JP5515131B2 - Method for reducing the occurrence of drug-resistant bacteria - Google Patents
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Description
本発明は、様々な遺伝子の細菌等の菌体への取り込みを抑制し、薬剤耐性菌等の発生を減少させることに関する。 The present invention relates to suppressing the uptake of various genes into bacteria such as bacteria and reducing the occurrence of drug-resistant bacteria.
ゲノム情報の解析された生物種の数が増える一方で、環境中の微生物の９５％以上が培養することさえ難しいとされている。これらの微生物の中には、有用な遺伝子情報をもつものも多いと推定されることから、土壌圏や水圏から直接ＤＮＡを抽出することが試みられた。その結果、環境中にはこれらの微生物等から由来するＤＮＡが未消化のまま存在することが確認された。このような環境微生物の中には、有益あるいは有害な様々な遺伝子情報をもつものが存在することが予想され得る。 While the number of species whose genome information has been analyzed increases, more than 95% of microorganisms in the environment are even difficult to culture. Since it is presumed that many of these microorganisms have useful genetic information, it was attempted to extract DNA directly from the soil or hydrosphere. As a result, it was confirmed that DNA derived from these microorganisms and the like existed in the environment in an undigested state. Among these environmental microorganisms, it can be expected that there are various kinds of beneficial or harmful genetic information.
かつては、これらの有害遺伝子が異なる生物種間で水平伝播する可能性はほとんどないものと考えられてきた（ここで、遺伝子の「水平伝播（転移）」とは、まったく関係のない別の生物から遺伝子が伝えられることであり、遺伝子が親から子へと伝えられていく遺伝子の「垂直伝播（転移）」と相対する用語である）。プラスミド、トランスポゾン、バクテリオファージなどの非自律性遺伝因子によって、異なる生物種の間で遺伝子が伝達される場合があることは知られていたが、これらの遺伝子の水平転移というのは、あくまで例外的な現象であると考えられていた。しかし、微生物等のゲノム情報の解析により異なる生物種間における遺伝子水平転移が、頻繁かつダイナミックに起こっている実態がわかってきた。院内感染を引き起こすＭＲＳＡなどの多剤耐性菌の拡がりや、大腸菌Ｏ−１５７に代表される病原性の進化などにおいても、微生物の種の壁を越えた遺伝子の水平転移が大きく関与していることが明らかとなっている。これらの遺伝子の細胞内への取り込みの機構についてはまだ不明な部分も多いが、自然取り込みを行うバクテリアにおいては、グラム陰性、グラム陽性のバクテリア共通に特殊なタンパク質を発現していることが知られている（例えば、非特許文献１参照）。 In the past, it has been thought that these harmful genes are unlikely to be transmitted horizontally between different species (where another gene has nothing to do with “horizontal transmission”). (This is a term opposite to “vertical transmission (transposition)” of genes that are transmitted from parents to children.) It has been known that non-autonomous genetic factors such as plasmids, transposons, and bacteriophages may transfer genes between different species, but horizontal transfer of these genes is only an exception. It was thought to be a strange phenomenon. However, analysis of genome information on microorganisms and the like has revealed the fact that horizontal gene transfer between different species frequently and dynamically occurs. The spread of multidrug-resistant bacteria such as MRSA that cause nosocomial infections and the evolution of pathogenicity typified by E. coli O-157 are largely involved in the horizontal transfer of genes across microbial species walls. Is clear. There are still many unclear parts about the mechanism of the uptake of these genes into cells, but it is known that bacteria that naturally uptake express special proteins in common to Gram-negative and Gram-positive bacteria. (For example, refer nonpatent literature 1).
一方、真核細胞、特にその培養細胞への遺伝子導入としては、主に正に荷電しているリポソーム（カチオンリポソーム）とポリヌクレオチドとの複合体を形成させ、該カチオンリポソームを負に荷電している細胞表面に吸着させ、細胞膜と融合させることによって、細胞内にポリヌクレオチドを導入させるリポフェクション法が用いられている（例えば、非特許文献２参照）。この手法は、ペプチドグリカン層やセルロース層などの細胞壁を有する細胞の場合、リポソームと融合する細胞膜が露出していないため、適用対象が細胞壁を有さない細胞に限定されると考えられてきたが、細胞壁を有する大腸菌、古細菌及び酵母等の生物種に対してリポフェクション法及びその類似法が、遺伝子を導入する有効な手法であることが知られつつある。従来リポソーム法やリポフェクション法には、生体膜に由来する脂質が用いられてきたが、これにカチオニック脂質を加えたり、カチオニック脂質単独で用いることで遺伝子導入効率が向上した。カチオニック脂質は、化学合成のものが主に用いられてきたが、最近生物由来のバイオサーフェクタントにおいても遺伝子導入が高効率におこなわれることが発見され、利用されつつある。 On the other hand, for gene transfer into eukaryotic cells, particularly cultured cells thereof, a complex of mainly a positively charged liposome (cationic liposome) and a polynucleotide is formed, and the cationic liposome is negatively charged. A lipofection method is used in which a polynucleotide is introduced into a cell by adsorbing it to the surface of a cell and fusing it with a cell membrane (see, for example, Non-Patent Document 2). In this method, in the case of cells having cell walls such as peptidoglycan layer and cellulose layer, since the cell membrane fused with the liposome is not exposed, it has been considered that the application target is limited to cells having no cell wall. It is becoming known that the lipofection method and similar methods are effective techniques for introducing genes into biological species such as Escherichia coli, archaea, and yeast having cell walls. Conventionally, lipids derived from biological membranes have been used in the liposome method and lipofection method, but gene transfer efficiency has been improved by adding cationic lipids or using only cationic lipids. Cationic lipids that have been chemically synthesized have been mainly used, but recently, it has been discovered that gene introduction is performed with high efficiency even in biosurfactants derived from living organisms.
このような背景により、リポフェクション法と同様の機構によって細胞へのＤＮＡ等の遺伝子の取り込みが環境中で生じ、このような遺伝子導入が多剤耐性菌等の発生の少なくとも一部に関与していると疑われている。例えば、医療分野や農業、畜産分野など抗生物質等が多量に用いられている現場では、薬剤耐性菌が発生し、その菌体死等によりその薬剤耐性を担う遺伝子が、リポソームの構成要素となりうるリン脂質で構成されている生体膜とともに環境中に放出されている。これらの遺伝子が同種もしくは異種の菌体に取り込
まれ薬剤耐性菌の発生を生じているものと推定され、このサイクルがいくつか繰り返され、また菌体内で遺伝子組み換えがおこり多剤耐性菌へと進化し、その後は多剤耐性を担う遺伝子が、同種、異種の多剤耐性菌の発生を促しているものと推定される。
Due to such a background, uptake of genes such as DNA into cells occurs in the environment by the same mechanism as the lipofection method, and such gene introduction is involved in at least a part of the occurrence of multidrug-resistant bacteria and the like. It is suspected. For example, at sites where a large amount of antibiotics are used, such as in the medical field, agriculture, and livestock field, drug-resistant bacteria are generated, and the genes responsible for the drug resistance due to the death of the cells can be a component of the liposome. It is released into the environment together with biological membranes composed of phospholipids. It is presumed that these genes are taken up by the same or different types of cells, resulting in the generation of drug-resistant bacteria. This cycle is repeated several times, and genetic recombination occurs in the cells to evolve into multi-drug resistant bacteria. After that, it is presumed that the gene responsible for multidrug resistance promotes the generation of multi-drug resistant bacteria of the same or different types.
例えば、医療分野で薬剤耐性菌が生じている現場においては、ＩＭＣＪ院内感染防止委員会マニュアルに、医療分野における多剤耐性菌等による病院内院内感染として、以下の３要因：
（１）感染源となる病原体が存在すること−これは外から院内に持ち込まれる場合と院内の常在菌の多剤耐性化が問題となる；
（２）感染が成り立つ経路が存在すること；
（３）感染が生じる宿主（新生児、老人を含む患者や病院職員等）が存在すること、
が挙げられており、多剤耐性菌の院外からの持ち込み、院内での発生が懸念されている。
For example, in the field where drug-resistant bacteria are occurring in the medical field, the IMCJ Nosocomial Infection Prevention Committee Manual states that the hospital has nosocomial infections due to multi-drug resistant bacteria in the medical field and the following three factors:
(1) The presence of a pathogen that is the source of infection-this is a problem when it is brought into the hospital from the outside and the multidrug resistance of the resident bacteria in the hospital is a problem;
(2) that there is a route for infection;
(3) The presence of a host (such as a newborn, a patient including an elderly person, or a hospital staff) that causes infection
There are concerns about the introduction of multidrug-resistant bacteria from outside the hospital and outbreaks in the hospital.
また、農業分野においては、同じ薬剤を長期に使うことにより各種の薬剤耐性を持った病原菌の発生が顕著な問題とっている。 In the agricultural field, the generation of pathogenic bacteria having various drug resistances has become a significant problem by using the same drug for a long time.
しかし、いずれの分野においても、発生した薬剤耐性菌等に対して、耐性薬剤以外の薬剤を使用するなど対症的な対策がとられているが、環境中の遺伝子を対象とし、その菌への取り込みを抑制することによって、菌体外遺伝子が導入された菌体の発生そのものを抑制する視点からの対策はとられていなかった。
本発明の主な目的は、様々な環境中の遺伝子を対象とし、その菌体への取り込みを抑制し、外部の遺伝子が導入され、その形質が変化した菌体の発生を抑制する方法を提供することにある。 The main object of the present invention is to provide a method for suppressing the generation of bacterial cells in which genes in various environments are targeted, the incorporation into the bacterial cells is suppressed, and the external genes are introduced to change the traits. There is to do.
本発明者は、上記の如き従来技術の問題点を解決するために、鋭意研究を重ねてきた。その結果、環境中の遺伝子、菌体及びリポソームを含む対象物を、そのリポソームの状態を改変するように処理することによって菌体への環境中の遺伝子の取り込みを抑制し、菌体外遺伝子が導入された菌体の発生を抑制することができることを見いだした。本発明は、これらの知見に基づくものである。 The present inventor has intensively studied to solve the problems of the prior art as described above. As a result, by treating an object containing environmental genes, bacterial cells and liposomes so as to modify the state of the liposomes, the incorporation of the environmental genes into the bacterial cells is suppressed, and the extracellular genes are It was found that generation of the introduced cells can be suppressed. The present invention is based on these findings.
即ち、本発明は、以下の項に関する；
項１．菌体及び菌体外の遺伝子を含む対象物を、リポソーム状態を改変可能な分子種を用いて処理することを特徴とする、該遺伝子の該菌体への導入を抑制する方法；
項２．前記処理が、対象物への前記分子種の噴霧、塗布、及び混合、該分子種への対象物の浸漬、ならびに該分子種を用いる対象物の洗浄から選択される、項１に記載の方法；
項３．前記分子種に加えて核酸分解酵素を用いて前記対象物を処理する、項１または２に記載の方法；
項４．前記分子種が、脂質、タンパク質、溶剤、エステル類、カルボン酸類またはその
塩、スルホン酸類またはその塩、界面活性剤、無機イオンまたはその塩からなる群より選択される、項１〜３のいずれか一項に記載の方法；
項５．前記分子種が、界面活性剤または無機塩である、項４に記載の方法；
項６．前記界面活性剤がマンノシルエリスリトールリピッド（Ｍａｎｎｏｓｙｌｅｒｙｔｈｒｙｔｏｌ ｌｉｐｉｄ）（ＭＥＬ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及びポリエチレングリコール モノ-p-イソ-オクチルフェニルエーテル（Triton X-100）からなる
群より選択される少なくとも１種であり、前記無機塩が、塩化マグネシウム、塩化ナトリウム及び塩化カリウムからなる群より選択される少なくとも１種である項５に記載の方法；
項７．リポソーム状態を改変可能な分子種を含む、菌体外遺伝子の菌体への導入を抑制するための組成物；
項８．前記分子種に加えて核酸分解酵素を含む、項７に記載の組成物；
項９．前記分子種が、脂質、タンパク質、溶剤、カルボン酸類またはその塩、スルホン酸類またはその塩、界面活性剤、無機イオンまたはその塩からなる群より選択される、項７または８に記載の組成物；
項１０．前記分子種が、界面活性剤または無機塩である、項９に記載の組成物；
項１１．前記界面活性剤が、ＭＥＬ、ＳＤＳ及びTriton X-100からなる群より選択される少なくとも１種であり、前記無機塩が、塩化マグネシウム、塩化ナトリウム及び塩化カリウムからなる群より選択される少なくとも１種である、項１０に記載の組成物；
項１２．リポソーム状態を改変可能な分子種、緩衝液、及び噴霧装置を含む、菌体外遺伝子の菌体への導入を抑制するためのキット；
項１３．核酸分解酵素をさらに含む、項１２に記載のキット；
項１４．前記分子種が、脂質、タンパク質、溶剤、エステル類、カルボン酸類またはその塩、スルホン酸類またはその塩、界面活性剤、無機イオンまたはその塩からなる群より選択される、項１２または１３に記載のキット；
項１５．前記分子種が、界面活性剤または無機塩である、項１４に記載のキット；
項１６．前記界面活性剤がＭＥＬ、ＳＤＳ及びTriton X-100からなる群より選択される少なくとも１種であり、前記無機塩が、塩化マグネシウム、塩化ナトリウム及び塩化カリウムからなる群より選択される少なくとも１種である項１５に記載のキット；
項１７．リポソーム状態を改変可能な分子種を含む被覆層を有する物品；
項１８．前記被服層が核酸分解酵素を含む、項１７に記載の物品。
That is, the present invention relates to the following items:
Item 1. A method for suppressing introduction of the gene into the microbial cell, which comprises treating a target containing the microbial cell and a gene outside the microbial cell with a molecular species capable of modifying a liposome state;
Item 2. Item 2. The method according to Item 1, wherein the treatment is selected from spraying, applying, and mixing the molecular species on an object, immersing the object in the molecular species, and washing the object using the molecular species. ;
Item 3. Item 3. The method according to Item 1 or 2, wherein the object is treated with a nucleolytic enzyme in addition to the molecular species;
Item 4. Any one of Items 1 to 3, wherein the molecular species is selected from the group consisting of lipids, proteins, solvents, esters, carboxylic acids or salts thereof, sulfonic acids or salts thereof, surfactants, inorganic ions or salts thereof. The method according to one paragraph;
Item 5. Item 5. The method according to Item 4, wherein the molecular species is a surfactant or an inorganic salt;
Item 6. The surfactant is at least one selected from the group consisting of mannosyl erythritol lipid (MEL), sodium dodecyl sulfate (SDS) and polyethylene glycol mono-p-iso-octylphenyl ether (Triton X-100). The method according to item 5, wherein the inorganic salt is at least one selected from the group consisting of magnesium chloride, sodium chloride and potassium chloride;
Item 7. A composition for suppressing introduction of an extracellular gene into a microbial cell, comprising a molecular species capable of modifying the liposome state;
Item 8. Item 8. The composition according to Item 7, comprising a nucleolytic enzyme in addition to the molecular species;
Item 9. Item 9. The composition according to Item 7 or 8, wherein the molecular species is selected from the group consisting of lipids, proteins, solvents, carboxylic acids or salts thereof, sulfonic acids or salts thereof, surfactants, inorganic ions or salts thereof;
Item 10. Item 10. The composition according to Item 9, wherein the molecular species is a surfactant or an inorganic salt;
Item 11. The surfactant is at least one selected from the group consisting of MEL, SDS and Triton X-100, and the inorganic salt is at least one selected from the group consisting of magnesium chloride, sodium chloride and potassium chloride. Item 10. The composition according to Item 10, which is
Item 12. A kit for suppressing introduction of an extracellular gene into a microbial cell, comprising a molecular species capable of modifying the liposome state, a buffer solution, and a spray device;
Item 13. Item 13. The kit according to Item 12, further comprising a nucleolytic enzyme;
Item 14. Item 14. The item 12 or 13, wherein the molecular species is selected from the group consisting of lipids, proteins, solvents, esters, carboxylic acids or salts thereof, sulfonic acids or salts thereof, surfactants, inorganic ions or salts thereof. kit;
Item 15. Item 15. The kit according to Item 14, wherein the molecular species is a surfactant or an inorganic salt;
Item 16. The surfactant is at least one selected from the group consisting of MEL, SDS and Triton X-100, and the inorganic salt is at least one selected from the group consisting of magnesium chloride, sodium chloride and potassium chloride. Item 16. The kit according to Item 15;
Item 17. An article having a coating layer comprising a molecular species capable of modifying the liposome state;
Item 18. Item 18. The article according to Item 17, wherein the clothing layer contains a nucleolytic enzyme.
本明細書において、遺伝子は、一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡであって、それ自体が遺伝情報を担っているか、または遺伝情報、表現型に影響を与えることができるヌクレオチドを意味する。これらの遺伝子としては、薬剤耐性、病原性等を担う遺伝子、酵素等をコードする遺伝子等が挙げられるが、これらに限定されない。 In the present specification, a gene refers to a single-stranded or double-stranded RNA or DNA, which itself bears genetic information or can influence genetic information or a phenotype. . Examples of these genes include, but are not limited to, genes responsible for drug resistance and pathogenicity, genes encoding enzymes, and the like.
また、遺伝子は各種形態の遺伝子を含み、例えば、自己増殖するプラスミド、トランスポゾン、ＤＮＡの制限酵素断片、ＤＮＡの各種分解酵素断片、ＤＮＡの物理分解断片、ＰＣＲ断片等も含むものとする。 Genes include various forms of genes, such as self-propagating plasmids, transposons, DNA restriction enzyme fragments, various DNA degradation enzyme fragments, DNA physical degradation fragments, PCR fragments, and the like.
本発明において遺伝子の導入が抑制される菌体としては、細菌、真菌等が挙げられる。 Bacteria, fungi, etc. are mentioned as a microbial cell by which introduction | transduction of a gene is suppressed in this invention.
ここで、細菌は、グラム陽性菌及びグラム陰性菌の両方、および古細菌を含む。グラム陽性菌としては、ブドウ球菌、連鎖球菌、放線菌、抗酸菌等が挙げられ、グラム陰性としては、緑膿菌、大腸菌、アグロバクテリウム、フザリウム等が挙げられる。 Here, the bacteria include both gram positive bacteria and gram negative bacteria, and archaea. Examples of gram-positive bacteria include staphylococci, streptococci, actinomycetes, and acid-fast bacteria, and examples of gram-negative bacteria include Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Agrobacterium, and Fusarium.
真菌としては、ツユカビ、ウドンコカビ、ボトリチス、酵母等が挙げられる。また、本明細書中において、酵母は、カンジダ等の不完全菌も含む。 Examples of the fungi include ayumu mold, powdery mildew, botrytis, and yeast. Moreover, in this specification, yeast also includes incomplete bacteria such as Candida.
本発明において遺伝子の導入が抑制される菌体は、既に病原性を有するものだけでなく、病原性を有さないものも含む。 In the present invention, the bacterial cells in which gene introduction is suppressed include not only those already having pathogenicity but also those having no pathogenicity.
本発明において、「菌体外の」遺伝子とは、菌体死により菌体細胞から生体膜等と共に放出された遺伝子だけでなく、生体膜等に含まれていない遺伝子、死細胞に残存する遺伝子も含む。 In the present invention, the term “extracellular” gene refers not only to a gene released together with a biological membrane from a bacterial cell due to the death of the bacterial cell, but also to a gene not contained in the biological membrane or the like, or a gene remaining in a dead cell Including.
本発明の対象物としては、菌体が増殖している現場、例えば、病院の器具洗浄流し、病室、トイレ、洗面所等の壁、床等、医療用具等の医療現場、圃場、農場（設備を含む）、厩舎等の農畜産現場が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中において、用語、医療用具とは、カテーテル、チューブ、聴診器、ガーゼ、絆創膏等だけでなく、医師、看護士、患者の衣類等（白衣、帽子、手袋、マスク、おむつ等）、シーツ、毛布、布団、身体と触れるような装置（腎臓透析装置等）等も含む。また、病院、農場以外にも、住居、学校等の設備、家具等、様々なものが対象物となり得る。 Examples of the object of the present invention include a site where fungus bodies are growing, such as a hospital equipment wash-out, a hospital room, a toilet, a wall of a washroom, a floor, a medical site such as a medical device, a farm, a farm (equipment) ), And farm and livestock fields such as stables, but are not limited to these. In this specification, the term medical device is not only a catheter, tube, stethoscope, gauze, bandage, etc., but also a doctor, nurse, patient's clothing (white coat, hat, gloves, mask, diaper, etc.), Also includes sheets, blankets, futons, and devices that come into contact with the body (eg, kidney dialysis devices). In addition to hospitals and farms, various objects such as housing, school facilities, furniture, and the like can be objects.
本発明における、リポソーム状態を改変可能な分子種とは、リポソームの状態やサイズを変更する分子種であって菌体への遺伝子の導入を抑制できるものを示す。本発明におけるリポソーム状態を改変可能な分子種は、このような特徴を有しているものであれば、どのような分子種でもよく、例えば、脂質（単純脂質、複合脂質（糖脂質、リポ多糖、リン脂質等）、誘導脂質、ステロイド、カロテノイド、テルペノイド等）、タンパク質（酵素（プロテアーゼ、ペプチダーゼ、エステラーゼ等）等）、溶剤（アルコール類（エタノール等）、グリコール類、グリセリン等）、カルボン酸類（酢酸、乳酸、低級脂肪酸、中級脂肪酸、高級脂肪酸等）またはその塩、スルホン酸類（トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸等）またはその塩、界面活性剤（ノニオン界面活性剤、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤、バイオサーファクタント等）、無機イオンまたはその塩（カルシウムイオン、リチウムイオン、塩化ナトリウム等）等が用いられ得る。本発明における好ましいリポソーム状態を改変可能な分子種としては、例えば、実施例に示す、ＭＥＬ、Triton X-100、ＳＤＳならびに塩化マグネシウム、塩化ナトリウム及び塩化カリウムが挙げられる。 In the present invention, the molecular species that can modify the liposome state refers to a molecular species that changes the state and size of the liposome and that can suppress the introduction of the gene into the microbial cells. The molecular species capable of modifying the liposome state in the present invention may be any molecular species as long as it has such characteristics. For example, lipid (simple lipid, complex lipid (glycolipid, lipopolysaccharide) Phospholipids, etc.), derived lipids, steroids, carotenoids, terpenoids, etc.), proteins (enzymes (proteases, peptidases, esterases, etc.)), solvents (alcohols (ethanol, etc.), glycols, glycerin, etc.), carboxylic acids ( Acetic acid, lactic acid, lower fatty acid, intermediate fatty acid, higher fatty acid, etc.) or salts thereof, sulfonic acids (toluenesulfonic acid, methanesulfonic acid, etc.) or salts thereof, surfactants (nonionic surfactants, anionic surfactants, cationic interfaces) Active agents, amphoteric surfactants, biosurfactants, etc.), inorganic ions or their salts (calcium) On, lithium ion, sodium chloride and the like) and the like can be used. Examples of the molecular species capable of modifying the preferred liposome state in the present invention include MEL, Triton X-100, SDS and magnesium chloride, sodium chloride and potassium chloride shown in Examples.
本明細書中において、核酸分解酵素は、ＤＮＡ分解酵素及びＲＮＡ分解酵素を含む。 In the present specification, the nucleolytic enzyme includes a DNA degrading enzyme and an RNA degrading enzyme.
菌体外遺伝子が導入された菌体としては、例えば、ＭＲＳＡなどの多剤耐性菌、大腸菌Ｏ−１５７等の病原性又はヒトを含む哺乳動物に対して有害な細菌が挙げられるが、これらに限定されない。環境中の種々の場所で遺伝子導入により発生する生態系を乱し得るあらゆる菌体の発生を、本発明によって排除することができる。また、菌体への菌体外遺伝子の導入は、自然界の環境、病院、農場等の他、微生物を培養する食品、化学等の分野の工場設備、多数の微生物が存在する下水処理設備等、様々な場所で発生し得る。 Examples of bacterial cells into which an extracellular gene has been introduced include multidrug-resistant bacteria such as MRSA, pathogenic bacteria such as E. coli O-157, and bacteria harmful to mammals including humans. It is not limited. The occurrence of any fungus that can disrupt the ecosystem generated by gene transfer at various locations in the environment can be eliminated by the present invention. In addition, the introduction of exogenes into bacterial cells includes natural environments, hospitals, farms, etc., foods that culture microorganisms, factory facilities in the field of chemistry, sewage treatment facilities where many microorganisms exist, It can occur in various places.
本発明の方法の実施によって、薬剤耐性菌や有害な微生物あるいはそれ自身ではヒトなどの動物または植物に有害ではないが、環境に何らかの影響を与える菌体の発生を抑制できる。 By carrying out the method of the present invention, it is possible to suppress the occurrence of drug-resistant bacteria, harmful microorganisms, or bacterial cells that are not harmful to animals or plants such as humans, but have some influence on the environment.
本発明の１つの実施形態において、薬剤耐性菌等の発生を減少させる方法は、遺伝子の菌体内への導入を阻害することを特徴とする。 In one embodiment of the present invention, a method for reducing the occurrence of drug-resistant bacteria and the like is characterized by inhibiting the introduction of a gene into a microbial cell.
１つの実施形態において、本発明は、対象物を、糖脂質系バイオサーファクタント等のリポソーム状態を改変可能な分子種を用いて処理することを特徴とする、菌体外遺伝子の菌体への導入の発生を抑制する方法を提供する。 In one embodiment, the present invention treats an object with a molecular species capable of modifying a liposome state such as a glycolipid biosurfactant, and introduces an extracellular gene into the cell. Provided is a method of suppressing the occurrence of
ここで、対象物の処理としては、対象物への前記分子種の噴霧、塗布、及び混合、前記分子種への対象物の浸漬、ならびに前記分子種を用いる対象物の洗浄が挙げられるが、これらに限定されない。 Here, the treatment of the object includes spraying, applying, and mixing the molecular species on the object, immersing the object in the molecular species, and washing the object using the molecular species. It is not limited to these.
例えば、溶液中に添加して用いる場合、最終濃度で、通常、約１０ｎｇ／μｌ以上、好ましくは、約２０ｎｇ／μｌ以上、より好ましくは、約５０ｎｇ／μｌ以上のリポソーム状態を改変分子種となるように添加することによって、遺伝子導入された菌体の伝播発生を抑制することができる。当業者は、処理の態様、使用される対象物の種類、状態等を考慮して、リポソーム状態を改変可能な分子種の必要量を決定し得る。この方法によって、環境中にリポソームとリポソームに含まれていない遺伝子とが存在する場合にも、環境中に遺伝子を含むリポソームが存在する場合にも、自然界でのリポフェクションと同様の機構による菌体への遺伝子の取り込みを抑制することができる。その際、環境中のリポソーム及び菌体を含む対象物にリポソーム状態を改変可能な分子種（例えばＭＥＬ）を作用させることで、リポソーム中への遺伝子の取り込みやリポソームに取り込まれた遺伝子の菌体への導入を阻止することができる（図１〜図３を参照のこと）。 For example, when added to a solution and used, the final molecular concentration is usually about 10 ng / μl or more, preferably about 20 ng / μl or more, more preferably about 50 ng / μl or more as a modified molecular species. By adding in such a manner, it is possible to suppress the occurrence of propagation of the microbial cells introduced with the gene. One skilled in the art can determine the required amount of molecular species capable of modifying the liposome state in view of the mode of treatment, the type of object used, the condition, etc. By this method, even when liposomes and genes not contained in the liposomes exist in the environment, or when liposomes containing the genes exist in the environment, the cells can be transformed into cells by the same mechanism as lipofection in nature. Uptake of the gene can be suppressed. At that time, by incorporating a molecular species (for example, MEL) capable of modifying the liposome state on an object including liposomes and bacteria in the environment, the genes incorporated into the liposomes and the cells of the genes incorporated into the liposomes Can be prevented (see FIGS. 1-3).
さらに、対象物を、リポソーム状態を改変可能な分子種で構成されたリポソームに遺伝子分解酵素等の核酸分解酵素を取り込んだものを用いて処理することによって、環境中のリポソームへの遺伝子の取り込み抑制に加えて遺伝子核酸の分解も生じ、薬剤耐性菌等の、菌体外遺伝子が導入された菌体の発生をより抑制することができる。 In addition, by treating the target with a liposome composed of molecular species capable of modifying the liposome state and incorporating a nucleic acid degrading enzyme such as a gene degrading enzyme, gene uptake into the liposome in the environment is suppressed. In addition to the degradation of the gene nucleic acid, it is possible to further suppress the generation of bacterial cells into which an extracellular gene such as drug-resistant bacteria has been introduced.
また、菌体外遺伝子の菌体への導入によって有害な菌体が発生し得る可能性が高い対象物を集中的に処理することが有効である。例えば、抗生物質を投与している患者の衣服、病室の壁に、リポソーム状態を改変可能な分子種を集中的に噴霧することで、効率的に、多剤耐性菌の発生を抑制することができる。 In addition, it is effective to intensively process a target object that has a high possibility of generating harmful microbial cells due to introduction of the exogene into the microbial cells. For example, it is possible to efficiently suppress the occurrence of multidrug-resistant bacteria by intensively spraying the molecular species that can modify the liposome state on the clothes and the walls of patient rooms receiving antibiotics. it can.
尚、本発明の方法により処理した後、対象物を乾燥することによって、薬剤耐性菌等の、菌体外遺伝子が導入された菌体の発生をより抑制することができる。 In addition, after processing by the method of this invention, generation | occurrence | production of the microbial cell which introduce | transduced the exogene, such as a drug-resistant bacterium, can be suppressed more by drying a target object.
別の実施形態において、本発明はまた、糖脂質系バイオサーファクタント等のリポソーム状態を改変可能な分子種、緩衝液、及び噴霧装置を含む、菌体外遺伝子の菌体への導入を抑制するためのキットを提供する。ここで、緩衝液としては、Ｇｏｏｄ’ｓ緩衝液、リン酸系緩衝液、酢酸系緩衝液等が挙げられるが、これらに限定されない。噴霧装置としては、携帯用霧吹き等の形態のものが挙げられるが、これに限定されない。この場合も、さらに遺伝子分解酵素を含むキットを用いることによって、菌体外遺伝子の菌体への導入をより抑制することができる。 In another embodiment, the present invention also suppresses the introduction of an extracellular gene into a microbial cell, including a molecular species capable of modifying a liposome state such as a glycolipid biosurfactant, a buffer solution, and a spray device. Provide kits. Here, examples of the buffer solution include Good's buffer solution, phosphate buffer solution, and acetic acid buffer solution, but are not limited thereto. Examples of the spray device include a portable spray device, but are not limited thereto. In this case as well, introduction of an exogenous gene into a cell can be further suppressed by using a kit containing a gene degrading enzyme.
さらに別の実施形態において、本発明は、リポソーム状態を改変可能な分子種を含む被覆層を有する医療用具等の物品を提供する。 In yet another embodiment, the present invention provides an article such as a medical device having a coating layer containing a molecular species capable of modifying the liposome state.
なお、本発明の方法において、当業者は、対象物、対象とする菌の種類、費用等、を考慮して、ＭＥＬ等のリポソーム状態を改変可能な分子種の使用形態として、対象物への塗布、対象物の浸漬、対象物の洗浄、対象物との混合等のうち、最適なものを選択し得る。 In the method of the present invention, a person skilled in the art considers the target object, the type of fungus to be used, the cost, etc., as the usage form of the molecular species that can modify the liposome state such as MEL. Among the application, the immersion of the object, the cleaning of the object, the mixing with the object, and the like, the optimum one can be selected.
本発明の方法によれば、外来遺伝子の取り込みによる薬剤耐性菌等の伝播発生を未然に防ぐことができる。 According to the method of the present invention, it is possible to prevent transmission of drug-resistant bacteria and the like due to incorporation of foreign genes.
例えば、多量に薬剤が使用されている医療分野や農業分野において、薬剤耐性遺伝子の水平転移を抑え、薬剤耐性菌等の、菌体外遺伝子が導入された菌体の発生を抑制すること
ができる。
For example, in the medical and agricultural fields where a large amount of drugs are used, horizontal transfer of drug resistance genes can be suppressed, and the occurrence of bacterial cells introduced with extraneous genes such as drug resistant bacteria can be suppressed. .
医療分野においては多剤耐性化した黄色ブドウ球菌や腸球菌などの発生が問題となっているが、これらの多剤耐性菌の多元的な発生を抑制するとともに、消臭等の機能をあわせもったスプレー剤や、高機能化洗浄剤として使用できる。 In the medical field, the occurrence of multi-drug resistant Staphylococcus aureus and enterococci has become a problem. In addition to suppressing the multi-generation of these multi-drug resistant bacteria, it also has functions such as deodorization. It can be used as a spray or a highly functional cleaning agent.
また、農業分野においては、特にその植物に病気を生じさせている主体が大腸菌と同じグラム陰性の菌体であるため、より効果的に薬剤耐性菌等の、菌体外遺伝子が導入された菌体の発生を抑制することができ、殺虫・殺菌剤等を散布する際の機能性展着剤（アジュバント）として使用すれば、相当の期間にわたって耐性菌発生抑制効果も期待される。また、例えば、以下の実施例において用いられるカチオンリポソームであるＭＥＬは、生物由来のバイオサーフェクタントであり、それ自身制菌活性と界面活性能を併せ持ち、生分解性されて無害化するため、特に有効と推定される。 Also, in the agricultural field, the main cause of disease in the plant is the same Gram-negative bacterial body as that of Escherichia coli. If it is used as a functional spreading agent (adjuvant) when spraying insecticides / bactericides, etc., it can be expected to suppress the generation of resistant bacteria over a considerable period of time. In addition, for example, MEL which is a cationic liposome used in the following examples is a biosurfactant derived from a living body, and has both antibacterial activity and surface activity, and is biodegradable and detoxified. It is estimated to be particularly effective.
以下に、実施例を示し、本発明の特徴とするところをより一層明瞭にする。 Hereinafter, examples will be shown to further clarify the features of the present invention.
実施例１：リポソームの形成阻害 大腸菌ＤＨ５α ＤＯＴＡＰ
薬剤耐性等の遺伝子を含んだリポソームの形成を阻害する
１ｎｇ／μｌのプラスミドｐＵＣ１９をマイクロチューブに１．０μｌずつ分注する。これにカチオンリポソーム試薬 ＤＯＴＡＰ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社、モノカチオニックタイプ、ＤＯＴＡＰ）１００ｎｇ／μｌとＭＥＬ１００ｎｇ／μｌとを混合し、ＭＥＬの濃度を、０％、１％、２％、５％、１０％、２０％、５０％、１００％、総量を１０μｌ（重量比でｐＵＣ１９の１０００倍）となるように調整したものを加え、混合後室温にて５分放置しポリヌクレオチド及びカチオンリポソーム試薬の複合体を得た。
Example 1: Inhibition of liposome formation E. coli DH5α DOTAP
1.0 μl of 1 ng / μl of plasmid pUC19 that inhibits the formation of liposomes containing genes such as drug resistance is dispensed into microtubes. To this, 100 ng / μl of MEL 100 ng / μl and MEL concentration of 0%, 1%, 2%, 5%, 10% were mixed with the cationic liposome reagent DOTAP Liposomal Transfection Reagent (Roche, mono-cationic type, DOTAP). %, 20%, 50%, 100%, adjusted to a total volume of 10 μl (weight ratio 1000 times that of pUC19), mixed and allowed to stand at room temperature for 5 minutes to combine polynucleotide and cationic liposome reagent Got the body.
大腸菌エレクトロコンピテントセルＤＨ５α（ＴＡＫＡＲＡ、１×１０10個ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を氷上で、ミリＱ水を用いて５倍に希釈した前記の複合体にそれぞれ５０μｌずつ加え、氷上に５分置いた。そこに３７℃に温めておいたＳＯＣ培地１ｍｌを加え、３７℃で１時間振盪培養し、アンピシリンを含むＬＢ培地プレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。 50 μl each of E. coli electrocompetent cell DH5α (TAKARA, 1 × 10 10 cells / ml) was added to the complex diluted 5-fold with milliQ water on ice, and placed on ice for 5 minutes. Thereto was added 1 ml of SOC medium warmed to 37 ° C., cultured with shaking at 37 ° C. for 1 hour, applied to an LB medium plate containing ampicillin, and incubated at 37 ° C. overnight.
ＭＥＬを加える割合が増加するにつれ、出現するアンピシリン耐性の形質転換株の数が減少し、ＭＥＬ１００％では全く形質転換株が得られなかった。 As the proportion of MEL added increased, the number of ampicillin-resistant transformants that emerged decreased, and no transformant was obtained at 100% MEL.
実施例２：リポソームの形成阻害 大腸菌ＤＨ５α ＤＯＳＰＥＲ
薬剤耐性等の遺伝子を含んだリポソームの形成を阻害する
１ｎｇ／μｌのプラスミドｐＵＣ１９をマイクロチューブに１．０μｌずつ分注する。これにカチオンリポソーム試薬 トランスフェクション試薬 ＤＯＳＦＥＲ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社、ダイカチオニックタイプ、（１，３−ジ−オレオキシオルオキシ−２−（６−カルボキシ−スペルミル）−プロピルアミド）（１，３−Ｄｉ−Ｏｌｅｏｘｙｌｏｘｙ−２−（６−Ｃａｒｂｏｘｙ−ｓｐｅｒｍｙｌ）−ｐｒｏｐｙｌａｍｉｄ））１００ｎｇ／μｌとＭＥＬ １００ｎｇ／μｌを混合し、ＭＥＬの濃度を、０％、１％、２％、５％、１０％、２０％、５０％、１００％、総量を１０μｌ（重量比でｐＵＣ１９の１０００倍）となるように調整したものを加え、混合後室温にて５分放置しポリヌクレオチド及びカチオンリポソーム試薬の複合体を得た。
Example 2: Inhibition of liposome formation E. coli DH5α DOSPER
1.0 μl of 1 ng / μl of plasmid pUC19 that inhibits the formation of liposomes containing genes such as drug resistance is dispensed into microtubes. To this, cation liposome reagent transfection reagent DOSFER Liposomal Transfection Reagent (Roche, Daicationic type, (1,3-di-oroxyoroxy-2- (6-carboxy-spermyl) -propylamide) (1,3 -Di-Oleoxyxy-2- (6-Carboxy-spermyl) -propylamid)) 100 ng / μl and MEL 100 ng / μl, and the concentration of MEL is 0%, 1%, 2%, 5%, 10%, Add 20%, 50%, 100%, and adjust the total amount to 10 μl (1000 times the weight of pUC19 by weight ratio). After mixing, leave it at room temperature for 5 minutes to assemble the complex of polynucleotide and cationic liposome reagent. Obtained.
大腸菌エレクトロコンピテントセルＤＨ５α（ＴＡＫＡＲＡ、１×１０10個ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を氷上で、ミリＱ水を用いて５倍に希釈した前記の複合体にそれぞれ５０μｌずつ加え、氷上に５分置いた。そこに３７℃に温めておいたＳＯＣ培地１ｍｌを加え、３７℃で１時間振盪培養し、アンピシリンを含むＬＢ培地プレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。 50 μl each of E. coli electrocompetent cell DH5α (TAKARA, 1 × 10 10 cells / ml) was added to the complex diluted 5-fold with milliQ water on ice, and placed on ice for 5 minutes. Thereto was added 1 ml of SOC medium warmed to 37 ° C., cultured with shaking at 37 ° C. for 1 hour, applied to an LB medium plate containing ampicillin, and incubated at 37 ° C. overnight.
ＭＥＬを加える割合が増加するにつれ、出現するアンピシリン耐性の形質転換株の数が減少し、ＭＥＬ１００％では全く形質転換株が得られなかった。 As the proportion of MEL added increased, the number of ampicillin-resistant transformants that emerged decreased, and no transformant was obtained at 100% MEL.
実施例３：リポソーム形成後の菌体への取り込み阻害 大腸菌ＤＨ５α ＤＯＴＡＰ
薬剤耐性等の遺伝子を含んで形成されたリポソームに作用して、リポソームの状態を変化させ、菌体への遺伝子の取り込みを阻害する
１ｎｇ／μｌのプラスミドｐＵＣ１９をマイクロチューブに１．０μｌずつ分注する。これにカチオンリポソーム試薬 ＤＯＴＡＰ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社、モノカチオニックタイプ、ＤＯＴＡＰ）１００ｎｇ／μｌを５μｌ（重量比でｐＵＣ１９の５００倍）となるように調整して加え、混合後室温にて５分放置し、ポリヌクレオチド及びカチオンリポソーム試薬の複合体を得た。それぞれに糖脂質系バイオサーファクタントであるＭＥＬ １００ｎｇ／μｌを混合し、ＤＯＴＡＰに対するＭＥＬの濃度を、０％， ２％， ５％， １０％， ２０％， ５０％， １００％、２００％となるように調整し加え、混合後室温にてさらに５分放置した。
Example 3: Inhibition of uptake into cells after liposome formation E. coli DH5α DOTAP
Dispense 1.0 ng each of 1 ng / μl of plasmid pUC19, which acts on liposomes containing genes such as drug resistance, changes the state of the liposomes and inhibits gene uptake into cells. To do. To this was added a cationic liposome reagent DOTAP Liposomal Transfection Reagent (Roche, monocationic type, DOTAP) 100 ng / μl, adjusted to 5 μl (weight ratio 500 times that of pUC19), and mixed for 5 minutes at room temperature. This was allowed to stand to obtain a complex of the polynucleotide and the cationic liposome reagent. MEL 100ng / μl, which is a glycolipid biosurfactant, is mixed with each so that the concentration of MEL against DOTAP is 0%, 2%, 5%, 10%, 20%, 50%, 100%, 200% After mixing, the mixture was further left at room temperature for 5 minutes.
大腸菌エレクトロコンピテントセルＤＨ５α（ＴＡＫＡＲＡ、１×１０10個ｃｅｌｌｓ
／ｍｌ）を氷上で、ミリＱ水を用いて５倍に希釈したものを前記の複合体にそれぞれ５０μｌずつ加え、氷上に５分置いた。そこに３７℃に温めておいたＳＯＣ培地１ｍｌを加え、３７℃で１時間振盪培養し、アンピシリンを含むＬＢ培地プレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。
E. coli electrocompetent cell DH5α (TAKARA, 1 × 10 10 cells
/ Ml) was diluted 5 times with milliQ water on ice, and 50 μl each was added to the complex, and placed on ice for 5 minutes. Thereto was added 1 ml of SOC medium warmed to 37 ° C., cultured with shaking at 37 ° C. for 1 hour, applied to an LB medium plate containing ampicillin, and incubated at 37 ° C. overnight.
ＭＥＬを加える割合が増加するにつれ、出現するアンピシリン耐性の形質転換株の数が減少した。 As the rate of MEL addition increased, the number of ampicillin resistant transformants that emerged decreased.
実施例４：遺伝子を含むリポソームの菌体との結合阻害 大腸菌ＤＨ５α ＤＯＴＡＰ
菌体と薬剤耐性等の遺伝子を含むリポソームとの結合、ひいては薬剤耐性遺伝子が菌体へ導入されるのを、薬剤耐性等の遺伝子を含まないリポソーム等により阻害する
１ｎｇ／μｌのプラスミドｐＵＣ１９をマイクロチューブに１．０μｌずつ分注する。これにカチオンリポソーム試薬 ＤＯＴＡＰ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社、モノカチオニックタイプ、ＤＯＴＡＰ）１００ｎｇ／μｌを５．０μｌ（重量比でｐＵＣ１９の５００倍）となるように調整して加え、混合後室温にて５分放置しポリヌクレオチド及びカチオンリポソーム試薬の複合体を得た。
Example 4: Inhibition of binding of liposomes containing a gene to bacterial cells E. coli DH5α DOTAP
The 1 ng / μl plasmid pUC19, which inhibits the binding of bacterial cells to liposomes containing genes such as drug resistance, and thus the introduction of drug resistance genes into bacterial cells by liposomes not containing genes such as drug resistance, etc. Dispense 1.0 μl into tubes. To this was added a cationic liposome reagent DOTAP Liposomal Transfection Reagent (Roche, mono-cationic type, DOTAP) 100 ng / μl to 5.0 μl (weight ratio 500 times that of pUC19), and after mixing, at room temperature The complex of polynucleotide and cationic liposome reagent was obtained by leaving for 5 minutes.
大腸菌エレクトロコンピテントセルＤＨ５α（ＴＡＫＡＲＡ、１×１０10個ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を氷上で、ミリＱ水を用いて１０倍に希釈し、５０μｌずつマイクロチューブに分注した。それぞれに糖脂質系バイオサーファクタントであるＭＥＬ １００ｎｇ／μｌをＤＯＴＡＰに対するＭＥＬの濃度を、０％、５０％、１００％、２００％、５００％となるように調整したものを加え、混合後氷上にて３分放置した。これらに、既に調整したポリヌクレオチド及びカチオンリポソーム試薬の複合体を加え、氷上にてさらに５分放置した。そこに３７℃に温めておいたＳＯＣ培地１ｍｌを加え、３７℃で１時間振盪培養し、アンピシリンを含むＬＢ培地プレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。 E. coli electrocompetent cell DH5α (TAKARA, 1 × 10 10 cells / ml) was diluted 10-fold with milliQ water on ice and dispensed in 50 μl aliquots into microtubes. GEL 100 ng / μl, a glycolipid biosurfactant, was added to the MEL concentration adjusted to 0%, 50%, 100%, 200%, 500% to DOTAP. Left for 3 minutes. To these, the complex of the already prepared polynucleotide and cationic liposome reagent was added and left on ice for another 5 minutes. Thereto was added 1 ml of SOC medium warmed to 37 ° C., cultured with shaking at 37 ° C. for 1 hour, applied to an LB medium plate containing ampicillin, and incubated at 37 ° C. overnight.
ＭＥＬを加える割合が増加するにつれ、出現するアンピシリン耐性の形質転換株の数が減少した。 As the rate of MEL addition increased, the number of ampicillin resistant transformants that emerged decreased.
実施例５：薬剤耐性遺伝子等の酵素を含むリポソームによる分解 大腸菌ＤＨ５α ＤＯＴＡＰ、ＭＥＬ
リポソームを形成後の薬剤耐性等の遺伝子を、遺伝子分解酵素等を含むリポソーム等により分解等を行い、薬剤耐性遺伝子の菌体への取り込みを阻害する
１ｎｇ／μｌのプラスミドｐＵＣ１９をマイクロチューブに１．０μｌずつ分注する。これにカチオンリポソーム試薬 ＤＯＴＡＰ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社、モノカチオニックタイプ、ＤＯＴＡＰ）１００ｎｇ／μｌを５．０μｌ（重量比でｐＵＣ１９の５００倍）となるように調整して加え、混合後室温にて５分放置しポリヌクレオチド及びトランスフェクション試薬の複合体を得た。
Example 5: Degradation by liposomes containing enzymes such as drug resistance genes E. coli DH5α DOTAP, MEL
The gene such as drug resistance after the formation of the liposome is decomposed by a liposome containing a gene degrading enzyme or the like, and 1 ng / μl of plasmid pUC19 that inhibits the incorporation of the drug resistance gene into the microbial cells is added to the microtube. Dispense 0 μl each. To this was added a cationic liposome reagent DOTAP Liposomal Transfection Reagent (Roche, mono-cationic type, DOTAP) 100 ng / μl to 5.0 μl (weight ratio 500 times that of pUC19), and after mixing, at room temperature The complex of polynucleotide and transfection reagent was obtained after being left for 5 minutes.
それぞれにＤｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉ（ＤＮａｓｅ Ｉ）（ＴＡＫＡＲＡ、０．７ ｕｎｉｔ／μｌミリＱ水にて希釈）１μｌおよび、５０ｍＭのＭｇＳＯ4
１μｌを、双方とも加えないもの、ＤＮａｓｅ Ｉのみ加えたもの、双方とも加えたものを作成し、それぞれに、ミリＱ水、またはＤＯＴＡＰ １００ｎｇ／μｌ、またはＭＥＬ １００ｎｇ／μｌをそれぞれ１０μｌ加え、室温にて３分放置した。これらに、既に調整したポリヌクレオチド及びトランスフェクション試薬の複合体を加え、室温にて１分放置した。大腸菌エレクトロコンピテントセル（ＤＨ５α（ＴＡＫＡＲＡ、１×１０10個ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を氷上で、ミリＱ水を用いて１０倍に希釈し、５０μｌずつマイクロチューブに分注したもの）に加え、氷上にてさらに５分放置した。そこに３７℃に温めておいたＳＯＣ培地１ｍｌを加え、３７℃で１時間振盪培養し、アンピシリンを含むＬＢ培地プレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。
1 μl of Deoxyribonuclease I (DNase I) (TAKARA, diluted in 0.7 unit / μl milliQ water) and 50 mM MgSO 4
Make 1 μl of both, add DNase I, add both, and add 10 μl of Milli-Q water or DOTAP 100 ng / μl or MEL 100 ng / μl to room temperature. Left for 3 minutes. To these, a complex of already prepared polynucleotide and transfection reagent was added and left at room temperature for 1 minute. E. coli electrocompetent cells (DH5α (TAKARA, 1 × 10 10 cells / ml) diluted 10-fold with milli-Q water and dispensed in 50 μl aliquots on ice) And left for another 5 minutes. Thereto was added 1 ml of SOC medium warmed to 37 ° C., cultured with shaking at 37 ° C. for 1 hour, applied to an LB medium plate containing ampicillin, and incubated at 37 ° C. overnight.
ＭＥＬを用いなかった対照区のサンプルに比べて、ＭＥＬを用いた試験区において、形質転換株数は、有意に減少した。 The number of transformed strains was significantly decreased in the test group using MEL as compared to the control group sample not using MEL.
実施例６：リポソーム形成後の菌体への取り込み阻害 大腸菌ＤＨ５α ＤＯＴＡＰ
薬剤耐性等の遺伝子を含んで形成されたリポソームもしくは菌体に作用して、菌体への遺伝子の取り込みを阻害する
１ｎｇ／μｌのプラスミドｐＵＣ１９をマイクロチューブに１．０μｌずつ分注する。これにカチオンリポソーム試薬 ＤＯＴＡＰ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社、モノカチオニックタイプ、ＤＯＴＡＰ）１００ｎｇ／μｌを５μｌ（重量比でｐＵＣ１９の５００倍）となるように調整して加え、混合後室温にて５分放置し、ポリヌクレオチド及びカチオンリポソーム試薬の複合体を得た。それぞれに無機塩である塩化マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウムの水溶液４４μｌおよび大腸菌エレクトロコンピテントセルＤＨ５α（ＴＡＫＡＲＡ、１×１０１０個ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を氷上で、ミリＱ水を用いて５倍に希釈したものを前記の複合体にそれぞれ５０μｌずつ加え、氷上に５分置いた。無機塩の最終濃度は、１ｍM、５ｍM、１０ｍM、５０ｍM，１００ｍMとなるように調整した。そこに３７℃に温めておいたＳＯＣ培地
１ｍｌを加え、３７℃で１時間振盪培養し、アンピシリンを含むＬＢ培地プレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。
Example 6: Inhibition of uptake into cells after liposome formation E. coli DH5α DOTAP
1.0 μl of 1 ng / μl of plasmid pUC19, which acts on liposomes or bacterial cells formed containing a gene such as drug resistance and inhibits the gene uptake into the bacterial cells, is dispensed into a microtube. To this was added a cationic liposome reagent DOTAP Liposomal Transfection Reagent (Roche, monocationic type, DOTAP) 100 ng / μl, adjusted to 5 μl (weight ratio 500 times that of pUC19), and mixed for 5 minutes at room temperature. This was allowed to stand to obtain a complex of the polynucleotide and the cationic liposome reagent. In each case, 44 μl of inorganic salt magnesium chloride, sodium chloride, potassium chloride aqueous solution and E. coli electrocompetent cell DH5α (TAKARA, 1 × 10 10 cells / ml) were diluted 5 times with ice using milli-Q water. 50 μl of each was added to the complex and placed on ice for 5 minutes. The final concentration of the inorganic salt was adjusted to 1 mM, 5 mM, 10 mM, 50 mM, and 100 mM. Thereto was added 1 ml of SOC medium warmed to 37 ° C., cultured with shaking at 37 ° C. for 1 hour, applied to an LB medium plate containing ampicillin, and incubated at 37 ° C. overnight.
無機塩を加えるにつれて、出現するアンピシリン耐性の形質転換株の数が減少した。
なお、大腸菌の液体培養で100mMのこれらの無機塩を加えても増殖に影響はなかった。
As inorganic salts were added, the number of ampicillin resistant transformants that emerged decreased.
In addition, the addition of 100 mM of these inorganic salts in liquid culture of E. coli did not affect the growth.
実施例７：リポソーム形成後の菌体への取り込み阻害 大腸菌ＤＨ５α ＤＯＴＡＰ
薬剤耐性等の遺伝子を含んで形成されたリポソームもしくは菌体に作用して、菌体への遺伝子の取り込みを阻害する
１ｎｇ／μｌのプラスミドｐＵＣ１９をマイクロチューブに１．０μｌずつ分注する。これにカチオンリポソーム試薬 ＤＯＴＡＰ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社、モノカチオニックタイプ、ＤＯＴＡＰ）１００ｎｇ／μｌを５μｌ（重量比でｐＵＣ１９の５００倍）となるように調整して加え、混合後室温にて５分放置し、ポリヌクレオチド及びカチオンリポソーム試薬の複合体を得た。それぞれに界面活性剤であるSDS（ドデシル硫酸ナトリウム）、Triton X-100(ポリエチレングリコール モノ-p-イソ-オクチルフェニルエーテル)の水溶液４４μｌおよび大腸菌エレクトロコンピテントセルＤＨ５α（ＴＡＫＡＲＡ、１×１０１０個ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を氷上で、ミリＱ水を用いて５倍に希釈したものを前記の複合体にそれぞれ５０μｌずつ加え、氷上に５分置いた。界面活性剤の最終濃度は、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％となるように調整した。そこに３７℃に温めておいたＳＯＣ培地１ｍｌを加え、３７℃で１時間振盪培養し、アンピシリンを含むＬＢ培地プレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。
Example 7: Inhibition of uptake into cells after liposome formation E. coli DH5α DOTAP
1.0 μl of 1 ng / μl of plasmid pUC19, which acts on liposomes or bacterial cells formed containing a gene such as drug resistance and inhibits the gene uptake into the bacterial cells, is dispensed into a microtube. To this was added a cationic liposome reagent DOTAP Liposomal Transfection Reagent (Roche, monocationic type, DOTAP) 100 ng / μl, adjusted to 5 μl (weight ratio 500 times that of pUC19), and mixed for 5 minutes at room temperature. This was allowed to stand to obtain a complex of the polynucleotide and the cationic liposome reagent. In each case, surfactants SDS (sodium dodecyl sulfate), Triton X-100 (polyethylene glycol mono-p-iso-octylphenyl ether) aqueous solution 44 μl and E. coli electrocompetent cell DH5α (TAKARA, 1 × 10 10 cells) / Ml) was diluted 5 times with milliQ water on ice, and 50 μl each was added to the complex, and placed on ice for 5 minutes. The final concentration of the surfactant was adjusted to 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, and 0.01%. Thereto was added 1 ml of SOC medium warmed to 37 ° C., cultured with shaking at 37 ° C. for 1 hour, applied to an LB medium plate containing ampicillin, and incubated at 37 ° C. overnight.
界面活性剤を加えるにつれて、出現するアンピシリン耐性の形質転換株の数が減少し、界面活性剤の濃度が、0.05％以上では完全に形質転換を阻害した。
なお、大腸菌の液体培養でSDSは0.01%まで増殖に影響せず、0.05％以上では、生育の阻害がみられた。TritonX-100は、１％まで増殖に影響しなかった。
As the surfactant was added, the number of ampicillin-resistant transformants that emerged decreased, and when the surfactant concentration was 0.05% or more, the transformation was completely inhibited.
In the liquid culture of E. coli, SDS did not affect the growth up to 0.01%, and growth inhibition was observed at 0.05% or more. TritonX-100 did not affect growth up to 1%.
Claims (9)
前記リポソーム状態を改変可能な分子種がマンノシルエリスリトールリピッド（Ｍａｎｎｏｓｙｌｅｒｙｔｈｒｙｔｏｌ ｌｉｐｉｄ）（ＭＥＬ）である方法。 A method for suppressing the introduction of a gene into a cell, comprising treating a target containing a cell and a gene outside the cell with a molecular species capable of modifying a liposome state,
The method wherein the molecular species capable of modifying the liposome state is Mannosylerythritol lipid (MEL).
前記リポソーム状態を改変可能な分子種がマンノシルエリスリトールリピッド（Ｍａｎｎｏｓｙｌｅｒｙｔｈｒｙｔｏｌ ｌｉｐｉｄ）（ＭＥＬ）である組成物。 A composition for suppressing introduction of an extracellular gene into a microbial cell, comprising a molecular species capable of modifying the liposome state,
A composition wherein the molecular species capable of modifying the liposome state is Mannosylerythritol lipid (MEL).
前記リポソーム状態を改変可能な分子種がマンノシルエリスリトールリピッド（Ｍａｎｎｏｓｙｌｅｒｙｔｈｒｙｔｏｌ ｌｉｐｉｄ）（ＭＥＬ）であるキット。 A kit for suppressing introduction of an extracellular gene into a microbial cell, comprising a molecular species capable of modifying the liposome state, a buffer solution, and a spray device,
The kit in which the molecular species capable of modifying the liposome state is Mannosylerythritol lipid (MEL).
前記リポソーム状態を改変可能な分子種がマンノシルエリスリトールリピッド（Ｍａｎｎｏｓｙｌｅｒｙｔｈｒｙｔｏｌ ｌｉｐｉｄ）（ＭＥＬ）である医療用具。 A medical device having a coating layer containing a molecular species capable of modifying the liposome state,
A medical device wherein the molecular species capable of modifying the liposome state is Mannosylerythritol lipid (MEL).
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