JP5519506B2 - Imaging method using particle probe and use thereof - Google Patents
Imaging method using particle probe and use thereof Download PDFInfo
- Publication number
- JP5519506B2 JP5519506B2 JP2010523769A JP2010523769A JP5519506B2 JP 5519506 B2 JP5519506 B2 JP 5519506B2 JP 2010523769 A JP2010523769 A JP 2010523769A JP 2010523769 A JP2010523769 A JP 2010523769A JP 5519506 B2 JP5519506 B2 JP 5519506B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- probe
- particle
- particle probe
- sample
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims description 407
- 239000002245 particle Substances 0.000 title claims description 277
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 title claims description 29
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 227
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 164
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 158
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 158
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 132
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 91
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 85
- 238000004416 surface enhanced Raman spectroscopy Methods 0.000 claims description 79
- 238000001069 Raman spectroscopy Methods 0.000 claims description 72
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 51
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 46
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 239000002923 metal particle Substances 0.000 claims description 15
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 claims description 13
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 claims description 11
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 239000004332 silver Substances 0.000 claims description 11
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 10
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 claims description 10
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 claims description 4
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000000956 alloy Substances 0.000 claims description 3
- 229910045601 alloy Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000010949 copper Substances 0.000 claims description 3
- 229910052741 iridium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- GKOZUEZYRPOHIO-UHFFFAOYSA-N iridium atom Chemical compound [Ir] GKOZUEZYRPOHIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 claims description 3
- WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N tungsten Chemical compound [W] WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000010937 tungsten Substances 0.000 claims description 3
- 239000011236 particulate material Substances 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 198
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 47
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 34
- 238000001237 Raman spectrum Methods 0.000 description 18
- 239000002082 metal nanoparticle Substances 0.000 description 17
- 238000000479 surface-enhanced Raman spectrum Methods 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 14
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 12
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 11
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- FOIXSVOLVBLSDH-UHFFFAOYSA-N Silver ion Chemical compound [Ag+] FOIXSVOLVBLSDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 9
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- 238000000701 chemical imaging Methods 0.000 description 8
- 238000003917 TEM image Methods 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 6
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 6
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000002042 Silver nanowire Substances 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 4
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 4
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 4
- 238000001878 scanning electron micrograph Methods 0.000 description 4
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 4
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 3
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 3
- -1 PO 2 -stretching Chemical class 0.000 description 3
- 206010034972 Photosensitivity reaction Diseases 0.000 description 3
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 208000007578 phototoxic dermatitis Diseases 0.000 description 3
- 231100000018 phototoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 3
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 3
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 3
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 3
- 230000005653 Brownian motion process Effects 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 201000003352 adrenal gland pheochromocytoma Diseases 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 2
- 238000005452 bending Methods 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 238000005537 brownian motion Methods 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 2
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 2
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000004297 night vision Effects 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 210000001943 adrenal medulla Anatomy 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001427 coherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000001491 hyper Rayleigh scattering spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000010189 intracellular transport Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000002715 modification method Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000028591 pheochromocytoma Diseases 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000002834 transmittance Methods 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
- G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
- G01N21/6458—Fluorescence microscopy
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/65—Raman scattering
- G01N21/658—Raman scattering enhancement Raman, e.g. surface plasmons
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
Description
本発明は、試料において粒子プローブ近傍に存在する物質の分布を検出する方法に関する。より具体的には、粒子プローブ（例えば、金などの金属粒子）を試料（例えば、生細胞など）の流動場に導入し、当該流動場内を自らの流動性を利用して移動する粒子プローブの近傍に存在する物質の光学応答（ラマン散乱光、レイリー散乱光、蛍光など）を経時的に検出することによって粒子プローブの位置情報および上記粒子プローブの近傍に存在する物質の情報を複数取得し、これら複数の位置情報および物質情報に基づいて、試料において粒子プローブの近傍に存在する物質の分布を検出する方法に関する。 The present invention relates to a method for detecting a distribution of a substance present in the vicinity of a particle probe in a sample. More specifically, a particle probe (for example, a metal particle such as gold) is introduced into a flow field of a sample (for example, a living cell), and the particle probe moves within the flow field using its own fluidity. By detecting the optical response (Raman scattered light, Rayleigh scattered light, fluorescence, etc.) of the substance present in the vicinity over time, the position information of the particle probe and a plurality of information on the substance present in the vicinity of the particle probe are obtained, The present invention relates to a method for detecting a distribution of a substance present in the vicinity of a particle probe in a sample based on the plurality of position information and substance information.
また、本発明は、粒子プローブまたはナノ粒子プローブを用いた高分解能の画像化の方法に関する。より具体的には、粒子プローブまたはナノ粒子プローブ（例えば、金などの金属粒子または金属ナノ粒子）を試料（例えば、生細胞など）の流動場に導入し、当該流動場内を自らの流動性を利用して移動する粒子プローブまたはナノ粒子プローブの近傍に存在する物質の光学応答（ラマン散乱光、レイリー散乱光、蛍光など）を経時的に検出することによって粒子プローブまたはナノ粒子プローブの位置情報を複数取得し、これら複数の位置情報を重ね合わせることによって、試料の画像を形成する方法に関する。 The present invention also relates to a high-resolution imaging method using a particle probe or a nanoparticle probe. More specifically, a particle probe or a nanoparticle probe (for example, metal particles such as gold or metal nanoparticles) is introduced into a flow field of a sample (for example, a living cell), and the fluidity in the flow field is controlled. By detecting the optical response (Raman scattered light, Rayleigh scattered light, fluorescence, etc.) of the substance existing in the vicinity of the moving particle probe or nanoparticle probe, the position information of the particle probe or nanoparticle probe is obtained. The present invention relates to a method of forming an image of a sample by acquiring a plurality and superimposing the plurality of position information.
本発明の方法においては、粒子プローブおよびナノ粒子プローブは、試料内を自ら移動するため、粒子プローブまたはナノ粒子プローブの位置情報を取得するために外的走査する必要がない。また粒子プローブおよびナノ粒子プローブは試料を三次元的に移動し得るために、三次元画像を形成することができる。 In the method of the present invention, since the particle probe and the nanoparticle probe move by themselves within the sample, it is not necessary to perform external scanning to acquire the position information of the particle probe or the nanoparticle probe. Further, since the particle probe and the nanoparticle probe can move the sample three-dimensionally, a three-dimensional image can be formed.
１７世紀初期ロバート・フックが自作の顕微鏡を用いて細胞を発見して以降、光学顕微鏡はミクロ／ナノスケールでの生体活動を観察するツールとして活躍してきた。生体分子の機能解明が重要視される昨今においても、一分子蛍光イメージング技術や近接場光顕微鏡の発展により、光を用いた新しい分子観察法が発展している。生きたまま細胞内の生体分子を観察できるのは光学顕微鏡のみであり、今後も光学顕微鏡は生命機能の解明において不可欠な手段であると考えられる。 Since the early 17th century when Robert Hook discovered his cells using his own microscope, the optical microscope has been used as a tool for observing biological activity at the micro / nano scale. Even in recent years when it is important to elucidate the functions of biomolecules, new molecular observation methods using light have been developed with the development of single-molecule fluorescence imaging technology and near-field light microscopy. Only optical microscopes can observe biomolecules in cells alive, and optical microscopes will continue to be an indispensable means for elucidating vital functions.
光を用いた生体分子の分析法としては、ラマン散乱光を用いたラマン分光法もまた頻繁に用いられてきた。光を分子に照射すると、照射した光の振動数とは異なる振動数の光が散乱される。これをラマン散乱光と呼ぶ。ラマン散乱光は散乱する分子に依存した振動数を有するため、ラマン散乱光を分光して得られるラマンスペクトルを解析することで、光を散乱した分子を同定することができる。１９９０年に報告されたPuppelsらによるショウジョウバエの染色体の構造解析が、ラマン分光法を用いた最初の生体試料の測定例である（非特許文献１を参照のこと）。これ以降、１９９５年には同グループによりヒトリンパ球のイメージングが報告され（非特許文献２を参照のこと）、２００３年にはUzunbajakavaらがヒト細胞中のタンパク質のイメージングを行った（非特許文献３を参照のこと）。ラマン散乱は分子の振動を検出するため、ラマン分光法を用いれば非侵襲かつ無標識で細胞内分子の構造を解析できる。しかし、ラマン散乱光の散乱断面積は非常に小さいため、ラマン分光法を用いて細胞中の分子情報を得るには、長時間の露光が必要である。このため、ラマン分光法は刻一刻と変化する細胞動態の観察にはあまり適していなかった。 As a biomolecule analysis method using light, Raman spectroscopy using Raman scattered light has also been frequently used. When light is irradiated to molecules, light having a frequency different from the frequency of the irradiated light is scattered. This is called Raman scattered light. Since the Raman scattered light has a frequency depending on the molecule to be scattered, the molecule that has scattered the light can be identified by analyzing the Raman spectrum obtained by spectroscopic analysis of the Raman scattered light. The structural analysis of Drosophila chromosomes by Puppels et al. Reported in 1990 is an example of the measurement of the first biological sample using Raman spectroscopy (see Non-Patent Document 1). Thereafter, imaging of human lymphocytes was reported in 1995 by the same group (see Non-Patent Document 2), and in 2003, Uzunbajakava et al. Performed imaging of proteins in human cells (Non-Patent Document 3). checking). Since Raman scattering detects molecular vibrations, the structure of intracellular molecules can be analyzed non-invasively and label-free using Raman spectroscopy. However, since the scattering cross-section of Raman scattered light is very small, long-time exposure is required to obtain molecular information in cells using Raman spectroscopy. For this reason, Raman spectroscopy was not very suitable for observing the changing cell dynamics.
上記問題点を解決すべく、表面増強ラマン散乱法（Surface enhanced Raman scattering：以下「ＳＥＲＳ」と略記する）が開発された。ＳＥＲＳでは、金属表面に光が入射した際に誘起される表面プラズモンによって、ラマン散乱光の散乱断面積を数〜十数桁増強することができる。ＳＥＲＳのin vitroでの生体分子分析への利用については、１９９０年代初から報告があり、ＤＮＡやタンパク質などの分子量の比較的大きな分子からのＳＥＲＳが観察されている（例えば非特許文献４〜８を参照のこと）。またin vivoでのＳＥＲＳ観察としては１９９０年代初期に初めて報告があり、生細胞内に付加された薬剤のＳＥＲＳ信号が観察されている（例えば非特許文献９〜１２を参照のこと）。また２００２年には、Feldらグループが細胞内から生体分子のＳＥＲＳ信号を取得することに成功した（非特許文献１３を参照のこと）。 In order to solve the above problems, a surface enhanced Raman scattering method (hereinafter abbreviated as “SERS”) has been developed. In SERS, the scattering cross section of Raman scattered light can be enhanced by several to several tens of orders by surface plasmons induced when light enters a metal surface. The use of SERS for in vitro biomolecular analysis has been reported since the early 1990s, and SERS from molecules having a relatively large molecular weight such as DNA and protein has been observed (for example, Non-Patent Documents 4 to 8). checking). In vivo SERS observation has been reported for the first time in the early 1990s, and SERS signals of drugs added in living cells have been observed (see, for example, Non-Patent Documents 9 to 12). In 2002, the Feld et al. Group succeeded in obtaining a SERS signal of a biomolecule from the inside of a cell (see Non-Patent Document 13).
一方、本発明者らは、これまでに、生細胞内に金ナノ粒子を導入し、当該生細胞内のＳＥＲＳ観察を経時的に行った結果を報告した（非特許文献１４を参照のこと）。 On the other hand, the present inventors have reported the results of introducing gold nanoparticles into living cells and observing SERS in the living cells over time (see Non-Patent Document 14). .
他方、上記ラマン分光法やＳＥＲＳ法の他に、生細胞を高分解能で観察する方法としては、原子間力顕微鏡や近接場光学顕微鏡等の所謂プローブ顕微鏡が知られている。プローブ顕微鏡による観察では、位置制御された探針を用いて生細胞試料を走査しながら観察するため、試料の表面付近しか観察することができないという欠点がある。タンパク質や酵素、イオン、糖など生命活動維持に不可欠な物質は細胞内部にあるため、プローブ顕微鏡を用いた方法では、これらを高空間分解能で観察することは不可能であった。また細胞内の物質の観察において、標的の物質を蛍光色素標識して観察する方法が用いられる場合があるが、この方法では蛍光色素で標識された特定の物質しか観察できないという問題点や、蛍光色素の褪光または消光の問題点があった。 On the other hand, in addition to the Raman spectroscopy and SERS methods, so-called probe microscopes such as an atomic force microscope and a near-field optical microscope are known as methods for observing living cells with high resolution. The observation with the probe microscope has a drawback that only the vicinity of the surface of the sample can be observed because the living cell sample is observed while scanning using a position-controlled probe. Substances indispensable for life activity maintenance such as proteins, enzymes, ions, sugars, etc. are inside the cells, so it was impossible to observe them with high spatial resolution by the method using a probe microscope. In addition, in the observation of intracellular substances, a method of observing a target substance with a fluorescent dye may be used, but this method can only observe a specific substance labeled with a fluorescent dye, There was a problem of the fluorescence or quenching of the dye.
これまで、生細胞内や生体組織内の分子などの試料を対象とし、外的な走査を行うことなく、高感度で高速かつ、高空間分解で生細胞内や生体組織内における分子など試料の分布を検出する方法は知られていなかった。そこで本発明は、外的な走査を行うことなく、生細胞内や生体組織内における、分子などの試料の分布を高感度で高速かつ、高空間分解に検出する方法を提供することを目的とした。 Until now, molecules such as molecules in living cells or living tissues are targeted, and without sensitive scanning, high sensitivity, high speed, and high spatial resolution can be used for molecules such as molecules in living cells and living tissues. The method for detecting the distribution was not known. Therefore, an object of the present invention is to provide a method for detecting the distribution of a sample such as a molecule in a living cell or a living tissue with high sensitivity, high speed, and high spatial resolution without performing external scanning. did.
また、これまで、生細胞内の分子などの微小な試料を対象とし、外的な走査を行うことなく、高感度で高速かつ、高空間分解で画像（三次元画像）を形成する方法は知られていなかった。そこで本発明は、外的な走査を行うことなく、生細胞内の分子等の微小な試料を高感度で高速かつ、高空間分解に画像（三次元画像）を形成する方法を提供することを目的とした。 In addition, there is a known method for forming an image (three-dimensional image) with high sensitivity, high speed, and high spatial resolution, without performing external scanning, for a minute sample such as a molecule in a living cell. It was not done. Therefore, the present invention provides a method for forming an image (three-dimensional image) with high sensitivity, high speed, and high spatial resolution of a minute sample such as a molecule in a living cell without performing external scanning. It was aimed.
なお、本明細書における「外的な走査」とは、特に原子間力顕微鏡や近接場光学顕微鏡等の従来公知のプローブ顕微鏡による観察で行われる走査、すなわち位置制御された探針を用いて試料を走査する行為や、試料外部から光照射、電場、磁場等の印加によりプローブを任意の位置に移動させる行為等を意味する。 In this specification, “external scanning” refers to scanning performed by observation with a conventionally known probe microscope such as an atomic force microscope or a near-field optical microscope, that is, a sample using a position-controlled probe. Scanning, or the action of moving the probe to an arbitrary position by applying light irradiation, electric field, magnetic field or the like from the outside of the sample.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、粒子プローブまたはナノ粒子プローブ（例えば、金などの金属粒子または金属ナノ粒子）を試料（例えば、生細胞など）の流動場に導入し、当該流動場内を自らの流動性を利用して三次元的に移動する粒子プローブの近傍に存在する物質の光学応答（ラマン散乱光、レイリー散乱光、蛍光など）を経時的に検出することによって、粒子プローブの位置情報および上記粒子プローブの近傍に存在する物質の情報を複数取得した。そして、上記情報に基づいて、試料において粒子プローブ近傍に存在する物質の分布を三次元的に検出しうることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the inventors of the present invention have used a particle probe or a nanoparticle probe (for example, a metal particle such as gold or a metal nanoparticle) as a sample (for example, a living cell). The optical response (Raman scattered light, Rayleigh scattered light, fluorescence, etc.) of the substance present in the vicinity of the particle probe that is introduced into the field and moves three-dimensionally within the flow field using its own fluidity over time By detecting, a plurality of pieces of position information of the particle probe and information on substances existing in the vicinity of the particle probe were obtained. And based on the said information, it discovered that distribution of the substance which exists in the vicinity of a particle probe in a sample can be detected three-dimensionally, and came to complete this invention.
また、本発明者らは、粒子プローブまたはナノ粒子プローブ（例えば、金などの金属粒子または金属ナノ粒子）を試料（例えば、生細胞など）の流動場に導入し、当該流動場内を自らの流動性を利用して三次元的に移動する粒子プローブまたはナノ粒子プローブの近傍に存在する物質の光学応答（ラマン散乱光、レイリー散乱光、蛍光など）を経時的に検出することによって粒子プローブまたはナノ粒子プローブの位置情報を複数取得し、これら複数の位置情報を重ね合わせることによって、外的な走査を行うことなく、高感度で高速かつ、高空間分解で試料の三次元画像を形成し得ることを発見し本発明を完成するに至った。すなわち本発明は以下の発明を包含する。 In addition, the present inventors introduce a particle probe or a nanoparticle probe (for example, metal particles such as gold or metal nanoparticles) into a flow field of a sample (for example, a living cell) and flow through the flow field. By detecting the optical response (Raman scattered light, Rayleigh scattered light, fluorescence, etc.) of a substance existing in the vicinity of a particle probe or a nanoparticle probe that moves three-dimensionally using the property of the particle probe or nano By acquiring multiple pieces of particle probe position information and superimposing these multiple pieces of position information, it is possible to form a three-dimensional image of a sample with high sensitivity, high speed, and high spatial resolution without performing external scanning. And the present invention has been completed. That is, the present invention includes the following inventions.
本発明にかかる、試料において粒子プローブ近傍に存在する物質の分布を検出する方法は、流動場を備える試料の流動場に粒子プローブを導入し、上記粒子プローブの近傍に存在する物質の光学応答を経時的に検出することによって、試料における粒子プローブの位置情報および上記粒子プローブの近傍に存在する物質の情報を複数取得することを特徴としている。 According to the present invention, a method for detecting a distribution of a substance present in the vicinity of a particle probe in a sample introduces the particle probe into a flow field of a sample having a flow field, and determines an optical response of the substance present in the vicinity of the particle probe. By detecting over time, a plurality of pieces of position information of the particle probe in the sample and information on substances existing in the vicinity of the particle probe are obtained.
また、本発明にかかる方法は、流動場を備える試料の画像を形成する方法であって、
当該流動場に粒子プローブを導入し、
上記粒子プローブの近傍に存在する物質の光学応答を経時的に検出することによって、試料における粒子プローブの位置情報および上記粒子プローブの近傍に存在する物質の情報を複数取得し、
当該複数取得された粒子プローブの位置情報を重ね合わせて画像化することを特徴としている。The method according to the present invention is a method of forming an image of a sample having a flow field,
Introducing a particle probe into the flow field,
By detecting the optical response of the substance existing in the vicinity of the particle probe over time, the position information of the particle probe in the sample and a plurality of information on the substance existing in the vicinity of the particle probe are obtained,
The plurality of obtained particle probe position information is superimposed and imaged.
