. In this case, a Fourier transform image of the double slit plate 23 is formed on a predetermined surface on the light exit side of the collimator lens 24 (Fourier plane of the double slit plate 23). The Fourier transform image is, for example, an interference fringe Sp as schematically shown in FIG. 6A, and the intensity distribution on the X axis of the interference fringe Sp is sinusoidal.

この干渉縞Ｓｐに寄与したのは、一方のスリット２３ａを通過した光と、他方のスリット２３ａ’を通過した光とである。以下、一方のスリット２３ａを通過して干渉縞Ｓｐに寄与する光を「一方の被干渉光」と称し、他方のスリット２３ａ’を通過して干渉縞Ｓｐに寄与する光を「他方の被干渉光」と称す。 What has contributed to the interference fringes Sp is light that has passed through one slit 23a and light that has passed through the other slit 23a '. Hereinafter, light that passes through one slit 23a and contributes to the interference fringes Sp is referred to as "one interfered light", and light that passes through the other slit 23a 'and contributes to the interference fringes Sp is referred to as "the other interfered light". It is called “light”.

この干渉縞Ｓｐの位相（明暗位置）は、一方の被干渉光と他方の被干渉光との間の位相差によって決まる。 The phase (light / dark position) of the interference fringes Sp is determined by the phase difference between one interfered light and the other interfered light.

ここで、培養容器１０中に観察対象分子が存在せずに培養液のみが収容されているとき（非観察時）の干渉縞Ｓｐを考える。図６（Ａ）〜（Ｃ）が、非観察時の干渉縞Ｓｐを説明する図である（但し、図６は模式図なので、干渉縞Ｓｐの実際のパターンが図６に示すとおりになるとは限らない。）。 Here, consider the interference fringes Sp when the observation target molecule is not present in the culture vessel 10 and only the culture solution is accommodated (when not observed). 6A to 6C are diagrams for explaining the interference fringes Sp at the time of non-observation (however, since FIG. 6 is a schematic diagram, the actual pattern of the interference fringes Sp is as shown in FIG. 6). Not exclusively.).

先ず、非観察時には、観察対象分子に起因するＣＡＲＳ信号は発生せず、水分子に起因するバックグラウンドノイズは発生する。 First, at the time of non-observation, the CARS signal due to the observation target molecule is not generated, and the background noise due to the water molecule is generated.

よって、非観察時の干渉縞Ｓｐに寄与する一方の被干渉光は、バックグラウンドノイズのみからなり、他方の被干渉光も、バックグラウンドノイズのみからなる。 Therefore, one interfered light that contributes to the interference fringes Sp at the time of non-observation consists only of background noise, and the other interfered light also consists only of background noise.

よって、非観察時には、これら１対の被干渉光の間では、強度はほぼ等しくなり、位相差はπとなるはずである。 Therefore, at the time of non-observation, the intensity should be approximately equal and the phase difference should be π between the pair of interfered lights.

なぜなら、培養容器１０中では水分子の密度分布はほぼ一様なので、１対の高密度スポットＳｒ、Ｓｒ’の間でも水分子の密度は等しくなり、その結果、１対のバックグラウンドノイズの間で強度は等しくなる。また、１対のレーザスポットＳ、Ｓ’の間には位相差πが付与されているので、１対のバックグラウンドノイズの位相差もπとなる。 This is because the density distribution of water molecules in the culture vessel 10 is almost uniform, so that the density of water molecules is equal between a pair of high-density spots Sr and Sr ′, and as a result, between a pair of background noises. The strength is equal. Further, since a phase difference π is given between the pair of laser spots S and S ′, the phase difference of the pair of background noises is also π.

したがって、図６（Ｂ）に示すとおり、非観察時の干渉縞Ｓｐのコントラストは十分に高くなり、非観察時の干渉縞Ｓｐの位相は所定位相（例えば光軸上に明部が位置するような位相）となる。 Therefore, as shown in FIG. 6B, the contrast of the interference fringes Sp when not observing is sufficiently high, and the phase of the interference fringes Sp when not observing is a predetermined phase (for example, a bright part is located on the optical axis). Phase).

図１に戻り、ピンホールアレイ板２５は、前述した所定面（フーリエ面）に配置される。ピンホールアレイ板２５には、図６（Ｃ）に示すとおり、干渉縞Ｓｐの縞ピッチと同じピッチで複数（例えば３以上）のピンホール２５ａがＸ軸上に配列されている。個々のピンホール２５ａの直径は、縞ピッチの１／２倍以下に設定されており、各ピンホール２５ａの形成先は、図６（Ｃ）に示すとおり、非観察時の干渉縞Ｓｐの各暗部に一致している。よって、非観察時にピンホールアレイ板２５を通過する光の光量は、ほぼゼロとなる。 Returning to FIG. 1, the pinhole array plate 25 is disposed on the predetermined plane (Fourier plane) described above. In the pinhole array plate 25, as shown in FIG. 6C, a plurality of (for example, three or more) pinholes 25a are arranged on the X axis at the same pitch as the fringe pitch of the interference fringes Sp. The diameter of each pinhole 25a is set to ½ times or less the fringe pitch, and the formation destination of each pinhole 25a is each interference fringe Sp at the time of non-observation as shown in FIG. It matches the dark part. Therefore, the amount of light passing through the pinhole array plate 25 during non-observation is substantially zero.

次に、培養容器１０に培養液と共に観察対象分子も収容されているとき（観察時）の干渉縞Ｓｐを考える。図６（Ｄ）〜（Ｆ）が、観察時の干渉縞Ｓｐを説明する図である。 Next, the interference fringes Sp when the observation target molecule is accommodated in the culture vessel 10 together with the culture solution will be considered. 6D to 6F are diagrams for explaining the interference fringes Sp at the time of observation.

先ず、観察時には、観察対象分子に起因するＣＡＲＳ信号と、水分子に起因するバックグラウンドノイズとの双方が発生する。 First, at the time of observation, both the CARS signal resulting from the observation target molecule and the background noise caused by the water molecule are generated.

よって、観察時の干渉縞Ｓｐに寄与する一方の被干渉光は、バックグラウンドノイズ及びＣＡＲＳ信号の混合光となり、他方の被干渉光も、バックグラウンドノイズ及びＣＡＲＳ信号の混合光となる。 Therefore, one interfered light that contributes to the interference fringes Sp at the time of observation becomes a mixed light of background noise and CARS signal, and the other interfered light also becomes a mixed light of background noise and CARS signal.

よって、観察時には、これら１対の被干渉光の間では、強度は等しくならない可能性があり、位相差はπからずれる可能性がある。 Therefore, during observation, the intensity may not be equal between the pair of interfered lights, and the phase difference may deviate from π.

なぜなら、培養容器１０中では観察対象分子の密度分布は非一様なので、１対の高密度スポットＳｒ、Ｓｒ’の間で観察対象分子の密度は等しいとは限らず、その結果、１対のＣＡＲＳ信号の間で強度が等しくなるとは限らない。この場合、一方の被干渉光に対して一方のＣＡＲＳ信号が与える影響（位相遅延量及び振幅変化量）と、他方の被干渉光に対してＣＡＲＳ信号が与える影響（位相遅延量及び振幅変化量）とは一致しない可能性がある。 This is because the density distribution of the observation target molecules is not uniform in the culture vessel 10, and the density of the observation target molecules is not necessarily equal between the pair of high-density spots Sr and Sr ′. Intensities are not necessarily equal between CARS signals. In this case, the influence (phase delay amount and amplitude change amount) of one CARS signal on one interfered light and the influence (phase delay amount and amplitude change amount) of a CARS signal on the other interfered light. ) May not match.

しかも、これら１対の被干渉光の間では、強度バランスの変化よりも位相差の変化の方が顕著である。 In addition, a change in phase difference is more significant than a change in intensity balance between the pair of interfered lights.

なぜなら、ＣＡＲＳ信号の強度はバックグラウンドノイズの強度と比較して低く、ＣＡＲＳ信号の位相はバックグラウンドノイズの位相よりも必ずπ／２だけずれるので、一方のＣＡＲＳ信号が一方の被干渉光に与える影響は主に位相遅延であり、他方のＣＡＲＳ信号は他方の被干渉光に対して与える影響も主に位相遅延である。このため、１対の被干渉光の間でも、強度バランスの変化よりも位相差の変化の方が顕著となる。 This is because the intensity of the CARS signal is lower than the intensity of the background noise, and the phase of the CARS signal is always shifted by π / 2 from the phase of the background noise, so that one CARS signal gives to one interfered light. The influence is mainly phase delay, and the influence of the other CARS signal on the other interfered light is also mainly phase delay. For this reason, the change in the phase difference becomes more significant than the change in the intensity balance even between the pair of interfered lights.

よって、図６（Ｄ）〜（Ｅ）に示すとおり、観察時の干渉縞Ｓｐは、大凡、非観察時の干渉縞Ｓｐ（図６（Ａ）〜（Ｆ））の位相をシフトさせたものに相当する。 Therefore, as shown in FIGS. 6D to 6E, the interference fringes Sp at the time of observation are generally obtained by shifting the phase of the interference fringes Sp at the time of non-observation (FIGS. 6A to 6F). It corresponds to.

したがって、非観察時の干渉縞Ｓｐを基準とした、観察時の干渉縞Ｓｐの位相シフト量さえ検知できれば、一方の被干渉光に対して一方のＣＡＲＳ信号が与えた影響と、他方の被干渉光に対して他方のＣＡＲＳ信号が与えた影響との差、すなわち、１対のＣＡＲＳ信号の差分（＝微分ＣＡＲＳ信号）を、既知とすることができる。 Therefore, as long as the phase shift amount of the interference fringes Sp at the time of observation can be detected with reference to the interference fringes Sp at the time of non-observation, the influence of one CARS signal on one interfered light and the other interfered The difference from the influence of the other CARS signal on the light, that is, the difference between the pair of CARS signals (= differential CARS signal) can be made known.

実際、本実施形態の顕微鏡では、複数のピンホールアレイ２５ａの形成先が前述したとおり最適化されているので、図６（Ｅ）、（Ｆ）に示すとおり、観察時にピンホールアレイ板２５を通過する光の光量は、観察時の干渉縞Ｓｐの位相シフト量を表す。 Actually, in the microscope of this embodiment, the formation destinations of the plurality of pinhole arrays 25a are optimized as described above. Therefore, as shown in FIGS. The amount of light passing through represents the amount of phase shift of the interference fringes Sp during observation.

光検出器２６は、ピンホールアレイ板２５の光射出側に配置され、ピンホールアレイ板２５を通過した光の光量を電気信号に変換する受光素子、例えばＰＭＴ（フォトマルチプライヤ）である。よって、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡は、観察時における光検出器２６の出力信号を、微分ＣＡＲＳ信号として使用することができる。 The photodetector 26 is a light receiving element, for example, a PMT (photomultiplier), which is disposed on the light emission side of the pinhole array plate 25 and converts the amount of light passing through the pinhole array plate 25 into an electric signal. Therefore, the CARS microscope of the present embodiment can use the output signal of the photodetector 26 at the time of observation as a differential CARS signal.

観察時、制御部３０は、光軸と垂直な方向（ＸＹ方向）へ試料ステージ１９を走査しながら、各走査位置において、レーザ光源１１を駆動しパルスレーザ光Ｌ１、Ｌ２を培養容器１０へ照射すると共に、検出器２６から出力信号の取り込みを行い、各走査位置で取り込まれた出力信号の値に基づき１フレームの画像を作成し、不図示のモニタへ表示する。この画像は、微分ＣＡＲＳ信号の観察対象面上の分布（微分ＣＡＲＳ画像）を表す。 At the time of observation, the control unit 30 drives the laser light source 11 at each scanning position while scanning the sample stage 19 in the direction (XY direction) perpendicular to the optical axis to irradiate the culture vessel 10 with the pulsed laser beams L1 and L2. At the same time, the output signal is captured from the detector 26, an image of one frame is created based on the value of the output signal captured at each scanning position, and displayed on a monitor (not shown). This image represents the distribution (differential CARS image) of the differential CARS signal on the observation target surface.

以上、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡では、観察対象面上のレーザスポットを１対のレーザスポットＳ、Ｓ’に分離し、それら１対のレーザスポットＳ、Ｓ７の中央（１対の高密度スポットＳｒ、Ｓｒ’）からＣＡＲＳ信号と同じ波長で射出する１対の光（１対の混合光）の間の位相ズレに応じて信号を生成する。 As described above, in the CARS microscope of the present embodiment, the laser spot on the observation target surface is separated into a pair of laser spots S and S ′, and the center of the pair of laser spots S and S7 (a pair of high-density spots Sr). , Sr ′) generates a signal according to a phase shift between a pair of lights (a pair of mixed lights) emitted at the same wavelength as the CARS signal.

したがって、非観察時（バックグラウンドノイズしか発生しないとき）の信号強度を基準とすれば、観察時（バックグラウンドノイズとＣＡＲＳ信号とが共に発生するとき）の信号強度を、微分ＣＡＲＳ信号として使用することができる。この微分ＣＡＲＳ信号は、バックグラウンドノイズの影響を受けないので、ＳＮ比が高い。よって、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡が取得する微分ＣＡＲＳ画像は、バックグラウンドノイズが少なくコントラストの高い画像となる。 Therefore, based on the signal intensity at the time of non-observation (when only background noise is generated), the signal intensity at the time of observation (when both background noise and CARS signal are generated) is used as a differential CARS signal. be able to. Since this differential CARS signal is not affected by the background noise, the SN ratio is high. Therefore, the differential CARS image acquired by the CARS microscope of the present embodiment is an image with low background noise and high contrast.

また、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡では、１対の被干渉光の間の位相ズレを信号化するために、１対の点像Ｓｔ、Ｓｔ’から１対の理想的球面波を生成し、それら１対の理想的球面波による干渉縞Ｓｐの位相をピンホールアレイ板２５により検出している。この場合、１対の被干渉光の間の位相ズレを、光検出器２６の出力信号に対して強く反映させることができるので、微分ＣＡＲＳ信号のＳＮ比は更に高まる。 In addition, in the CARS microscope of the present embodiment, in order to signal the phase shift between a pair of interfered lights, a pair of ideal spherical waves is generated from a pair of point images St and St ′, The pinhole array plate 25 detects the phase of the interference fringes Sp caused by a pair of ideal spherical waves. In this case, the phase shift between the pair of interfered lights can be strongly reflected on the output signal of the photodetector 26, so that the SN ratio of the differential CARS signal is further increased.

また、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡では、レーザスポットを分離するために空間光位相変調素子を使用するので、１対のレーザスポットＳ１、Ｓ１’の間で偏光方向が一致し、１対のレーザスポットＳ２、Ｓ２’の間で偏光方向が一致し、その結果、１対のレーザスポットＳ、Ｓ’各々による分子の励起方向を等しくすることができる。よって、前述した微分ＣＡＲＳ信号には、１対の高密度スポットＳｒ、Ｓｒ’の間における観察対象分子の密度差が正確に反映される。 In the CARS microscope of the present embodiment, since the spatial light phase modulation element is used to separate the laser spots, the polarization directions coincide between the pair of laser spots S1 and S1 ′, and the pair of laser spots. The polarization directions coincide between S2 and S2 ′, and as a result, the excitation directions of the molecules by each of the pair of laser spots S and S ′ can be made equal. Therefore, the differential CARS signal described above accurately reflects the density difference of the molecules to be observed between the pair of high-density spots Sr and Sr ′.

なお、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡では、空間光位相変調素子１６１、１６２の各々として、光路長分布が可変の空間光位相変調素子を使用したが、空間光位相変調素子１６１、１６２の少なくとも一方として、光路長分布が不変の空間光位相変調素子（いわゆる位相板）を使用してもよい。但し、光路長分布が不変の空間光位相変調素子を使用する場合、入射光の波長が変更されるときには、その空間光位相変調素子を、光路長分布の異なる他の空間光位相変調素子に交換する必要がある。 In the CARS microscope of the present embodiment, a spatial light phase modulation element with a variable optical path length distribution is used as each of the spatial light phase modulation elements 161 and 162, but as at least one of the spatial light phase modulation elements 161 and 162. Alternatively, a spatial light phase modulation element (so-called phase plate) having an invariable optical path length distribution may be used. However, when using a spatial light phase modulation element whose optical path length distribution is unchanged, when the wavelength of the incident light is changed, the spatial light phase modulation element is replaced with another spatial light phase modulation element with a different optical path length distribution. There is a need to.

また、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡では、点像Ｓｔ、Ｓｔ’の形成面に配置される絞り部材としてダブルスリット板２３を使用したが、ダブルスリット板２３の代わりに、１対のピンホールを有したダブルピンホール板を使用してもよい。このダブルピンホール板における１対のピンホールの形成先は、点像Ｓｔ、Ｓｔ’の各々のピーク位置であり、１対のピンホールの各々の直径は、ピンホールを透過した光の波面形状が理想的球面状となるよう十分に小さく設定される。 In the CARS microscope according to the present embodiment, the double slit plate 23 is used as a diaphragm member disposed on the formation surface of the point images St and St ′. However, instead of the double slit plate 23, a pair of pinholes is provided. A double pinhole plate may be used. In this double pinhole plate, a pair of pinholes is formed at the peak positions of the point images St and St ′, and the diameter of each of the pair of pinholes is determined by the wavefront shape of the light transmitted through the pinhole. It is set sufficiently small so as to have an ideal spherical shape.

また、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡では、複数のピンホール２５ａの形成先を、非観察時の干渉縞Ｓｐの各暗部に一致させたが、非観察時の干渉縞Ｓｐの各明部に一致させてもよい。因みに、複数のピンホール２５ａの形成先を非観察時の干渉縞Ｓｐの各暗部に一致させた場合、微分ＣＡＲＳ画像は暗視野画像（暗い背景の上に微分ＣＡＲＳ像が明るく写る画像）となるが、複数のピンホール２５ａの形成先を非観察時の干渉縞の各明部に一致させた場合、微分ＣＡＲＳ画像は明視野画像（明るい背景の上に微分ＣＡＲＳ像が暗く写る画像）となる。 Further, in the CARS microscope of the present embodiment, the formation destinations of the plurality of pinholes 25a are made to coincide with the dark portions of the interference fringes Sp at the time of non-observation, but are made to coincide with the light portions of the interference fringes Sp at the time of non-observation. May be. Incidentally, when the formation destinations of the plurality of pinholes 25a are made to coincide with the dark portions of the interference fringes Sp at the time of non-observation, the differential CARS image becomes a dark field image (an image in which the differential CARS image appears brightly on a dark background). However, when the formation destinations of the plurality of pinholes 25a are made to coincide with the bright portions of the interference fringes at the time of non-observation, the differential CARS image becomes a bright field image (an image in which the differential CARS image appears dark on a bright background). .

また、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡では、干渉縞Ｓｐの形成面に配置される絞り部材としてピンホールアレイ板２５を使用したが、ピンホールアレイ板２５の代わりに、Ｙ方向に延びる複数のスリットをＸ方向に配列したスリットアレイ板を使用してもよい。このスリットアレイ板における複数のスリットの形成先は、非観察時の干渉縞Ｓｐの各暗部又は各明部に設定される。 In the CARS microscope of the present embodiment, the pinhole array plate 25 is used as a diaphragm member arranged on the formation surface of the interference fringes Sp. Instead of the pinhole array plate 25, a plurality of slits extending in the Y direction are used. A slit array plate arranged in the X direction may be used. The formation destination of the plurality of slits in the slit array plate is set in each dark part or each bright part of the interference fringes Sp at the time of non-observation.

また、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡では、観察時の干渉縞Ｓｐの基準（非観察時の干渉縞Ｓｐ）として、培養容器１０中に観察対象分子が存在しない場合に形成される干渉縞Ｓｐを使用したが、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡で基準として使用すべき干渉縞は、少なくとも、高密度スポットＳｒ、Ｓｒ’の間で観察対象分子の密度が等しいときに形成される干渉縞であればよい。すなわち、培養容器１０内で観察対象分子の密度が一様である場合に形成される干渉縞や、観察対象分子の密度がゼロ又は一様である領域にビームスポットＳ、Ｓ’を配置したときに形成される干渉縞を、基準として使用してもよい。 In the CARS microscope of the present embodiment, the interference fringes Sp formed when the observation target molecule is not present in the culture vessel 10 are used as the reference of the interference fringes Sp at the time of observation (interference fringes Sp at the time of non-observation). However, the interference fringes to be used as a reference in the CARS microscope of the present embodiment may be interference fringes formed at least when the density of the observation target molecules is equal between the high-density spots Sr and Sr ′. That is, when the beam spots S and S ′ are arranged in the interference fringes formed when the density of the observation target molecules is uniform in the culture vessel 10 or in the region where the density of the observation target molecules is zero or uniform. The interference fringes formed in the above may be used as a reference.

［第２実施形態］
以下、本発明の第２実施形態を説明する。本実施形態は、第１実施形態の変形例である。ここでは、第１実施形態との相違点のみを説明する。 [Second Embodiment]
Hereinafter, a second embodiment of the present invention will be described. This embodiment is a modification of the first embodiment. Here, only differences from the first embodiment will be described.

図７は、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡の構成図である。図７において、図１に示したものと同じ要素には、図１における符号と同じ符号を付与した。図１、図７を比較すると明らかなとおり、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡は、第１実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡において、ダブルスリット板２３の代わりにピンホール板２２５を配置し、コリメートレンズ２４及びピンホールアレイ板２５を省略したものである。 FIG. 7 is a configuration diagram of the CARS microscope according to the present embodiment. 7, the same elements as those shown in FIG. 1 are given the same reference numerals as those in FIG. As apparent from comparison between FIGS. 1 and 7, the CARS microscope of the present embodiment is the same as the CARS microscope of the first embodiment except that a pinhole plate 225 is disposed instead of the double slit plate 23, and the collimating lens 24 and the pinhole are arranged. The array plate 25 is omitted.

ピンホール板２２５の配置先は、ダブルスリット板２３の配置先と同様、１対の点像Ｓｔ、Ｓｔ’の形成面である。ピンホール板２２５には、図８に示すとおり、単一のピンホール２２５ａが形成されており、ピンホール２２５ａの形成先は、一方の点像Ｓｔと他方の点像Ｓｔ’との間のバレー位置（強度がバレーとなる位置であって、点像Ｓｔ、Ｓｔ’の中間点）である。また、ピンホール２２５ａの直径は、点像Ｓｔ、Ｓｔ’の横ズレ量以下に設定されている。 The placement destination of the pinhole plate 225 is the formation surface of the pair of point images St and St ′, like the placement location of the double slit plate 23. As shown in FIG. 8, a single pinhole 225a is formed on the pinhole plate 225, and the formation destination of the pinhole 225a is a valley between one point image St and the other point image St ′. It is a position (a position where the intensity is a valley and is an intermediate point between the point images St and St ′). The diameter of the pinhole 225a is set to be equal to or less than the lateral shift amount of the point images St and St '.

ここで、培養容器１０中に観察対象分子が存在せずに培養液のみが収容されているとき（非観察時）の点像Ｓｔ、Ｓｔ’を考える。図９（Ａ）が、被観察時の点像Ｓｔ、Ｓｔ’を説明する図である（但し、図９は模式図なので、点像Ｓｔ、Ｓｔ’の強度分布が図９に示すとおりになるとは限らない。）。 Here, point images St and St 'when the culture vessel 10 contains no observation target molecule and only the culture solution is accommodated (when not observed) are considered. FIG. 9A is a diagram for explaining point images St and St ′ at the time of observation (however, since FIG. 9 is a schematic diagram, the intensity distribution of the point images St and St ′ is as shown in FIG. 9). Is not limited.)

よって、非観察時の一方の点像Ｓｔに寄与する光（一方の結像光）は、バックグラウンドノイズのみからなり、他方の点像Ｓｔ’に寄与する光（他方の結像光）も、バックグラウンドノイズのみからなる。 Therefore, the light that contributes to one point image St at the time of non-observation (one imaging light) consists only of background noise, and the light that contributes to the other point image St ′ (the other imaging light) is also Consists of background noise only.

よって、非観察時には、これら１対の結像光の間では、強度はほぼ等しくなり、位相差はπとなるはずである。 Therefore, at the time of non-observation, the intensity should be substantially equal between the pair of imaging lights and the phase difference should be π.

なぜなら、培養容器１０中では水分子の密度分布はほぼ一様なので、１対の高密度スポットＳｒ、Ｓｒ’の間で水分子の密度は等しくなり、その結果、１対のバックグラウンドノイズの間で強度は等しくなる。また、１対のレーザスポットＳ、Ｓ’の間には位相差πが付与されているので、１対のバックグラウンドノイズの位相差もπとなる。 Because the density distribution of water molecules is almost uniform in the culture vessel 10, the density of water molecules is equal between the pair of high-density spots Sr and Sr ′, and as a result, between the pair of background noises. The strength is equal. Further, since a phase difference π is given between the pair of laser spots S and S ′, the phase difference of the pair of background noises is also π.

したがって、図９（Ａ）に示すとおり、非観察時の点像Ｓｔ、Ｓｔ’の各々のピーク強度は十分に高くなり、非観察時の点像Ｓｔ、Ｓｔのバレー強度はほぼゼロとなる（点像Ｓｔ、Ｓｔ’のピーク強度もほぼ等しくなる。）。 Therefore, as shown in FIG. 9A, the peak intensity of each of the point images St and St ′ when not observed is sufficiently high, and the valley intensity of the point images St and St when not observed is substantially zero ( The peak intensities of the point images St and St ′ are also substantially equal.)

したがって、ピンホール２２５ａの配置先を前述したとおり最適化しておけば、非観察時にピンホール板２２５を通過する光の光量は、ほぼゼロとなる。 Therefore, if the placement destination of the pinhole 225a is optimized as described above, the amount of light passing through the pinhole plate 225 during non-observation is substantially zero.

次に、培養容器１０に培養液と共に観察対象分子も収容されているとき（観察時）の点像Ｓｔ、Ｓｔ’を考える。図９（Ｂ）が、観察時の点像Ｓｔ、Ｓｔ’を説明する図である。 Next, point images St and St 'when the observation target molecule is accommodated in the culture vessel 10 together with the culture solution are considered. FIG. 9B illustrates the point images St and St ′ at the time of observation.

よって、観察時の点像Ｓｔ、Ｓｔ’に寄与する一方の結像光は、バックグラウンドノイズ及びＣＡＲＳ信号の混合光となり、他方の結像光も、バックグラウンドノイズ及びＣＡＲＳ信号の混合光となる。 Therefore, one image forming light contributing to the point images St and St ′ at the time of observation becomes a mixed light of background noise and CARS signal, and the other image forming light also becomes a mixed light of background noise and CARS signal. .

よって、観察時には、これら１対の結像光の間では、強度は等しくならない可能性があり、位相差はπからずれる可能性がある。 Therefore, at the time of observation, the intensity may not be equal between the pair of imaging lights, and the phase difference may deviate from π.

なぜなら、培養容器１０中では観察対象分子の密度分布は非一様なので、１対の高密度スポットＳｒ、Ｓｒ’の間で観察対象分子の密度は等しいとは限らず、その結果、１対のＣＡＲＳ信号の間で強度が等しくなるとは限らない。この場合、一方の結像光に対して一方のＣＡＲＳ信号が与える影響（位相遅延量及び振幅変化量）と、他方の結像光に対して他方のＣＡＲＳ信号が与える影響（位相遅延量及び振幅変化量）とは一致しない可能性がある。 This is because the density distribution of the observation target molecules is not uniform in the culture vessel 10, and the density of the observation target molecules is not necessarily equal between the pair of high-density spots Sr and Sr ′. Intensities are not necessarily equal between CARS signals. In this case, the influence (phase delay amount and amplitude change amount) of one CARS signal on one imaging light and the influence (phase delay amount and amplitude) of the other CARS signal on the other imaging light. Change amount).

しかも、これら１対の結像光の間では、強度バランスの変化よりも位相差の変化の方が顕著である。 In addition, a change in phase difference is more significant than a change in intensity balance between the pair of imaging lights.

なぜなら、ＣＡＲＳ信号の強度はバックグラウンドノイズの強度と比較して低く、ＣＡＲＳ信号の位相はバックグラウンドノイズの位相よりも必ずπ／２だけずれるので、一方のＣＡＲＳ信号が結像光に対して与える影響は主に位相遅延であり、他方のＣＡＲＳ信号が他方の結像光に対して与える影響も主に位相遅延である。このため、１対の結像光の間でも、強度バランスの変化よりも位相差の変化の方が顕著となる。 This is because the intensity of the CARS signal is lower than the intensity of the background noise, and the phase of the CARS signal is always shifted by π / 2 from the phase of the background noise, so that one CARS signal gives to the imaging light. The influence is mainly phase delay, and the influence of the other CARS signal on the other imaging light is also mainly phase delay. For this reason, even in a pair of imaging light, the change in phase difference becomes more significant than the change in intensity balance.

よって、図９（Ｂ）に示すとおり、観察時の点像Ｓｔ、Ｓｔ’は、大凡、非観察時の点像Ｓｔ、Ｓｔ’（図９（Ａ））のコントラスト（ピーク強度とバレー強度の差）を低下させたものに相当する。 Therefore, as shown in FIG. 9B, the point images St and St ′ at the time of observation are roughly the contrast (peak intensity and valley intensity of the point images St and St ′ at the time of non-observation (FIG. 9A)). This is equivalent to a reduction in the difference.

したがって、非観察時の点像Ｓｔ、Ｓｔ’を基準とした、観察時の点像Ｓｔ、Ｓｔ’ のコントラスト低下量さえ検知できれば、一方の結像光に対してＣＡＲＳ信号が与えた影響と、他方の結像光に対してＣＡＲＳ信号が与えた影響との差、すなわち、１対のＣＡＲＳ信号の差分（＝微分ＣＡＲＳ信号）を、既知とすることができる。 Therefore, as long as the amount of contrast reduction of the point images St and St ′ at the time of observation with reference to the point images St and St ′ at the time of non-observation can be detected, the influence of the CARS signal on one of the imaging lights, The difference from the influence of the CARS signal on the other imaging light, that is, the difference between the pair of CARS signals (= differential CARS signal) can be made known.

実際、本実施形態の顕微鏡では、ピンホール２２５ａの形成先が前述したとおり最適化されているので、図９（Ｂ）に示すとおり、観察時にピンホール板２２５を通過する光の光量は、観察時の点像Ｓｔ、Ｓｔ’のコントラスト低下量を表す。 Actually, in the microscope of the present embodiment, the formation destination of the pinhole 225a is optimized as described above. Therefore, as shown in FIG. 9B, the amount of light passing through the pinhole plate 225 at the time of observation is This represents the contrast reduction amount of the point images St and St ′ at the time.

光検出器２６は、ピンホール板２２５の光射出側に配置され、ピンホール板２２５を通過した光の光量を電気信号に変換する。よって、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡は、観察時における光検出器２６の出力信号を、微分ＣＡＲＳ信号として使用することができる。 The photodetector 26 is disposed on the light emission side of the pinhole plate 225 and converts the amount of light that has passed through the pinhole plate 225 into an electrical signal. Therefore, the CARS microscope of the present embodiment can use the output signal of the photodetector 26 at the time of observation as a differential CARS signal.

したがって、本実施形態の制御部３０は、第１実施形態の制御部３０と同様に各部を制御することにより、微分ＣＡＲＳ画像を取得することができる。 Therefore, the control part 30 of this embodiment can acquire a differential CARS image by controlling each part similarly to the control part 30 of 1st Embodiment.

以上、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡では、１対の結像光の間の位相ズレを信号化するために、１対の点像Ｓｔ、Ｓｔ’のコントラスト（ここでは１対の点像Ｓｔ、Ｓｔ’のバレー強度）をピンホール板２２５により検出している。この場合、微分ＣＡＲＳ信号の感度は、第１実施形態のそれほどは高くないものの、微分ＣＡＲＳ信号の生成に要する光学素子の点数が第１実施形態のそれよりも抑えられるという利点がある。 As described above, in the CARS microscope of the present embodiment, in order to signal the phase shift between the pair of imaging lights, the contrast between the pair of point images St and St ′ (here, the pair of point images St and St 'Valley intensity) is detected by the pinhole plate 225. In this case, although the sensitivity of the differential CARS signal is not so high as that of the first embodiment, there is an advantage that the number of optical elements required for generating the differential CARS signal is suppressed as compared with that of the first embodiment.

なお、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡では、点像Ｓｔ、Ｓｔ’の形成面に配置される絞り部材としてピンホール板を使用したが、ピンホール板の代わりに、Ｙ方向に延びるスリットを有したスリット板を使用してもよい。このスリット板におけるスリットの形成先は、点像Ｓｔ、Ｓｔ’のバレー位置である。 In the CARS microscope of the present embodiment, a pinhole plate is used as a diaphragm member disposed on the formation surface of the point images St and St ′. However, instead of the pinhole plate, a slit having a slit extending in the Y direction. A plate may be used. A slit is formed on the slit plate at a valley position of the point images St and St ′.

［第３実施形態］
以下、本発明の第３実施形態を説明する。本実施形態は、第１実施形態の変形例である。ここでは、第１実施形態との相違点のみを説明する。 [Third Embodiment]
The third embodiment of the present invention will be described below. This embodiment is a modification of the first embodiment. Here, only differences from the first embodiment will be described.

図１０は、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡の構成図である。図１０において、図１に示したものと同じ要素には、図１における符号と同じ符号を付与した。図１、図１０を比較すると明らかなとおり、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡は、第１実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡において、第１対物レンズ１８及び第２対物レンズ２０の代わりに１つの対物レンズ２００を備え、光スキャナ３１９、ダイクロイックミラー２１０、リレー光学系３１を備え、波長選択フィルタ２１を省略したものである。なお、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡の照明方式は、落射照明方式であり、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡の走査方式は、光走査型である。 FIG. 10 is a configuration diagram of the CARS microscope according to the present embodiment. 10, the same elements as those shown in FIG. 1 are given the same reference numerals as those in FIG. As is clear from comparison between FIGS. 1 and 10, the CARS microscope according to the present embodiment includes one objective lens 200 instead of the first objective lens 18 and the second objective lens 20 in the CARS microscope according to the first embodiment. The optical scanner 319, the dichroic mirror 210, and the relay optical system 31 are provided, and the wavelength selection filter 21 is omitted. The illumination method of the CARS microscope of the present embodiment is an epi-illumination method, and the scanning method of the CARS microscope of the present embodiment is an optical scanning type.

図１０において、ダイクロイックミラー１７には、第１実施形態と同様のパルスレーザ光Ｌ１、Ｌ２が到達する。これらのパルスレーザ光Ｌ１、Ｌ２は、ダイクロイックミラー２１０を透過し、光スキャナ３１９へ入射する。なお、光スキャナ３１９は、Ｘスキャン用のガルバノメータとＹスキャン用のガルバノメータとを有している。 In FIG. 10, the same pulse laser beams L1 and L2 as in the first embodiment reach the dichroic mirror 17. These pulse laser beams L 1 and L 2 pass through the dichroic mirror 210 and enter the optical scanner 319. The optical scanner 319 includes an X-scan galvanometer and a Y-scan galvanometer.

光スキャナ３１９を射出したパルスレーザ光Ｌ１、Ｌ２は、リレー光学系３１を介して対物レンズ２００へ入射する。なお、対物レンズ２００は、第１実施形態の第１対物レンズ１８の機能と第２対物レンズ２０の機能とを兼ねる。また、リレー光学系３１には、光スキャナ３１９の配置先を対物レンズ２００の瞳面と共役に結ぶ働きがある。 The pulse laser beams L1 and L2 emitted from the optical scanner 319 enter the objective lens 200 via the relay optical system 31. The objective lens 200 has both the function of the first objective lens 18 of the first embodiment and the function of the second objective lens 20. Further, the relay optical system 31 has a function of connecting the optical scanner 319 to the pupil plane of the objective lens 200 in a conjugate manner.

対物レンズ２００へ入射したパルスレーザ光Ｌ１、Ｌ２は、対物レンズ２００の焦点面（観察対象面）上に第１実施形態と同様のレーザスポットＳ、Ｓ’を形成する。前述した光スキャナ３１９が駆動されると、観察対象面上をレーザスポットＳ、Ｓ’が二次元走査する。但し、その走査範囲は、対物レンズ２００の視野内に収められる。 The pulse laser beams L1 and L2 incident on the objective lens 200 form laser spots S and S ′ similar to those in the first embodiment on the focal plane (observation target plane) of the objective lens 200. When the optical scanner 319 described above is driven, the laser spots S and S ′ scan two-dimensionally on the surface to be observed. However, the scanning range is within the field of view of the objective lens 200.

レーザスポットＳ、Ｓ’から射出する光（ＣＡＲＳ信号、バックグラウンドノイズ、第２の光、パルスレーザ光Ｌ１、Ｌ２）は、レーザスポットＳ、Ｓ’を形成したレーザ光Ｌ１、Ｌ２と同じ光路を逆に辿り、対物レンズ２００及び光スキャナ３１９を介してダイクロイックミラー２１０へ入射する。 Lights emitted from the laser spots S and S ′ (CARS signal, background noise, second light, and pulsed laser lights L1 and L2) have the same optical path as the laser beams L1 and L2 that form the laser spots S and S ′. On the contrary, the light enters the dichroic mirror 210 via the objective lens 200 and the optical scanner 319.

ダイクロイックミラー２１０の特性は、ＣＡＲＳ信号と同じ光周波数の光を反射し、他の光周波数の光を反射する特性に設定されている。よって、光スキャナ３１９からダイクロイックミラー２１０へ入射したＣＡＲＳ信号及びバックグラウンドノイズはダイクロイックミラー２１０を反射し、それ以外の光はダイクロイックミラー２１０を透過する。 The characteristic of the dichroic mirror 210 is set to a characteristic that reflects light having the same optical frequency as that of the CARS signal and reflects light having another optical frequency. Therefore, the CARS signal and background noise incident on the dichroic mirror 210 from the optical scanner 319 reflect the dichroic mirror 210, and other light passes through the dichroic mirror 210.

ダイクロイックミラー２１０を反射した光（ＣＡＲＳ信号及びバックグラウンドノイズ）は、集光レンズ２２、ダブルスリット板２３、コリメートレンズ２４、ピンホールアレイ板２５を介して光検出器２６へ入射する。なお、集光レンズ２２から光検出器２６までの構成は、第１実施形態のそれと同じである。 The light (CARS signal and background noise) reflected from the dichroic mirror 210 is incident on the photodetector 26 through the condenser lens 22, the double slit plate 23, the collimator lens 24, and the pinhole array plate 25. In addition, the structure from the condensing lens 22 to the photodetector 26 is the same as that of 1st Embodiment.

よって、本実施形態の制御部３０は、試料ステージ１９を走査する代わりに光スキャナ３１９を駆動するだけで、観察対象面をレーザスポットＳ、Ｓ’で二次元走査することができる。したがって、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡も、第１実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡と同様の効果を得ることができる。 Therefore, the control unit 30 of the present embodiment can scan the observation target surface two-dimensionally with the laser spots S and S ′ only by driving the optical scanner 319 instead of scanning the sample stage 19. Therefore, the CARS microscope of this embodiment can also obtain the same effect as the CARS microscope of the first embodiment.

［その他］
なお、第３実施形態は、第１実施形態の変形例であるが、第２実施形態を同様に変形してもよい。 [Others]
The third embodiment is a modification of the first embodiment, but the second embodiment may be similarly modified.

また、上述した何れかの実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡では、空間光位相変調の対象（スポットの分離対象）を、２種類のパルスレーザ光Ｌ１、Ｌ２の双方としたが、一方のみとしてもよい。 In the CARS microscope according to any one of the embodiments described above, the spatial light phase modulation target (spot separation target) is both the two types of pulsed laser beams L1 and L2, but only one of them may be used.

また、上述した何れかの実施形態の非線形顕微鏡は、非線形過程としてＣＡＲＳ過程を利用したが、他の非線形過程を利用してもよい。他の非線形過程とは、例えば、二光子蛍光、第２高調波（ＳＨＧ）、第３高調波（ＴＨＧ）、コヒーレントストークスラマン散乱（ＣＳＲＳ）、４波混合、和周波発生などである。 Moreover, although the nonlinear microscope of any one of the above-described embodiments uses the CARS process as the nonlinear process, other nonlinear processes may be used. Other nonlinear processes include, for example, two-photon fluorescence, second harmonic (SHG), third harmonic (THG), coherent Stokes Raman scattering (CSRS), four-wave mixing, and sum frequency generation.

１１…レーザ光源、１２…光パラメトリック発振器、１３…ビームエキスパンダ、１４…ダイクロイックミラー、１５１、１５２…全反射ミラー、１６１、１６２…空間光位相変調素子、１７…ダイクロイックミラー、１８…第１対物レンズ、１９…透過型の試料ステージ１９、２０…第２対物レンズ、２１…波長選択フィルタ、２２…集光レンズ、２３…ダブルスリット板、２４…コリメートレンズ、２５…ピンホールアレイ板、２６…光検出器、３０…制御部 DESCRIPTION OF SYMBOLS 11 ... Laser light source, 12 ... Optical parametric oscillator, 13 ... Beam expander, 14 ... Dichroic mirror, 151, 152 ... Total reflection mirror, 161, 162 ... Spatial light phase modulation element, 17 ... Dichroic mirror, 18 ... First objective Lens ... 19 Transmission type sample stage 19, 20 Second objective lens, 21 Wavelength selection filter, 22 Condensing lens, 23 Double slit plate, 24 Collimator lens, 25 Pinhole array plate, 26 Photodetector, 30 ... control unit

Claims

観察対象物中の特定種類の分子に非線形光学過程による特定波長の光を生起させるためのレーザ光を生成する生成手段と、
前記生成手段が生成した前記レーザ光を集光して前記観察対象物の観察対象面上にレーザスポットを形成する集光手段と、
前記観察対象面上に形成される前記レーザスポットを、面内位置のずれた１対のレーザスポットに分離する分離手段と、
前記１対のレーザスポットの一方で生起した前記特定波長の光と他方で生起した前記特定波長の光との間の位相ズレを示す信号を生成する検出手段と、
前記１対のレーザスポットで前記観察対象面上を走査しながら前記検出手段が生成する信号を繰り返し取り込むことにより、前記観察対象面における前記信号の分布を計測する制御手段と、
を備えることを特徴とする非線形顕微鏡。 Generating means for generating laser light for generating light of a specific wavelength by a nonlinear optical process in a specific type of molecule in the observation object;
Condensing means for condensing the laser light generated by the generating means to form a laser spot on the observation target surface of the observation object;
Separating means for separating the laser spot formed on the observation target surface into a pair of laser spots whose in-plane positions are shifted;
Detecting means for generating a signal indicating a phase shift between the light of the specific wavelength generated in one of the pair of laser spots and the light of the specific wavelength generated in the other;
Control means for measuring the distribution of the signal on the observation target surface by repeatedly taking in the signal generated by the detection means while scanning the observation target surface with the pair of laser spots;
A non-linear microscope comprising:

請求項１に記載の非線形顕微鏡において、
前記検出手段は、
前記１対のレーザスポットで発生した前記特定波長の光により前記１対のレーザスポットの像である１対の点像を形成する形成する結像光学系と、
前記１対の点像の形成面に配置され、前記１対の点像の各々から理想的球面波を生成する第１絞り部材と、
前記第１絞り部材が生成した１対の理想的球面波が成す干渉縞の形成面に配置され、前記干渉縞の縞周期と同じ周期で複数の開口部を配列した第２絞り部材と、
前記第２絞り部材を通過した前記特定波長の光の光量を検出する光検出器と
を備えることを特徴とする非線形顕微鏡。 The nonlinear microscope according to claim 1,
The detection means includes
An imaging optical system for forming a pair of point images, which are images of the pair of laser spots, by the light of the specific wavelength generated in the pair of laser spots;
A first diaphragm member that is disposed on a surface on which the pair of point images are formed and generates an ideal spherical wave from each of the pair of point images;
A second diaphragm member arranged on the formation surface of interference fringes formed by a pair of ideal spherical waves generated by the first diaphragm member, and having a plurality of openings arranged at the same period as the fringe period of the interference fringes;
A non-linear microscope, comprising: a photodetector that detects a light amount of the light having the specific wavelength that has passed through the second diaphragm member.

請求項１に記載の非線形顕微鏡において、
前記検出手段は、
前記１対のレーザスポットで発生した前記特定波長の光により前記１対のレーザスポットの像である１対の点像を形成する結像光学系と、
前記１対の点像の形成面に配置され、前記１対の点像のバレー位置に開口部を配置した絞り部材と、
前記絞り部材を通過した前記特定波長の光の光量を検出する光検出器と
を備えることを特徴とする非線形顕微鏡。 The nonlinear microscope according to claim 1,
The detection means includes
An imaging optical system that forms a pair of point images, which are images of the pair of laser spots, by the light of the specific wavelength generated in the pair of laser spots;
A diaphragm member disposed on a surface where the pair of point images are formed and having an opening disposed at a valley position of the pair of point images;
A non-linear microscope, comprising: a photodetector that detects a light amount of the light having the specific wavelength that has passed through the diaphragm member.

請求項１〜請求項３の何れか一項に記載の非線形顕微鏡において、
前記分離手段は、
前記観察対象面に向かう前記レーザ光の波面を空間的に分割し、分割波面の一方及び他方の間に位相差πを付与する空間光位相変調素子である
ことを特徴とする非線形顕微鏡。 In the nonlinear microscope according to any one of claims 1 to 3,
The separating means includes
A nonlinear microscope characterized by being a spatial light phase modulation element that spatially divides a wavefront of the laser light toward the observation target surface and gives a phase difference π between one and the other of the divided wavefronts.

請求項１〜請求項４の何れか一項に記載の非線形顕微鏡において、
前記レーザ光には、波長の異なる２種類のレーザ光が含まれ、
前記２種類のレーザ光の波長の組み合わせは、前記観察対象物に含まれる特定種類の分子にコヒーレントアンチストークスラマン散乱光学過程を生起させるための組み合わせに設定される
ことを特徴とする非線形顕微鏡。 In the nonlinear microscope according to any one of claims 1 to 4,
The laser beam includes two types of laser beams having different wavelengths,
The combination of the two types of wavelengths of the laser light is set to a combination for causing a coherent anti-Stokes Raman scattering optical process to occur in a specific type of molecule included in the observation object.

観察対象物中の特定種類の分子に非線形光学過程による特定波長の光を生起させるためのレーザ光を生成する生成手順と、
前記生成手順で生成された前記レーザ光を集光して前記観察対象物の観察対象面上にレーザスポットを形成する集光手順と、
前記観察対象面上に形成される前記レーザスポットを、面内位置のずれた１対のレーザスポットに分離する分離手順と、
前記１対のレーザスポットの一方で生起した前記特定波長の光と他方で生起した前記特定種類の光との間の位相ズレを示す信号を生成する検出手順と、
前記１対のレーザスポットで前記観察対象面上を走査しながら前記検出手順で生成される信号を繰り返し取り込むことにより、前記観察対象面における前記信号の分布を計測する制御手順と、
を含むことを特徴とする非線形観察方法。
A generation procedure for generating laser light for generating light of a specific wavelength by a nonlinear optical process in a specific type of molecule in the observation object,
A condensing procedure for condensing the laser light generated in the generating procedure to form a laser spot on the observation target surface of the observation target;
A separation procedure for separating the laser spot formed on the observation target surface into a pair of laser spots whose in-plane positions are shifted;
A detection procedure for generating a signal indicating a phase shift between the light of the specific wavelength generated in one of the pair of laser spots and the specific type of light generated in the other;
A control procedure for measuring the distribution of the signal on the observation target surface by repeatedly capturing the signal generated by the detection procedure while scanning the observation target surface with the pair of laser spots;
A non-linear observation method comprising: