JP5508711B2 - コードされたライブラリーの合成のための方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2004年12月17日に出願された係属中の米国特許出願第11/015458号の一部継続出願であり、その出願は、2003年12月17日に出願された米国仮特許出願第60/530854号、2004年1月30日に出願された米国仮特許出願第60/540681号、2004年3月15日に出願された米国仮特許出願第60/553,715号、および2004年7月16日に出願された米国仮特許出願第60/588,672号に関連している。本出願はまた、2005年6月9日に出願された米国仮特許出願第60/689,466号、および2005年10月28日に出願された米国仮特許出願第60/731,041号への優先権を主張している。それぞれの前述の出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
有用な生物学的活性を有する化合物を同定する、より効果的な方法の捜索は、コンビナトリアルライブラリーと呼ばれる収集物中に存在する、膨大な数の異なる化合物をスクリーニングするための方法の開発をもたらした。そのようなライブラリーは、105種またはそれより多い異なる化合物を含み得る。コンビナトリアルライブラリーを産生するための多くの方法が存在し、そしてペプチド、擬似ペプチド(peptidomimetic)、および小さな有機分子のコンビナトリアル合成が報告されている。
本発明は、コード化オリゴヌクレオチドタグを含む分子のライブラリーを合成する方法を提供する。その方法は、「分割(split)および混合(pool)」ストラテジーを使用し、イニシエーター(コード化オリゴヌクレオチドに連結した第一の構成要素(building block)を含む)を含む溶液は、多数の画分に分割(「分割(split)」)される。各画分において、そのイニシエーターは、第二の独特な構成要素、およびその第二の構成要素を同定する第二の独特なオリゴヌクレオチドと反応される。これらの反応は、同時または連続的であり得、連続的である場合、一方の反応が他方の反応に先行し得る。各画分において産生される二量体分子は、合併(「混合(pool)」)され、次に多数の画分に再び分割される。次に、これらの画分はそれぞれ、第三の独特な(画分特異的な)構成要素、およびその構成要素をコードする第三の独特なオリゴヌクレオチドと反応される。生成物のライブラリー中に存在する独特な分子の数は、(1)その合成の各工程で用いられる異なる構成要素の数、および(2)混合および分割が繰り返される時間の数の関数である。
ここで、Xは、一つまたは一つより多い構成要素を含む機能的部分であり;Zは、その3’末端でBに結合したオリゴヌクレオチドであり;Yは、その5’末端でCに結合したオリゴヌクレオチドであり;Aは、Xと共有結合を形成する官能基であり;Bは、Zの3’末端と結合を形成する官能基であり;Cは、Yの5’末端と結合を形成する官能基であり;D、F、およびEは、それぞれ独立して、二官能性結合基であり;そして、Sは、原子または分子骨格である。そのような化合物は、本発明の方法を使用して合成される化合物を含む。
ここで、Xは、一つまたは一つより多い構成要素を含む機能的部分であり;Zは、その3’末端でBに結合したオリゴヌクレオチドであり;Yは、その5’末端でCに結合したオリゴヌクレオチドであり;Aは、Xと共有結合を形成する官能基であり;Bは、Zの3’末端と結合を形成する官能基であり;Cは、Yの5’末端と結合を形成する官能基であり;D、F、およびEは、それぞれ独立して、二官能性結合基であり;そして、Sは、原子または分子骨格である。そのようなライブラリーは、本発明の方法を使用して合成されるライブラリーを含む。
本発明は、化合物およびコンビナトリアル化合物のライブラリーを産生するための方法、本発明の方法により産生される化合物およびライブラリー、ならびに所望の特性(例えば、所望の生物学的活性)を有する化合物を同定するためにこのライブラリーを使用するための方法に関する。本発明はさらに、これらの方法を用いて同定される化合物に関する。
アルケンへの第一級アミンの付加:
アルドール反応:
ここで、Aは、構成要素と共有結合を形成し得る官能基であり、Bは、オリゴヌクレオチドの5’末端と結合を形成し得る官能基であり、そしてCは、オリゴヌクレオチドの3’末端と結合を形成し得る官能基である。D、F、およびEは、官能基A、官能基C、および官能基Bを、核となる原子または骨格であるSに連結する化学的基である。好ましくは、D、E、およびFは、それぞれ独立して原子の鎖(例えば、アルキレン鎖またはオリゴ(エチレングリコール)鎖)であり、そして、D、E、およびFは、同じであっても、異なっていてもよく、好ましくは、二本のオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成および機能的部分の合成を可能にするほど効果的である。一つの実施形態において、三価の連結部分は、構造
5’プライマー(可変位置がボールド体かつイタリック体):
ここで、Xは、一つまたは一つより多い構成要素を含む機能的部分であり、Zは、その3’末端でBに結合したオリゴヌクレオチドであり、そしてYは、その5’末端でCに結合したオリゴヌクレオチドである。Aは、Xと共有結合を形成する官能基であり、Bは、Zの3’末端と結合を形成する官能基であり、そしてCは、Yの5’末端と結合を形成する官能基である。D、F、およびEは、官能基A、官能基C、および官能基Bを、核となる原子または骨格であるSに連結させる化学的基である。好ましくは、D、E、およびFは、それぞれ独立して原子の鎖(例えば、アルキレン鎖またはオリゴ(エチレングリコール)鎖)であり、そして、D、E、およびFは、同じであっても、異なっていてもよく、好ましくは、二本のオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成および機能的部分の合成を可能にするほど効果的である。
ここで、Xは分子骨格であり、各Yは、独立して辺縁部分であり、そしてnは1〜6の整数である。各Yは、独立して構成要素であり、そしてnは0〜約5の整数である。Lは連結部分であり、Zは構造−At−X(Y)nを同定する一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチドである。その構造X(Y)nは、例えば、表8(以下を参照のこと)で示される骨格構造のうちの一つであり得る。一つの実施形態において、本発明は、式III
ここで、tは0〜約5、好ましくは0〜3の整数であり、そして各Aは、独立して構成要素である。Lは連結部分であり、そしてZは各AならびにR1、R2、R3およびR4を同定する一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチドである。R1、R2、R3およびR4は、それぞれ独立して、水素、アルキル、置換されたアルキル、ヘテロアルキル、置換されたヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、置換されたシクロアルキル、置換されたヘテロシクロアルキル、アリール、置換されたアリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、置換されたアリールアルキル、置換されたヘテロアリールアルキル、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、および置換されたアミノから選択される置換基である。一つの実施形態において、各Aはアミノ酸残基である。
105のオーダーの異なるメンバーを含むライブラリーの合成を、以下の試薬を用いて成し遂げた:
化合物1:
10× リガーゼ緩衝液:500mM Tris、pH7.5;100mMジチオトレイトール;100mM MgCl2;25mM ATP;500mM NaCl。
12個の各PCRチューブに、50μLの水中の化合物1の1mM溶液;75μLのタグ1.1〜1.12のうちの一つの0.80mM溶液;10×リガーゼ緩衝液、および10μL脱イオン水を加えた。そのチューブを、95℃まで1分間にわたって加熱し、次に10分間にわたって16℃まで冷却した。各チューブに50μl 1×リガーゼ緩衝液中の5000ユニットのT4 DNAリガーゼ(2,000,000ユニット/mL溶液の2.5μL(New England Biolabs,カタログ番号.M0202))を加え、生じた溶液を16時間にわたって16℃でインキュベートした。
これらの各サイクルに対して、前のサイクルから生じた合わせた溶液を、それぞれ50μlの12個の等しいアリコートに分割し、PCRチューブ内に置いた。各チューブに、異なるタグを含む溶液を加え、そしてライゲーション、精製、およびアシル化をサイクル1に関して記載される通りに(サイクル3〜5に対しては、サイクル1に関して記載されるHPLC精製工程を省略したことを除き)行った。サイクル2〜5に関するタグおよび構成要素の対応を表2に示す。
上で記述した合成手順は、125(約249,000)種の異なる構造を含むライブラリーを産生する能力を有する。そのライブラリーの合成を、各サイクルの生成物のゲル電気泳動によりモニターした。5サイクルのぞれぞれ、および近接プライマーのライゲーション後の最後のライブラリーの結果を図7で説明する。「ヘッドピース(head piece)」と標識される化合物は、化合物1である。その図は、各サイクルが期待された分子量の増加をもたらし、各サイクルの産物が、分子量に関して実質的に同質であることを示している。
108のオーダーの異なるメンバーを含むライブラリーの合成を、以下の試薬を用いて成し遂げた:
化合物2:
10× リガーゼ緩衝液:500mM Tris、pH7.5;100mM ジチオトレイトール;100mM MgCl2;20mMATP;500mM NaCl。
4℃まで冷やしたホウ酸ナトリウム(150mM、pH9.4)中の化合物2の溶液(60mL、1mM)に、N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)中の、40当量のN−Fmoc−15−アミノ−4,7,10,13−テトラオキサオクタデカン酸(S−Ado)(16mL、0.15M)、続いて40当量の、水中の塩化4−(4,6−ジメトキシ[1.3.5]トリアジン−2−イル)−4−メチルモルホリニウム水和物(DMTMM)(9.6mL、0.25M)を加えた。混合物を2時間にわたって4℃で穏やかに振とうし、その後さらに40当量のS−AdoおよびDMTMMを加え、そして16時間にわたって4℃でさらに振とうした。
96ウェルプレートの各ウェルに、12.5μLの、化合物3の4mM水溶液;100μLの、表3に示されるオリゴヌクレオチドタグ1.1〜1.96のうちの一つの1mM溶液(化合物3とタグのモル比は1:2であった)に加えた。プレートを1分間にわたって95℃まで加熱し、次に10分間にわたって16℃まで冷却した。各ウェルに10μLの10×リガーゼ緩衝液、30ユニットのT4 DNAリガーゼ(30ユニット/μL溶液の1μL(FermentasLife Science、カタログ番号EL0013))。76.5μLの水を加え、生じた溶液を16℃で16時間にわたってインキュベートした。
これらのサイクルのそれぞれに対して、前のサイクルからの乾燥させたペレットを水に溶解させ、そしてライブラリーの濃度を、ライブラリーのDNA成分の消衰係数に基づいて、分光測定法により測定した。ここで、化合物2の元の消衰係数は、131,500L/(モル.cm)である。ライブラリーの濃度は、次のライゲーション反応における最終濃度が0.25mMとなるように水で調整した。ライブラリーを96ウェルプレート中の96個の等量のアリコートに分割した。各ウェルに、異なるタグを含む溶液を加え(そのライブラリーとタグのモル比は1:2であった)、ライゲーションをサイクル1に関して記述した通りに行った。サイクル2、サイクル3、およびサイクル4で用いたオリゴヌクレオチドタグは、それぞれ表4、表5、および表6に示される。サイクル1〜4のそれぞれに対するタグと構成要素前駆体との間の対応を、表7に提供する。ライブラリーは、サイクル1に関して上で記述した通りに、さらなるエタノールの添加により沈殿させ、ホウ酸ナトリウム緩衝液(150mM、pH9.4)に、1mMの濃度まで溶解させた。次にアシル化および精製を、サイクル1に関して記述したように(サイクル3の間、HPLC精製は省略した点を除いて)行った。
上で記述した合成手順は、964(約108)種の異なる構造を含むライブラリーを産生する能力を有する。そのライブラリーの合成を、各サイクルの生成物のゲル電気泳動およびLC/MSによりモニターした。完成後、ライブラリーを種々の技術を用いて分析した。図13aは、近接プライマーのライゲーションの前から、サイクル4の後のライブラリーのクロマトグラフであり;図13bは、同じ合成段階での、ライブラリーのマススペクトルである。平均分子量を、負イオンLC/MS分析により決定した。イオンシグナルをProMassソフトウェアを用いて解析した。この結果は、予測されたライブラリーの平均分子量と一致する。
サイクル4の完了時に、ライブラリーの一部を、通常のアシル化条件下で、アジド酢酸を用いてN末端をキャップした。EtOH沈殿による精製後の生成物を、1mMの濃度まで、リン酸ナトリウム緩衝液(150mM、pH8)中に溶解させ、4当量の水中のCuSO4(200mM)、4当量の水中のアスコルビン酸(200mM)をそれぞれ、そしてDMF中の溶液(200mM)として以下に示される触媒量の化合物を加えた。反応混合物を2時間にわたって室温で緩やかに振とうした。
別々のチューブで、プロパルギルグリシンまたは2−アミノ−3−フェニルプロピルアジド(それぞれ8μmol)を、pH9.4のホウ酸緩衝液(250μL)中のFAM−OSu(Molecular Probes Inc.)(1.2当量)と合わせた。反応を3時間にわたって室温で続け、次に一晩中凍結乾燥した。HPLCによる精製は、定量可能な収率で所望の蛍光アルキンおよびアジドをもたらした。
アジドアセチル−Gly−Pro−Phe−Pra−NH2の調製
0.3mmolのRink−アミド樹脂を用いて、示された配列を標準固相合成技術を用いて、Fmocで保護されたアミノ酸および活性化物質としてのHATU(Pra=C−プロパルギルグリシン)を用いて、合成した。アジド酢酸を用いて、テトラペプチドをキャップした。そのペプチドを、20% TFA/DCMを用いて、4時間にわたってその樹脂から切断した。RP HPLCによる精製により、白色の固形物(75mg、51%)としての生成物を得た。1H NMR(DMSO−d6,400MHz):8.4−7.8(m,3H)、7.4−7.1(m,7H)、4.6−4.4(m,1H)、4.4−4.2(m,2H)、4.0−3.9(m,2H)、3.74(dd,1H,J=6Hz,17Hz)、3.5−3.3(m,2H)、3.07(dt,1H,J=5Hz,14Hz)、2.92(dd,1H,J=5Hz,16Hz)、2.86(t,1H,J=2Hz)、2.85−2.75(m,1H)、2.6−2.4(m,2H)、2.2−1.6(m,4H)。IR(mull)2900,2100,1450,1300cm−1。ESIMS 497.4([M+H],100%)、993.4([2M+H],50%)。イオン源フラグメンテーションを用いるESIMS:519.3([M+Na],100%)、491.3(100%)、480.1([M−NH2],90%)、452.2([M−NH2−CO],20%)、424.2(20%)、385.1([M−Pra],50%)、357.1([M−Pra−CO],40%),238.0([M−Pra−Phe],100%)。
0.3mmolのグリシン−Wang樹脂を用いて、示された配列を、Fmocで保護されたアミノ酸および活性化物質としてのHATUを用いて合成した。アジド酢酸を最後のカップリング工程で用いて、ペンタペプチドをキャップした。そのペプチドの切断を、50% TFA/DCMを用いて、2時間に達成した。RP HPLCによる精製により、白色の固形物(83mg、50%)としてのペプチドを得た。1H NMR(DMSO−d6,400MHz):8.4−7.9(m,4H)、7.2(m,5H)、4.7−4.2(m,3H)、4.0−3.7(m,4H)、3.5−3.3(m,2H)、3.1(m,1H)、2.91(dd,1H,J=4Hz,16Hz)、2.84(t,1H,J=2.5Hz)、2.78(m,1H)、2.6−2.4(m,2H)、2.2−1.6(m,4H)。IR(mull)2900,2100,1450,1350cm−1。ESIMS 555.3([M+H],100%)。イオン源フラグメンテーションを用いるESIMS:577.1([M+Na],90%)、555.3([M+H],80%)、480.1([M−Gly],100%)、385.1([M−Gly−Pra],70%)、357.1([M−Gly−Pra−CO],40%)、238.0([M−Gly−Pra−Phe],80%)。
ペプチド(32mg、0.058mmol)をMeCN(60mL)に溶解させた。ジイソプロピルエチルアミン(1mL)およびCu(MeCN)4PF6(1mg)を加え、溶液を2時間にわたって撹拌した。溶媒をエバポレートし、粗生成物をRP HPLCに供し、二量体および三量体を除去した。環式の単量体を無色のガラス(6mg、20%)として単離した。ESIMS 555.6([M+H],100%)、1109.3([2M+H],20%)、1131.2([2M+Na],15%)。イオン源フラグメンテーションを用いるESIMS:555.3([M+H],100%)、480.4([M−Gly],30%)、452.2([M−Gly−CO],25%)、424.5([M−Gly−2CO],10%,環式構造でのみ可能)。
化合物2(45nmol)を45μLのホウ酸ナトリウム緩衝液(pH9.4;150mM)に溶解させた。4℃で線状ペプチド(DMF中、18μLの100mMストック;180nmol;40当量)、続いて、DMT−MM(水中、3.6μLの500mMストック;180nmol;40当量)を加えた。2時間にわたって撹拌した後、LCMSは反応の完了、および生成物がエタノール沈殿により単離されたことを示した。ESIMS 1823.0([M−3H]/3,20%)、1367.2([M−4H]/4,20%)、1093.7([M−5H]/5,40%),911.4([M−6H]/6,100%)。
化合物2(20nmol)を20μLのホウ酸ナトリウム緩衝液(pH9.4;150mM)に溶解させた。4℃で線状ペプチド(DMF中、8μLの100mMストック;80nmol;40当量)、続いて、DMT−MM(水中、1.6μLの500mMストック;80nmol;40当量)を加えた。2時間にわたって撹拌した後、LCMSは反応の完了、および生成物がエタノール沈殿により単離されたことを示した。ESIMS 1823.0([M−3H]/3,20%)、1367.2([M−4H]/4,20%)、1093.7([M−5H]/5,40%)、911.4([M−6H]/6,100%)。
線状のペプチド−DNA結合体(10nmol)を、pH8のリン酸ナトリウム緩衝液(10μL、150mm)に溶解させた。室温で、各々4当量のCuSO4、アスコルビン酸、およびSharplessリガンドをすべて加えた(0.2μLの200mMストック)。反応を一晩中続けた。RP HPLCは、線状のペプチド−DNAは存在せず、そして生成物は、真の環状ペプチド−DNAとともに溶出されたことを示した。二量体および他のオリゴマーの痕跡は全く観察されなかった。
塩化シアヌルを用いる化合物3のアリール化のための一般的手順
化合物2を、濃度1mMで、pH9.4のホウ酸ナトリウム緩衝液に溶解させた。溶液を4℃まで冷却し、次に20当量の塩化シアヌルを、MeCN中500mM溶液として加えた。2時間後、反応の完了をLCMSにより確認し、生じたジクロロトリアジン−DNA結合体をエタノール沈殿により単離する。
ジクロロトリアジン−DNA結合体を、1mMの濃度で、pH9.5のホウ酸緩衝液に溶解させる。室温で、40当量の脂肪族アミンをDMF溶液として加える。反応をLCMSにより追跡し、通常は2時間後に完了する。生じたアルキルアミノ−モノクロロトリアジン−DNA結合体を、エタノール沈殿により単離する。
アルキルアミノ−モノクロロトリアジン−DNA結合体を、1mMの濃度で、pH9.5のホウ酸緩衝液に溶解させる。42℃で、40当量の第二級脂肪族アミンを、DMF溶液として加える。反応をLCMSにより追跡し、通常は2時間後に完了する。生じたジアミノトリアジン−DNA結合体を、エタノール沈殿により単離する。
アルデヒド構成要素による第二級アミンを含むDNA−リンカーの還元アミノ化の一般的手順:
化合物2をN末端プロリン残基に結合させた。生じた化合物をリン酸ナトリウム緩衝液(50μL、150mM、pH5.5)に、1mMの濃度で溶解させた。この溶液に、40当量の、DMF中アルデヒド構成要素(8μL、0.25M)およびDMF中ナトリウムシアノボロヒドリド(8μL、0.25M)をそれぞれ加え、溶液を2時間にわたって80℃で加熱した。アルキル化の後、溶液をエタノール沈殿により精製した。
アルデヒド基を含む構成要素に結合させた化合物2を、リン酸ナトリウム緩衝液(50μL、250mM、pH5.5)に、1mMの濃度で溶解させた。この溶液に、40当量の、DMF中アミン構成要素(8μL、0.25M)およびDMF中ナトリウムシアノボロヒドリド(8μL、0.25M)をそれぞれ加え、溶液を2時間にわたって80℃で加熱した。アルキル化の後、溶液をエタノール沈殿により精製した。
DNA−リンカー上のペプトイド合成に関する一般的手順
一般的手順
アルキンを含むDNA結合体を、約1mMの濃度で、pH8.0のリン酸緩衝液に溶解させる。この混合物に、10当量の有機アジドおよび5当量の硫酸銅(II)、5当量のアスコルビン酸、および5当量のリガンド(トリス−((1−ベンジルトリアゾール−4−イル)メチル)アミンをそれぞれ、すべて室温で加える。反応をLCMSにより追跡し、通常は1〜2時間後に完了する。生じたトリアゾール−DNA結合体は、エタノール沈殿により単離され得る。
望ましくないライブラリーメンバーを超えて、DNAでコードされたライブラリー中で、関心を引く分子を富化する能力は、関心を引く治療標的に対する定められた特性を有する化合物を同定することに卓越する。この富化能力を証明するために、rhAb1キナーゼ(GenBank U07563)への公知の結合分子(Shah et al.,Science 305,399−401(2004)(本明細書中に参考として援用される)に記載される)を合成した。この化合物を、実施例1および実施例2に記述した方法により生成される分子と類似の分子(オリゴヌクレオチドに連結した機能的部分)を生成するために、標準化学方法を用いて、前述の実施例に記述したリンカーにより、二本鎖オリゴヌクレオチドに結合させた。実施例2に記述した通りに一般的に生成されるライブラリーおよび、DNAと連結したAb1キナーゼ結合剤は、両方の種のqPCR分析を可能にする独特のDNA配列で設計した。そのDNAと連結したAb1キナーゼを、ライブラリーと1:1000の比で混合した。この混合物をrhAbleキナーゼと平衡化させ、酵素を固相上に捕捉し、結合していないライブラリーのメンバーを除去するために洗浄し、結合分子を溶出した。溶出液中のライブラリー分子とDNAで連結されたAb1キナーゼの比は、1:1であった。これは、1000倍過剰なライブラリー分子中で、DNAで結合されたAb1キナーゼ結合剤の500倍より大きい富化を示している。
当業者は、定型にすぎない実験を用いて、本明細書中に記載された本発明の特定の実施形態への多くの等価物を認識するか、または確かめることができる。そのような等価物は、上記の特許請求の範囲内に包含されることが意図される。
Claims (42)
- 化合物のライブラリーを溶液中で合成する方法であって、ここで、該化合物は機能的部分を含み、該機能的部分は、該機能的部分の構造を同定するコード化オリゴヌクレオチドに作動可能に連結する二つまたは二つより多い構成要素を含み、該方法は、
(a)m個のイニシエーター化合物を含む溶液を提供する工程、ここでmは1または1より大きい整数であり、該イニシエーター化合物は少なくとも1つの反応基を有する構成要素をn個含む元の機能的部分を含み、該元の機能的部分は、該n個の構成要素を同定する元のオリゴヌクレオチドに作動可能に連結され、ここで、nは1または1より大きい整数であり、ここで該元の機能的部分および該元のオリゴヌクレオチドは連結部分により連結され、該元のオリゴヌクレオチドは二本鎖であり、該連結部分は該元の機能的部分および元のオリゴヌクレオチドの双方の鎖に共有結合される、工程;
(b)工程(a)の溶液をr個の反応容器に分割して、該溶液のr個のアリコートを産生する工程であって、ここでrは2または2より大きい整数である、工程;
(c)各反応容器における該イニシエーター化合物を、工程(a)の反応基に相補的な少なくとも1つの相補的反応基を含むr個の構成要素のうちの一つと、該相補的反応基の反応に対して適切な条件下で反応させて共有結合を形成させ、それによって、該元のオリゴヌクレオチドに作動可能に連結するn+1個の構成要素を含む機能的部分からなる化合物を含むr個のアリコートを産生する、工程;ならびに
(d)各アリコートにおける該元のオリゴヌクレオチドを、r個の異なる入来オリゴヌクレオチドのセットのうちの一つと、工程(c)の構成要素に対応する入来オリゴヌクレオチドと該元のオリゴヌクレオチドとのライゲーションを触媒する酵素の存在下で、該入来オリゴヌクレオチドと該元のオリゴヌクレオチドとの酵素的ライゲーションに対して適切な条件下で反応させ、コード化オリゴヌクレオチドを形成させる工程であって、最後のr個の異なる入来オリゴヌクレオチドはキャップ配列を含み、該キャップ配列は変質したヌクレオチドを含有するヌクレオチド配列を含む、工程;
を包含し、それによりn+1個の構成要素を含む機能的部分の構造を同定するコード化オリゴヌクレオチドに作動可能に連結する該n+1個の構成要素を含む機能的部分からなる分子を含むr個のアリコートを産生する、方法。 - 請求項1に記載の方法であって、該方法が、(e)二個または二個より大きい前記r個のアリコートを合併し、それによりn+1個の構成要素を含む機能的部分からなる分子を含む溶液を生成する工程をさらに包含し、ここで該機能的部分は、該n+1個の構成要素を含む機能的部分の構造を同定するコード化オリゴヌクレオチドに作動可能に連結する、方法。
- r個のアリコートが合併される、請求項2に記載の方法。
- 前記工程(a)〜(e)が一回または一回より多く行われ、サイクル1〜iを生成し、ここで、iは2または2より大きい整数であり、サイクルs+1において、工程(a)のm個のイニシエーター化合物を含む溶液は、サイクルsの工程(e)の溶液であり、ここでsはi−1またはi−1より小さい整数である、請求項2に記載の方法。
- サイクル1〜iのうちの少なくとも一つにおいて、工程(d)が工程(c)に先行する、請求項4に記載の方法。
- 少なくとも一つの構成要素が、アミノ酸である、請求項2に記載の方法。
- 前記酵素がDNAリガーゼ、RNAリガーゼ、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、またはトポイソメラーゼである、請求項1に記載の方法。
- 前記入来オリゴヌクレオチドが、二本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項1に記載の方法。
- 連結部分が、構成要素と結合するように適合された第一の官能基、オリゴヌクレオチドの5’末端に結合するように適合された第二の官能基、およびオリゴヌクレオチドの3’末端に結合するように適合された第三の官能基を含む、請求項1に記載の方法。
- 請求項10に記載の方法であって:
Aが、アミノ基であり;
Bが、リン酸基であり;
Cが、リン酸基である、
方法。 - D、E、およびFが、それぞれ独立して、アルキレン基またはオリゴ(エチレングリコール)基である、請求項10に記載の方法。
- Sが、炭素原子、窒素原子、リン原子、ホウ素原子、または多原子骨格である、請求項10に記載の方法。
- Sが、リン酸基または多環式基である、請求項10に記載の方法。
- n、m、およびpが、それぞれ独立して、2〜8の整数である、請求項15に記載の方法。
- n、m、およびpが、それぞれ独立して、3〜6の整数である、請求項16に記載の方法。
- 前記反応基がアミノ基であり、および前記相補的反応基が、カルボキシル基;スルホニル基;ホスホニル基;エポキシド基;アジリジン基;およびイソシアネート基からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記反応基または前記相補的反応基が、独立して、ヒドロキシル基;カルボキシル基;スルホニル基;ホスホニル基;エポキシド基;アジリジン基;およびイソシアネート基からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記反応基がアミノ基であり、および前記相補的反応基が、アルデヒド基およびケトン基からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記反応基と前記相補的反応基との間の反応が、還元条件下で行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記反応基および前記相補的反応基が、リンイリド基およびアルデヒド基またはケトン基からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記反応基および前記相補的反応基が、付加環化を介して反応し環式構造を形成する、請求項1に記載の方法。
- 前記反応基および前記相補的反応基が、アルキンおよびアジドからなる群より選択される、請求項24に記載の方法。
- 前記反応基および前記相補的反応基が、ハロゲン化されたヘテロ芳香族基および求核試薬からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記ハロゲン化されたヘテロ芳香族基が、塩素化されたピリミジン、塩素化されたトリアジン、および塩素化されたプリンからなる群より選択される、請求項26に記載の方法。
- 前記求核試薬がアミノ基である、請求項26に記載の方法。
- 請求項4に記載の方法であって、該方法が、サイクルiの後に:
(f)一つまたは一つより多い前記機能的部分を環化する工程、
をさらに包含する、方法。 - 工程(f)の機能的部分が、アジド基およびアルキニル基を含む、請求項29に記載の方法。
- 前記機能的部分が、前記アジド基および前記アルキニル基の付加環化に対して適切な条件下で維持されて、トリアゾール基を形成し、それにより環式機能的部分を形成する、請求項30に記載の方法。
- 前記付加環化反応が、銅触媒の存在下で行われる、請求項31に記載の方法。
- 請求項32に記載の方法であって、工程(f)の一つまたは一つより多い機能的部分のうちの少なくとも一つが、少なくとも二つのスルフヒドリル基を含み、ここで、該機能的部分は、該二つのスルフヒドリル基の反応に対して適切な条件下で維持され、ジスルフィド基を形成し、それにより、該機能的部分を環化する、方法。
- 前記元のオリゴヌクレオチドが、PCRプライマー配列を含む、請求項1に記載の方法。
- サイクルiの入来オリゴヌクレオチドが、PCR近接プライマーを含む、請求項4に記載の方法。
- 請求項4に記載の方法であって、該方法が、サイクルiの後に、
(d)近接PCRプライマー配列を含むオリゴヌクレオチドを、前記コード化オリゴヌクレオチドにライゲーションする工程、
をさらに包含する、方法。 - 近接PCRプライマー配列を含む前記オリゴヌクレオチドが、酵素の存在下で前記コード化オリゴヌクレオチドにライゲーションされ、ここで該酵素は、該ライゲーションを触媒する、請求項36に記載の方法。
- 合成した分子がポリマー化合物である、請求項1に記載の方法。
- 合成した分子が非ポリマー化合物である、請求項1に記載の方法。
- キャップ配列が、配列:3’−AA GTCGCAAGCT NNNNN GTCTGTTCGAAGTGGACG−5’を含み、ここで、Nは、A、T、GまたはCのいずれかである、請求項1に記載の方法。
- キャップ配列が、配列:3’−AA GTCGCAAGCT NN N NN GTCTGTTCGAAGTGGACG−5’を含み、ここで、BはT、GまたはCのいずれかである、請求項1に記載の方法。
- 化合物のライブラリーを溶液中で合成する方法であって、ここで、該化合物は機能的部分を含み、該機能的部分は、該機能的部分の構造を同定するコード化オリゴヌクレオチドに作動可能に連結する二つまたは二つより多い構成要素を含み、該方法は、
(a)m個のイニシエーター化合物を含む溶液を提供する工程、ここでmは1または1より大きい整数であり、該イニシエーター化合物は少なくとも1つの反応基を有する構成要素をn個含む元の機能的部分を含み、該元の機能的部分は、該n個の構成要素に対応する元のオリゴヌクレオチドに作動可能に連結され、ここで、nは1または1より大きい整数であり、ここで該元の機能的部分および該元のオリゴヌクレオチドは連結部分により連結され、該元のオリゴヌクレオチドは二本鎖であり、該連結部分は該元の機能的部分および元のオリゴヌクレオチドの双方の鎖に共有結合され、連結部分が、
Aは、構成要素に結合するように適合された官能基であり;
Bは、元のオリゴヌクレオチドの5’末端に結合するように適合された官能基であり;
Cは、元のオリゴヌクレオチドの3’末端に結合するように適合された官能基であり;
Sは、原子または骨格であり;
Dは、AとSを結びつける化学構造であり;
Eは、BとSを結びつける化学構造であり;そして
Fは、CとSを結びつける化学構造である、工程;
(b)工程(a)の溶液をr個の反応容器に分割して、該溶液のr個のアリコートを産生する工程であって、ここでrは2または2より大きい整数である、工程;
(c)各反応容器における該イニシエーター化合物を、工程(a)の反応基に相補的な少なくとも1つの相補的反応基を含むr個の構成要素のうちの一つと、該相補的反応基の反応に対して適切な条件下で反応させて共有結合を形成させ、それによって、該元のオリゴヌクレオチドに作動可能に連結するn+1個の構成要素を含む機能的部分からなる化合物を含むr個のアリコートを産生する、工程;ならびに
(d)各アリコートにおける該元のオリゴヌクレオチドを、r個の異なる入来オリゴヌクレオチドのセットのうちの一つと、工程(c)の構成要素に対応する入来オリゴヌクレオチドと該元のオリゴヌクレオチドとのライゲーションを触媒する酵素の存在下で、該入来オリゴヌクレオチドと該元のオリゴヌクレオチドとの酵素的ライゲーションに対して適切な条件下で反応させ、コード化オリゴヌクレオチドを形成させる工程であって、最後のr個の異なる入来オリゴヌクレオチドはキャップ配列を含み、該キャップ配列は変質したヌクレオチドを含有するヌクレオチド配列を含む、工程;
を包含し、それによりn+1個の構成要素を含む機能的部分の構造を同定するコード化オリゴヌクレオチドに作動可能に連結する該n+1個の構成要素を含む機能的部分からなる分子を含むr個のアリコートを産生する、方法。
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