また本発明の方法において上記粒子プローブは、金属粒子であることが好ましい。 In the method of the present invention, the particle probe is preferably a metal particle.
また本発明の方法において上記金属粒子は、金、銀、銅、白金、アルミニウム、タングステン、イリジウムからなる群から選択される１つ以上の金属、または当該群から選択される１つ以上の金属の合金からなる粒子であることが好ましい。 In the method of the present invention, the metal particles may be one or more metals selected from the group consisting of gold, silver, copper, platinum, aluminum, tungsten, iridium, or one or more metals selected from the group. Particles made of an alloy are preferable.
また本発明の方法において上記粒子プローブの近傍に存在する物質の光学応答は、上記粒子プローブの近傍に存在する物質に対する散乱光および蛍光のいずれか１つ以上であることが好ましい。 In the method of the present invention, the optical response of the substance present in the vicinity of the particle probe is preferably one or more of scattered light and fluorescence with respect to the substance present in the vicinity of the particle probe.
また本発明の方法においては、ラマン散乱検出法、レイリー散乱検出法、ミー散乱検出法および蛍光検出法からなる群から選択される１つ以上の方法により、上記粒子プローブの近傍に存在する物質の光学応答を経時的に検出することが好ましい。 In the method of the present invention, the substance present in the vicinity of the particle probe is detected by one or more methods selected from the group consisting of Raman scattering detection method, Rayleigh scattering detection method, Mie scattering detection method, and fluorescence detection method. It is preferred to detect the optical response over time.
また本発明の方法において上記ラマン散乱検出法は、表面増強ラマン散乱法であることが好ましい。 In the method of the present invention, the Raman scattering detection method is preferably a surface enhanced Raman scattering method.
また本発明の方法において上記流動場を備える試料は、生細胞であってもよい。 In the method of the present invention, the sample provided with the flow field may be a living cell.
また本発明の方法において上記流動場に粒子プローブを導入するとは、生細胞内に粒子プローブを導入することであってもよい。 In the method of the present invention, introducing a particle probe into the flow field may be introducing a particle probe into a living cell.
また本発明の方法においては、マイクロインジェクション法により生細胞内に粒子プローブを導入してもよい。 In the method of the present invention, a particle probe may be introduced into a living cell by a microinjection method.
また本発明の方法においては、流動場に複数の粒子プローブを導入してもよい。 In the method of the present invention, a plurality of particle probes may be introduced into the flow field.
また本発明の方法において、上記粒子プローブは、その表面が修飾されているものであってもよい。 In the method of the present invention, the surface of the particle probe may be modified.
本発明の方法では、粒子プローブはナノ粒子プローブであってもよい。 In the method of the present invention, the particle probe may be a nanoparticle probe.
また、本発明の方法では、上記ナノ粒子プローブは、粒子径が可視光線の波長範囲未満である粒子状物質であってもよい。 In the method of the present invention, the nanoparticle probe may be a particulate substance having a particle diameter less than the wavelength range of visible light.
また本発明の方法においては、生細胞とナノ粒子プローブとを接触させ、生細胞のエンドサイトーシスにより生細胞内にナノ粒子プローブを導入してもよい。 In the method of the present invention, the living cell may be brought into contact with the nanoparticle probe, and the nanoparticle probe may be introduced into the living cell by endocytosis of the living cell.
本発明にかかる方法を実施するための装置は、試料内における粒子プローブの位置を決定する位置決定手段と、
上記位置決定手段によって決定された位置に存在する粒子プローブに光を照射し、上記粒子プローブの近傍に存在する物質から散乱光および蛍光のいずれか１つ以上を発生させる照射手段と、
上記照射手段から照射される光、上記散乱光および蛍光からなる群より選ばれるいずれか１以上の光の光路を変更可能な光路変更手段と、
上記散乱光および蛍光のいずれか１つ以上を検出するための検出手段と、を備えることを特徴としている。An apparatus for carrying out the method according to the present invention comprises position determining means for determining the position of a particle probe in a sample,
Irradiating means for irradiating light to the particle probe existing at the position determined by the position determining means, and generating one or more of scattered light and fluorescence from a substance existing in the vicinity of the particle probe;
An optical path changing means capable of changing an optical path of any one or more light selected from the group consisting of the light irradiated from the irradiation means, the scattered light and the fluorescence;
Detecting means for detecting any one or more of the scattered light and the fluorescence.
なお、これまでは、ＳＥＲＳなどの光学的手法が細胞内の分析に適用が可能であるということは知られていた（非特許文献１〜１４）。また本発明者らは、生細胞内に金ナノ粒子を導入し、当該細胞内のＳＥＲＳによる分析を経時的に行った結果をこれまでに開示したが（非特許文献１４）、これは単に細胞内のＳＥＲＳによる分析を経時的に行ったという事実を示したに過ぎない。 Heretofore, it has been known that an optical technique such as SERS can be applied to intracellular analysis (Non-Patent Documents 1 to 14). In addition, the present inventors have disclosed the results of introducing gold nanoparticles into living cells and analyzing the intracellular SERS over time (Non-Patent Document 14). It only shows the fact that the analysis by SERS was performed over time.
その後、本発明者らは、金ナノ粒子が細胞内を自らの流動性を利用して三次元的に移動している点に着目し、金ナノ粒子のラマン散乱光などの光学応答を経時的に検出することによってナノ粒子プローブの位置情報および上記ナノ粒子プローブの近傍に存在する物質の情報を複数取得した。そして、それぞれの位置情報に基づいて、試料内におけるナノ粒子プローブの近傍に存在する物質の分布を三次元的に検出することができることを見出した。 Subsequently, the present inventors focused on the fact that the gold nanoparticles are moving three-dimensionally in the cell using their fluidity, and the optical response of the gold nanoparticles such as Raman scattered light over time. In this way, a plurality of information on the position of the nanoparticle probe and information on the substance existing in the vicinity of the nanoparticle probe were obtained. And based on each positional information, it discovered that distribution of the substance which exists in the vicinity of the nanoparticle probe in a sample can be detected three-dimensionally.
また、これら複数の位置情報を重ね合わせることによって、外的な走査を行うことなく、生細胞内の分子等の微小な試料を高感度で高速かつ、高空間分解に三次元画像を形成し得るという独自の技術的思想を見出すことによって、本発明を完成させるに至った。つまり金ナノ粒子が細胞内を自らの流動性を利用して三次元的に移動している点に着目し、これを試料において粒子プローブの近傍に存在する物質の分布を検出する方法および三次元画像を形成する方法に結びつけたからこそ本発明が完成されたのであって、この点に気づき得ない当業者は本発明を容易に完成させることはできない。 In addition, by superimposing these multiple pieces of position information, it is possible to form a three-dimensional image with high sensitivity, high speed, and high spatial resolution of a minute sample such as a molecule in a living cell without performing external scanning. The present invention has been completed by finding the original technical idea. In other words, focusing on the fact that gold nanoparticles are moving three-dimensionally in the cell using their own fluidity, this method detects the distribution of substances existing in the vicinity of the particle probe in the sample and three-dimensional The present invention has been completed because it has been linked to a method for forming an image, and those skilled in the art who cannot recognize this point cannot easily complete the present invention.
本発明によれば、生細胞内や生体組織内の分子などについて、外的な走査を行うことなく、高感度で高速かつ、高空間分解で、生細胞内や生体組織内における分布を三次元的に検出することができる。よって、生細胞内や生体組織内において、どの場所に上記分子等が存在しているかを三次元的に検出することができる。 According to the present invention, a molecule in a living cell or a living tissue is three-dimensionally distributed in a living cell or in a living tissue with high sensitivity, high speed, and high spatial resolution without performing external scanning. Can be detected automatically. Therefore, it is possible to detect three-dimensionally where the molecule or the like is present in a living cell or a living tissue.
本発明によれば、外的な走査を行うことなく、生細胞内の分子等の微小な試料を高感度で高速かつ、高空間分解に画像（三次元画像）を形成することができる。よって、より簡便に高空間分解で画像（三次元画像）を取得することができる。また本発明においては外的な走査が必要ないため、従来公知のプローブ顕微鏡による生細胞の観察のように細胞の表面付近しか観察できないという問題は生じず、細胞内部についても画像（三次元画像）の取得が本発明によって可能となる。 According to the present invention, it is possible to form an image (three-dimensional image) of a minute sample such as a molecule in a living cell with high sensitivity, high speed, and high spatial resolution without performing external scanning. Therefore, an image (three-dimensional image) can be acquired more easily and with high spatial resolution. Further, in the present invention, since no external scanning is required, there is no problem that only the vicinity of the surface of the cell can be observed as in the case of observing a living cell with a conventionally known probe microscope, and an image of the inside of the cell (three-dimensional image). Can be obtained by the present invention.
また本発明においては、標的の物質を蛍光色素標識して観察する方法において生じる、蛍光色素で標識された特定の物質しか観察できないという問題点や、蛍光色素の褪光や消光の問題点についても解決されている。 Also, in the present invention, there are problems that can be observed only in a specific substance labeled with a fluorescent dye, and problems with fluorescence dye quenching and quenching that occur in a method of observing a target substance with a fluorescent dye. It has been resolved.
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下のとおりである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本明細書中に記載された非特許文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。また本明細書中の「〜」は「以上、以下」を意味し、例えば明細書中で「★〜☆」と記載されていれば「★以上、☆以下」を示す。 An embodiment of the present invention will be described as follows. Note that the present invention is not limited to this. In addition, all the nonpatent literatures and patent literatures described in this specification are used as reference in this specification. In addition, “˜” in the present specification means “above and below”. For example, if “★ to ☆” is described in the specification, it means “★ or more and ☆ below”.
本発明は、試料において粒子プローブの近傍に存在する物質の分布を検出する方法であって、
（１）流動場を備える試料の流動場に粒子プローブを導入する工程（便宜上「プローブ導入工程」という）、
（２）上記粒子プローブの近傍に存在する物質の光学応答を経時的に検出することによって、試料における粒子プローブの位置情報および上記粒子プローブの近傍に存在する物質の情報を複数取得する工程（便宜上「光学応答検出工程」という）を含む。なお、上記粒子プローブは、後述するナノ粒子プローブであってもよい。The present invention is a method for detecting the distribution of a substance present in the vicinity of a particle probe in a sample,
(1) A step of introducing a particle probe into a flow field of a sample having a flow field (referred to as a “probe introduction step” for convenience),
(2) A step of acquiring a plurality of positional information of the particle probe in the sample and information of the substance existing in the vicinity of the particle probe by detecting the optical response of the substance existing in the vicinity of the particle probe over time (for convenience) (Referred to as “optical response detection step”). The particle probe may be a nanoparticle probe described later.
ここで本発明の方法の対象となる試料は、流動場を備える試料であれば特に限定されるものではなく、生細胞、生体組織、臓器をはじめとする生体由来試料や、半導体、金属、ガラス等の微細構造やマイクロ流路をはじめとする非生体試料などが意図される。上記「流動場」とは、後述する粒子プローブまたはナノ粒子プローブが流動することができる環境（場）を意味し、水、水溶液、細胞液、血液等の液体が主に意図される。また、液体等の周囲の物質が移動しない場合でも、ブラウン運動等により粒子プローブまたはナノ粒子プローブの位置が変化する環境や、食道や腸等の蠕動運動により粒子プローブまたはナノ粒子プローブが運搬される環境等も「流動場」に含まれる。なお、粒子プローブまたはナノ粒子プローブが流動し得る環境であれば、上記流動場は気体であってもよい。 Here, the sample to be subjected to the method of the present invention is not particularly limited as long as it is a sample having a flow field, and is derived from living samples such as living cells, living tissues, organs, semiconductors, metals, and glasses. For example, non-biological samples such as micro-structures and micro-channels are contemplated. The “flow field” means an environment (field) in which a particle probe or nanoparticle probe described later can flow, and mainly liquids such as water, aqueous solution, cell fluid, and blood are intended. Even when surrounding substances such as liquid do not move, the particle probe or nanoparticle probe is transported by the environment in which the position of the particle probe or nanoparticle probe changes due to Brownian motion or the like, or by the peristaltic motion of the esophagus or intestine The environment is also included in the “flow field”. Note that the flow field may be a gas as long as the particle probe or the nanoparticle probe can flow.
また「流動場を備える」とは、試料の表面の一部もしくは全部、または内部の一部もしくは全部に適当な流動場が形成されていることを意味し、流動場はその試料が元来有するものであっても、外的に付加されたものであってもよい。例えば、前者の場合は細胞液が生細胞（試料）の流動場に該当する。また後者は半導体などの試料上に噴霧されるなどして形成された液体層が流動場に該当する。次に工程ごとに説明する。 Further, “having a flow field” means that a suitable flow field is formed on a part or all of the surface of the sample, or a part or all of the inside of the sample. It may be a thing added externally. For example, in the former case, the cell fluid corresponds to the flow field of living cells (sample). In the latter, a liquid layer formed by spraying on a sample such as a semiconductor corresponds to the flow field. Next, each process will be described.
＜１．プローブ導入工程＞
本工程は、試料の流動場に粒子プローブまたはナノ粒子プローブを導入する工程である。ここで「粒子プローブ」とは、特に粒子径が限定されない粒子状物質を意味する。粒子プローブは、粒子径がナノメートルサイズであるナノ粒子プローブであってもよいが、ナノスケールの分解能を必要としない場合は、粒子径は必ずしもナノメートルサイズでなくてもよい。本発明では、粒子のサイズと分解能とがほぼ等しいため、マクロスケールでの測定で足りる場合は、粒子プローブの粒子径はナノメートルサイズに限定されないことになる。よって、粒子プローブの粒子径の上限は特に限定されるものではない。例えば、試料が細胞である場合は、粒子径が１μｍ未満の粒子プローブを用いることができ、試料が生体組織である場合は、粒子径が１ｃｍ以下の粒子プローブを用いることができる。<1. Probe introduction process>
This step is a step of introducing a particle probe or nanoparticle probe into the flow field of the sample. Here, the “particle probe” means a particulate substance whose particle diameter is not particularly limited. The particle probe may be a nanoparticle probe having a nanometer size, but the particle size does not necessarily have to be a nanometer size when nanoscale resolution is not required. In the present invention, since the particle size and resolution are substantially equal, the particle diameter of the particle probe is not limited to nanometer size when measurement on a macro scale is sufficient. Therefore, the upper limit of the particle diameter of the particle probe is not particularly limited. For example, when the sample is a cell, a particle probe having a particle diameter of less than 1 μm can be used, and when the sample is a biological tissue, a particle probe having a particle diameter of 1 cm or less can be used.
「ナノ粒子プローブ」とは、粒子径がナノメートルサイズ（１μｍ未満）の粒子状物質を意味する。ここで「粒子径」とは、粒子プローブまたはナノ粒子プローブを顕微鏡によって観察し、その二次元形状に対する最大内接円の直径が意図される。例えば、粒子プローブまたはナノ粒子プローブの二次元形状が実質的に円形状である場合はその円の直径が意図され、実質的に楕円形状である場合はその楕円の短径が意図され、実質的に正方形状である場合はその正方形の辺の長さが意図され、実質的に長方形状である場合はその長方形の短辺の長さが意図される。 “Nanoparticle probe” means a particulate material having a particle size of nanometer size (less than 1 μm). Here, the “particle diameter” is intended to mean the diameter of the maximum inscribed circle with respect to the two-dimensional shape of the particle probe or nanoparticle probe observed with a microscope. For example, when the two-dimensional shape of the particle probe or nanoparticle probe is substantially circular, the diameter of the circle is intended, and when it is substantially elliptical, the minor diameter of the ellipse is intended. In the case of a square shape, the length of the side of the square is intended, and in the case of a substantially rectangular shape, the length of the short side of the rectangle is intended.
上記ナノ粒子プローブは、その粒子径が上記の通り、ナノメートルサイズであれば特に限定されないが、特にその粒子径が可視光線の波長範囲未満であることが好ましい。ナノ粒子プローブの粒子径が可視光線の最小波長未満であることで、従来の光学顕微鏡では観察できなかった可視光線の波長範囲未満の領域までナノ粒子プローブがトレースすることができるために、従来の光学顕微鏡では実現できなかった極めて詳細な観察が可能となる。なお可視光線の波長範囲は特に限定されるものではないが、３８０〜８００ｎｍであるといわれている。 The nanoparticle probe is not particularly limited as long as the particle diameter is nanometer size as described above, but the particle diameter is particularly preferably less than the wavelength range of visible light. Since the particle diameter of the nanoparticle probe is less than the minimum wavelength of visible light, the nanoparticle probe can be traced to a region below the wavelength range of visible light that could not be observed with a conventional optical microscope. An extremely detailed observation that cannot be realized with an optical microscope is possible. The wavelength range of visible light is not particularly limited, but is said to be 380 to 800 nm.
なお、エンドサイトーシスを利用してナノ粒子を生細胞（ＨｅＬａ細胞）内へ導入する場合は、ナノ粒子の粒子径は大き過ぎても小さ過ぎても導入されにくいことが知られている（「B.D. Chithrani, A.A. Ghazani, W.C.W. Chan, Nano Lett., 6 (4), 662 (2006)」を参照のこと）。Chithraniらの検討を考慮すれば、エンドサイトーシスを利用してナノ粒子プローブを生細胞（例えばＨｅＬａ細胞）へ導入する場合、好ましいナノ粒子プローブの粒子径は３０〜７０ｎｍ程度が好ましく、５０ｎｍ程度が最も好ましいといえる。 In addition, when introducing a nanoparticle into a living cell (HeLa cell) using endocytosis, it is known that the particle diameter of the nanoparticle is too large or too small to be introduced (“ BD Chithrani, AA Ghazani, WCW Chan, Nano Lett., 6 (4), 662 (2006)). In consideration of Chithrani et al., When a nanoparticle probe is introduced into a living cell (for example, HeLa cell) using endocytosis, the preferred particle diameter of the nanoparticle probe is preferably about 30 to 70 nm, and about 50 nm. Most preferred.
本発明における粒子プローブまたはナノ粒子プローブは、光学応答（ラマン散乱光、レイリー散乱光、蛍光など）を検出され得る材料からなる粒子であれば特に限定されるものではないが、光学応答シグナルをより検出されやすいとの理由から金属粒子が好ましい。上記金属粒子としては、金、銀、銅、白金、アルミニウム、タングステン、イリジウム、などからなる金属粒子が挙げられる。上記の金属の中でも特に、金からなる金属粒子が好ましい。光学応答のシグナルが得られやすい、および生細胞に導入された場合の生細胞に対する安全性が高いからである。なお上記金属粒子は上記単一の金属からなる金属粒子であってもよいが、１種類以上の金属の合金からなる粒子であってもよい。 The particle probe or nanoparticle probe in the present invention is not particularly limited as long as it is a particle made of a material that can detect an optical response (Raman scattered light, Rayleigh scattered light, fluorescence, etc.). Metal particles are preferred because they are easy to detect. Examples of the metal particles include metal particles made of gold, silver, copper, platinum, aluminum, tungsten, iridium, and the like. Among the above metals, metal particles made of gold are particularly preferable. This is because an optical response signal is easily obtained, and the safety of living cells when introduced into living cells is high. The metal particles may be metal particles made of the single metal, but may be particles made of an alloy of one or more kinds of metals.
試料の流動場に粒子プローブまたはナノ粒子プローブを導入する際の具体的方法については、試料に備えられた流動場中で粒子プローブまたはナノ粒子プローブが流動し得るように導入される方法であれば、その具体的方法は特に限定されるものではない。なお、粒子プローブまたはナノ粒子プローブがより流動しやすいという理由から、粒子プローブまたはナノ粒子プローブは流動場の最上面に対して浮上した状態ではなく、流動場の最上面より下に沈んだ状態で存在することが好ましい。上記のようにすべく、粒子プローブまたはナノ粒子プローブと流動場を構成する物質との組み合わせを検討してもよいし、また流動場を構成する物質に対する親和性の高い基で粒子プローブまたはナノ粒子プローブの表面を修飾してもよい。例えば、流動場が水である場合、水酸基などの親水性基を粒子プローブまたはナノ粒子プローブの表面に導入してもよい。 The specific method for introducing the particle probe or nanoparticle probe into the flow field of the sample is any method that allows the particle probe or nanoparticle probe to flow in the flow field provided in the sample. The specific method is not particularly limited. Note that because the particle probe or nanoparticle probe is more likely to flow, the particle probe or nanoparticle probe is not floating above the top surface of the flow field, but is sinking below the top surface of the flow field. Preferably it is present. As described above, the combination of the particle probe or the nanoparticle probe and the substance constituting the flow field may be considered, or the particle probe or the nanoparticle may be based on a group having a high affinity for the substance constituting the flow field. The surface of the probe may be modified. For example, when the flow field is water, a hydrophilic group such as a hydroxyl group may be introduced on the surface of the particle probe or nanoparticle probe.
試料として生細胞を用いる場合は、生細胞が外部からの物質を自ら取り込む機構（エンドサイトーシス）を利用してナノ粒子プローブを生細胞内に取り込ませてもよい。この場合、生細胞とナノ粒子プローブとを懸濁し、一定時間放置するだけでナノ粒子プローブの試料への導入が完了するために極めて簡単な操作で本工程を完結させることができる。また、生細胞が自ら有する機構を用いているため、導入されたナノ粒子プローブが細胞内で襲撃されることが少ないというメリットもある。 When living cells are used as a sample, the nanoparticle probe may be incorporated into the living cells using a mechanism (endocytosis) in which the living cells take in substances from the outside. In this case, since the introduction of the nanoparticle probe into the sample is completed simply by suspending the living cells and the nanoparticle probe and leaving them to stand for a certain period of time, this step can be completed with an extremely simple operation. In addition, since the mechanism that living cells themselves have is used, the introduced nanoparticle probe is less likely to be attacked inside the cell.
上記したエンドサイトーシス以外の方法としては、マイクロインジェクション法が適用可能である。マイクロインジェクション法は、卵細胞や体細胞に微量のＤＮＡ、ｍＲＮＡや化学物質を、微細なガラス針で注入する手法である。この手法を本工程に利用すればよい。かかるマイクロインジェクション法によれば、導入する粒子プローブまたはナノ粒子プローブの数を所望の数に調整することが可能であるというメリットを享受することができる。また粒子プローブまたはナノ粒子プローブが小胞内に封じ込められることがないため、細胞内のあらゆる場所を観察することができる。 As a method other than the above-mentioned endocytosis, a microinjection method can be applied. The microinjection method is a method in which a minute amount of DNA, mRNA, or chemical substance is injected into egg cells or somatic cells with a fine glass needle. This method may be used in this step. According to such a microinjection method, it is possible to enjoy the advantage that the number of particle probes or nanoparticle probes to be introduced can be adjusted to a desired number. In addition, since the particle probe or the nanoparticle probe is not confined in the vesicle, it is possible to observe every place in the cell.
さらに、遺伝子の導入方法として公知であるパーティクルガンを用いて生細胞内に粒子プローブまたはナノ粒子プローブを導入することも可能である。 Furthermore, it is also possible to introduce a particle probe or a nanoparticle probe into a living cell using a particle gun known as a gene introduction method.
本工程によって導入される粒子プローブまたはナノ粒子プローブの数は、流動場内で粒子プローブまたはナノ粒子プローブが均一に分散し得る数が導入されていればよく、その具体的な数は粒子プローブまたはナノ粒子プローブの粒子径、流動場の体積等によって決定されるため、特に限定されるものではない。粒子プローブまたはナノ粒子プローブが均一に分散しない場合、光学応答のシグナルがどの粒子プローブまたはナノ粒子プローブに由来するのかが特定できなくなってしまう。上記の意味から流動場に導入される粒子プローブまたはナノ粒子の数は１個であることが好ましいといえる。ただしこの場合、単位時間当たりに得られる粒子プローブまたはナノ粒子プローブの位置情報が少ないために、試料において粒子プローブの近傍に存在する物質の分布を検出するために、または三次元画像を得るためにある程度の時間を要する。しかし複数の粒子プローブまたはナノ粒子であっても十分濃度が低い場合には、複数の箇所を同時に計測できるため、複数の粒子を試料に導入して、検出速度または撮像速度を向上することができる。 The number of particle probes or nanoparticle probes introduced by this step is not limited as long as the number of particle probes or nanoparticle probes that can be uniformly dispersed in the flow field is introduced. Since it is determined by the particle diameter of the particle probe, the volume of the flow field, etc., it is not particularly limited. If the particle probe or nanoparticle probe is not uniformly dispersed, it becomes impossible to specify which particle probe or nanoparticle probe the signal of the optical response is derived from. From the above meaning, it can be said that the number of particle probes or nanoparticles introduced into the flow field is preferably one. However, in this case, since the position information of the particle probe or nanoparticle probe obtained per unit time is small, it is necessary to detect the distribution of substances existing in the vicinity of the particle probe in the sample or to obtain a three-dimensional image. It takes a certain amount of time. However, even with multiple particle probes or nanoparticles, if the concentration is low enough, multiple locations can be measured simultaneously, so multiple particles can be introduced into the sample to improve detection speed or imaging speed .
なお粒子プローブまたはナノ粒子プローブは光学応答のシグナル感度の向上や観察部位、物質を特定するため、表面修飾されていてもよい。例えば、カチオン性分子（陽性に帯電した分子）や、特定のタンパク質で表面修飾されていてもよい。それにより、観察対象となる物質や部位を制限することが可能となる。 Note that the particle probe or the nanoparticle probe may be surface-modified in order to improve the signal sensitivity of the optical response or specify the observation site or substance. For example, it may be surface-modified with a cationic molecule (positively charged molecule) or a specific protein. Thereby, it becomes possible to restrict the substances and parts to be observed.
本発明に適用可能な生細胞としては特に限定されるものではなくあらゆる細胞に適用可能である。例えば、マクロファージ細胞、ＨｅＬａ細胞などの癌細胞などに適用可能である。 The living cells applicable to the present invention are not particularly limited and can be applied to all cells. For example, the present invention can be applied to cancer cells such as macrophage cells and HeLa cells.
また、本発明に適用可能な生体組織としては特に限定されるものではなく、あらゆる生体組織を適用可能である。例えば、上皮組織、結合組織、筋肉組織、神経組織等の組織、胃、食道、腸等の臓器を適用可能である。 In addition, the living tissue applicable to the present invention is not particularly limited, and any living tissue can be applied. For example, tissues such as epithelial tissue, connective tissue, muscle tissue, nerve tissue, and organs such as stomach, esophagus and intestine are applicable.
＜２．光学応答検出工程＞
本工程は、粒子プローブまたはナノ粒子プローブ（以下、両者をまとめて単に「粒子プローブ」ともいう）の近傍に存在する物質の光学応答を経時的に検出することによって、試料における粒子プローブの位置情報および上記粒子プローブの近傍に存在する物質の情報を複数取得する工程である。<2. Optical response detection process>
In this step, the position information of the particle probe in the sample is detected by detecting the optical response of the substance existing in the vicinity of the particle probe or the nanoparticle probe (hereinafter, collectively referred to as “particle probe”) over time. And a step of acquiring a plurality of pieces of information on substances existing in the vicinity of the particle probe.
「粒子プローブの近傍に存在する物質の光学応答」とは、上記粒子プローブの近傍に存在する物質に入射された光（電磁波）の散乱光および蛍光のいずれか１つ以上を意味する。なお、上記光学応答は、粒子プローブの光学応答であってもよい。すなわち、粒子プローブに入射された光（電磁波）の散乱光および蛍光のいずれか１つ以上であってもよい。 The “optical response of a substance existing in the vicinity of the particle probe” means one or more of scattered light and fluorescence of light (electromagnetic wave) incident on the substance existing in the vicinity of the particle probe. The optical response may be an optical response of a particle probe. That is, any one or more of scattered light of light (electromagnetic wave) incident on the particle probe and fluorescence may be used.
粒子プローブの近傍に存在する物質の光学応答を特異的に検出することで、ある時点における試料中の粒子プローブの位置を点として表現することができるとともに、上記粒子プローブの近傍に存在する物質の情報を取得することができる。また、粒子プローブの近傍に存在する物質の光学応答を経時的に検出することで、点による粒子プローブの位置情報および上記粒子プローブの近傍に存在する物質の情報を複数個取得することができる。 By specifically detecting the optical response of the substance present in the vicinity of the particle probe, the position of the particle probe in the sample at a certain point in time can be expressed as a point, and the substance present in the vicinity of the particle probe can be expressed. Information can be acquired. Further, by detecting the optical response of the substance existing in the vicinity of the particle probe over time, it is possible to obtain a plurality of pieces of position information of the particle probe by points and information on the substance existing in the vicinity of the particle probe.
なお、本明細書において、粒子プローブの「近傍」とは、粒子プローブの表面から数十ｎｍまでの距離、より具体的には０ｎｍ〜２０ｎｍの距離にある範囲をいい、粒子プローブの位置も含む。この範囲では、粒子プローブに励起光を照射すると、粒子プローブから生じる表面プラズモンによって上記粒子プローブの近傍に存在する物質の光学応答が増強される。 In the present specification, the “near” of the particle probe means a range from the surface of the particle probe to several tens of nm, more specifically a range of 0 nm to 20 nm, and includes the position of the particle probe. . In this range, when the particle probe is irradiated with excitation light, the optical response of the substance existing in the vicinity of the particle probe is enhanced by surface plasmons generated from the particle probe.
また、本明細書において、上記「粒子プローブの近傍に存在する物質」とは、特に限定されるものではなく、生体由来試料または非生体試料を構成する物質であれば構わない。例えば、生体分子、基板材料等を挙げることができる。 In the present specification, the “substance present in the vicinity of the particle probe” is not particularly limited, and may be any substance that constitutes a biological sample or a non-biological sample. For example, biomolecules, substrate materials and the like can be mentioned.
さらに、本明細書において、上記「粒子プローブの近傍に存在する物質の情報」とは、上記粒子プローブの近傍に存在する物質に入射された光（電磁波）の散乱光および蛍光のいずれか１つ以上の強度またはスペクトルのことをいう。粒子プローブに励起光を照射すると、粒子プローブから生じる表面プラズモンによって、粒子プローブの近傍に存在する物質に入射された光（電磁波）の散乱光および蛍光のいずれか１つ以上が増強される。そこで、増強された上記強度またはスペクトルを解析することにより、上記粒子プローブの近傍にどのような物質が存在するかということを明らかにすることができる。すなわち、試料において粒子プローブ近傍に存在する物質の分布を検出することができる。 Further, in the present specification, the “information on the substance existing in the vicinity of the particle probe” means any one of scattered light and electromagnetic light incident on the substance existing in the vicinity of the particle probe and fluorescence. It refers to the above intensity or spectrum. When the particle probe is irradiated with excitation light, one or more of scattered light and fluorescence of light (electromagnetic waves) incident on a substance existing in the vicinity of the particle probe are enhanced by surface plasmons generated from the particle probe. Therefore, by analyzing the enhanced intensity or spectrum, it is possible to clarify what kind of substance exists in the vicinity of the particle probe. That is, the distribution of substances present in the vicinity of the particle probe in the sample can be detected.
粒子プローブは、原理的には自己の流動性（ブラウン運動、細胞内輸送、原形質流動等）を利用して試料内を移動するため、粒子プローブの近傍に存在する物質の光学応答を検出するために試料の全体もしくは一部の外的な走査をしなくても、プローブ自体が試料内を走査してくれる。それゆえ、例えば粒子プローブの位置情報および上記粒子プローブの近傍に存在する物質の情報を経時的に取得して、時間、位置および光学応答の関係をグラフ化すること等によって、試料における上記物質の三次元的な分布を知ることができる。また、後述する画像化工程において、粒子プローブの位置を示すこれらの点の情報（粒子プローブの位置情報）を重ね合わせることによって、試料の全体もしくは一部を画像化することができる。 The particle probe, in principle, uses its own fluidity (Brownian motion, intracellular transport, protoplasmic flow, etc.) to move through the sample, so it detects the optical response of substances in the vicinity of the particle probe. Therefore, the probe itself scans the inside of the sample without external scanning of the whole or a part of the sample. Therefore, for example, by acquiring the positional information of the particle probe and the information of the substance existing in the vicinity of the particle probe over time and graphing the relationship between the time, the position, and the optical response, etc. You can know the three-dimensional distribution. Further, in the imaging step described later, the information of these points indicating the position of the particle probe (position information of the particle probe) can be superposed to image the whole or a part of the sample.
より高精度で画像化を行うためには、上記粒子プローブの位置情報はできるだけ多いことが好ましい。したがって、光学応答のシグナルの検出は、断続的ではなく連続的に行うことが好ましいといえる。ただし、本発明は必ずしも連続的に光学応答のシグナル検出を行う必要はなく、断続的に光学応答のシグナルを検出してもよい。この場合、高精度で画像化を行うためは、できるだけ短時間間隔で検出を行い、できるだけ多くの粒子プローブの位置情報を得ることが肝要である。 In order to perform imaging with higher accuracy, it is preferable that the position information of the particle probe is as much as possible. Therefore, it can be said that the detection of the optical response signal is preferably performed continuously, not intermittently. However, in the present invention, it is not always necessary to continuously detect an optical response signal, and an optical response signal may be detected intermittently. In this case, in order to perform imaging with high accuracy, it is important to perform detection at intervals as short as possible and obtain as much position information as possible of the particle probes.
粒子プローブの近傍に存在する物質の光学応答を検出するための具体的方法は、特に限定されるものではないが、例えば、ラマン散乱検出法、レイリー散乱検出法、ミー散乱検出法および蛍光検出法からなる群から選択される１つ以上の方法が本工程において採用され得る。すなわち本工程における上記粒子プローブの近傍に存在する物質の光学応答を検出する方法は、１種類に限定されず複数の方法を組み合わせであってもよい。複数種類の方法を組み合わせることによって、粒子プローブの位置情報を１つの方法では検出できなくとも、他の方法で補完することができるため、より高精度で試料観察を行うことができる。 Although the specific method for detecting the optical response of the substance existing in the vicinity of the particle probe is not particularly limited, for example, Raman scattering detection method, Rayleigh scattering detection method, Mie scattering detection method, and fluorescence detection method One or more methods selected from the group consisting of can be employed in this step. That is, the method for detecting the optical response of the substance existing in the vicinity of the particle probe in this step is not limited to one type, and a plurality of methods may be combined. By combining a plurality of types of methods, even if the position information of the particle probe cannot be detected by one method, it can be complemented by another method, so that sample observation can be performed with higher accuracy.
なお上記ラマン散乱検出法には、通常のラマン散乱検出法のみならず、表面増強ラマン散乱法（ＳＥＲＳ）、共鳴ラマン散乱検出法、コヒーレントアンチストークスラマン散乱検出法、ハイパーラマン散乱検出法等の改変法も含まれる。また上記レイリー散乱検出法には、通常のレイリー散乱検出法のみならず、ハイパーレイリー散乱検出法等の改変法も含まれる。なお本工程においては、特にＳＥＲＳが好ましく採用され得る。ＳＥＲＳによれば粒子プローブに光が入射した際に誘起される表面プラズモンによって、ラマン散乱光の散乱断面積を数〜十数桁増強することができるため、通常のラマン散乱検出法より高感度に検出を行うことが可能である。よって、ＳＥＲＳを採用した場合、露光時間が比較的短時間で足りる。 The above-described Raman scattering detection method is not limited to the normal Raman scattering detection method, but is modified such as the surface enhanced Raman scattering method (SERS), the resonance Raman scattering detection method, the coherent anti-Stokes Raman scattering detection method, and the hyper Raman scattering detection method. Law is also included. The Rayleigh scattering detection method includes not only a normal Rayleigh scattering detection method but also a modification method such as a hyper Rayleigh scattering detection method. In this step, SERS can be preferably used. According to SERS, the surface plasmon induced when light enters the particle probe can increase the scattering cross section of the Raman scattered light by several to several tens of orders of magnitude. Therefore, it is more sensitive than the usual Raman scattering detection method. Detection can be performed. Therefore, when SERS is adopted, the exposure time is relatively short.
本工程を行う方法（ラマン散乱検出法、レイリー散乱検出法、ミー散乱検出法、蛍光検出法等）における好ましい条件は、試料の種類、粒子プローブの種類等に応じて異なるため、特に限定されるものではない。よって、好適な条件を適宜検討の上、採用すればよい。 Preferred conditions in the method of performing this step (Raman scattering detection method, Rayleigh scattering detection method, Mie scattering detection method, fluorescence detection method, etc.) are particularly limited because they vary depending on the type of sample, the type of particle probe, and the like. It is not a thing. Therefore, a suitable condition may be adopted after appropriate consideration.
本発明者らの検討によれば、試料として生細胞、ナノ粒子プローブとして金ナノ粒子（粒子径５０ｎｍ）、光学応答の検出方法としてＳＥＲＳを用いた場合、波長７８５ｎｍの光で励起を行うことが好ましいということが判明した。なお本発明はこれに限定されるものではないことは言うまでもない。 According to the study by the present inventors, when living cells are used as a sample, gold nanoparticles (particle diameter 50 nm) are used as a nanoparticle probe, and SERS is used as a method for detecting an optical response, excitation can be performed with light having a wavelength of 785 nm. It turned out to be preferable. Needless to say, the present invention is not limited to this.
また試料として生細胞、ナノ粒子プローブとして金ナノ粒子（粒子径５０ｎｍ）、光学応答の検出方法としてＳＥＲＳを用いた場合の好ましい励起光強度は、１〜３０ｍＷ／μｍ２の範囲が好ましく、１〜１０ｍＷ／μｍ２の範囲がさらに好ましい。上記好ましい範囲未満の強度であると高感度検出が困難な場合があり、また上記好ましい範囲を超えると生細胞に対して悪影響をおよぼす場合がある。なお本発明はこれに限定されるものではない。Moreover, the preferable excitation light intensity | strength at the time of using a living cell as a sample, a gold nanoparticle (particle diameter of 50 nm) as a nanoparticle probe, and SERS as a detection method of an optical response has the preferable range of 1-30 mW / micrometer 2 , The range of 10 mW / μm 2 is more preferable. When the intensity is less than the above preferable range, high-sensitivity detection may be difficult, and when it exceeds the above preferable range, there may be an adverse effect on living cells. The present invention is not limited to this.
また試料として生細胞、ナノ粒子プローブとして金ナノ粒子（粒子径５０ｎｍ）、光学応答の検出方法としてＳＥＲＳを用いた場合の好ましい露光時間は、特に限定されるものではないが、１分以下が好ましく、１秒以下がさらに好ましい。上記好ましい範囲未満であると検出されるシグナルの強度が弱い場合があり、また上記好ましい範囲を超えると生細胞に対して悪影響をおよぼす場合がある。なお本発明はこれに限定されるものではない。 Further, the preferred exposure time when using live cells as a sample, gold nanoparticles (particle diameter 50 nm) as a nanoparticle probe, and SERS as a method for detecting an optical response is not particularly limited, but preferably 1 minute or less. 1 second or less is more preferable. The intensity of the detected signal may be weak if it is less than the above preferred range, and if it exceeds the above preferred range, it may adversely affect live cells. The present invention is not limited to this.
＜３．画像化工程＞
本工程は、上記光学応答検出工程において取得された複数の粒子プローブまたはナノ粒子プローブの位置情報を重ね合わせて画像化する工程である。換言すれば本工程は、光学応答検出工程によって得られた粒子プローブまたはナノ粒子プローブの位置を示す複数の点の情報を重ね合わせることによって、試料の画像を形成する工程である。<3. Imaging process>
This step is a step in which the positional information of the plurality of particle probes or nanoparticle probes acquired in the optical response detection step is superimposed and imaged. In other words, this step is a step of forming an image of the sample by superimposing information on a plurality of points indicating the position of the particle probe or nanoparticle probe obtained by the optical response detection step.
図１を用い本工程をより具体的に説明する。なお本発明は説明の容易のために二次元的に存在するサンプルを用い二次元の画像を形成する場合を示しているが、本発明は三次元的に存在するサンプルに採用すれば、三次元の画像を形成することができる。図１の１は試料を示し、２は粒子プローブまたはナノ粒子プローブの光学応答のシグナルを示す（同図において同様のものを示す場合は部材番号を省略する）。図１（ａ）における複数のシート（３）は光学応答検出工程における、ある時点の試料における粒子プローブまたはナノ粒子プローブの位置を示す点の情報である。各シート上にシート番号を表記する（１、２、３、４、・・・ｎ）。図１（ｂ）は１からｎ番目のシートを重ね合わせて得られた試料（１）の画像を示す（１＋２＋３＋４＋・・・＋ｎ）。粒子プローブまたはナノ粒子プローブの位置を示す複数の点の情報を重ね合わせることによって、試料を画像化することを図１は示している。 This process will be described more specifically with reference to FIG. Note that the present invention shows a case where a two-dimensional image is formed using a sample that exists two-dimensionally for ease of explanation, but the present invention is a three-dimensional image if it is applied to a sample that exists three-dimensionally. Images can be formed. 1 in FIG. 1 indicates a sample, and 2 indicates a signal of an optical response of a particle probe or a nanoparticle probe (a member number is omitted when the same is shown in FIG. 1). A plurality of sheets (3) in FIG. 1A is point information indicating the position of the particle probe or nanoparticle probe in the sample at a certain point in the optical response detection step. A sheet number is written on each sheet (1, 2, 3, 4,... N). FIG. 1B shows an image of the sample (1) obtained by superimposing the 1st to nth sheets (1 + 2 + 3 + 4 +... + N). FIG. 1 illustrates imaging a sample by superimposing multiple points of information indicating the position of a particle probe or nanoparticle probe.
本工程において粒子プローブまたはナノ粒子プローブの位置情報を重ね合わせる手段としては、特に限定されるものではなく、市販や無料の画像処理ソフト（例えば、Adobe社製Photoshop、米NIH製ImageJが利用可能である。また上記の目的を達成し得るソフトウェアを自己で作成して、それを本工程において利用してもよい。 The method of superimposing the position information of the particle probe or nanoparticle probe in this step is not particularly limited, and commercially available or free image processing software (for example, Photoshop by Adobe, ImageJ by NIH, can be used). In addition, software that can achieve the above-mentioned object may be created by itself and used in this process.
＜４．本発明にかかる方法を実施するための装置＞
本発明にかかる、試料において粒子プローブの近傍に存在する物質の分布を検出する方法を実施するための装置は、試料内における粒子プローブの位置を決定する位置決定手段と、上記位置決定手段によって位置を決定された粒子プローブに光を照射し、上記粒子プローブの近傍に存在する物質から散乱光および蛍光のいずれか１つ以上を発生させる照射手段と、上記照射手段から照射される光、上記散乱光および蛍光からなる群より選ばれるいずれか１以上の光の光路を変更可能な光路変更手段と、上記散乱光および蛍光のいずれか１つ以上を検出するための検出手段と、を備えている。<4. Apparatus for carrying out the method according to the present invention>
An apparatus for carrying out a method for detecting a distribution of a substance present in the vicinity of a particle probe in a sample according to the present invention includes a position determining means for determining the position of the particle probe in the sample, and a position determined by the position determining means. Irradiating means for irradiating the particle probe with light and generating one or more of scattered light and fluorescence from a substance existing in the vicinity of the particle probe; and the light irradiated from the irradiating means and the scattering An optical path changing means capable of changing the optical path of any one or more light selected from the group consisting of light and fluorescence, and a detecting means for detecting any one or more of the scattered light and the fluorescence. .
上記位置決定手段としては、試料の流動場に導入された粒子プローブの位置を経時的に観察できる手段であれば、特に限定されるものではない。例えば、暗視野顕微鏡、位相差顕微鏡、微分干渉顕微鏡等の従来公知の顕微鏡を用いることができる。中でも、可視光の波長よりも小さな物体の存在を高いコントラストで観察可能であるため、暗視野顕微鏡を用いることが好ましい。 The position determining means is not particularly limited as long as the position of the particle probe introduced into the flow field of the sample can be observed over time. For example, a conventionally known microscope such as a dark field microscope, a phase contrast microscope, or a differential interference microscope can be used. Among them, it is preferable to use a dark field microscope because the presence of an object smaller than the wavelength of visible light can be observed with high contrast.
また、粒子の散乱光や蛍光を分割ディテクターで検出する方法である、粒子トラッキング法や、粒子の加熱による試料の屈折率変化を利用したトラッキング法、などの方法を実施できる装置（本明細書において「粒子追跡装置」と称する）を用いることも可能である。上記方法では、カメラで観察像を取得することなく粒子プローブの位置を測定することができる。そのため、粒子追跡装置を用いる場合は、顕微鏡を用いる場合のような画像処理を行わずに粒子プローブの位置を測定することができる。 In addition, an apparatus that can perform a method such as a particle tracking method, which is a method of detecting scattered light or fluorescence of a particle with a split detector, or a tracking method using a change in the refractive index of a sample due to particle heating (in this specification, It is also possible to use a “particle tracking device”. In the above method, the position of the particle probe can be measured without acquiring an observation image with a camera. Therefore, when the particle tracking device is used, the position of the particle probe can be measured without performing image processing as in the case of using a microscope.
上記照射手段は、粒子プローブに照射することによって、上記粒子プローブの近傍に存在する物質から散乱光および蛍光のいずれか１つ以上を発生させることができるような励起光を照射できるものであればよく、従来公知の光源、例えばレーザー光源や水銀灯等を用いることができる。上記粒子プローブに励起光が照射されることによって、上記粒子プローブの近傍に存在する物質の光学応答が生じる。このとき、粒子プローブから表面プラズモンが生じ、上記物質の光学応答が増強される。 As long as the irradiation means can irradiate the particle probe with excitation light that can generate one or more of scattered light and fluorescence from a substance present in the vicinity of the particle probe. Well-known light sources such as laser light sources and mercury lamps can be used. When the particle probe is irradiated with excitation light, an optical response of a substance existing in the vicinity of the particle probe is generated. At this time, surface plasmon is generated from the particle probe, and the optical response of the substance is enhanced.
レーザーを用いる場合、レーザーの種類は特に限定されるものではなく、固体レーザー、気体レーザー、色素レーザー、半導体レーザーなどを用いることができ、照射したい光波の種類によって、連続波レーザー、パルスレーザー、同調可能レーザー、モードロックレーザー等を適宜選択することができる。 When using a laser, the type of laser is not particularly limited, and a solid laser, gas laser, dye laser, semiconductor laser, etc. can be used. Depending on the type of light wave to be irradiated, continuous wave laser, pulse laser, tuning Possible lasers, mode-locked lasers, and the like can be selected as appropriate.
光学応答検出工程の項で述べたように、本発明にかかる方法では、粒子プローブの近傍に存在する物質の光学応答を検出するための具体的方法は特に限定されるものではなく、試料、用いる粒子プローブの種類、光学応答の検出方法等の条件に応じて異なる。そのため、該条件に応じて適切な照射手段を適宜選択すればよい。 As described in the section of the optical response detection step, in the method according to the present invention, the specific method for detecting the optical response of the substance existing in the vicinity of the particle probe is not particularly limited, and a sample is used. It differs depending on conditions such as the type of particle probe and the detection method of the optical response. Therefore, an appropriate irradiation means may be appropriately selected according to the conditions.
例えば、上述のように、試料として生細胞、ナノ粒子プローブとして金ナノ粒子（粒子径５０ｎｍ）、光学応答の検出方法としてＳＥＲＳを用いた場合は、波長７８５ｎｍの光で励起を行うことが好ましく、励起光強度は、１〜３０ｍＷ／μｍ２の範囲が好ましく、１〜１０ｍＷ／μｍ２の範囲がさらに好ましいため、このような波長、励起光強度を持つ光を照射可能な照射手段を選択すればよい。For example, as described above, when using live cells as a sample, gold nanoparticles (particle diameter 50 nm) as a nanoparticle probe, and SERS as a method for detecting an optical response, excitation with light with a wavelength of 785 nm is preferable, excitation light intensity is preferably in the range of 1 to 30 mW / [mu] m 2, because more preferably in the range of 1~10mW / μm 2, this wavelength, by selecting the irradiating means capable of irradiating light having an excitation light intensity Good.
光路変更手段は、上記照射手段から照射される光、上記散乱光および蛍光からなる群より選ばれるいずれか１以上の光の光路を変更するためのものである。本発明の方法では、粒子プローブは流動場を移動する性質を有するため、粒子プローブが位置決定手段によって決定された位置に存在する間に、当該粒子プローブに光を照射できるようにする必要がある。 The optical path changing means is for changing the optical path of any one or more light selected from the group consisting of the light irradiated from the irradiation means, the scattered light and the fluorescence. In the method of the present invention, since the particle probe has a property of moving in the flow field, it is necessary to be able to irradiate the particle probe with light while the particle probe exists at the position determined by the position determining means. .
光路変更手段は、照射手段からの光を、位置決定手段によって決定された上記位置に照射できるよう、照射手段からの光の光路を適宜変更できるように構成されている。そのような光路変更手段としては、例えばガルバノミラー、音響光学偏光器などを用いることができる。ガルバノミラーは、軸に固定された自由に回転可能なミラーであり、光路を連続的に変化させることができる。 The optical path changing unit is configured to appropriately change the optical path of the light from the irradiating unit so that the light from the irradiating unit can be applied to the position determined by the position determining unit. As such an optical path changing means, for example, a galvanometer mirror, an acousto-optic polarizer or the like can be used. The galvanometer mirror is a freely rotatable mirror fixed to the shaft, and can continuously change the optical path.
そこで、位置決定手段によって決定された位置の情報を上記光路変更手段に常にフィードバックしておき、粒子プローブの移動速度に対して十分に速い速度で光路を変更させ、上記位置決定手段によって決定された位置に存在する粒子プローブに光を照射する。これにより、上記位置に存在する粒子プローブの近傍に存在する物質から散乱光および蛍光のいずれか１つ以上を発生させることができる。よって、位置決定手段による粒子プローブの位置決定と、照射手段による粒子プローブへの光の照射を同時に行うことができる。なお、上記フィードバックおよび光路の変更は、例えば、位置決定手段からの位置情報に基づき、コンピュータ等によって光路変更手段の位置を粒子プローブに光を照射可能な位置に制御することによって実現することができる。 Therefore, the position information determined by the position determining means is always fed back to the optical path changing means, the optical path is changed at a sufficiently high speed relative to the moving speed of the particle probe, and the position determining means is determined. Light is irradiated to the particle probe existing at the position. Thereby, any one or more of the scattered light and the fluorescence can be generated from the substance existing in the vicinity of the particle probe existing at the position. Therefore, the position determination of the particle probe by the position determination means and the irradiation of the light to the particle probe by the irradiation means can be performed simultaneously. The feedback and the change of the optical path can be realized, for example, by controlling the position of the optical path changing means to a position where the particle probe can be irradiated with light based on the position information from the position determining means. .
上記光路変更手段は、照射手段から照射される光だけではなく、上記粒子プローブの近傍に存在する物質から発生した上記散乱光の光路および蛍光の光路をも変更しうる。これにより、粒子プローブの位置に関わらず、上記散乱光および蛍光を、後述する検出手段に確実に導くことができる。 The optical path changing unit can change not only the light irradiated from the irradiation unit but also the optical path of the scattered light and the optical path of the fluorescence generated from the substance existing in the vicinity of the particle probe. Thereby, regardless of the position of the particle probe, the scattered light and fluorescence can be reliably guided to the detection means described later.
検出手段は、上記散乱光および蛍光のいずれか１つ以上を検出するためのものである。検出手段により、上記散乱光および蛍光のいずれか１つ以上の強度もしくはスペクトルが測定され、当該強度もしくはスペクトルが、試料において粒子プローブの近傍に存在する物質の情報となる。上述のように、本装置では、位置決定手段による粒子プローブの位置決定と、照射手段による粒子プローブへの光の照射とを同時に行うことができるため、位置決定手段による粒子プローブの位置決定と、上記散乱光および蛍光のいずれか１つ以上の検出とを同時に行うことができる。 The detection means is for detecting one or more of the scattered light and fluorescence. One or more intensities or spectra of the scattered light and fluorescence are measured by the detecting means, and the intensities or spectra become information on a substance existing in the vicinity of the particle probe in the sample. As described above, in the present apparatus, the position determination unit can determine the position of the particle probe and the irradiation unit can irradiate the particle probe with light simultaneously. Any one or more of the scattered light and fluorescence can be detected simultaneously.
上記散乱光および蛍光のいずれか１つ以上を検出するための具体的方法は、光学応答検出工程の項で述べたように、特に限定されるものではない。そのため、上記検出手段は、上記具体的方法に応じて、従来公知の検出手段を適宜選択して用いることができる。例えば、上記具体的方法がラマン分光法である場合は、検出手段として分光器およびＣＣＤカメラを用いることができる。この場合、上記粒子プローブの近傍に存在する物質から発せられた散乱光が分光器によって分光され、ラマン散乱光がＣＣＤカメラによって測定される。 A specific method for detecting one or more of the scattered light and fluorescence is not particularly limited as described in the section of the optical response detection step. Therefore, as the detection means, conventionally known detection means can be appropriately selected and used according to the specific method. For example, when the specific method is Raman spectroscopy, a spectroscope and a CCD camera can be used as detection means. In this case, scattered light emitted from a substance existing in the vicinity of the particle probe is dispersed by a spectroscope, and Raman scattered light is measured by a CCD camera.
以下に、本発明にかかる装置の一実施形態を、図２９に基づき説明する。ただし、図２９に示す構成はあくまで一例であり、本発明はこれに限定されるものではない。図２９において、１００は本発明にかかる方法を実施するための装置、４は暗視野顕微鏡（位置決定手段）、５はレーザー光源（照射手段）、６はガルバノミラー（光路変更手段）、７は検出手段、８は分光器、９はＣＣＤカメラ、１０はハロゲンランプ、１１は暗視野コンデンサー、１２は対物レンズ、１３はダイクロイックミラー、１４は結像レンズ、１５はアイリス、１６はエッジフィルター、１７はリレーレンズ、１８はコンピュータ、１９は市販のミラーである。コンピュータ１８は、暗視野顕微鏡（位置決定手段）４、レーザー光源（照射手段）５、ガルバノミラー（光路変更手段）６、検出手段７、の各手段と接続されており、これらの各手段からの情報を入力できると共に、これらの各手段を制御可能なように接続されている。 Below, one Embodiment of the apparatus concerning this invention is described based on FIG. However, the configuration shown in FIG. 29 is merely an example, and the present invention is not limited to this. 29, 100 is an apparatus for carrying out the method according to the present invention, 4 is a dark field microscope (position determining means), 5 is a laser light source (irradiating means), 6 is a galvanometer mirror (optical path changing means), and 7 is Detection means, 8 is a spectroscope, 9 is a CCD camera, 10 is a halogen lamp, 11 is a dark field condenser, 12 is an objective lens, 13 is a dichroic mirror, 14 is an imaging lens, 15 is an iris, 16 is an edge filter, 17 Is a relay lens, 18 is a computer, and 19 is a commercially available mirror. The computer 18 is connected to each of a dark field microscope (position determining means) 4, a laser light source (irradiating means) 5, a galvanometer mirror (optical path changing means) 6, and a detecting means 7. It is connected so that information can be input and each of these means can be controlled.
暗視野顕微鏡（位置決定手段）４は、ハロゲンランプ１０から、暗視野コンデンサー１１を介して試料１に光を照射し、対物レンズ１２、ダイクロイックミラー１３、結像レンズ１４を透過した光を市販のミラー１９で反射してリレーレンズ１７およびアイリス１５に導いた後、ＣＣＤカメラ９で撮像し、暗視野像を得る。当該暗視野像を観察することにより、粒子プローブの位置を決定することができる。なお、ダイクロイックミラー１３としては、特に限定されるものではないが、例えば、レーザー光源（照射手段）５として波長６７５ｎｍのレーザー光を照射可能な光源を利用して試料１からのラマン散乱光を計測する場合、４００ｎｍ〜６１０ｎｍにおいて透過率が９０％以上、６７５ｎｍ〜９３０ｎｍにおいて反射率が９５％以上のダイクロイックミラーを好適に用いることができる。 The dark field microscope (position determining means) 4 irradiates the sample 1 with light from the halogen lamp 10 through the dark field condenser 11, and transmits the light transmitted through the objective lens 12, the dichroic mirror 13, and the imaging lens 14 on the market. After being reflected by the mirror 19 and guided to the relay lens 17 and the iris 15, the image is taken by the CCD camera 9 to obtain a dark field image. By observing the dark field image, the position of the particle probe can be determined. The dichroic mirror 13 is not particularly limited. For example, the Raman scattered light from the sample 1 is measured using a light source capable of irradiating a laser beam having a wavelength of 675 nm as the laser light source (irradiation means) 5. In this case, a dichroic mirror having a transmittance of 90% or more at 400 nm to 610 nm and a reflectance of 95% or more at 675 nm to 930 nm can be suitably used.
次に、暗視野像の観察により決定された粒子プローブの位置にレーザー光を照射できるように、コンピュータ１８からの指令によりガルバノミラー（光路変更手段）６を回動させる。レーザー光源（照射手段）５から照射され、ガルバノミラー（光路変更手段）６によって反射されたレーザー光は、リレーレンズ１７を透過し、市販のミラー１９によって反射される。さらにリレーレンズ１７によって透過された後、エッジフィルター１６およびガルバノミラー（光路変更手段）６によって反射され、リレーレンズ１７および結像レンズ１４を透過後、ダイクロイックミラー１３によってさらに反射され、対物レンズ１２を透過して、試料１における上記粒子プローブの位置に照射される。 Next, the galvano mirror (optical path changing means) 6 is rotated by a command from the computer 18 so that the laser beam can be irradiated to the position of the particle probe determined by observing the dark field image. The laser light emitted from the laser light source (irradiating means) 5 and reflected by the galvanometer mirror (optical path changing means) 6 passes through the relay lens 17 and is reflected by a commercially available mirror 19. Further, after being transmitted by the relay lens 17, it is reflected by the edge filter 16 and the galvanometer mirror (optical path changing means) 6, is transmitted through the relay lens 17 and the imaging lens 14, is further reflected by the dichroic mirror 13, and the objective lens 12 is The light is transmitted and irradiated to the position of the particle probe in the sample 1.
この際、暗視野顕微鏡（位置決定手段）４によって決定された粒子プローブの位置についての情報を、コンピュータ１８を介して上記ガルバノミラー（光路変更手段）６に常にフィードバックしておく。そして、コンピュータ１８からの指令によって粒子プローブの移動速度に対して十分に速い速度でガルバノミラー（光路変更手段）６を回動させ、上記暗視野顕微鏡（位置決定手段）４によって決定された位置に存在する粒子プローブに光を照射する。これにより、暗視野顕微鏡（位置決定手段）４による粒子プローブの位置決定と、レーザー光源（照射手段）５による粒子プローブの位置への光の照射とを同時に行うことができる。 At this time, information on the position of the particle probe determined by the dark field microscope (position determining means) 4 is always fed back to the galvanometer mirror (optical path changing means) 6 via the computer 18. Then, the galvanometer mirror (optical path changing means) 6 is rotated at a sufficiently high speed with respect to the moving speed of the particle probe by a command from the computer 18, and the position determined by the dark field microscope (position determining means) 4 is reached. An existing particle probe is irradiated with light. Thereby, the position determination of the particle probe by the dark field microscope (position determination means) 4 and the light irradiation to the position of the particle probe by the laser light source (irradiation means) 5 can be performed simultaneously.
粒子プローブの位置における試料からは、レーザー光の照射によって、粒子プローブにより増強された散乱光および蛍光のいずれか１つ以上が散乱される。散乱光および蛍光のいずれか１つ以上は、ダイクロイックミラー１３によって反射され、結像レンズ１４およびリレーレンズ１７を透過後ガルバノミラー（光路変更手段）６によって反射され、エッジフィルター１６によってレイリー散乱光が除去された後、分光器８によって分光され、ＣＣＤカメラ９によって測定される。 From the sample at the position of the particle probe, one or more of scattered light and fluorescence enhanced by the particle probe are scattered by the irradiation of the laser beam. One or more of the scattered light and the fluorescent light is reflected by the dichroic mirror 13, passes through the imaging lens 14 and the relay lens 17, is reflected by the galvano mirror (optical path changing means) 6, and Rayleigh scattered light is reflected by the edge filter 16. After removal, the light is dispersed by the spectroscope 8 and measured by the CCD camera 9.
このように、本発明にかかる装置１００は、暗視野顕微鏡（位置決定手段）４、レーザー光源（照射手段）５および検出手段７を備えるため、粒子プローブの位置を計測するための観察と試料の物質情報を取得するための光学応答の観察とを同時に行うことができる。その結果、粒子プローブの位置情報の取得と、その位置における、上記粒子プローブの近傍に存在する物質の情報の取得とを同時に行うことができる。また、粒子プローブの近傍に存在する物質の光学応答を経時的に検出することで、点による粒子プローブの位置情報および上記粒子プローブの近傍に存在する物質の情報を複数個取得することができる。なお、粒子プローブの位置情報を重ね合わせて画像化することが必要な場合は、上述の市販や無料の画像処理ソフトを利用すればよい。 Thus, since the apparatus 100 according to the present invention includes the dark field microscope (position determining means) 4, the laser light source (irradiating means) 5, and the detecting means 7, the observation for measuring the position of the particle probe and the sample It is possible to simultaneously observe an optical response for acquiring substance information. As a result, acquisition of the position information of the particle probe and acquisition of information on the substance existing in the vicinity of the particle probe at that position can be performed simultaneously. Further, by detecting the optical response of the substance existing in the vicinity of the particle probe over time, it is possible to obtain a plurality of pieces of position information of the particle probe by points and information on the substance existing in the vicinity of the particle probe. If it is necessary to superimpose the position information of the particle probe to form an image, the above-described commercially available or free image processing software may be used.
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることは言うまでもない。 Examples will be shown below, and the embodiments of the present invention will be described in more detail. Of course, the present invention is not limited to the following examples, and it goes without saying that various aspects are possible in detail.
〔実験例１：各種細胞へのエンドサイトーシスによる金ナノ粒子の導入の検討〕
本実験例では試料として、マウス由来のマクロファージ細胞、神経細胞様モデル細胞ＰＣ１２細胞（ラット副腎髄褐色細胞腫由来）、ヒト乳がん由来ＭＣＦ７細胞、ＨｅＬａ細胞（非食細胞）を用い、それぞれの細胞へエンドサイトーシスによる金ナノ粒子の導入を行った。[Experimental Example 1: Examination of introduction of gold nanoparticles into various cells by endocytosis]
In this experimental example, mouse-derived macrophage cells, neuronal cell-like model cells PC12 cells (derived from rat adrenal medullary pheochromocytoma), human breast cancer-derived MCF7 cells, HeLa cells (non-phagocytic cells) were used as samples. Gold nanoparticles were introduced by endocytosis.
＜方法＞
石英ガラス製のガラスボトムディッシュに、各種細胞をそれぞれ播種し、細胞がディッシュの基板に接着するまでインキュベータ中で培養した。細胞の基板上への接着を確認後、５０ｎｍの粒子径の金ナノ粒子を４．５×１０11個/mlの密度で含有する金コロイド溶液を２００μl、培地中に添加し１日間培養を行った。<Method>
Various types of cells were seeded on a glass bottom dish made of quartz glass and cultured in an incubator until the cells adhered to the dish substrate. After confirming the adhesion of the cells to the substrate, 200 μl of a gold colloid solution containing gold nanoparticles with a particle size of 50 nm at a density of 4.5 × 10 11 particles / ml was added to the medium and cultured for 1 day. It was.
＜結果＞
金ナノ粒子の導入を試みた細胞を、暗視野顕微鏡を用いて観察した。図２は金ナノ粒子とともに１日間培養したマクロファージ細胞の暗視野像である。図２（ａ）は金ナノ粒子を導入する前のマクロファージ細胞のみの暗視野像であり、図２（ｂ）は金ナノ粒子導入後のマクロファージ細胞の暗視野像である。<Result>
Cells that attempted to introduce gold nanoparticles were observed using a dark field microscope. FIG. 2 is a dark field image of macrophage cells cultured for 1 day with gold nanoparticles. FIG. 2 (a) is a dark field image of only macrophage cells before introducing gold nanoparticles, and FIG. 2 (b) is a dark field image of macrophage cells after introducing gold nanoparticles.
図２において金ナノ粒子は明るい粒子として表される（カラー画像においては金ナノ粒子は赤色の粒子として観察される）。図２（ｂ）によれば、細胞内に金ナノ粒子が多数導入されたことが確認された。なお金ナノ粒子は４００〜５００ｎｍの波長に吸収を有するため、それ以外の波長の光を散乱し、金ナノ粒子が暗視野観察で赤色に観察される。 In FIG. 2, the gold nanoparticles are represented as bright particles (in the color image, the gold nanoparticles are observed as red particles). According to FIG. 2 (b), it was confirmed that many gold nanoparticles were introduced into the cells. Since gold nanoparticles have absorption at a wavelength of 400 to 500 nm, light of other wavelengths is scattered and the gold nanoparticles are observed in red by dark field observation.
さらに、金ナノ粒子が導入されたマクロファージ細胞の透過型電子顕微鏡（Transmission electron microscope：ＴＥＭ）観察を行った。その結果を図３に示す。図３（ａ）は金ナノ粒子を導入する前のマクロファージ細胞のＴＥＭ像であり、（ｂ）は金ナノ粒子導入後のマクロファージ細胞のＴＥＭ像である。なお切片の厚さは１００ｎｍである。ＴＥＭ像においてもマクロファージ細胞内に導入された金ナノ粒子が確認できた（図３（ｂ）中の丸印および矢印部を参照のこと）。図３（ｃ）には細胞内に観察された金ナノ粒子の拡大図を示した。 Furthermore, the transmission electron microscope (TEM) observation of the macrophage cell into which the gold nanoparticle was introduced was performed. The result is shown in FIG. FIG. 3A is a TEM image of macrophage cells before introducing gold nanoparticles, and FIG. 3B is a TEM image of macrophage cells after introducing gold nanoparticles. The thickness of the slice is 100 nm. Also in the TEM image, the gold nanoparticles introduced into the macrophage cells could be confirmed (see the circles and arrows in FIG. 3B). FIG. 3C shows an enlarged view of the gold nanoparticles observed in the cells.
図４にＨｅＬａ細胞の結果を示す。図４（ａ）は金ナノ粒子を導入する前のＨｅＬａ細胞の暗視野像であり、図４（ｂ）は金ナノ粒子導入後のＨｅＬａ細胞の暗視野像である。図４（ｂ）によれば、細胞内に金ナノ粒子が導入されたことが確認された。 FIG. 4 shows the results of HeLa cells. 4 (a) is a dark field image of HeLa cells before introducing gold nanoparticles, and FIG. 4 (b) is a dark field image of HeLa cells after introducing gold nanoparticles. According to FIG.4 (b), it was confirmed that the gold nanoparticle was introduce | transduced in the cell.
また、金ナノ粒子が導入されたＨｅＬａ細胞の透過型電子顕微鏡（Transmission electron microscope：ＴＥＭ）観察を行った。その結果を図５に示す。図５（ａ）および（ｂ）は金ナノ粒子を培地に添加３０分後のＨｅＬａ細胞のＴＥＭ像である。なお切片の厚さは１００ｎｍである。図５によれば金ナノ粒子添加３０分後にはすでに、細胞内に金ナノ粒子が導入されていることが分かった（図５中の丸印を参照のこと）。また、図５中矢印で示す箇所では、エンドサイトーシスにより金ナノ粒子がＨｅＬａ細胞に取り込まれる瞬間の様子が観察された。 In addition, transmission electron microscope (TEM) observation of HeLa cells into which gold nanoparticles were introduced was performed. The result is shown in FIG. FIGS. 5A and 5B are TEM images of HeLa cells 30 minutes after adding gold nanoparticles to the medium. The thickness of the slice is 100 nm. According to FIG. 5, it was found that gold nanoparticles were already introduced into the cells 30 minutes after the addition of the gold nanoparticles (see the circle in FIG. 5). Moreover, in the part shown by the arrow in FIG. 5, the mode of the moment when a gold nanoparticle is taken in into a HeLa cell by endocytosis was observed.
その他の細胞について金ナノ粒子の導入後の暗視野顕微鏡像を図６に示す。図６（ａ）は神経細胞様モデル細胞ＰＣ１２細胞（ラット副腎髄褐色細胞腫由来）の結果であり、（ｂ）はヒト乳がん由来ＭＣＦ７細胞の結果である。ＰＣ１２細胞およびＭＣＦ７細胞はともに非食細胞である。図６によれば両細胞ともに、金ナノ粒子が細胞内にエンドサイトーシスにより導入されていることがわかった。 FIG. 6 shows dark field microscopic images after introduction of gold nanoparticles for other cells. FIG. 6 (a) shows the results of neuron-like model cell PC12 cells (derived from rat adrenal pheochromocytoma), and (b) shows the results of human breast cancer-derived MCF7 cells. Both PC12 cells and MCF7 cells are non-phagocytic cells. According to FIG. 6, it was found that gold nanoparticles were introduced into the cells by endocytosis in both cells.
〔実験例２：マイクロインジェクション法を用いたＨｅＬａ細胞への金ナノ粒子の導入の検討〕
マイクロインジェクション法を用いて、ＨｅＬａ細胞へ金ナノ粒子を導入することを検討した。マイクロガラスピペットを細胞膜表面に密着させ、ピペット内に吸引力を与えることで細胞膜の一部を破壊し、ピペット内部と細胞膜が一体化したホールセルと呼ばれる状態を作る。この時、マイクロガラスピペット中は金コロイドで満たしておく。このホールセル状態では、金コロイドが自然と細胞内溶液中と混ざり合い、金ナノ粒子が細胞内に導入される。マイクロガラスピペットをはずすと、破れてピペット内に張り付いていた細胞膜は再び繋がり元のように復元されるため、細胞はすぐには細胞死には至らない。[Experimental example 2: Examination of introduction of gold nanoparticles into HeLa cells using microinjection method]
The introduction of gold nanoparticles into HeLa cells using a microinjection method was examined. A micro glass pipette is brought into close contact with the cell membrane surface, and a part of the cell membrane is destroyed by applying a suction force in the pipette to create a state called a whole cell in which the inside of the pipette and the cell membrane are integrated. At this time, the micro glass pipette is filled with colloidal gold. In this whole cell state, the gold colloid naturally mixes with the intracellular solution, and gold nanoparticles are introduced into the cell. When the micro glass pipette is removed, the cell membrane that has been broken and stuck in the pipette is reconnected and restored to its original state, so that the cell does not immediately die.
＜方法＞
（マイクロインジェクション）
パッチクランプの装置を用い、マイクロガラスピペットによって導入を行った。石英製ガラスボトムディッシュにＨｅＬａ細胞を播種し、ディッシュの基板上に細胞が接着するまで培養を行った。細胞の基板上への接着を確認後、５０ｎｍの粒子径の金ナノ粒子を４．５×１０11個/mlの密度で含有する金コロイド溶液で満たしたマイクロガラスピペットを用いてホールセル状態をつくり、３分間保持した後にピペットをとりはずした（図７を参照のこと）。<Method>
(Microinjection)
The introduction was performed by means of a microglass pipette using a patch clamp device. HeLa cells were seeded on a quartz glass bottom dish and cultured until the cells adhered to the dish substrate. After confirming the adhesion of the cells to the substrate, the whole cell state was determined using a micro glass pipette filled with a gold colloid solution containing gold nanoparticles having a particle size of 50 nm at a density of 4.5 × 10 11 particles / ml. After making and holding for 3 minutes, the pipette was removed (see FIG. 7).
（細胞内への金ナノ粒子導入の確認）
走査型レーザー顕微鏡（Laser Scan Microscope：ＬＳＭ）を用いてＨｅＬａ細胞への金ナノ粒子の導入確認を行った。ＬＳＭはレーザー光を光源とする顕微鏡である。試料面をレーザーで走査してその焦点面の蛍光や反射光の空間分布を記録し、コンピュータを通してその切片画像を再現することにより画像が得られる。(Confirmation of introduction of gold nanoparticles into cells)
The introduction of gold nanoparticles into HeLa cells was confirmed using a scanning laser microscope (LSM). LSM is a microscope using laser light as a light source. An image can be obtained by scanning the sample surface with a laser, recording the spatial distribution of fluorescence and reflected light on the focal plane, and reproducing the slice image through a computer.
＜結果＞
図８にマイクロインジェクション法により金ナノ粒子が導入されたＨｅＬａ細胞のＬＳＭ像を示す。図８（ａ）はＨｅＬａ細胞の散乱が可視化できるように像のコントラストを調整したＬＳＭ像であり、（ｂ）は金ナノ粒子の散乱が可視化できるように像のコントラストを調整したＬＳＭ像であり、（ｃ）は（ａ）のＬＳＭ像と（ｂ）のＬＳＭ像とを重ね合わせた像である。<Result>
FIG. 8 shows an LSM image of HeLa cells into which gold nanoparticles have been introduced by the microinjection method. FIG. 8A is an LSM image in which the contrast of the image is adjusted so that the scattering of the HeLa cells can be visualized, and FIG. 8B is an LSM image in which the contrast of the image is adjusted so that the scattering of the gold nanoparticles can be visualized. (C) is an image obtained by superimposing the LSM image of (a) and the LSM image of (b).
図８によれば、マイクロインジェクションが行われたＨｅＬａ細胞（図８（ａ）中、矢印で示す）のみに金ナノ粒子の分布が確認され（図８（ｃ）中、色の濃い部分）、マイクロインジェクション法によって金ナノ粒子が、ＨｅＬａ細胞に導入されたことが確認できた。 According to FIG. 8, the distribution of the gold nanoparticles was confirmed only in the HeLa cells (indicated by arrows in FIG. 8 (a)) subjected to microinjection (the dark portion in FIG. 8 (c)), It was confirmed that the gold nanoparticles were introduced into the HeLa cells by the microinjection method.
〔実験例３：生細胞を用いた表面増強ラマンスペクトル解析〕
本実験例では、金ナノ粒子が導入された生細胞を、ラマン顕微鏡を用いて観察し、ＳＥＲＳスペクトルの測定を試みた。生細胞の観察であるため、できるだけ短時間での信号取得が望ましい。そのため、観察する顕微鏡として点照射によるラマン観察に比べより高速な測定が可能なスリット共焦点ラマン顕微鏡を用いた。スリット共焦点ラマン顕微鏡は、点照射によるラマン顕微鏡に比べ、より高速な測定が可能である。また得られたＳＥＲＳスペクトルから、細胞内分子のラマン散乱光の増強と空間分解能についても考察した。[Experimental example 3: Surface-enhanced Raman spectrum analysis using living cells]
In this experimental example, living cells into which gold nanoparticles were introduced were observed using a Raman microscope, and measurement of the SERS spectrum was attempted. Since it is an observation of living cells, it is desirable to acquire signals in as short a time as possible. Therefore, a slit confocal Raman microscope capable of higher-speed measurement than the Raman observation by point irradiation was used as an observation microscope. The slit confocal Raman microscope can perform higher-speed measurement than the point-irradiated Raman microscope. In addition, from the obtained SERS spectrum, the enhancement of the Raman scattered light of the intracellular molecules and the spatial resolution were also considered.
＜スリット共焦点ラマン顕微鏡＞
スリット共焦点ラマン顕微鏡とは、試料の走査をライン照明で行う共焦点ラマン顕微鏡のことである。ライン照明で走査することで点照射の場合よりも短い時間で試料を走査することができる。ライン照明では１ラインあたり積算時間を１秒とすると、６４pixel×６４pixelの画像を取得するのに約６０秒でよいのに対し、点照明では一点あたりの積算時間を１秒としても約１時間必要である。<Slit confocal Raman microscope>
A slit confocal Raman microscope is a confocal Raman microscope that scans a sample with line illumination. By scanning with line illumination, the sample can be scanned in a shorter time than the point irradiation. With line lighting, if the accumulated time per line is 1 second, it takes about 60 seconds to acquire a 64 pixel x 64 pixel image, whereas spot lighting requires about 1 hour even if the accumulated time per point is 1 second. It is.
図９に本実験例に用いられたスリット共焦点ラマン顕微鏡の光学系を示す。シリンドリカルレンズによりライン照明を作り、ガルバノミラーを回動させることにより試料をライン走査する。レーザーはエッジフィルターで反射され、水浸対物レンズ（１００倍、N.A.1.0）に入射し試料に集光される。試料から散乱されたラマン散乱光はガルバノミラーによりデスキャンされ、エッジフィルターによりレイリー散乱光を取り除かれた後、分光器手前のレンズによってスリットに結像され、分光器に入る。ラマン散乱光は分光器によって分光され、冷却ＣＣＤによって測定される。試料の各ラインで測定したラマン散乱光強度からイメージングを行う。レーザー光源は波長７８５ｎｍのTi:sapphireレーザー（Tsunami：Spectra-Physics社）、検出器として冷却ＣＣＤカメラ（PIXIS400：Princeton Instrument社）、および分光器（MK-300：分光計器社）を用いた。 FIG. 9 shows an optical system of a slit confocal Raman microscope used in this experimental example. Line illumination is made by a cylindrical lens, and a sample is line-scanned by rotating a galvanometer mirror. The laser is reflected by the edge filter, is incident on a water immersion objective lens (100 ×, N.A.1.0), and is focused on the sample. The Raman scattered light scattered from the sample is descanned by the galvanometer mirror, and after the Rayleigh scattered light is removed by the edge filter, it is imaged on the slit by the lens in front of the spectrometer and enters the spectrometer. Raman scattered light is dispersed by a spectroscope and measured by a cooled CCD. Imaging is performed from the Raman scattered light intensity measured at each line of the sample. The laser light source used was a Ti: sapphire laser (Tsunami: Spectra-Physics) having a wavelength of 785 nm, a cooled CCD camera (PIXIS400: Princeton Instrument) as a detector, and a spectrometer (MK-300: Spectrometer).
なお、図９に示すスリット共焦点ラマン顕微鏡のみを用いても、粒子プローブの移動速度が遅い場合には、上述の本発明にかかる方法を実施するための装置と同様に、粒子プローブの位置情報および上記粒子プローブの近傍に存在する物質の情報を同時に得ることは可能である。その場合に得られる粒子プローブの位置決定精度および空間分解能は、（撮像時間）×（粒子プローブの移動速度）で与えられる。 If only the slit confocal Raman microscope shown in FIG. 9 is used and the moving speed of the particle probe is slow, the position information of the particle probe is the same as in the apparatus for carrying out the method according to the present invention described above. It is possible to simultaneously obtain information on substances existing in the vicinity of the particle probe. The position determination accuracy and spatial resolution of the particle probe obtained in that case are given by (imaging time) × (movement speed of the particle probe).
ラマン散乱観察像の作成原理を図１０に示す。x軸方向にライン照明による空間情報があり、波長方向にラマンスペクトル情報があるとする。このときy軸方向に試料上をライン走査した位置情報が与えられる。ある波長を選択してラマン散乱観察像を作成すると、試料のx-y平面でのラマン散乱光の強度分布が得られる。ラマン散乱観察像の各点は、異なるラマンスペクトル情報を有している。 The principle of creating a Raman scattering observation image is shown in FIG. It is assumed that there is spatial information by line illumination in the x-axis direction and Raman spectrum information in the wavelength direction. At this time, position information obtained by line scanning on the sample in the y-axis direction is given. When a Raman scattering observation image is created by selecting a certain wavelength, the intensity distribution of the Raman scattered light in the xy plane of the sample can be obtained. Each point of the Raman scattering observation image has different Raman spectrum information.
＜方法＞
石英ガラスのガラスボトムディッシュにマクロファージ細胞、およびＨｅＬａ細胞をそれぞれ播種し、ガラスボトムディッシュ基板上への細胞接着を確認後、５０ｎｍの粒子径の金ナノ粒子を４．５×１０11個/mlの密度で含有する金コロイド溶液２００μlを、２ｍｌの培地中に添加し、１日間培養を行った。金ナノ粒子が添加された培地を取り除き、タイロード液（Tyrode’s solution：塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、炭酸水素ナトリウムの混合液にブドウ糖を加えた生理溶液）で細胞表面を２回以上洗い流し、タイロード液でガラスボトムディッシュを満たした（図１１を参照のこと）。金ナノ粒子を洗い流すのは、溶液中、および細胞膜表面に付着した金ナノ粒子からのＳＥＲＳシグナルを除外するためである。培養液は細胞のラマン散乱光と同じ波数に散乱光や蛍光が観察され細胞のラマン観察には適さないため、異なる波数にラマン散乱光が観察されるタイロード溶液を用いた。基板からのラマン散乱光により細胞のＳＥＲＳ観察に影響がないよう、細胞のラマン散乱光とは異なる波数にラマン散乱光が観察される石英ガラス基板を選択した。<Method>
After seeding macrophage cells and HeLa cells on a glass bottom dish made of quartz glass and confirming cell adhesion on the glass bottom dish substrate, gold nanoparticles with a particle size of 50 nm are 4.5 × 10 11 particles / ml. 200 μl of colloidal gold solution containing the density was added to 2 ml of the medium and cultured for 1 day. Remove the medium containing gold nanoparticles and wash the cell surface twice or more with Tyrode's solution (physiological solution of glucose mixed with sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, and sodium bicarbonate) The glass bottom dish was filled with Tyrode solution (see FIG. 11). The gold nanoparticles are washed away to exclude SERS signals from the gold nanoparticles attached to the solution and to the cell membrane surface. Since the culture solution is not suitable for Raman observation of cells because scattered light and fluorescence are observed at the same wave number as the Raman scattered light of cells, a Tyrode solution in which Raman scattered light is observed at different wave numbers was used. A quartz glass substrate on which the Raman scattered light was observed at a wave number different from that of the cell Raman scattered light was selected so that the Raman scattered light from the substrate did not affect the SERS observation of the cells.
＜結果＞
図１２に、金ナノ粒子が導入されたＨｅＬａ細胞から得られたＳＥＲＳ像およびＳＥＲＳスペクトルを示した。図１２（ａ）は金ナノ粒子が導入されたＨｅＬａ細胞の明視野像を示し、（ｂ）は同細胞のＳＥＲＳ像を示し、（ｃ）は（ａ）の像と（ｂ）の像とを重ね合わせた像を示し、（ｄ）は各点（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）におけるＳＥＲＳスペクトルを示す。観察条件は、励起光強度６．５ｍＷ/μｍ2、励起波長７８５ｎｍ、露光時間５分/イメージである。<Result>
FIG. 12 shows SERS images and SERS spectra obtained from HeLa cells into which gold nanoparticles were introduced. FIG. 12 (a) shows a bright field image of HeLa cells into which gold nanoparticles are introduced, (b) shows a SERS image of the same cells, (c) shows an image of (a) and an image of (b). (D) shows the SERS spectrum at each point (A, B, C, D, E). The observation conditions are an excitation light intensity of 6.5 mW / μm 2 , an excitation wavelength of 785 nm, and an exposure time of 5 minutes / image.
図１２（ｂ）は１１３０ｃｍ-1の波数におけるＳＥＲＳ光の強度分布を示しており、金ナノ粒子の存在する部位から強いＳＥＲＳ光が得られている（図１２（ｄ））。また図１２（ｃ）により、ＨｅＬａ細胞における金ナノ粒子の分布が観察できる。FIG. 12B shows the intensity distribution of SERS light at a wave number of 1130 cm −1 , and strong SERS light is obtained from a site where gold nanoparticles are present (FIG. 12D). Also, from FIG. 12 (c), the distribution of gold nanoparticles in HeLa cells can be observed.
また、図１３に、金ナノ粒子が導入されたマクロファージ細胞から得られたＳＥＲＳ像およびＳＥＲＳスペクトルを示した。図１３（ａ）は金ナノ粒子が導入されたマクロファージ細胞の明視野像を示し、（ｂ）は同細胞のＳＥＲＳ像を示し、（ｃ）はＳＥＲＳ像の各点（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）におけるＳＥＲＳスペクトルを示す。観察条件は、励起光強度７ｍＷ/μｍ2、励起波長７８５ｎｍ、露光時間１分/イメージである。なおＨｅＬａ細胞とマクロファージ細胞との観察における露光時間の違いは、金ナノ粒子がマクロファージ細胞により多く導入されているため、短時間でのＳＥＲＳ観察が可能であったことに因る。FIG. 13 shows a SERS image and a SERS spectrum obtained from macrophage cells into which gold nanoparticles were introduced. FIG. 13 (a) shows a bright field image of macrophage cells into which gold nanoparticles are introduced, (b) shows a SERS image of the same cell, and (c) shows each point (A, B, C, The SERS spectrum in D, E) is shown. The observation conditions are an excitation light intensity of 7 mW / μm 2 , an excitation wavelength of 785 nm, and an exposure time of 1 minute / image. Note that the difference in exposure time in the observation between HeLa cells and macrophage cells is due to the fact that SERS observation was possible in a short time because a large amount of gold nanoparticles were introduced into the macrophage cells.
図１３（ｂ）はＳＥＲＳ光の強度分布を示しており、金ナノ粒子の存在する部位（図１３（ｂ）のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）から強いＳＥＲＳ光が得られている（図１３（ｃ））。一方、金ナノ粒子の存在しない部位（図１３（ｂ）のＥ）では、ラマン散乱光はほとんど得られていない（図１３（ｃ））。図１３（ｃ）には、６４０ｃｍ-1にチロシン由来のＣ−Ｃひねりを示すピークが見られ、１１００ｃｍ-1にＤＮＡ由来のＰＯ2−伸縮/脂質由来のＣ−Ｃ伸縮を示すピークが見られ、１５３０ｃｍ-1にグアニン/アデニンを示すピークが見られる。また図１３（ｂ）のＡおよびＣにおいて、１１００ｃｍ-1の強度が高いため、ＤＮＡや脂質が多く分布していることがわかる（図１３（ｃ））。また図１３（ｂ）のＢではチロシンが多く、Ｄではグアニン/アデニンが多く観察されている（図１３（ｃ））。このように、金ナノ粒子の周辺に存在する種々の分子を、ＳＥＲＳを用いることで検出できる。FIG. 13B shows the intensity distribution of the SERS light, and strong SERS light is obtained from the site where the gold nanoparticles are present (A, B, C, D in FIG. 13B) (FIG. 13). (C)). On the other hand, almost no Raman scattered light is obtained at the site where gold nanoparticles do not exist (E in FIG. 13B) (FIG. 13C). In FIG. 13 (c), a peak indicating a tyrosine-derived CC twist is observed at 640 cm −1 , and a peak indicating a DNA-derived PO 2 -stretch / lipid-derived CC stretch is observed at 1100 cm −1. A peak indicating guanine / adenine is observed at 1530 cm −1 . Further, in A and C of FIG. 13B, since the intensity of 1100 cm −1 is high, it can be seen that a large amount of DNA and lipid are distributed (FIG. 13C). In FIG. 13 (b) B, a large amount of tyrosine is observed, and in D, a large amount of guanine / adenine is observed (FIG. 13 (c)). Thus, various molecules present around the gold nanoparticles can be detected by using SERS.
次に、金ナノ粒子が導入されたマクロファージ細胞のＳＥＲＳスペクトルの強度と、金ナノ粒子が導入されていないマクロファージ細胞のラマンスペクトルの強度とを比較した。観察条件は、励起光強度１０ｍＷ/μｍ2、励起波長７８５ｎｍ、露光時間１秒とした。試料は、金ナノ粒子を培地に添加して１時間培養を行った細胞と、金ナノ粒子を添加せずに１時間培養を行った細胞とが用いられた。Next, the intensity of the SERS spectrum of macrophage cells into which gold nanoparticles were introduced was compared with the intensity of the Raman spectrum of macrophage cells into which gold nanoparticles were not introduced. The observation conditions were an excitation light intensity of 10 mW / μm 2 , an excitation wavelength of 785 nm, and an exposure time of 1 second. Samples used were cells that had been cultured for 1 hour with gold nanoparticles added to the medium, and cells that had been cultured for 1 hour without the addition of gold nanoparticles.
図１４にその結果を示す。金ナノ粒子が導入されていない細胞のラマンスペクトルではラマンピークが全く観察されなかった。これに対して、金ナノ粒子が導入された細胞から得られたＳＥＲＳスペクトルでは、強いラマンピークが観察できた。この結果から、金ナノ粒子の導入によりラマン散乱光の大幅な増強が確認された。よってＳＥＲＳは通常のラマン散乱検出法に比べ、より感度の高い検出ができるといえる。 FIG. 14 shows the result. No Raman peak was observed in the Raman spectrum of cells into which gold nanoparticles were not introduced. In contrast, a strong Raman peak could be observed in the SERS spectrum obtained from the cells into which the gold nanoparticles were introduced. From this result, it was confirmed that Raman scattering light was significantly enhanced by introducing gold nanoparticles. Therefore, it can be said that SERS can be detected with higher sensitivity than the ordinary Raman scattering detection method.
さらに、金ナノ粒子が導入されたマクロファージ細胞のＳＥＲＳスペクトルの形状と、金ナノ粒子が導入されていないマクロファージ細胞のラマンスペクトルの形状とを比較した。観察条件は、金ナノ粒子が導入されていない細胞のラマン観察では励起光強度６８０ｍＷ/μｍ2、励起波長７８５ｎｍ、露光時間６０秒とし、金ナノ粒子が導入されたラマン観察では励起光強度１０ｍＷ/μｍ2、励起波長７８５ｎｍ、露光時間１秒で行われた。試料は、金ナノ粒子を培地に添加して１時間培養を行った細胞と、金ナノ粒子を添加せずに１時間培養を行った細胞とが用いられた。なお金ナノ粒子が導入されていない細胞の場合、ラマン散乱光が弱いためＳＥＲＳの場合よりも大幅に強い励起光強度で長時間露光によりスペクトルを取得した。Furthermore, the shape of the SERS spectrum of macrophage cells into which gold nanoparticles were introduced was compared with the shape of the Raman spectrum of macrophage cells into which gold nanoparticles were not introduced. The observation conditions are an excitation light intensity of 680 mW / μm 2 , an excitation wavelength of 785 nm and an exposure time of 60 seconds for Raman observation of cells into which gold nanoparticles have not been introduced, and an excitation light intensity of 10 mW / day for Raman observation into which gold nanoparticles have been introduced. The measurement was performed at μm 2 , an excitation wavelength of 785 nm, and an exposure time of 1 second. Samples used were cells that had been cultured for 1 hour with gold nanoparticles added to the medium, and cells that had been cultured for 1 hour without the addition of gold nanoparticles. In the case of cells into which gold nanoparticles were not introduced, the Raman scattered light was weak, so that a spectrum was obtained by long-time exposure with a much stronger excitation light intensity than in the case of SERS.
図１５にその結果を示す。金ナノ粒子が導入されていない細胞の場合のラマンスペクトルでは、フェニルアラニンやアミドIIIなどのタンパク質由来のピーク、ウラシルやシトシンやチミンなどのＤＮＡ由来のピーク、ＰＯ2−伸縮などの脂質由来のピーク等、多数の分子のシグナルが観察された。これに対して、金ナノ粒子が導入された細胞のＳＥＲＳ観察では、脂質由来のＣ＝Ｈ屈曲、Ｃ−Ｃ伸縮、Ｃ−Ｎ伸縮、Ｃ−Ｈ変角のピーク、並びにＤＮＡ由来のグアニンおよびアデニンのピークのみが観察されており、非常に少ない数の分子のみが検出された。これは、ＳＥＲＳ観察によれば、観察されている分子種が少なく、金ナノ粒子近傍の分子のみを空間分解能高く検出できたことを示している。局在電場の減衰距離はＲ＝０．４９ｒ（ｒは金属粒子の半径）で表されるため、本ＳＥＲＳ観察の場合、金ナノ粒子表面からおよそ１２ｎｍの範囲に存在する分子のみを検出していると考えられる。FIG. 15 shows the result. In the Raman spectrum in the case of cells into which gold nanoparticles are not introduced, peaks derived from proteins such as phenylalanine and amide III, peaks derived from DNA such as uracil, cytosine and thymine, peaks derived from lipids such as PO 2 -stretching, etc. A number of molecular signals were observed. In contrast, in SERS observation of cells into which gold nanoparticles were introduced, C═H bending derived from lipid, C—C stretching, C—N stretching, C—H bending peak, and DNA-derived guanine and Only the adenine peak was observed, and only a very small number of molecules were detected. This indicates that according to SERS observation, the number of molecular species observed is small, and only molecules in the vicinity of gold nanoparticles can be detected with high spatial resolution. Since the attenuation distance of the localized electric field is represented by R = 0.49r (r is the radius of the metal particle), in the case of this SERS observation, only molecules existing in the range of about 12 nm from the gold nanoparticle surface are detected. It is thought that there is.
〔実験例４：生細胞を用いたＳＥＲＳ観察の最適条件検討〕
＜方法＞
生細胞を用いた場合のＳＥＲＳ観察の最適条件を検討すべく、種々パラメータを変更してＳＥＲＳ観察を行った。異なる大きさまたは形状の金、および銀ナノ粒子（球状：粒子径１０ｎｍ〜５０ｎｍの金粒子および粒子径６０ｎｍの銀粒子、立方体：１辺が５０ｎｍ、または２００ｎｍの銀粒子、長さ１μｍの銀ナノワイヤ）をそれぞれマクロファージ細胞に導入し、７８５ｎｍ、または５３２ｎｍの励起波長を用いてＳＥＲＳ観察を行った。このとき、ラマン増強度、細胞内導入率、細胞への光毒性について評価した。細胞内導入率については暗視野観察によって確認し、細胞への光毒性はＳＥＲＳ観察後（レーザー照射後）の明視野像において細胞膜の破裂や細胞の膨張等について確認して評価した。[Experimental Example 4: Examination of optimum conditions for SERS observation using living cells]
<Method>
In order to examine the optimum conditions for SERS observation when using living cells, SERS observation was performed by changing various parameters. Gold and silver nanoparticles of different sizes or shapes (spherical: gold particles with a particle size of 10-50 nm and silver particles with a particle size of 60 nm, cube: silver particles with a side of 50 nm or 200 nm, silver nanowires with a length of 1 μm ) Were introduced into macrophage cells, and SERS observation was performed using an excitation wavelength of 785 nm or 532 nm. At this time, Raman enhancement intensity, intracellular introduction rate, and phototoxicity to cells were evaluated. The cell introduction rate was confirmed by dark field observation, and the phototoxicity to the cells was evaluated by confirming cell membrane rupture and cell expansion in a bright field image after SERS observation (after laser irradiation).
＜結果＞
この結果を表１にまとめた。<Result>
The results are summarized in Table 1.
細胞内への導入は、いずれの粒子においても確認できた。図１６（ａ）に導入に用いられた銀ナノワイヤのＳＥＭ像を示し、（ｂ）に銀ナノワイヤが導入されたマクロファージ細胞の暗視野像を示す。また図１７（ａ）に導入に用いられた１辺が２００ｎｍの銀立方体のＳＥＭ像を示し、（ｂ）に銀立方体が導入されたマクロファージ細胞の暗視野像を示した。本実験例で検討した粒子の中で、特に５０ｎｍ付近の粒子径を有する金ナノ粒子（球状）が最もよく細胞内に導入されていた。 The introduction into the cell could be confirmed in any particle. FIG. 16A shows an SEM image of silver nanowires used for introduction, and FIG. 16B shows a dark field image of macrophage cells into which silver nanowires have been introduced. FIG. 17A shows an SEM image of a silver cube having a side of 200 nm used for introduction, and FIG. 17B shows a dark field image of macrophage cells into which the silver cube has been introduced. Among the particles examined in this experimental example, particularly gold nanoparticles (spherical) having a particle size of around 50 nm were most often introduced into the cells.
またＳＥＲＳ観察において最も頻度よく、最も高感度に且つ短時間でＳＥＲＳスペクトルが観察されたのは、粒子径５０ｎｍの金ナノ粒子が導入された細胞を、７８５ｎｍの励起光で観察した場合であった。これは、粒子の導入率にも関係しているが、粒子径５０ｎｍの金ナノ粒子のプラスズモン共鳴が７８５ｎｍの励起波長と合致したことに因ると推察される。一方、５３２ｎｍの励起波長におけるＳＥＲＳ観察では、細胞または粒子からの自家蛍光が強く観察されたために、ＳＥＲＳシグナルを覆い隠してしまい、ラマンピークを観察できなかった。これに対して、７８５ｎｍの励起光を用いた場合では、細胞または粒子の吸収が少ないため、自家蛍光はほとんど観察されなかった。よって、上述のとおり、粒子径５０ｎｍ金ナノ粒子と、７８５ｎｍ励起波長との組み合わせが、ＳＥＲＳ観察に適しているといえる。また、この組み合わせの場合、細胞へのダメージは明視野観察においてほとんど見られなかった。このため、上記の組み合わせは細胞への光毒性の点でも適しているといえる。 In addition, the SERS spectrum was observed most frequently in SERS observation with the highest sensitivity and in a short time when cells into which gold nanoparticles with a particle diameter of 50 nm were introduced were observed with 785 nm excitation light. . This is related to the introduction rate of the particles, but it is assumed that the plasmon resonance of the gold nanoparticles having a particle diameter of 50 nm matches the excitation wavelength of 785 nm. On the other hand, in SERS observation at an excitation wavelength of 532 nm, since autofluorescence from cells or particles was strongly observed, the SERS signal was obscured, and the Raman peak could not be observed. On the other hand, when 785 nm excitation light was used, there was little absorption of cells or particles, so that almost no autofluorescence was observed. Therefore, as described above, it can be said that the combination of the gold nanoparticle having a particle diameter of 50 nm and the excitation wavelength of 785 nm is suitable for SERS observation. In the case of this combination, damage to the cells was hardly observed in bright field observation. For this reason, it can be said that the above combination is also suitable in terms of phototoxicity to cells.
〔実施例１：ＳＥＲＳの経時観察によるイメージング〕
粒子径が５０ｎｍの金ナノ粒子を、エンドサイトーシスを利用してマクロファージ細胞に導入し、ＳＥＲＳ観察を経時的に行った。そして得られた金ナノ粒子のＳＥＲＳシグナルをもとに、試料の画像化（イメージング）を行った。[Example 1: Imaging by observation of SERS over time]
Gold nanoparticles having a particle size of 50 nm were introduced into macrophage cells using endocytosis, and SERS observation was performed over time. Based on the SERS signal of the obtained gold nanoparticles, the sample was imaged (imaging).
＜方法＞
マクロファージ細胞を石英ガラスボトムディッシュに播種し、ガラスボトムディッシュの基板への細胞接着を確認後、培地を取り除き、タイロード溶液（Tyrode’s solution：塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、炭酸水素ナトリウムの混合液にブドウ糖を加えた生理溶液）で２回以上洗浄した。粒子径５０ｎｍの金ナノ粒子を４．５×１０11個/mlの密度で含有する金コロイド溶液２００μlが添加されたタイロード溶液でガラスボトムディッシュを満たし、タイロード溶液中の細胞のＳＥＲＳ像を、２．５分毎に１時間取得した。観察条件は、励起光強度１５ｍＷ/μｍ2、励起波長７８５ｎｍ、露光時間２分/イメージである。ＳＥＲＳ像は、６００ｃｍ-1〜１７００ｃｍ-1のラマンスペクトルの平均強度を用いて作成された。<Method>
After seeding macrophage cells in a quartz glass bottom dish and confirming cell adhesion to the substrate of the glass bottom dish, the medium is removed and Tyrode's solution (mixture of sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, and sodium bicarbonate) And a physiological solution in which glucose was added to the solution) twice or more. A glass bottom dish is filled with a Tyrode solution to which 200 μl of a gold colloid solution containing gold nanoparticles having a particle diameter of 50 nm at a density of 4.5 × 10 11 particles / ml is added, and a SERS image of cells in the Tyrode solution is obtained. 1 hour every 2.5 minutes. The observation conditions are an excitation light intensity of 15 mW / μm 2 , an excitation wavelength of 785 nm, and an exposure time of 2 minutes / image. SERS image is generated using the average intensity of the Raman spectrum of 600cm -1 ~1700cm -1.
＜結果＞
ＳＥＲＳ観察と同時に暗視野顕微鏡観察を行った結果を図１８に示した。図中の「Ｍｉｎ」は金ナノ粒子添加後の時間（分）を示す。例えば「Ｍｉｎ０」は金ナノ粒子添加後０分のＳＥＲＳ像であることを示し、「Ｍｉｎ２．５」は金ナノ粒子添加後２．５分のＳＥＲＳ像であることを示す（以下、同様に解釈される）。図１８によって、金ナノ粒子の細胞内導入が確認できた。<Result>
The result of dark field microscope observation simultaneously with SERS observation is shown in FIG. “Min” in the figure indicates the time (minutes) after the addition of the gold nanoparticles. For example, “Min0” indicates that the SERS image is 0 minutes after the addition of the gold nanoparticles, and “Min2.5” indicates that the SERS image is 2.5 minutes after the addition of the gold nanoparticles (hereinafter, similarly interpreted) ) FIG. 18 confirmed the introduction of gold nanoparticles into the cell.
次に取得されたＳＥＲＳ像を図１９に示す。図中の「Ｍｉｎ」は金ナノ粒子添加後の時間（分）を示す。例えば「Ｍｉｎ０」は金ナノ粒子添加後０分のＳＥＲＳイメージであることを示し、「Ｍｉｎ２．５」は金ナノ粒子添加後２．５分のＳＥＲＳイメージであることを示す（以下、同様に解釈される）。 Next, the acquired SERS image is shown in FIG. “Min” in the figure indicates the time (minutes) after the addition of the gold nanoparticles. For example, “Min0” indicates that the SERS image is 0 minutes after the addition of the gold nanoparticles, and “Min2.5” indicates that the SERS image is 2.5 minutes after the addition of the gold nanoparticles (hereinafter, similarly interpreted) )
図１９において金ナノ粒子は、白色で観察される。各ＳＥＲＳイメージは、それぞれ異なった位置に金ナノ粒子が観察され、金ナノ粒子が細胞内を自己の流動性を利用して移動していることが確認された。 In FIG. 19, the gold nanoparticles are observed in white. In each SERS image, gold nanoparticles were observed at different positions, and it was confirmed that the gold nanoparticles were moving in the cells using their own fluidity.
図２０に、金ナノ粒子を添加後３２．５分後、４７．５分後、および５２．５分後のＳＥＲＳ像から得られるそれぞれのラマンスペクトルを示す。図２０（ａ）は金ナノ粒子を添加後３２．５分後のＳＥＲＳ像から得られる２点（地点１、および地点２）におけるラマンスペクトルを示し、（ｂ）は金ナノ粒子を添加後４７．５分後のＳＥＲＳ像から得られる地点３におけるラマンスペクトルを示し、（ｃ）は金ナノ粒子を添加後５２．５分後のＳＥＲＳ像から得られる地点４におけるラマンスペクトルを示す。 FIG. 20 shows respective Raman spectra obtained from SERS images 32.5 minutes, 47.5 minutes, and 52.5 minutes after the addition of the gold nanoparticles. FIG. 20 (a) shows Raman spectra at two points (point 1 and point 2) obtained from the SERS image 32.5 minutes after the addition of gold nanoparticles, and FIG. 20 (b) shows 47 after the addition of gold nanoparticles. The Raman spectrum at the point 3 obtained from the SERS image after 5 minutes is shown, and (c) shows the Raman spectrum at the point 4 obtained from the SERS image 52.5 minutes after adding the gold nanoparticles.
図２０（ａ）によれば、金ナノ粒子を添加３２．５分後のＳＥＲＳ像の地点１において脂質由来のＣ−Ｈ変角を示すピークが見られ、地点２においてヌクレオチドを示すピークが見られた。よって地点１における脂質の分布、地点２におけるヌクレオチドの分布が確認された。 According to FIG. 20 (a), a peak showing a C-H deflection angle derived from lipid is seen at point 1 of the SERS image 32.5 minutes after the addition of gold nanoparticles, and a peak showing nucleotides is seen at point 2. It was. Therefore, the lipid distribution at point 1 and the nucleotide distribution at point 2 were confirmed.
また図２０（ｂ）によれば金ナノ粒子を添加３２．５分後のＳＥＲＳ像の地点３において脂質リン酸塩を示すピーク、およびタンパク質のアミドIIIを示すピークが見られた。よって地点３における脂質リン酸塩、およびタンパク質の分布が確認された。 Moreover, according to FIG.20 (b), the peak which shows a lipid phosphate and the peak which shows the protein amide III was seen in the point 3 of the SERS image 32.5 minutes after adding a gold nanoparticle. Therefore, the distribution of lipid phosphate and protein at point 3 was confirmed.
また図２０（ｃ）によれば金ナノ粒子を添加５２．５分後のＳＥＲＳ像の地点４においてプロリンを示すピーク、およびグアニンを示すピークが見られた。よって地点３におけるタンパク質由来のプロリン、およびＤＮＡ由来のグアニンの分布が確認された。 Moreover, according to FIG.20 (c), the peak which shows a proline, and the peak which shows guanine were seen in the point 4 of the SERS image 52.5 minutes after adding a gold nanoparticle. Therefore, the distribution of protein-derived proline and DNA-derived guanine at point 3 was confirmed.
複数得られたＳＥＲＳ像を重ねてイメージングを行った結果を図２７に示した。図２７によれば、外的な走査を行うことなく、生細胞を高感度かつ、高空間分解に画像化ずることができるということがわかった。 FIG. 27 shows the result of imaging by superimposing a plurality of SERS images obtained. According to FIG. 27, it was found that live cells can be imaged with high sensitivity and high spatial resolution without performing external scanning.
〔実施例２：暗視野経時観察によるイメージング〕
明視野観察や位相差顕微鏡による観察では、細胞内に導入された金属ナノ粒子は観察されにくい。これは、金属ナノ粒子が顕微鏡の分解能よりも小さいからである。また、金ナノ粒子をはじめとする金属ナノ粒子は光をよく散乱するため、明視野観察や位相差顕微鏡では金属ナノ粒子はコントラストをつけて観察できないことにも因る。[Example 2: Imaging by dark field observation over time]
In bright-field observation or phase-contrast microscope observation, metal nanoparticles introduced into cells are difficult to observe. This is because metal nanoparticles are smaller than the resolution of the microscope. In addition, since metal nanoparticles such as gold nanoparticles scatter light well, it is because metal nanoparticles cannot be observed with contrast in bright field observation or phase contrast microscope.
ここで金属ナノ粒子の散乱光と細胞の散乱光とを分離するには、金属ナノ粒子の散乱光と細胞の散乱光との違いを利用すれば良い。金属ナノ粒子の散乱光と細胞の散乱光との違いは、（１）金属ナノ粒子の散乱は細胞の散乱に比べて非常に強いこと（細胞の組成はほぼ水で、金属の散乱効率と比べれば非常に弱い。）、（２）細胞の散乱光がブロードであるのに対し、金属ナノ粒子には共鳴波長があり散乱光はピークを持つことの二つが挙げられる。（１）を利用した金属ナノ粒子の散乱光と細胞の散乱光との分離方法は暗視野観察である。暗視野顕微鏡では暗視野コンデンサーを用い、レイリー散乱光を観察する方法である。本実施例ではこれを説明する。他方（２）を利用した金属ナノ粒子と細胞の分離方法はレイリー分光イメージングである。これは暗視野観察で得られるレイリー散乱光を分光して、そのスペクトル情報を利用して観察を行う方法である。これについては、実施例３において説明する。 Here, in order to separate the scattered light of the metal nanoparticles from the scattered light of the cells, the difference between the scattered light of the metal nanoparticles and the scattered light of the cells may be used. The difference between the scattered light of metal nanoparticles and the scattered light of cells is as follows: (1) The scattering of metal nanoparticles is much stronger than the scattering of cells (the composition of cells is almost water, compared to the scattering efficiency of metals). (2) While the scattered light of the cells is broad, the metal nanoparticles have a resonance wavelength and the scattered light has a peak. The separation method of the scattered light of metal nanoparticles and the scattered light of cells using (1) is dark field observation. The dark field microscope uses a dark field condenser to observe Rayleigh scattered light. This embodiment will explain this. On the other hand, the separation method of metal nanoparticles and cells using (2) is Rayleigh spectroscopic imaging. This is a method in which Rayleigh scattered light obtained by dark field observation is dispersed and observation is performed using the spectral information. This will be described in Example 3.
＜暗視野経時観察＞
金属ナノ粒子のレイリー散乱光と細胞のレイリー散乱光とでは、散乱効率の差から金属ナノ粒子からの方が強い散乱光が観察できる。これを利用してレイリー散乱光を観察すれば、細胞内の金属ナノ粒子を区別して観察することができる。レイリー散乱光は暗視野顕微鏡を用いて観察した。暗視野顕微鏡は、特殊なコンデンサーを使用し、対物レンズには直接光をいれず試料からの散乱光のみが観察できるようにした顕微鏡である。図２１に暗視野顕微鏡の模式図を示す。暗視野照射の原理は以下のとおりである。コンデンサーからの光（図２１中、実線で示す）は試料がなければ対物レンズに入らないような構造になっているので、目で見たときには真っ暗となる。ところが試料がある場合には、試料によって散乱される光（図２１中、点線で示す）が対物レンズに回り込んできて、試料がきらきらと光って見える。夜空の星がはっきりと見えるように、実際には顕微鏡の分解能よりも小さいものまで確認できる。<Dark field observation>
From the Rayleigh scattered light of the metal nanoparticles and the Rayleigh scattered light of the cells, scattered light that is stronger from the metal nanoparticles can be observed due to the difference in scattering efficiency. By using this to observe Rayleigh scattered light, it is possible to distinguish and observe intracellular metal nanoparticles. Rayleigh scattered light was observed using a dark field microscope. The dark field microscope is a microscope that uses a special condenser so that only light scattered from a sample can be observed without direct light entering the objective lens. FIG. 21 shows a schematic diagram of a dark field microscope. The principle of dark field irradiation is as follows. The light from the condenser (shown by a solid line in FIG. 21) is structured such that it does not enter the objective lens without a sample, and therefore it is completely dark when viewed with the eyes. However, when there is a sample, light scattered by the sample (indicated by a dotted line in FIG. 21) wraps around the objective lens, and the sample appears to shine brightly. In order to clearly see the stars in the night sky, it is actually possible to confirm even those smaller than the resolution of the microscope.
＜方法＞
暗視野顕微鏡を用いて、１辺の長さが２００ｎｍの銀ナノ粒子（立方体）または粒子径５０ｎｍの金ナノ粒子（球状）をマクロファージ細胞に導入し、経時的観察を行った。各粒子の細胞への導入方法は、既述した方法と同様である。<Method>
Using a dark field microscope, silver nanoparticles (cubic) having a side length of 200 nm or gold nanoparticles (spherical) having a particle diameter of 50 nm were introduced into macrophage cells and observed over time. The method for introducing each particle into the cell is the same as the method described above.
＜結果＞
図２２に銀ナノ粒子（立方体）を細胞内に導入した場合の暗視野経時観察の結果を示した。図２２は銀ナノ粒子（立方体）を培地に添加した直後から２時間の暗視観察像である。銀ナノ粒子添加直後から５５分後までは銀ナノ粒子（立方体）は観察できなかったが、５５．４分後（図２２中、「Ｍｉｎ．５５．４」で示す）において、培地中において銀ナノ粒子（立方体）が観察できた。そして６０分後（図２２中、「Ｍｉｎ．６０」で示す）に銀ナノ粒子（立方体）が細胞膜に接着しているのが観察でき、６５分後「Ｍｉｎ．６５」において、別の銀ナノ粒子（立方体）が細胞膜に接着している様子が観察された。その後、細胞膜に接着した銀ナノ粒子（立方体）が細胞内に取り込まれていく様子が観察された。その後、導入された銀ナノ粒子（立方体）が細胞内を自己の流動性を利用して移動している様子が観察された。<Result>
FIG. 22 shows the results of dark field temporal observation when silver nanoparticles (cubic) were introduced into cells. FIG. 22 is a night-vision observation image for 2 hours immediately after adding silver nanoparticles (cube) to the medium. Silver nanoparticles (cubic) could not be observed immediately after the addition of silver nanoparticles until 55 minutes later, but after 55.4 minutes (indicated as “Min. 55.4” in FIG. 22) Nanoparticles (cubes) could be observed. Then, after 60 minutes (indicated by “Min. 60” in FIG. 22), it can be observed that the silver nanoparticles (cubes) are adhered to the cell membrane. After 65 minutes, another silver nanoparticle is observed in “Min. 65”. It was observed that the particles (cubes) adhered to the cell membrane. Thereafter, it was observed that the silver nanoparticles (cubes) adhered to the cell membrane were taken into the cells. Thereafter, it was observed that the introduced silver nanoparticles (cubes) were moving inside the cells using their own fluidity.
また、図２３に金ナノ粒子（球状）を細胞内に導入した場合の暗視野経時観察の結果を示した。図２３は金ナノ粒子（球状）を培地に添加した直後から２時間の暗視観察像である。図２３によれば金ナノ粒子（球状）が細胞内に導入されている様子、および導入された金ナノ粒子（球状）が細胞内を自己の流動性を利用して移動している様子が観察された。 FIG. 23 shows the results of dark field observation with time when gold nanoparticles (spherical) were introduced into cells. FIG. 23 is a night-vision observation image for 2 hours immediately after the gold nanoparticles (spherical shape) were added to the medium. According to FIG. 23, it is observed that the gold nanoparticles (spherical) are introduced into the cells, and the introduced gold nanoparticles (spherical) are moving in the cells using their own fluidity. It was done.
〔実験例５：レイリー分光イメージング〕
＜方法＞
マクロファージ細胞に粒子径５０ｎｍの金ナノ粒子を導入し、レイリー散乱スペクトルを取得した。この実験に用いた光学系を図２４に示す。暗視野コンデンサーによって試料を照明し、散乱光のみを水浸対物レンズ(100倍、N.A.1.0)を用いて集光する。スリットと共役な位置のスペクトルの一次元方向の空間分布を観察できる。ガルバノミラーによって観察位置を走査し、散乱光は分光器によって分光され、冷却ＣＣＤによって測定される。試料の各ラインで測定した散乱光強度からイメージングを行う。検出器として冷却ＣＣＤカメラ（PIXIS400：Princeton Instrument社）、および分光器（MK-300：分光計器社）を用いた。[Experimental Example 5: Rayleigh spectroscopic imaging]
<Method>
Gold nanoparticles having a particle diameter of 50 nm were introduced into macrophage cells, and a Rayleigh scattering spectrum was obtained. The optical system used for this experiment is shown in FIG. The sample is illuminated by a dark field condenser, and only the scattered light is collected using a water immersion objective lens (100 ×, NA1.0). One-dimensional spatial distribution of the spectrum at a position conjugate with the slit can be observed. The observation position is scanned by a galvanometer mirror, and the scattered light is dispersed by a spectroscope and measured by a cooled CCD. Imaging is performed from the scattered light intensity measured at each line of the sample. A cooled CCD camera (PIXIS400: Princeton Instrument) and a spectrometer (MK-300: Spectrometer) were used as detectors.
＜結果＞
金ナノ粒子を培地に添加し、１時間培養したマクロファージ細胞のレイリー分光イメージを図２５（ａ）に示す。細胞に導入された金ナノ粒子は、図２５（ａ）中で明るい灰色の粒子状の部分で表され、細胞は金ナノ粒子より暗い灰色で表されている。なお細胞のイメージは６３２ｎｍの散乱光強度により作成された。図２５（ａ）からマクロファージ内に導入された金ナノ粒子を検出することができるということがわかった。図２５（ｂ）は、同図（ａ）の各点で観察された散乱光スペクトルを示す。細胞の散乱光スペクトルがブロードであるのに対し、金ナノ粒子の散乱光スペクトルには共鳴ピークがあった。<Result>
FIG. 25 (a) shows a Rayleigh spectroscopic image of macrophage cells in which gold nanoparticles were added to the medium and cultured for 1 hour. The gold nanoparticles introduced into the cells are represented by light gray particulate portions in FIG. 25 (a), and the cells are represented in darker gray than the gold nanoparticles. In addition, the image of the cell was created with the scattered light intensity of 632 nm. FIG. 25 (a) shows that gold nanoparticles introduced into macrophages can be detected. FIG. 25B shows the scattered light spectrum observed at each point in FIG. The scattered light spectrum of the cells was broad, whereas the scattered light spectrum of the gold nanoparticles had a resonance peak.
〔実施例３：経時レイリー分光イメージング〕
＜方法＞
金ナノ粒子を培地に添加した直後のマクロファージ細胞について、１時間に渡って経時的にレイリー分光イメージングを行った。細胞を経時的に観察した以外は、実験例５と同様にした。[Example 3: Rayleigh spectral imaging over time]
<Method>
Rayleigh spectroscopic imaging of macrophage cells immediately after adding gold nanoparticles to the medium was performed over time for 1 hour. The procedure was the same as in Experimental Example 5 except that the cells were observed over time.
＜結果＞
図２６に、金ナノ粒子の導入が行われたマクロファージ細胞についてレイリー分光イメージングを経時的に観察を行った結果を示す。図２６によれば金ナノ粒子（球状）が細胞内に導入されている様子、および導入された金ナノ粒子（球状）が細胞内を自己の流動性を利用して移動している様子が観察された（図中の明るい粒子状の部分が金ナノ粒子を示す）。<Result>
FIG. 26 shows the results of observation of Rayleigh spectral imaging over time for macrophage cells into which gold nanoparticles have been introduced. According to FIG. 26, it is observed that the gold nanoparticles (spherical) are introduced into the cells, and the introduced gold nanoparticles (spherical) are moving in the cells using their own fluidity. (Bright particles in the figure represent gold nanoparticles).
上記で得られたレイリー分光イメージングから得られた像を重ねてイメージングを行った結果を図２８に示した。図２８によれば、生細胞を高感度かつ、高空間分解に画像化ずることができるということがわかった。 FIG. 28 shows the result of imaging by superimposing the images obtained from the Rayleigh spectral imaging obtained above. According to FIG. 28, it was found that live cells can be imaged with high sensitivity and high spatial resolution.
上記のように本発明によれば、外的な走査を行うことなく、生細胞内の分子等の微小な試料を高感度で高速かつ、高空間分解に画像（三次元画像）を形成する方法を提供することができる。 As described above, according to the present invention, a method for forming an image (three-dimensional image) with high sensitivity, high speed, and high spatial resolution of a minute sample such as a molecule in a living cell without performing external scanning. Can be provided.
また本発明の方法によれば、試料の画像化を行うことができると同時に、ナノ粒子プローブの近傍に存在する物質の情報を検出することができる。ナノメートルサイズのプローブを用いているため、当該プローブを用いない場合に比してラマン散乱光等の光学応答によって観察される分子種が少ないために、高精度で物質の情報を把握することができる。例えば、タンパク質、酵素をはじめとする各種物質の細胞内分布を細胞の画像化と同時に調べることができる。 Further, according to the method of the present invention, it is possible to perform imaging of a sample, and at the same time, it is possible to detect information on a substance existing in the vicinity of the nanoparticle probe. Since a nanometer-sized probe is used, there are fewer molecular species observed by optical response such as Raman scattered light than when the probe is not used, so it is possible to grasp substance information with high accuracy. it can. For example, the intracellular distribution of various substances including proteins and enzymes can be examined simultaneously with the imaging of cells.
さらに細胞内での動向を調べたい薬剤などの物質を、ナノ粒子プローブの表面に標識しておくことで、細胞内における当該物質の動向を調べることができる。また当該薬物等の物質が細胞内で運搬される経路の状態を高空間分解能で観察することも可能となる。 Furthermore, by labeling the surface of the nanoparticle probe with a substance such as a drug whose movement in the cell is to be investigated, the movement of the substance in the cell can be examined. It is also possible to observe with high spatial resolution the state of the route through which the substance such as the drug is transported in the cell.
それゆえ、本発明は試料の画像化に関する産業のみならず、各種分析に関する産業、製薬に関する産業等、種々広範な産業において利用可能である。 Therefore, the present invention can be used not only in the industry related to sample imaging but also in various industries such as various analysis industries and pharmaceutical industries.
１ 試料
２ 粒子プローブまたはナノ粒子プローブの光学応答のシグナル
３ シート
４ 暗視野顕微鏡（位置決定手段）
５ レーザー光源（照射手段）
６ ガルバノミラー（光路変更手段）
７ 検出手段
８ 分光器
９ ＣＣＤカメラ
１８ コンピュータ
１００ 本発明にかかる方法を実施するための装置1 Sample 2 Signal of optical response of particle probe or nanoparticle probe 3 Sheet 4 Dark field microscope (position determining means)
5 Laser light source (irradiation means)
6 Galvano mirror (light path changing means)
DESCRIPTION OF SYMBOLS 7 Detection means 8 Spectrometer 9 CCD camera 18 Computer 100 Apparatus for implementing the method concerning this invention
Claims (15)
流動場を備える試料の流動場に、自己の流動性を利用して当該試料内を移動する粒子プローブを導入し、
上記試料は生細胞であり、
位置決定手段によって、上記試料の内部における、上記試料内を移動する上記粒子プローブの位置を経時的に決定し、
上記粒子プローブの近傍に存在する物質の、上記粒子プローブの位置決定時と同時の光学応答を経時的に検出することによって、試料における粒子プローブの位置情報を複数取得し、
上記複数取得された粒子プローブの位置情報を重ね合わせて画像化することによって流動場を備える試料の画像を形成することを特徴とする、上記方法。 A method for forming an image of a sample comprising a flow field,
Introducing a particle probe that moves inside the sample using its own fluidity into the flow field of the sample with the flow field,
The sample is a living cell,
By the position determination means, the position of the particle probe moving in the sample inside the sample is determined over time ,
By detecting the optical response of the substance existing in the vicinity of the particle probe at the same time as the position determination of the particle probe over time, a plurality of pieces of position information of the particle probe in the sample are obtained,
The method according to claim 1, wherein an image of a sample having a flow field is formed by overlaying and imaging the position information of the plurality of acquired particle probes.
上記位置決定手段によって決定された位置に存在する粒子プローブに、上記位置決定手段による上記粒子プローブの位置決定と同時に光を照射し、上記粒子プローブの近傍に存在する物質から散乱光および蛍光のいずれか１つ以上を発生させる照射手段と、
上記照射手段から照射される光、上記散乱光および蛍光からなる群より選ばれるいずれか１以上の光の光路を変更可能であって、上記粒子プローブの移動速度に対して十分に速い速度で光路を変更する光路変更手段と、
上記散乱光および蛍光のいずれか１つ以上を、上記位置決定手段による上記粒子プローブの位置決定と同時に検出するための検出手段と、
粒子プローブの位置情報を重ね合わせて画像化する手段と、
を備え、
上記粒子プローブは、自己の流動性を利用して当該試料内を移動する粒子プローブであることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法を実施するための装置。 Position determining means for determining the position of the particle probe in the sample;
The particle probe existing at the position determined by the position determining means is irradiated with light simultaneously with the position determination of the particle probe by the position determining means, and either scattered light or fluorescence is emitted from a substance existing in the vicinity of the particle probe. Irradiation means for generating one or more,
The optical path of any one or more light selected from the group consisting of the light irradiated from the irradiation means, the scattered light, and the fluorescence can be changed, and the optical path is sufficiently fast with respect to the moving speed of the particle probe. An optical path changing means for changing
Detection means for detecting any one or more of the scattered light and fluorescence simultaneously with the position determination of the particle probe by the position determination means;
Means for overlaying and imaging the position information of the particle probe;
With
The apparatus for carrying out the method according to claim 1, wherein the particle probe is a particle probe that moves within the sample using its own fluidity.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010523769A JP5519506B2 (en) | 2008-08-08 | 2009-08-07 | Imaging method using particle probe and use thereof |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2008205387 | 2008-08-08 | ||
| JP2008205387 | 2008-08-08 | ||
| PCT/JP2009/003792 WO2010016267A1 (en) | 2008-08-08 | 2009-08-07 | Method for detecting distribution of substance present near particle probe, imaging method using particle probe, and use thereof |
| JP2010523769A JP5519506B2 (en) | 2008-08-08 | 2009-08-07 | Imaging method using particle probe and use thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2010016267A1 JPWO2010016267A1 (en) | 2012-01-19 |
| JP5519506B2 true JP5519506B2 (en) | 2014-06-11 |
Family
ID=41663494
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2010523769A Active JP5519506B2 (en) | 2008-08-08 | 2009-08-07 | Imaging method using particle probe and use thereof |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP5519506B2 (en) |
| WO (1) | WO2010016267A1 (en) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5549356B2 (en) * | 2010-04-28 | 2014-07-16 | 学校法人早稲田大学 | Surface-enhanced Raman spectroscopy |
| JP5947181B2 (en) | 2012-09-28 | 2016-07-06 | 富士フイルム株式会社 | Optical measuring device using photoelectric field enhancement device |
| JP6145881B2 (en) * | 2013-11-07 | 2017-06-14 | 富士フイルム株式会社 | Raman spectral image acquisition system and Raman spectral image acquisition method |
| WO2022151469A1 (en) * | 2021-01-18 | 2022-07-21 | 中国科学院生态环境研究中心 | Device and method for confocal imaging of scattered light of nano-particles |
| WO2023106372A1 (en) * | 2021-12-08 | 2023-06-15 | 国立研究開発法人理化学研究所 | Enzyme measurement method, microchamber array, kit, method for capturing raman scattering image, and method for measuring target molecule |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000258410A (en) * | 1999-03-11 | 2000-09-22 | Kokuritsu Iyakuhin Shokuhin Eisei Kenkyusho | Measuring method of carcinogenesis promoter function |
| JP2005069768A (en) * | 2003-08-21 | 2005-03-17 | Mitsubishi Heavy Ind Ltd | Nano-cluster measuring instrument and solar cell manufacturing apparatus |
| JP2006058321A (en) * | 2004-08-17 | 2006-03-02 | Yokogawa Electric Corp | Three-dimensional confocal microscopic system |
| WO2007135804A1 (en) * | 2006-05-22 | 2007-11-29 | Tokyo Institute Of Technology | Fluid measurement instrument and fluid measurement method employing laser-induced fluorescence method |
-
2009
- 2009-08-07 JP JP2010523769A patent/JP5519506B2/en active Active
- 2009-08-07 WO PCT/JP2009/003792 patent/WO2010016267A1/en active Application Filing
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000258410A (en) * | 1999-03-11 | 2000-09-22 | Kokuritsu Iyakuhin Shokuhin Eisei Kenkyusho | Measuring method of carcinogenesis promoter function |
| JP2005069768A (en) * | 2003-08-21 | 2005-03-17 | Mitsubishi Heavy Ind Ltd | Nano-cluster measuring instrument and solar cell manufacturing apparatus |
| JP2006058321A (en) * | 2004-08-17 | 2006-03-02 | Yokogawa Electric Corp | Three-dimensional confocal microscopic system |
| WO2007135804A1 (en) * | 2006-05-22 | 2007-11-29 | Tokyo Institute Of Technology | Fluid measurement instrument and fluid measurement method employing laser-induced fluorescence method |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| JPN6009058240; Ｋｎｅｉｐｐ Ｊ ， ｅｔ．ａｌ．: 'Ｏｎｅ- ａｎｄ Ｔｗｏ-Ｐｈｏｔｏｎ Ｅｘｃｉｔｅｄ Ｏｐｔｉｃａｌ ｐＨ Ｐｒｏｂｉｎｇ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ Ｓｕｒｆａｃｅ-Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒａｍａｎ ａｎｄ Ｈｙｐｅｒ-Ｒａｍａ' Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ Ｖｏｌ．７， Ｎｏ．９, 200709, ｐ．２８１９-２８２３ * |
| JPN6009058241; 市村垂生、河田聡: '高分子科学最近の進歩 ＤＮＡを光でどこまで見ることができるか？' 高分子 第５６巻、第６号, 20070601, 第４４１頁-第４４５頁 * |
| JPN6009058242; Ｓｈａｒｏｎｏｖ Ｓ ， ｅｔ．ａｌ．: 'Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｔｈｒｅｅ-Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｌａｓｅｒ Ｒａｍａｎ-ＳＥＲＳ-Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｐｒｏｂｅ． Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｈ' Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ Ｖｏｌ．２５， Ｎｏ．７＆８, 199407, ｐ．６９９-７０７ * |
| JPN6009058243; Ｌｅｅ Ｓ， ｅｔ．ａｌ．: 'Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ＨＥＫ２９３ Ｃｅｌｌｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＰＬＣgamma１ Ｕｓｉｎｇ Ｓｕｒｆａｃｅ-Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒａｍａｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ' Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．７９， Ｎｏ．３, 20070201, ｐ．９１６-９２２ * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2010016267A1 (en) | 2010-02-11 |
| JPWO2010016267A1 (en) | 2012-01-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Vo‐Dinh et al. | Plasmonic nanoprobes for SERS biosensing and bioimaging | |
| Stender et al. | Single cell optical imaging and spectroscopy | |
| Klein et al. | Quantitative visualization of colloidal and intracellular gold nanoparticles by confocal microscopy | |
| Potara et al. | Chitosan-coated triangular silver nanoparticles as a novel class of biocompatible, highly sensitive plasmonic platforms for intracellular SERS sensing and imaging | |
| Qian et al. | Dark-field light scattering imaging of living cancer cell component from birth through division using bioconjugated gold nanoprobes | |
| Vo-Dinh et al. | Nanoprobes and nanobiosensors for monitoring and imaging individual living cells | |
| CN105758838B (en) | The detection of induced with laser enhancing Raman spectrum and method for separating and its device in liquid | |
| Taylor et al. | Interferometric scattering (iSCAT) microscopy and related techniques | |
| Lee et al. | Plasmonic nanostructure-based bioimaging and detection techniques at the single-cell level | |
| Gibbs-Flournoy et al. | Darkfield-confocal microscopy detection of nanoscale particle internalization by human lung cells | |
| JP5519506B2 (en) | Imaging method using particle probe and use thereof | |
| Wang et al. | Detecting and tracking nonfluorescent nanoparticle probes in live cells | |
| Lin et al. | Advanced plasmonic technologies for multi-scale biomedical imaging | |
| Nedosekin et al. | Photoacoustic flow cytometry for nanomaterial research | |
| Nicolson et al. | Surface enhanced resonance Raman spectroscopy (SERRS) for probing through plastic and tissue barriers using a handheld spectrometer | |
| Chen et al. | Advances in super-resolution fluorescence microscopy for the study of nano–cell interactions | |
| KR20100002434A (en) | A method of dectecting cancer cells using gold hollow nanoparticle and optical imaging technology | |
| Harada et al. | Raman molecular imaging of cells and tissues: towards functional diagnostic imaging without labeling | |
| JP6796379B2 (en) | Laser microdissection and laser microdissection method | |
| CN112041660A (en) | System, apparatus and method for three-dimensional imaging of moving particles | |
| D’Acunto et al. | Raman spectroscopy of osteosarcoma cells | |
| Tang et al. | Chemical probing of single cancer cells with gold nanoaggregates by surface-enhanced Raman scattering | |
| Cheng et al. | Background-free three-dimensional selective imaging of anisotropic plasmonic nanoparticles | |
| WO2007106069A2 (en) | Precision optical intracellular near field imaging/spectroscopy technology | |
| Estrada et al. | Spectroscopic properties of gold nanoparticles at the single‐particle level in biological environments |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20120224 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130205 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130408 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20131015 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140115 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20140122 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20140325 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20140403 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5519506 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |